Quality Control of scRNAseq data - GitHub Pages · 2020-04-02 · Single-cell transcriptomics...
47
Transcript of Quality Control of scRNAseq data - GitHub Pages · 2020-04-02 · Single-cell transcriptomics...
Outline
• Backgroundontranscriptionalbursting&drop-outs• Experimentalsetup–whatcouldgowrong?• Spike-inRNAs• Qualitycontrol:
– Filteringlowqualitycells– Doubletcells– AmbientRNAeffects– Filteringofgenes
• PCAforqualitycontrol
Transcriptionalbursting
• BurstfrequencyandsizeiscorrelatedwithmRNAabundance• ManyTFshavelowmeanexpression(andlowburstfrequency)andwillonlybe
detectedinafractionofthecells
(Suteretal.Science2011)
Gene 1Gene 2Gene 3Gene 4
DissociateBias due to cell type/state
Stochastic gene expression
BulkRNAseq
Reverse transcription“random” selection of 10-40% of mRNAs- Drop-outs
AmplificationMay have bias due to length, structure, gc-content
20% Gene 150% Gene 225% Gene 35% Gene 4
0% Gene 155% Gene 225% Gene 320% Gene 4
20% Gene 130% Gene 250% Gene 30% Gene 4
Bursting,drop-outsandamplificationbias
ProblemscomparedtobulkRNA-seq
• Amplificationbias• Drop-outrates• Transcriptionalbursting• Backgroundnoise• Biasduetocell-cycle,cellsizeandotherfactors• Oftenclearbatcheffects
(Karchenkoetal.NatureMethods2014)
scRNA-seqanalysisoverview
Mapping&Geneexpressionestimate
QC:RemovelowQcells
Removecontaminants
Data:Expressionprofiles
Rawdata:fastqfiles
Definingcelltypes/lineages
Genesignatures
Verificationexperiments
• Clusteringmethods
• Trajectoryassignment
• Datanormalization• Genesetselection• Batcheffectremoval• Removalofother
confounders
Visualization/Dimensionalityreduction
Experimentalsetup
Singlecellcapture
Singlecelllysis
Reversetranscription
Preamplification
Librarypreparationandsequencing
Celldissociation
Whatcouldgowrong?
Experimentalsetup
(Kolodziejczyketal.2015)
ItiscriticaltohavehealthywholecellswithnoRNAleakage.Shorttimefromdissociationtocell!Tissuesthatarehardtodissociate:
Lasercapturemicroscopy(LCM)Nucleisorting
PROBLEMS:• Incompletedissociationcangivemultiplecellssticking
together.• Toharshdissociationmaydamagecells->RNAdegradationand
RNAleakage.• LeakageofRNA–backgroundsignal.
Singlecellcapture
Singlecelllysis
Reversetranscription
Preamplification
Librarypreparationandsequencing
Celldissociation
Dissociationartifacts
• Dissociationmaybiasyourcellpopulations• Dissociationprotocolsmayintroducetranscriptionalchanges.
(vandenBrinketal.Naturemethods2017)
AmbientRNA
SamplefromDay3havedetectionofNeutrophilmarkersinallcells.PossiblycontaminationfromambientRNA.
AmbientRNA
• Usingemptydroplets,estimatebackgroundsignal–giveswarningincellrangerreport.
• SoupX(YoungMD,BiorXiv2018)
Experimentalsetup
(Kolodziejczyketal.2015)
PROBMLEMS:• Allthesemethodsmaygiverisetoemptywells/droplets,and
alsoduplicatesormultiplesofcells.• Sizeselectionbiasformanyofthemethods– dropseqhas
upperlimitforcellsize.• Biasedselectionofcertaincelltype(s)• Longtimeforsortingmaydamagethecells
Singlecellcapture
Singlecelllysis
Reversetranscription
Preamplification
Librarypreparationandsequencing
Celldissociation
Single-cell transcriptomics protocols overview
Kolodziejczyk et al, 2013
DoubletsinscRNAseq
Celldebrismaycausedoubletsignatures
Refrozensamples
Lowqualitysample
Percen
tdou
blets
Predicteddoubletsbasedoncelltypesignatures
DoubletsinscRNAseq
• Canbedistinctcluster• Canbeastreakbetweenclusters.
(McGinnisetal.BioRxiv2018)
Detectingduplicate/multiplecells
• HighnumberofdetectedgenesorUMIs–canbeasignofmultiples– But,bewaresothatyoudonotremoveallcellsfromalargercelltype.
• Afterclustering–checkifyouhavecellswithsignaturesfrommultipleclusters.
• Acombinationofthose2featureswouldindicateduplicates.
• With10Xyoushouldhaveafeelingforyourdoubletratebasedonhowmanycellswereloaded
Doubletdetectors
• DoubletFinder-https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/DoubletFinder
• Scrublet-https://github.com/AllonKleinLab/scrublet• DoubletDecon-https://github.com/EDePasquale/DoubletDecon
• DoubletCluster/DoubletCellinScran
Experimentalsetup
(Kolodziejczyketal.2015)
Optimallysisconditionsmayvaryfromcelltypetocelltypeandfornucleivscells.PROBLEMS:• Toharshlysisconditionsmayinterferewithlibraryprep.• Differentlysisconditionsmay/maynotgivenuclearlysis.
Singlecellcapture
Singlecelllysis
Reversetranscription
Preamplification
Librarypreparationandsequencing
Celldissociation
Experimentalsetup
(Kolodziejczyketal.2015)
Efficiencyofreversetranscriptionisthekeytohighsensitivity.Drop-outrateisaround90-60%dependingonthemethodused.Twolibrarieswiththesamemethodusingthesamecelltypemayhaveverydifferentdrop-outrates.
Singlecellcapture
Singlecelllysis
Reversetranscription
Preamplification
Librarypreparationandsequencing
Celldissociation
Single-cell transcriptomics protocols overview
Kolodziejczyk et al, 2013
Experimentalsetup
(Kolodziejczyketal.2015)
Singlecellcapture
Singlecelllysis
Reversetranscription
Preamplification
Librarypreparationandsequencing
Celldissociation
Single-cell transcriptomics protocols overview
Kolodziejczyk et al, 2013
Anyamplificationstepwillintroduceabiasinthedata.MethodsthatusesUMIswillcontrolforthistoalargeextent,butthechanceofdetectingatranscriptthatisamplifiedmoreishigher.FulllengthmethodslikeSmartSeq2hasnoUMIs,sowecannotcontrolforamplificationbias.
Experimentalsetup
(Kolodziejczyketal.2015)
Singlecellcapture
Singlecelllysis
Reversetranscription
Preamplification
Librarypreparationandsequencing
Celldissociation
Multiplexingofsampleswillnotalwaysbeperfect,sothenumberofreadspercellmayvaryquitealot.Basecallsinthesequencingmaybeeffectedbyanumberoffactors:• Lowcomplexityoflibrary–maybeanissuewheythereare
manyprimerdimers• Basecallqualityscoresmaybeeffectedifthereare
contaminationsintheflowcellIndexswapping
Spike-inRNAs
(Vallejosetal.PLOSCompBiol2015)
Externalmoleculesaddedinaknownconcentration.•ERCC:–92bacterialRNAspecies,differentlengths,GCcontents–22abundancelevels,2mixesforfold-changeaccuracyassessment•SIRV:–69artificialtranscripts–Mimichumangenes–Usedforisoformsdetection
Spike-inRNAs
(Brenneckeetal.NatureMethods2013)(Tungetal.ScientificReports2017)
Spike-inscanbeusedtomodel:• Technicalnoise• Drop-outrates/captureefficiency• StartingamountofRNAinthecell• Datanormalization
Problems:• Spike-insbehavedifferentlyto
endogenousgenes• Cannotbeusedindrop-seqmethods
QC-metrics
– Mappingstatistics(%uniquelymapping)– Fractionofexonmappingreads– 3’bias–forfulllengthmethodslikeSS2– mRNA-mappingreads– NumberofUMIs/reads– Numberofdetectedgenes– Spike-indetection– Mitochondrialreadfraction,ribosomalreadfraction– rRNAreadfraction– Pairwisecorrelationtoothercells
QC-metrics
– Numberofreads– Mappingstatistics(%uniquelymapping)– Fractionofexonmappingreads– mRNA-mappingreads(vsothertypesofgeneslikerRNA,sRNA,noncoding,pseudogenesetc.)
