Quelques rappels Modifications des anticorps …€¦ · Techniques pour l’amélioration de...
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C.Sirac M2Immunotech 2011
Ingénierie moléculaire et cellulaire des anticorps monoclonaux thérapeutiques
- Quelques rappels - Modifications des anticorps - Systèmes d’expression mammifères - Modifications cellulaires - Systèmes de production
C.Sirac M2Immunotech 2011
Différents fragments d’anticorps monoclonaux utilisés en thérapeutique
Rappels sur les anticorps recombinants
+ Protéines de fusion avec fragments Fc: Etanercept (TNFRc-Fc)
C.Sirac M2Immunotech 2011
Rappels sur les anticorps recombinants
Hypermutations somatiques Site de fixation de l’antigène = CDR 1,2,3
VL VH
Ag
CDR1 CDR2 CDR3
C.Sirac M2Immunotech 2011
Rappels sur les anticorps recombinants Rôle des différentes parties d’un anticorps
Chimerisation/humanisation
C.Sirac M2Immunotech 2011
Les différents types d’anticorps recombinants monoclonaux
Induction HAMA (Human Anti-Murine
Antibody) Fréquent Induction HACA
(Human Anti-Chimeric Antibody) Plus rare
Non-immunogènes
Ac humanisé Ac humain
Rappels sur les anticorps recombinants
C.Sirac M2Immunotech 2011
Modification des anticorps Chimérisation des anticorps
VHm
VLm
CHm
CLm
Obtention Hybridome
VHm
VLm
Amplification par PCR des régions variables chaînes lourdes et légères
Prom polyA
VHm CHh
Prom polyA
VLm CLh
1
2
3 Clonage dans un vecteur d’expression possédant les domaines constants humain
Prom polyA
VHm CHh
Prom polyA
VLm CLh
Ac de souris
Ac Chimérique
Transfection dans une lignée productrice
4
C.Sirac M2Immunotech 2011
Optimisation des anticorps Humanisation
Exemple d’un anticorps humanisé: anti-CD52 (Campath ou Alemtuzumab)
-Conservation des séquences animales uniquement dans le site de liaison à l’antigène (CDRs): « CDR grafting » -Modification des AA exposés au solvants: « Resurfacing »
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 Rat EVKLLESGGGLVQPGGSMRLSCAGS GFTFTDFY MNWIRQPAGKAPEWLGF IRDKAKGYTT EYNPSVKGRFTISRDNTQNMLYLQMNTLRAEDTATYYC AREGHTAAPFDY WGQGVMVTVSS Campath QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVS GFTFTDFY MNWVRQPPGRGLEWIGF IRDKAKGYTT EYNPSVKGRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYC AREGHTAAPFDY WGQGSLVTVSS
C.Sirac M2Immunotech 2011
Optimisation des anticorps Humanisation
Banques de domaines variables humains Ex: Morphosys > 7 VL et 7 VH puis changement CDRs > 1,6x1010 possibilités
Phage display
C.Sirac M2Immunotech 2011
Techniques pour l’amélioration de l’affinité Mutagenèse aléatoire
Optimisation des anticorps
C.Sirac M2Immunotech 2011
Optimisation des anticorps Techniques pour l’amélioration de l’affinité
Mutagenèse aléatoire cellulaire
- Lignées cellulaires mutagènes (BL-2)
IgH
kappa
Induction d’hypermutations (Ag + PBL)
Test affinité anticorps muté
Vecteurs de transfections
BL2
C.Sirac M2Immunotech 2011
Optimisation des anticorps Techniques pour l’amélioration de l’affinité
Mutagenèse aléatoire
- Hybridomes - Phage display - Ribosome display - RNA display
Intégrée dans les systèmes de sélection d’un anticorps
C.Sirac M2Immunotech 2011
Optimisation des anticorps Techniques pour l’amélioration de l’affinité
Mutagenèse dirigée
Nécessite: Structure 3D
Permet: Alanine-scanning Mutagenèse combinatoire
C.Sirac M2Immunotech 2011
Rappels sur les anticorps recombinants Rôle des différentes parties d’un anticorps
Chimerisation/humanisation
C.Sirac M2Immunotech 2011
Optimisation des anticorps Optimisation des régions Fc: rôles sur les fonctions effectrices
Importance des interactions Fc/RcFc
Permet de déterminer les AA importants dans la fixation de
l’Ac sur le récepteur Fc
Mutagenèse aléatoire ou dirigée
Exemple d’une interaction avec le récepteur FcRn
C.Sirac M2Immunotech 2011
Optimisation des anticorps Optimisation des régions Fc: rôles sur les fonctions effectrices