Lownumberofreads–maynothaveenoughinformationforthatcell.Badmappingmaybeanindicationofafailedlibraryprep.LowcontentofmRNAswillleadtomoreprimerdimersandmorespuriousmappingandfewermappingreads.
QC-metrics
– Spike-indetection– Spike-inratio
Ifthenumberofspike-inmoleculesthataredetectedislow,thisisaclearlyfailedlibraryprep.Proportionofcelltospike-inreadsisanindicationofthestartingamountofRNAfromthecell.LowamountofcellRNAcanindicatebreakageorjustasmallercell.
QC-metrics
– Numberofdetectedgenes
Numberofdetectedgenesclearlycorrelatestothesizeofthecells,sobecarefulifyouareworkingwithcellswithveryvaryingsizes.Highnumberofdetectedgenesmaybeanindicationofduplicate/multiplecells.Butcanalsobealargercelltype.
uniquemap 9 cells removed, cutoff 8.3711
05
1015
2025
30
3.5 16.5 31.5 46.5 61.5 76.5
mismatch/indel 26 cells removed, cutoff 0.7076
010
2030
4050
60
0.23 0.57 0.91 1.25 1.59
exonmap 20 cells removed, cutoff 0.6052
010
2030
4050
6070
0.015 0.225 0.435 0.645 0.855
3primemap 13 cells removed, cutoff 0.0856
050
100
150
200
250
300
0.0225 0.0925 0.1625 0.2325
normreads 16 cells removed, cutoff 100000.0000
010
2030
4050
50000 1750000 3650000 5550000
gene_detection 14 cells removed, cutoff 0.0949
010
2030
4050
60
0.035 0.175 0.315 0.455 0.595
total 48 samples failed QCTotal samples: 722
Failedlibraries Multiplecells
OK
QC-metrics
• Cellsize,spike-inratioandnumberofdetectedgenesareclearlycorrelated
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
● ●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
● ●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
● ●
●
●●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
● ●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●●●
●●
●
●
●
● ●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
● ●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
2 4 6 8 10 12
50000
60000
70000
80000
ERCC−ratio vs FSCPearson=0.6133
Spearman=0.6365
ERCC−ratio
FSC
● ●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
● ●
●●
●
●●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
● ●●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●●
●●●
●
●
●
●
●
●
● ●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
● ●
●
●
●
●●
●
● ●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●●
●
●
●
●
●
●●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
● ●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
● ●
●
●
●
●●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●●●
●
●
●
●
●
● ●
●
●
●●
●● ●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
● ●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●●
●●
●●
●●●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●
●●
●
●●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●●
●
●
●●
●●
●
●
●
●
●
2 4 6 8 10 12
2000
3000
4000
ERCC−ratio vs nDetPearson=0.8203
Spearman=0.8407
ERCC−ratio
nDet
FCS–ForwardScatteringfromFACS
QC-metrics
– Mitochondrialreadfraction
Suggestedthatwhenthecellmembraneisbroken,cytoplasmicRNAwillbelost,butnotRNAsenclosedinthemitochondria.HighcontentofmitochondrialRNAmayindicateapoptosis.
QC-metrics
– RibosomalRNAreadfraction– Ribosomalproteinreadfraction
PossiblethatdegradationofRNAleadstomoretemplatingofrRNA-fragments.Proportionribosomalproteinsmaybeanartifactfromhandlingofsamplesforcellsofthesamecelltype.
QC-metrics
– 3’bias(degradedRNA)–forfulllengthmethodslikeSS2
Notdegraded Degraded
0 20 40 60 80 100
1e+0
52e
+05
3e+0
54e
+05
5e+0
56e
+05
percentile of gene body (5'−>3')
read
num
ber
0 20 40 60 80 100
5000
0010
0000
015
0000
020
0000
025
0000
030
0000
035
0000
0
percentile of gene body (5'−>3')
read
num
ber
Lookatproportionofreadsthatmapstothe10-20%most3’endofthetranscript
QC-metrics
– Numberofreads– Mappingstatistics(%uniquelymapping)– Fractionofexonmappingreads– mRNA-mappingreads– 3’bias–forfulllengthmethodslikeSS2– mRNA-mappingreads– Numberofdetectedgenes– Spike-indetection– Mitochondrialreadfraction– rRNAreadfraction– Pairwisecorrelationtoothercells
Howtofiltercells
• Normally,mostoftheseqc-metricswillshowthesametrends,soitcouldbesensibletouseacombinationofmeasures.
• Lookatthedistributionsbeforedecidingoncutoffs.
Howtofiltercells
• CanusePCAbasedonQC-metricstoidentifyoutliercells.(Scaterpackage)
DropSeq-nUMIvsnGene
Decidingoncutoffsforfiltering
• Doyouhaveahomogeneouspopulationofcellswithsimilarsizes?
• Isitpossiblethatyouwillremovecellsfromasmallercelltype(e.g.redbloodcells)
• ExaminePCA/tSNEbefore/afterfilteringandmakeajudgmentonwhethertoremovemore/lesscells.
Howtofiltergenes
• Inmostcases,allgenesarenotusedindimensionalityreductionandclustering.
• Genesetselectionbasedon:– GenesexpressedinXcellsovercutoffY.– Variablegenes–usingspike-insorwholedistribution.– Filteroutgeneswithcorrelationtofewothergenes– Priorknowledge/annotation– DEgenesfrombulkexperiments– TopPCAloadings
Lookattotalcontributiontoexpression
• Sometimesindividualgenesmayhaveveryhighexpression–maybeproblematicfornormalization.
LookoutforMALAT1andothernuclearlincRNAs.Mitochonrialorribosomalgenes,actinandhemoglobin.
Lookattotalcontributiontoexpression
• MALAT1clearlycorrelateswithpercentmitochondrialgenesinsomesamples.
LookoutforMALAT1andothernuclearlincRNAs.Mitochonrial,ribosomalgenes,actinandhemoglobin.
Removalofgenesbeforeanalysis
• Mitochondrialencodedgenes–oftenmainlytechnicalbias.
• Genessuspectedtobetechnicalbias• Genesthatmaynotcontributetocelltypevariation(e.g.ribosomalgenes)
Batcheffects
• Canbebatcheffectsper– Experiment– Animal/Patient/Batchofcells– Sortplate– Sequencinglane
• CheckifQC-measuresdeviatesforanyofthosemeasures
• CheckinPCAifanyPCcorrelatestobatches– Scatertutorial
Alsocheckifyourdifferentqc-measuresaredifferentbetweenbatches.
PCAforQC
• OneofthefirstPCswill(always)correlatewithnumberofdetectedgenes
Red–highnumberofdetectedgenesGreen-low
PC10.062
−100 0 50
*
*
* *
*
*
*
*
***
*
*
*** *
**
*
*
**
**
*
*
****
**
***
*
****
*
**
*
*
**
*
**
****
**
*
*
*
**
*
*
**
** *** *
** *
***
*
*
*
*
*
****
****
*
**
***
*
*
***
*
*
*
**
*
**
* **
** *
***
***
*
**
*
**
*
*
* **
*
**
**
*
*
**
*
*
**
*
*
** *
*
*
*
*
**
*
*
*
***
*
*
*
* *
*
*
**
*
*
*
**
**
*
*
*
*
**
*
*
**
***
*
*
***
*
*
**
**
*
*
***
***
*
***
*
***
*
*
**
*
*
*
*
*
*
**
**
*
*
*
* **
**
**
*
**
*
**
* *
*
**
*
*
**
*
*
*
* *
*
****
*
*
**
*
**
**
*
**
*
**
*
*
**
*
*
* **
*
*
**
*
** * *
*
*
*
**
*
**
**
*
**
*
**
**
*
* **
*
***
**
**
**
* *
*
****
*
*
*
**
*
* *
*
*
**
*
***
*
*
**
*
*
*
*
*
*
**
***
***
***
**
*
* **
** **
*
*
****
**
*
*
*
***
*
**
***
*
***
*
* **
*
* ****
****
**
** *
**
***
***
* **
******
**
**
* ** *
****
*
* ***
*
*
* ***
**
*
* * *
**
*
**
***
*
**
** *
*
*
*
***
***
**
****
** ***
*
*
*
*
**** ***
* *
** ** ***
**
*
*****
***
*
*
*
**
**
***
*
*
**
*** **
*
*
*
****
** **
**
**
*
*
**
*** *
* ****
***
*
** ** **
***
**
**
**
*
**** ** *
**
*
*
*
* *** **
*
****
*
* *
*
****
**** *
**
**
*
*
**
*
*
*
*
***
*
*
**
***
*
*
*
**
**
*
*
****
**
** *
*
*** *
*
**
*
*
* *
*
**
****
**
*
*
*
***
*
**
******
***
***
*
*
*
*
*
***** ** *
*
**
***
*
*
**
*
*
*
*
* *
*
**
* **
** *
** *
***
*
**
*
**
*
*
* **
*
**
* *
*
*
**
*
*
**
*
*
** *
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
*
**
*
*
**
*
*
*
**
* *
*
*
*
*
**
*
*
**
***
*
*
***
*
*
**
**
*
*
***
***
*
***
*
**
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
**
**
*
*
*
**** *
**
*
**
*
**
* *
*
**
*
*
**
*
*
*
* *
*
****
*
*
**
*
* *
**
*
**
*
**
*
*
**
*
*
***
*
*
**
*
** **
*
*
*
**
*
* *
**
*
**
*
**
* *
*
* **
*
***
**
**
**
* *
*
****
*
*
*
**
*
* *
*
*
**
*
* **
*
*
* *
*
*
*
*
*
*
**
** *
***
* **
**
*
***
****
*
*
*** *
***
*
*
**
*
*
**
**
*
*
* **
*
* ** *
* ****
****
**
***
**
** *
***
* **
*** *
**
**
**
****
***
*
*
* ** *
*
*
** **
**
*
***
* *
*
**
* **
*
**
* **
*
*
*
**
*
**
***
**
***
***
*
*
*
*
*
*******
**
***
*** *
**
*
* * ****
**
*
*
*
**
**
**
**
*
**
*** **
*
*
*
****
*** *
**
**
*
*
**
****
*** **
***
*
*** **
*
* **
*** *
**
*
**
* * ***
* *
*
*
*
* *** **
*
***
*
*
* *
*
**
***
*** ****
*
−150 −50 50
*
*
**
*
*
*
*
***
*
*
**
***
*
*
*
**
**
*
*
*** *
**
* * *
*
*** *
*
**
*
*
* *
*
**
* ***
**
*
*
*
**
*
*
**
** ****
* **
***
*
*
*
*
*
*** *** **
*
**
***
*
*
***
*
*
*
**
*
**
***
** *
***
** *
*
**
*
**
*
*
* **
*
**
**
*
*
**
*
*
**
*
*
***
*
*
*
*
***
*
*
**
*
*
*
*
**
*
*
* *
*
*
*
**
**
*
*
*
*
**
*
*
**
***
*
*
***
*
*
**
**
*
*
** *
***
*
** *
*
***
*
*
***
*
*
*
*
*
**
**
*
*
*
*****
**
*
**
*
**
* *
*
**
*
*
**
*
*
*
**
*
* ***
*
*
**
*
**
**
*
**
*
**
*
*
**
*
*
* **
*
*
**
*
** **
*
*
*
**
*
**
**
*
**
*
**
**
*
** *
*
* **
****
**
**
*
****
*
*
*
**
*
**
*
*
**
*
* **
*
*
* *
*
*
*
*
*
*
**
** *
**
***
***
*
* **
*** *
*
*
****
**
*
*
*
**
*
*
*****
*
***
*
****
* * ***
***
*
**
***
**
* * *
***
***
*****
***
**
** **
****
*
****
*
*
** * *
**
*
***
* *
*
**
****
* *
***
*
*
*
**
*
***
**
**
* **
***
*
*
*
*
*
**** **
*
**
***
******
*
* *** **
**
*
*
*
***
****
*
*
**
**** *
*
*
*
***
*
** **
**
**
*
*
**
*** *
****
*
***
*
** ** *
*
***
**
* *
**
*
*** **
****
*
*
*
*****
*
*
****
*
**
*
**
***
*****
**
*
−300
−100
100
*
*
* *
*
*
*
*
** *
*
*
*** *
**
*
*
**
***
*
* ** *
**
** *
*
* * **
*
**
*
*
**
*
**
* * **
**
*
*
*
**
*
*
**
****
* *
* **
***
*
*
*
*
*
********
*
**
***
*
*
***
*
*
*
**
*
*** *
**
**
***
***
*
**
*
**
*
*
***
*
**
**
*
*
**
*
*
**
*
*
***
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
*
**
*
*
**
*
*
*
**
**
*
*
*
*
**
*
*
**
**
*
*
*
** *
*
*
**
**
*
*
***
***
*
***
*
***
*
*
**
*
*
*
*
*
*
**
**
*
*
*
* ****
***
**
*
**
* *
*
**
*
*
**
*
*
*
**
*
* ****
*
**
*
**
**
*
**
*
**
*
*
* *
*
*
* **
*
*
**
*
*** **
*
*
* *
*
**
**
*
**
*
**
**
*
* **
*
***
**
**
* *
**
*
* ***
*
*
*
**
*
**
*
*
**
*
* **
*
*
**
*
*
*
*
*
*
**
** *
***
* **
* *
*
***
*** *
*
*
*** *
**
*
*
*
***
*
**
**
*
*
** *
*
* **
*
** **
*
** **
**
***
**
* **
* **
* **
**
***
***
**
* ** *
***
*
*
****
*
*
* * **
**
*
***
* *
*
****
**
* *
** *
*
*
*
***
***
****
***
* ***
*
*
*
*
***
** **
**
** ** *
* ***
*
* *****
**
*
*
*
**
****
**
*
**
** ***
*
*
*
***
*
** **
**
**
*
*
**
* ***
*** **
***
*
*****
*
** *
**
* *
**
*
*****
* ** *
*
*
*
**** **
*
* **
*
*
**
*
****
** ***
**
**
−100
050
**
***
***
*
*
** *
* ***
*
*
*
***
**
* *** **
* ***
*
*
**
*
*
**
*
***
*
**
*
* *** * *
*
**
*
*
* **
*
**
***
*****
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
**
*
* *
**
*
*
**
**
*
**
*
*
*
*
**
**
* *
**
*
*
*
*
*
*
**
*
*
* *
* *
*
**
*
*
* *
**
*
*
* *
*
*
*
*
*
**
*
*
* *
**
**
* *
*
**
**
**
*
* *
*
**
*
**
*
** *
**
*
*
**
** *
*
*
**
*
*
**
*
**
*
***
*
*
**
*
**
* **
***
*
**
*
*
* *
*
*
**
*
*
* *
**
**
***
**
*
*
*
*
*
*
***
*
**
* *
**
*
**
**
*
**
*
*
* *