Mutagenèse dans la région Fc:
Amélioration de l’ADCC (Fixation sur RcFγIII + RcFγI) Amélioration de la CDC (Fixation à C1q)
Mais aussi: inhibition d’une fonction ex: Telixizumab (anti-CD3) IgG1 muté pour inhiber ADCC et CDC
Optimisation des régions Fc: rôles sur la pharmacocinétique
Amélioration de la demi-vie des anticorps par optimisation de la fixation au FcRn
PEGylation (ScFv)
C.Sirac M2Immunotech 2011
Récepteurs Fc: activateurs et inhibiteurs
CD64 et CD16 (NK): Récepteurs Fc activateurs (ITAM), phagocytose ou cytotoxicité (ADCC) CD32: Récepteurs Fc inhibiteurs (ITIM), rôle dans ma régulation de la réponse immune
> Certains allotypes de CD16 fixent moins les IgG: diminution de l’ADCC NK
C.Sirac M2Immunotech 2011
Récepteurs FcRn: Néonatal Fc récepteur
Rôle dans le transport des IgG de la mère vers l’enfant (placenta)
Exprimé par les cellules endothéliales et les macrophages: permet le recyclage des IgG après endocytose > augmentation de la ½ vie sérique des IgG
C.Sirac M2Immunotech 2011
Vecteurs d’expression
HK416-31 10349 bp
DHFR
Light Chain
néo
Heavy Chain
intron
intron Amp
PolyA polyA
polyA polyA
promoteur
Promoteur/enhancer
Promoteur/enhancer
Promoteur
ScaI
Exemple d’un vecteur d’expression pour cellules mammifères
C.Sirac M2Immunotech 2011
HK416-31 10349 bp
DHFR
Ckappa
néo
HC Gamma1 (CH1, 2, 3) Amp
PolyA polyA
polyA polyA
promoter
prom/enh promoter
Prom/enh
VH
VL
Vecteurs d’expression Vecteur générique d’Ac recombinant
Possibilité d’intégrer n’importe quel domaine variable
C.Sirac M2Immunotech 2011
Vecteurs d’expression
HK416-31 10349 bp
DHFR
LC
néo
HC
intron
intron Amp
PolyA polyA
polyA polyA
promoter
prom/enh promoter
Prom/enh
Promoteurs/Enhancers: hCMV, LTR RSV, pEF1α, Eµ/pVH, etc… Doivent être testés dans la lignée de production (parfois lignée-spécifique comme Eµ) Enhancers (contiennent des sites de fixations à des facteurs de transcription) peuvent être situés dans le promoteur ou séparément de celui-ci
Intron: Placé en amont ou dans le gène d’intérêt (jamais après le codon STOP: NMD), Stabilisation et exportation de l’ARN. Forte augmentation des taux de production
Gène d’intérêt: Séquence de Kozak (GCCGCC(A/G)CCATGG), éviter les séquences fortes en GC en amont du site d’initiation de la traduction, séquence leader optimale.
Site de polyadénylation: BGHpolyA, HGHpolyA, late SV40 polyA, polyA synthétique, etc… Comme pour promoteur, doit être testé dans la lignée de production choisie
Gène de sélection: Néo, Puro, Hygro, GPT, etc… Sert à sélectionner les clones ayant intégré le vecteur d’expression
Les incontournables
C.Sirac M2Immunotech 2011
Vecteurs d’expression
HK416-31 10349 bp
DHFR
LC
néo
HC
intron
intron Amp
PolyA polyA
polyA polyA
promoter
prom/enh promoter
Prom/enh Les « plus »
Gène d’amplification: DHFR (dihydrofolate reductase) ou GS (glutamine synthetase). Systèmes de sélection permettant l’amplification du nombre de copies du transgène en présence respectivement de MTX (méthotrexate) ou MSX (methionine sulfoximine)
Gène de sélection « diminué »: permet, en parallèle à des doses élevées d’antibiotiques, de cibler des sites à haute activité transcriptionnelle
IRES: expression bicistronique de deux gènes. Permet des taux d’expression équivalents de deux gènes
C.Sirac M2Immunotech 2011
Modifications cellulaires Simplification et augmentation de la productivité
Lignées « taguées » dans un hot-spot de transcription
Transfection classique
H1
L1
GS FRT
FRT
Vecteur de
ciblage
Lignée d’expression
Clone fort producteur Ac n° 1
1
GS H1 L1
Site d’intégration
2
Lignée “taguée”
Transfection transitoire
Vecteur Flp ou Cre
FRT
Site d’intégration
Clone fort producteur Ac n° 2, …, n
Co-transfection avec vecteur Flp
3
L2
H2 GS
Vecteur d’expression
nouvel anticorps
GS H2 L2
Site d’intégration
Autre méthode: knock-in dans site connu (locus Ig par ex.)