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
* *
*
*
*
*
* *
**
**
**
**
* *
**
*
***
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
**
**
*
* ** **
**
*
*
** *
**
*
******
**
*
*
*
**
* *
* *
**
*
*
***
* *
**
*** *
* ******
****
* ****
*
*
*
****
*
**
* ***
*
****
*** *
*
** * ****
* **
**
*
*
*
*
** **
****
* **
**
* **
* ***
** **
*
***
*
** **
*
* *
** *** **
**
*** **
*
*
***
*
*
*
*** *** **
*
**
*
*
*
** **
* **** *
***
** ** *
**
**** ***
*
****
*
** * *
** **
* *
**
**
**
*
* **
*
* *
**
*
** **
* * *****
* *
*
*
*
*
*
**
*** *** **
*
*
***** **
**
* **
*** *
* *
*
* **
*
***
* ***
*
PC20.021 *
****
***
*
*
***
* ***
*
*
*
** *
**
**** **
* **
*
*
*
**
*
*
**
*
***
*
**
*
***
* * *
*
**
*
*
* **
*
**
* **
******
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
**
*
**
**
*
*
**
**
*
**
*
*
*
*
**
* *
**
**
*
*
*
*
*
*
**
*
*
**
**
*
**
*
*
* *
* *
*
*
* *
*
*
*
*
*
**
*
*
**
**
**
* *
*
**
**
**
*
* *
*
* *
*
**
*
** ***
*
*
*****
*
*
**
*
*
**
*
**
*
***
*
*
**
*
**
* **
***
*
**
*
*
* *
*
*
**
*
*
* *
**
**
* **
**
*
*
*
*
*
*
***
*
**
* *
**
*
**
**
*
**
*
*
* *
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
*
* *
**
**
**
**
**
* *
*
**
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
****
*
* ** **
* *
*
*
** *
***
** ****
* *
*
*
*
**
* *
* *
**
*
*
***
* *
**
*** *
* ***
***** **
*****
*
*
*
****
*
**
* ***
*
**
* *
****
*
** ** ** *
* **
**
*
*
*
*
** **
*** ** **
**
* **
* **
*** **
*
* **
*
** **
*
* *
* **** ****
*****
*
*
***
*
*
*
****** **
*
**
*
*
*
***
** *
** **
**
*
** ***
**
** ** *
***
****
*
** **** * *
* *
**
**
**
*
***
*
* *
**
*
** **
* * ***
* ** *
*
*
*
*
*
**
*** * * ***
*
*
***
** *
*
**
***
****
* *
*
* **
*
***
****
*
**
** *
** **
*
***
****
*
*
*
***
**
**** * *
* **
*
*
*
**
*
*
**
*
****
**
*
* **
** *
*
**
*
*
* **
*
**
* * *
******
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
**
*
**
**
*
*
* *
***
**
*
*
*
*
**
**
**
**
*
*
*
*
*
*
**
*
*
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
**
*
*
*
*
*
**
*
*
**
**
**
**
*
**
**
**
*
**
*
* *
*
**
*
***
**
*
*
***
**
*
*
**
*
*
**
*
**
*
***
*
*
**
*
**
***
***
*
**
*
*
**
*
*
**
*
*
**
**
**
***
**
*
*
*
*
*
*
***
*
**
* *
**
*
**
**
*
**
*
*
* *
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
*
**
**
**
**
**
**
**
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
**
**
*
* ** **
* *
*
*
** *
**
*
** ****
**
*
*
*
**
**
* *
**
*
*
***
* *
**
*** *
* ******
******
* **
*
*
*
****
*
**
* **
*
*
**
* *
****
*
** *** **
***
**
*
*
*
*
****
**
*** **
**
* *** *
*****
*
*
***
*
* ***
*
* *
** *****
**
*** **
*
*
***
*
*
*
********
*
**
*
*
*
****
* *****
**
*
** ***
**
**** *
***
**
* *
*
** *** ***
**
***
*
**
*
* **
*
* *
**
*
** *** ** ****
**
*
*
*
*
*
**
* ** * ** **
*
*
****
* **
**
* **
* ** *
* *
*
* **
*
***
* ***
*
**
***
***
*
*
***
*** *
*
*
*
***
**
*** ** ***
**
*
*
**
*
*
**
*
***
*
**
*
* **
* * *
*
**
*
*
***
*
**
***
*****
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
**
*
* *
**
*
*
**
**
*
**
*
*
*
*
**
**
**
**
*
*
*
*
*
*
**
*
*
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
* *
*
*
*
*
*
**
*
*
**
**
**
**
*
**
**
**
*
* *
*
**
*
**
*
***
**
*
*
***
* *
*
*
**
*
*
**
*
**
*
***
*
*
**
*
**
* **
***
*
**
*
*
* *
*
*
**
*
*
**
**
**
***
**
*
*
*
*
*
*
** **
**
**
**
*
**
**
*
**
*
*
* *
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
* *
*
*
*
*
**
**
**
**
**
**
**
*
**
*
* *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
* ** **
**
*
*
** *
***
** ****
* *
*
*
*
**
* *
* *
**
*
*
***
* *
**
****
* ***
* ***** *****
*
*
*
*
****
*
**
***
*
*
**
**
*** *
*
** * ****
* **
**
*
*
*
*
****
***** **
**
* **
* **
****
*
*
***
*
* * **
*
* *
** * ****
*****
**
*
*
***
*
*
*
*** ** *
**
*
**
*
*
*
** **
* *** **
**
*
*** **
**
* *** ****
**
**
*
** **
*** *
**
**
**
**
*
* **
*
**
**
*
** **
* * *******
*
*
*
*
*
**
********
*
*
****
* **
**
***
*** *
* *
*
* **
*
***
* ***
*
****
*
*
*
*
*
*
**
*
**
** ****
*
*
*
** *
**
**
*
*****
*** *
*
**
*
*
**
** ** **
* **
** *
*
* *
*
**
***
**
*
* ***
*
*
* **
*
*
*
**
*
**
*
***
*
**
*
**
* *
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
* *
*
*
* *
* *
*
**
*
*
**
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
**
*
*
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
* **
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
*
** ** *
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
***
*
**
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*
***
*
**
*
*
**
* ***
*
**
*
**
*
***
*
* *
*
*
*
*
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** * *
**
***
*
**
*
*
*
**
*
**
*
*
****
*
*
*
*
**
***
****
*
* **
*
*
*
** *
*
**
*
**
*
**** *
**
* *
***
***
** *
** **
** **
*
*
*
***** *
**
*
* **
*
*
**
*
*
* ** *
***
*
*
** **
**
***
**
*
*
**
***
**
*
*
*
*
***
*
**
**
** **
*
***
*
**
* *
*
**
**
* **
*
*** ****
*
*
*
**
*
**
***
*
***
* **
*
***
** *
*
*
*
***
*
**
*****
*
*
*
**
** **
*
*
**
**
**
*
*
****
*
****
** *
*
*
*
****
**
*
*
* *
*
**
*
*
**
**
**
*
*
*
*
***
*
** ** ***
*
*
**
*
**
*
**
*
**
*** *
* *** *
*
*
*
*
*
*
* *
*
**
*** * *
*
*
*
*
** *
****
*
***
* *
****
*
**
*
*
**
* ** ***
***
* * *
*
* *
*
**
** *
**
*
** **
*
*
***
*
*
*
**
*
**
*
* **
*
**
*
**
* *
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
* *
*
*
**
**
*
**
*
*
**
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
**
*
*
*
*
*
*
* *
*
*
*
*
*
* **
*
*
*
*
*
*
*
* *
*
*
* ****
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
* **
*
**
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*
* **
*
**
*
*
* *
*** *
*
* *
*
**
*
* ***
**
*
*
*
*
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*
*
**
*
* *
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** **
**
* **
*
**
*
*
*
**
*
**
*
*
****
*
*
*
*
*** *
*
** *
*
*
* **
*
*
*
***
*
**
*
**
*
**** *
**
**
***
**
*
***
** **
*** *
*
*
*
** ****
**
*
***
*
*
**
*
*
* ** *
***
*
*
***
****
**
**
*
*
**
**
***
*
*
*
*
****
**
**
****
*
**
**
**
**
*
* *
*** *
*
*
** ** ****
*
*
* *
*
**
** *
*
***** *
*
***
***
*
*
*
**
*
*
**
* ****
*
*
*
**
****
*
*
**
**
**
*
*
*** *
*
**
**** *
*
*
*
****
**
*
*
* *
*
**
*
*
**
**
* *
*
*
*
*
** **
*** *****
*
**
*
**
*
**
*
**
****
*PC30.007
** **
*
*
*
*
*
*
**
*
**
** ** **
*
*
*
***
****
*
** *
**
*** *
*
***
*
**
** ** **
***
** *
*
**
*
**
** *
* *
*
* ***
*
*
***
*
*
*
**
*
**
*
* **
*
**
*
**
* *
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
**
**
*
**
*
*
**
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
***
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*****
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
* *
*
*
* **
*
**
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*
***
*
**
*
*
**
* ** *
*
* *
*
**
*
* **
*
* *
*
*
*
*
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
***
*
*
*
*
*
*
**
*
* *
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*** *
**
***
*
**
*
*
*
**
*
* *
*
*
****
*
*
*
*
**
* **
****
*
* **
*
*
*
** *
*
**
*
**
*
**** *
**
**
* **
**
*
** *
****
** **
*
*
*
* *****
* *
*
***
*
*
**
*
*
*****
**
*
*
** *
**
**
**
**
*
*
**
*****
*
*
*
*
**
**
**
**** *
*
*
**
**
**
* *
*
**
**
***
*
**** ***
*
*
*
**
*
**
***
*
* **
* **
*
* **
***
*
*
*
**
*
*
**
***
* *
*
*
*
**
* ***
*
*
**
**
**
*
*
*** *
*
**
**
***
*
*
*
****
**
*
*
* *
*
* *
*
*
**
**
**
*
*
*
*
***
*
** ** **
**
*
**
*
**
*
**
*
**
****
*
−100
050
*** *
*
*
*
*
*
*
**
*
**
** * ***
*
*
*
***
**
**
*
***
**
** **
*
***
*
**
**** **
* **
***
*
* *
*
**
***
**
*
* ***
*
*
***
*
*
*
**
*
**
*
* **
*
**
*
**
* *
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
* *
*
*
**
**
*
**
*
*
**
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
**** *
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
* **
*
**
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*
* **
*
**
*
*
* *
* ***
*
**
*
**
*
* **
*
**
*
*
*
*
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*
*
**
*
* *
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** * *
**
***
*
**
*
*
*
**
*
**
*
*
****
*
*
*
*
****
*
***
*
*
* **
*
*
*
** *
*
**
*
**
*
* ** *
*
**
**
***
***
** *
* ***
** **
*
*
*
*** ** *
**
*
* **
*
*
**
*
*
* ** **
**
*
*
** ***
**
**
**
*
*
**
****
*
*
*
*
*
***
*
**
**** * *
*
**
**
**
**
*
* *
**
* **
*
*** ** * **
*
*
* *
*
**
***
*
* *****
*
***
***
*
*
*
**
*
*
****
***
*
*
*
**
****
*
*
**
**
**
*
*
* * **
*
**
**
***
*
*
*
****
**
*
*
**
*
**
*
*
**
**
* *
*
*
*
*
****
***** **
*
*
**
*
**
*
* *
*
**
*** *
*
−150
−50
50
* *
*
*
*
**
*
*
*
**
*
**
** *
*
*
*
*
*
**
* *
*
***
**
**
*
*
*
**
*
*
*
**
***
*
*
** *
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
***
**
** ***
* *
*
*
**
*
*
*** *
*
*
**
* ** **
**
*
***
**
**
*
**
*
*
**
*
**
*
***
**
* ** **
*
*
*
** **
*
*
*
* *
*
**
** * **
*
*
*
**
*
*
* **
** *
*
*
* *** *
* *
**
*
* *
**
*
**
*
**
* **
*
** *
* ** *
***
**
**
* ** **
** *
**
** **
*
* ** **
*
**
*
***
***
*
*
***
**
* *
*
*
**
**** *
*
****
*
*
* **
**
*
*
*** **
*
***
***
*
** **
** * *
*** **
*
** ***
**
*
*
**
*
**
**
*
**
*
*
* **
*
* * *
*
*
*
*
**
***
*** *
**
*
**
****
*
**
*
***
*
***
** *
** **
*
**
*
*
*
* *
*
***
* **
**
**
*
*
*
** *
*
*
*
**
***
*
**
**
*** *
*
*** ** *
*
**** ****
*
*
****** *
*
*
**
*** *
**
*** *
*
*
*
* **
*** *
*
*
*
*
*
*
*
** **
*
***
*
**
**
*
*
**
*
**** ***
*
***** **
*
*
* *
*
**
****
*
*
*
*
**
*
*
**
*
*
**
**
* *** *
**
*
*
*
*
*
* * ***
******
*
*
*
*
** * **
****
**
*
***
**
*
**
* *
** *
*
* ****
**
*
*
***
*
****
*
*
*
* ** * **
**
** *
*
*
*
*
*
**
**
****
*
**
*
*
*
*
** **
*
*
*****
*
*
*
*
**
*
*
*
****
** *
*
* *
*
*
*
**
*
*
*
* *
*
*** **
*
*
*
*
*
**
* *
*
***
**
**
*
*
*
**
*
*
*
****
*
*
*
* **
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
*****
**
*
*
**
*
*
*** *
*
*
****
***
**
*
***
**
**
*
**
*
*
***
**
*
* **
**
*** **
*
*
*
*** **
*
*
**
*
**
* ****
*
*
*
**
*
*
* **
***
*
*
*** * *
**
**
*
* *
**
*
**
*
**
* **
*
***
****
***
***
*