C.Sirac M2Immunotech 2011
Modifications cellulaires Augmentation de la productivité
Surexpression de protéines anti-apoptotiques (Bcl2, Bcl-XL) Diminution de l’expression de protéines apoptotiques par ARN interférence (Caspase3)
Inhibition du cycle cellulaire (expression de kinase inhibitrices du cycle cellulaire telles que p21CIP ou p27KIP)
Surexpression de protéines chaperones (BiP, HSP70)
Surexpression de facteurs de transcription (SRF, TFII-I, etc…)
Contrôle de l’apoptose
Contrôle de la croissance (biomasse)
Amélioration de la sécrétion
Amélioration de la transcription
C.Sirac M2Immunotech 2011
Modifications cellulaires Augmentation de la productivité
Leçon de la nature: Mécanismes impliqués dans la transformation des cellules B en usine à anticorps, les plasmocytes
UPR: unfolded protein response
Blimp1 augmente expression Ig
Réponse UPR: XBP1s augmente capacités sécrétoires de la cellule
Application aux lignées productrices d’Ac: surexpression de XBP1s
C.Sirac M2Immunotech 2011
Modifications cellulaires Optimisation de la glycosylation: rôle sur les fonctions effectrices
Surexpression de la GalTIII (beta 1,4 N-
acetylglucosaminyltransferase) : amélioration de l’ADCC
E/T=1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100
mAb concentration (ng/ml)
% o
f lys
is
2 20 200 2000
CHO
YB2/0 Exemple d’ADCC dans CHO versus YB2/0: rôle du fucose
KO ou diminution par ARNi de Fut8: amélioration de l’ADCC (Lignées CHO Lec-13, YB2/0 ou KO Fut8)
C.Sirac M2Immunotech 2011
Voir dia 18-21 KI ou hot-spots
Introns, polyA...
Xbp1s, optimisation codons…
Bip, Xbp1s, peptide leader, glycosyl transferases, choix lignée…
Résumé (non exhaustif !) des moyens permettant d’améliorer la production des anticorps (et protéines thérapeutiques en général)
C.Sirac M2Immunotech 2011
Systèmes de production des anticorps thérapeutiques Lignées mammifères
CHO: Chinese Hamster Ovary 70% des anticorps du marché sont produits dans CHO -Bon taux de production, stabilité et connaissance du génome, adhérentes ou en suspension, adaptation aux milieux sans sérum, bien adaptées scale-up (fermenteurs)
NSO: Myélome murin non sécréteur d’Ig -Bon taux de production, peut servir à fusion avec cellules de souris humanisées, génome moins stable que CHO, uniquement en suspension, adaptation milieu sans sérum plus délicat
Sp2/0, YB2/0: hybridomes - Partenaires de fusion avec cellules de souris humanisées, problèmes de stabilité du génome (perte de chromosomes ou du transgène), adaptation sans sérum délicate, peu adaptés au scale-up
Autres lignées: BHK21 (hamster), Per.C6 (humaine), EBx (aviaire) Arrivent sur le marché en connaissant les défauts des autres lignées…
C.Sirac M2Immunotech 2011
Systèmes de production des anticorps thérapeutiques Les autres systèmes de production
Bactéries Levures (glycoFi, Glycode) Cellules d’insectes Plantes et cellules végétales Animaux transgéniques (GTC Biotech/LFB)
Principales difficultés: glycosylations
C.Sirac M2Immunotech 2011
Systèmes de production: Optimisation des milieux
Adapter le milieu à la lignée utilisée et au mode de culture (batch, fed-batch etc…)
Diminuer ou éliminer le sérum animal (réglementaire et purification)
C.Sirac M2Immunotech 2011
T-flasks
Rollers
Systèmes de production
C.Sirac M2Immunotech 2011
filtrat
Perfusion
Chemostat
Cuvée-alimentée (fedbatch)
Cuvée (batch)
Les types de fermenteurs
Systèmes de production
C.Sirac M2Immunotech 2011
Systèmes de production Les fibres creuses (hollow fibers)
C.Sirac M2Immunotech 2011
Bioréaction: les paramètres
• Température • pH (CO2, NaOH) • Composition du milieu
(Glutamine, Glucose) • Agitation • Aération (oxygène) • Asepsie
Systèmes de production
C.Sirac M2Immunotech 2011
Exemple d’étapes nécessaires à la réalisation d’une Working Cell Bank (WCB)
Congélation MCB/WCB
C.Sirac M2Immunotech 2011
Acide Folique Bases Puriques (Adénine, Guanine) + Thymidine
DHFR
MTX (méthotrexate) Blocage de l’enzyme
Acide Folique Bases Puriques (Adénine, Guanine) + Thymidine
DHFR
MTX (méthotrexate) Blocage insuffisant
Clone amplifié (x nombre de copies transgène)
Amplification par DHFR
C.Sirac M2Immunotech 2011
NEO Prom Faible
Site à faible activité transcriptionnelle
Transcription de Neo insuffisante à forte dose de G418
Ciblage de sites à forte activité transcriptionnelle
polyA faible
NEO
Site à forte activité transcriptionnelle
Transcription de Neo suffisante même à forte dose de G418
Kozak non optimal