* ** **
***
**
* ***
*
* ****
*
**
*
***
* **
*
*
***
****
*
*
**
*** **
*
***
**
*
***
* *
*
*
**
* **
*
* **
***
*
* * **
****
***
**
*
*** *
*
**
*
*
**
*
**
**
*
**
*
*
***
*
* **
*
*
*
*
***
* **
***
**
*
******
*
**
*
* **
*
***
** *
* ***
*
**
*
*
*
* *
*
***
* ***
*
**
*
*
*
***
*
*
*
**
***
*
**
**
*****
*** ** *
*
***** ** *
*
*
***
* ** *
*
*
**
* ** *
**
****
*
*
*
***** ***
*
*
*
*
*
*
*** *
*
***
*
**
**
*
*
**
*
* **** *
*
*
** *****
*
*
**
*
**
***
**
*
*
*
**
*
*
**
*
*
**
*******
**
*
*
*
*
*
*** **
****
* *
*
*
*
*
*** *
*
****
**
*
* **
**
*
**
**
***
*
***
***
*
*
*
***
*
**
**
*
*
*
* *****
* *
***
*
*
*
*
*
**
**
**
***
**
*
*
*
*
***
*
*
*
*****
*
*
*
*
**
*
*
*
****
***
*
**
*
*
*
**
*
*
*
**
*
**
***
*
*
*
*
*
**
**
*
**
**
*
**
*
*
*
**
*
*
*
**
***
*
*
***
*
*
*
*
***
*
*
*
*
*
*
***
**
*****
**
*
*
**
*
*
*** *
*
*
**
*****
**
*
***
* *
* *
*
**
*
*
**
*
**
*
***
**
*****
*
*
*
** **
*
*
*
* *
*
**
** ***
*
*
*
**
*
*
***
** *
*
*
*****
* *
**
*
**
**
*
**
*
**
***
*
***
*** *
***
**
**
* ** **
***
**
****
*
* ****
*
**
*
***
* **
*
*
***
**
**
*
*
**
*****
*
***
**
*
* **
* *
*
*
**
* **
*
***
** *
*
****
*** *
***
**
*
****
*
**
*
*
**
*
****
*
* *
*
*
***
*
***
*
*
*
*
**
** *
** **
**
*
**
***
*
*
**
*
***
*
****
* *** **
*
**
*
*
*
* *
*
***
****
*
**
*
*
*
** *
*
*
*
**
***
*
**
**
*** *
*
*** ***
*
* **** ** *
*
*
*******
*
*
**
*** *
**
****
*
*
*
***
*** *
*
*
*
*
*
*
*
** **
*
** *
*
**
**
*
*
**
*
*** * **
*
*
*** ** * *
*
*
* *
*
**
*****
*
*
*
**
*
*
**
*
*
**
****** *
**
*
*
*
*
*
* ****
** * *
**
*
*
*
*
*** *
*
** **
**
*
* **
**
*
**
**
** *
*
* ****
**
*
*
***
*
**
**
*
*
*
*** * **
**
** *
*
*
*
*
*
**
**
**
**
*
**
*
*
*
*
** *
*
*
*
***
**
*
*
*
*
**
*
*
*
****
***
*
PC40.007
* *
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*** * *
*
*
*
*
*
**
**
*
**
**
*
**
*
*
*
**
*
*
*
**
**
*
*
*
** *
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
**
*
**
** ***
**
*
*
**
*
*
*** *
*
*
****
* **
**
*
***
**
**
*
**
*
*
**
*
**
*
* **
*** *
* **
*
*
*
*** *
*
*
*
**
*
**
** * **
*
*
*
**
*
*
***
** *
*
*
*** **
* *
**
*
**
**
*
**
*
**
****
***
* ***
***
***
*
* ****
***
**
** **
*
*****
*
**
*
***
* **
*
*
** *
*** *
*
*
**
**** *
*
****
*
*
*****
*
*
*** *
*
*
* **
***
*
* ***
*****
* **
*
*
*** * *
**
*
*
**
*
**
* *
*
**
*
*
***
*
** *
*
*
*
*
**
***
*** *
**
*
*** *
**
*
***
* **
*
***
***** **
*
**
*
*
*
**
*
**** *
**
*
**
*
*
*
** *
*
*
*
**
***
*
**
**
****
*
**** **
*
** *** ***
*
*
***
** **
*
*
**
****
**
* ** *
*
*
*
* **
** * **
*
*
*
*
*
*
****
*
***
*
**
**
*
*
**
*
*** ****
*
***** **
*
*
**
*
* *
***
**
*
*
*
**
*
*
**
*
*
**
**
* ** * *
**
*
*
*
*
*
* * ***
*** ***
*
*
*
*
*** **
* ***
**
*
** *
**
*
**
**
***
*
***
* **
*
*
*
** *
*
****
*
*
*
*** * **
**
***
*
*
*
*
*
****
***
**
**
*
*
*
*
** **
*
*
** *
**
*
*
*
*
**
*
*
*
* ***
** *
*
−300 −100 100
*
*
*
*
*
*
* **
*
*
**
* ****
*
* ***
*** * *
**
*
*
*
*
**
***
* *
**
* *
*
**
**
*
**
*
*
**
*
**
* *
* *
**
***
*** *
**** **
*
**
********
*
* *
****
**
*
*** *
*
** ****
** **
* **
*
**** **
*
*
* *
* ** *
**
*
*
*
**
*
*
**
* *
*** *
***
* **
*
*
**
**
*
** *
*
* *
*
*
*
** ***
*
*
*
*
* *
**
* *
** *
*
**
****
*
* *
*
*
*
* **** *
**
***
*** ** *
**
*
*
*
**
**
*
*
* ** *
*
*
***** * *
**** *
*
*
** *
*
*
* *
* **
**
* **
*
*
*
** *
*
**
*
**
**
* * *
*
*
**
*
**
*
***
*
*
*****
* ***
**
**
*
** * ***
**** **
**
**
* *
*****
*
** *
* ***
*
**
** **
** *
**
***
**** *
*
*
*
* *
**
*
**
*
**
**
*
*
*
**
*** *
*
**
****
*
*
*
*
* **
**
*** ***
**
*
** ****
*
**
*
*
*****
* *
**
** *
****
*
**
*
*
**
**
*
**
*
****
*
***
*
*
*
****
*
*
**
**
*
*
**
*** ** * *****
*
*
*
*
*
* ** **
*
***
* *** *
**
*
* *
*
*
**
**
*
*
**
*
***
*
*
*
*
**
**
*
***
* *
*
*
*
**
** **
**
*
*
**
** **
***
*
**
*
*
*
* **
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
* ***
*
*
** *
*
*****
*
**
*
*
*
**
**
*** **
* ***
**
**
**
*** *
* *
**
*
*
*
*
*
****
*
*
**
*
***
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
**
****
*
*
** **
* ** * *
**
*
*
*
*
**
***
**
**
* *
*
**
* *
*
**
*
*
**
*
**
**
* *
**
***
**
*** **
***
*
**
** ***
***
*
* *
* **
*
**
*
*** *
*
******
***
*
***
*
*** * **
*
*
**
** **
***
*
*
**
*
*
**
**
****
* **
***
*
*
* *
**
*
***
*
**
*
*
*
* * ***
*
*
*
*
**
**
**
* **
*
**
* **
*
*
* *
*
*
*
* *****
**
**
*
** * ***
* *
*
*
*
**
**
*
*
*** *
*
*
**** ** *
*** **
*
*
***
*
*
**
***
* *
* **
*
*
*
***
*
**
*
**
**
* **
*
*
**
*
**
*
** *
*
*
**
* **
** **
**
**
*
* **** *
*** **
*
****
**
**
**
*
*
***
* ***
*
**
* ** *
** *
**
** ***** *
*
*
*
* *
**
*
***
**
**
*
*
*
**
****
*
**
****
*
*
*
*
* **
* *
******
**
*
*****
*
*
**
*
*
* **
**
**
**
** *
***
*
*
**
*
*
**
***
**
*
**
**
*
***
*
*
*
*** *
*
*
**
**
*
*
* *
***** ***
* ***
*
*
*
*
******
***
* ** **
**
*
* *
*
*
**
**
*
*
**
*
* ***
*
*
*
*** *
*
*****
*
*
*
**
****
***
*
***** *
***
*
**
*
*
*
***
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
** **
*
*
** *
*
**** *
*
**
*
*
*
**
**
*** ** ****
* *
**
**
**
****
**
*
*
*
*
*
****
*
*
**
*
***
*
−100 0 50
*
*
*
*
*
*
* **
*
*
**
* ****
*
* ***
**** *
**
*
*
*
*
**
***
* *
**
* *
*
**
**
*
**
*
*
**
*
**
* *
* *
**
***
**
* ****
***
*
**
** ***
* **
*
* *
* **
*
**
*
*** *
*
* *****
****
***
*
*** * *
*
*
*
* *
** **
***
*
*
**
*
*
**
* *
****
***
* **
*
*
**
**
*
** *
*
**
*
*
*
*****
*
*
*
*
* *
**
* *
***
*
**
***
*
*
* *
*
*
*
* **** *
**
**
*
*** ***
**
*
*
*
**
**
*
*
* ** *
*
*
**** ** *
*****
*
*
***
*
*
* *
* **
* *
* **
*
*
*
** *
*
**
*
**
**
* **
*
*
**
*
**
*
***
*
*
**
* **
* ***
**
* *
*
*******
* ****
**
**
* *
**
**
*
*
** *
* ***
*
**
*** *
***
**
****** * *
*
*
*
* *
* *
*
**
*
**
**
*
*
*
**
*** *
*
**
****
*
*
*
*
* **
**
*****
***
*
******
*
**
*
*
*****
* *
**
** *
* ***
*
**
*
*
**
**
*
**
*
****
*
***
*
*
*
** **
*
*
* *
**
*
*
**
* ** *** * *
** **
*
*
*
*
* ****
*
**** ****
**
*
**
*
*
**
**
*
*
**
*
***
*
*
*
*
**
**
*
** *
**
*
*
*
**
****
**
*
*
**
** * *
**
*
*
**
*
*
*
* **
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
* ***
*
*
***
*
**
* **
*
**
*
*
*
**
**
*** * *
****
**
**
**
**
* ***
**
*
*
*
*
*
**
**
*
*
**
*
***
*
*
*
*
*
*
*
* **
*
*
**
*****
*
* ***
* *** *
**
*
*
*
*
**
***
* *
**
* *
*
**
**
*
**
*
*
**
*
**
* *
* *
**
***
**
* ****
** *
*
**
**** *
** *
*
**
* ***
**
*
* ***
*
***** *
** **
***
*
**** **
*
*
**
** **
**
*
*
*
**
*
*
****
*** *
* **
***
*
*
* *
**
*
***
*
* *
*
*
*
* ****
*
*
*
*
**
**
**
***
*
*** **
*
*
**
*
*
*
** ****
**
***
** ***** *
*
*
*
***
*
*
*
****
*
*
***
* ***
*****
*
*
****
*
* *
***
**
* ***
*
*
** *
*
**
*
***
*
* **
*
*
**
*
**
*
** **
*
**
* **
** **
**
**
*
* ** ** *
*****
*
**
* *
**
***
**
*
** *
* ***
*
**
****
***
**
****** **
*
*
*
* *
* *
*
***
**
**
*
*
*
**
*** *
*
**
****
*
*
*
*
* **
**
******
**
*
**** **
*
**
*
*
*****
* *
***
**
* ***
*
**
*
*
**
**
*
***
**
**
*
****
*
*
****
*
*
* *
**
*
*
**
* ***
** *****
*
*
*
*
*
* ** ***
***
* *** *
**
*
**
*
*
**
**
*
*
**
*
***
*
*
*
*
****
*
**** *
*
*
*
**
****
***
*
**
** **
***
*
**
*
*
*
***
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
* ***
*
*
***
*
**
** *
*
**
*
*
*
**
**
* ** * ** ** *
**
**
**
**
* ** *
**
*
*
*
*
*
**
**
*
*
**
*
***
*
−100 0 50
−100
050PC5
0.006
PCA 4413 genes, rpkm ,color by nDet
PC1
PC2
CheckforbatcheffectsinPCA
Scaterpackage
PCAforQC
• PCAcanbeusedtoidentifycontaminantcellswhenyouaresortingforaspecificcelltype.
PC10.172
−100 0 100 200
** *
*
***
**
** *
*
* **
* ****
****
**
**
*
*
*
****
* ***
*
*** * ****
** *
**
*
*
*
**
**
*
***
*
****
** *
*
** **
*
*
* *
*
** ** ***
*
*
*
*
*
*
* *
*
** *
*
*
*** *
*
*
*
*
*
*
*
**
* **
*
**
*
*
*
* * *
*
*
**
* *****
*
* *
*
*
*
*
*
* **
***
*
*
*
** *
*
* **
*
**
***
*
* * **
*
*** ** **
*
***
*
*** **
*
* ***
*
*
** *
**
*
**
***
*
*
****
*
* **
*
*
*
*
*
*
**
**
***
**** *
**
**
** **
***
*
*
*
*
**
***** **
*
*** *
*
*
***
*
*
**
*
***
*
**
*
** * **
*
**** *
*
*
*
*
*
*
*
* *
**
*** ***
***
**
*
*
*
***
*
*
*
*
*
* **
*
*
*
** ** * * *
*
*
*
**
**
*
*****
*
*
*** *
**
* * ****
* **
**
*
*
*
*
*
*
****
**
**
*
*
*
* *** *
*
*
*
**
*** * *
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
****
*
*
*
*
**
*
**
*
*****
* *
*
*
*
*
*
** ***
*
*
****
*
* *
**
*
*
***
**
*
**** *** ****** ** ****
*
*** **
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** **
*** *
*
*
***** ** ** *
*
** **
*
*
* *** *
**
*
*
*****
*
*
** * **
*
**
*
**
***
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*** **
*
* *
*
***
**
*
**
*
*
*
**
*
** *
*
** ***
*
*
*
**
**
*****
** ** **
*
**
*
*
**
* *
*
****
*
*** ** **** * ***
**** ** *
* *
**
*
*
**
**
*
*
*** **
*
*
*
******* ** *** ** *** *
* * **
*
*****
** *
*
***
* ******* *
**
**
*
*
*
* ***
* ***
*
******* *
** **
*
*
*
*
**
* *
*
***
*
****
***
*
** ***
*
**
*
****** **
*
*
*
*
*
**
*
***
*
*
*** *
*
*
*
*
*
*
*
**
* **
*
**
*
*
*
* * *
*
*
**
* *****
*
* *
*
*
*
*
*
***
****
*
*
** *
*
* **
*
**
* * *
*
* ***
*
*** ***
*
*
***
*
* ****
*
****
*
*
***
**
*
**
****
*
****
*
* ***
*
*
*
*
*
**
**
** ******* *
**
*** *
****
*
*
*
**
****** *
*
* ***
*
*
****
*
**
*
***
*
**
*
*****
*
** * **
*
*
*
*
*
*
*
**
*********
**
**
*
*
*
* **
*
*
*
*
*
***
*
*
*
** *** *
**
*
*
**
* *
*
* ** **
*
*
*** *
**
* *****
***
**
*
*
*
*
*
*
*** *
**
**
*
*
*
* ****
*
*
*
**
** ** *
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
****
*
*
*
*
**
*
**
*
*** ****
*
*
*
*
*
* ****
*
*
****
*
* *
**
*
*
***
**
*
******* ****** * ******
** ***
*
*
*
*
*
*
*
*
*
****
****
*
*
** *** * *** *
*
*** *
*
*
* **** ***
*
* ** **
*
*
*****
*
**
*
**
** *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
** ***
*
**
*
** *
**
*
**
*
*
*
**
*
** *
*
** ***
*
*
*
**
**
*** **
** ****
*
**
*
*
**
* *
*
*** *
*
*** *** *******
*****
**
* *
**
*
*
**
**
*
*
* ** **
*
*
*
** ******* ***** ** ***
−50 50 150
* **
*
****
*
***
*
***
** *****
* *
**
**
*
*
*
********
*
****** **
*****
*
*
*
**
**
*
***
*
*******
*
****
*
*
**
*
*** *****
*
*
*
*
*
**
*
* **
*
*
****
*
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
*
*
***
*
*
****** **
*
**
*
*
*
*
*
***
** **
*
*
***
*
***
*
**
* **
*
****
*
**** **
*
*
* **
*
* ****
*
****
*
*
***
* *
*
**
***
*
*
****
*
****
*
*
*
*
*
****
***
*******
* *
********
*
*
*
**
****** *
*
****
*
*
****
*
**
*
***
*
**
*
***
* *
*
* ** **
*
*
*
*
*
*
*
**
***
** ******
***
*
*
***
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*** ** ***
*
*
**
**
*
** ****
*
*****
*
**** **
***
**
*
*
*
*
*
*
****
**
**
*
*
*
* ****
*
*
*
**
*****
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
****
*
*
*
*
**
*
**
*
*** ****
*
*
*
*
*
*****
*
*
* ***
*
**
**
*
*
***
**
*
* *** ********** *****
*
*****
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** *
*
** **
*
*
** ********
*
* ***
*
*
*******
*
*
******
*
**** *
*
**
*
***
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
* * *
**
*
**
*
*
*
* *
*
***
*
*****
*
*
*
**
**
**** *
**** **
*
**
*
*
**
**
*
****
*
* ************
* ** ****
**
* *
*
*
* *
**
*
*
**** *
*
*
*
***** ***** *********
−100
100
300
***
*
** **
*
** *
*
**** ******
* *
**
**
*
*
*
* ***** **
*
*** **** *
** *
**
*
*
*
*** *
*
* **
*
****
***
*
** **
*
*
**
*
**** ** **
*
*
*
*
*
**
*
** *
*
*
*** *
*
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
*
*
* **
*
*
**
* **** *
*
**
*
*
*
*
*
*******
*
*
** *
*
* **
*
**
** *
*
* ***
*
*** ****
*
***
*
** ***
*
***
*
*
*
* **
**
*
**
***
*
*
*** *
*
* **
*
*
*
*
*
*
**
**
***
** *** **
* *
*** *** **
*
*
*
**
****
* **
*
* ***
*
*
* ***
*
**
*
***
*
**
*
*****
*
** ***
*
*
*
*
*
*
*
**
**** ** **
** *
**
*
*
*
* **
*
*
*
*
*
* **
*
*
*
** ****
**
*
*
**
* *
*
* ** **
*
*
*** ***
* **** *
* **
**
*
*
*
*
*
*
****
**
**
*
*
*
** ** *
*
*
*
**
**** *
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
** **
*
*
*
*
**
*
**
*
*****
* *
*
*
*
*
*
* ****
*
*
* ***
*
* *
**
*
*
***
**
*
***** ** ****** * *****
*
** ***
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** **
****
*
*
***** * *** *
*
****
*
*
********
*
*** ***
*
*** **
*
**
*
*****
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
** *
**
*
**
*
*
*
* *
*
** *
*
** ***
*
*
*
**
**
******
* ****
*
**
*
*
* *
* *
*
*** *
*
*** *** *** ****
*****
* *
* *
**
*
*
* *
**
*
*
* ** **
*
*
*
*** ****** *** ** ** ***
−100
0100
***
** **
***
**
****
****
*
**
**
* *
**
**
*
*
*
*
*
*
*
** ***
***
***
*
*
* *
*
****
*
** *
*
** *
**** ***
*
***
*
***
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
***
*
*
* ** *
*
*
* ***
**
****
**
*
*
***
*
*
**
*
*
*
* *
**
**
*
*
**
**
*
***
****
*
**
*** *
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
***
*
*
***
**
*
****
*
*** ***
***
**
**
*
**
*
*
**
* *
*
*
**
*
*
*
****
*
*
***
*
*
**
**
*
**
**
**
*
*
*
*** *
**
*
**
***
*
**
** *
**
**
***
*
*
*
*
*
*
* *
*
***
*
*
*
*
**
** **
*
**
**
* ***
*
**
**
* **
**
*
** **
**
*
*
*
*
* *
*
***
***
** **
**
*
***
*
*
*
****
**
*
******
**
* ***
*
*
**
* *****
*
*
*
* ***
**
**
*
*
* *****
** *
*
* **
*
*
**
*
* *
*
***
*
**
*
**
*
*
**
*****
**
*
* *
**
*****
** * ***
*
**
**
*
*
** *
**
*
*************
*
*
***
*
*
** *
** *
*
*
*
** * *
*
***
*
****
*******
***** *
*
*
*
**
*
**
***
*
*
*
*** ***
*
*
*
***
*
*
** ***
*
**
*
**
*
*
*
*
*
****
**
***
** **
*
****
*
*
**
*
****
* *
*
*
*
*
*
*
* *
****
***
***
*
*
*
* ***
***
**
*
*****
*
*
*
*
***
**
*****
*
************
*
***
*
* *
*
**
**
*
*
*
* **
**
*****
** **************** ****
PC20.063
**
**** *
***
**
****
* ***
*
**
**
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*****
***
** *
*
*
**
*
****
*
** *
*
** *
**** ***
*
** *
*
** *
*
*
*
*
*
*
** *
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
***
*
*
****
*
*
***
**
*
**
**
***
*
**
*
*
*
***
*
*
**
**
**
*
*
**
**
*
***
* ***
*
**
****
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
** *
*
*
***
***
****
*
******
***
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
**
*
*
*
* ***
*
*
***
*
*
**
* *
*
**
***
*
*
*
*
****
**
*
* *
***
*
**
***
**
**
****
*
*
*
*
*
**
*
** *
*
*
*
*
**
** **
*
**
**
****
*
**
**
* **
* *
*
** **
**
*
*
*
*
**
*
***
***
** **
* *
*
* **
*
*
*
****
**
*
* *****
**
*****
*
**
**** **
*
*
*
****
**
**
*
*
* **** *
* * *
*
* **
*
*
**
*
**
*
***
*
**
*
**
*
*
***
** **
**
*
**
**
* ****
******
*
**
**
*
*
***
**
*
****
****
*****
*
*
***
*
*
** *
** *
*
*
*
** **
*
* **
*
****
**** ***
***** *
*
*
*
**
*
* *
***
*
*
*
** ** **
*
*
*
***
*
*
* ****
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*** *
**
* **
** **
*
*** *
*
*
* *
*
******
*
*
*
*
*
*
**
***
**
**
**
*
*
*
*
****
***
**
*
**
***
*
*
*
*
***
**
**** *
*
*****
* ******
*
***
*
**
*
****
*
*
*
***
**
****
** **** ***
***
* *****
*****
**
**** *
***
**
****
** **
*
**
**
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*** **
***
* **
*
*
**
*
****
*
** *
*
***
*******
*
***
*
***
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
***
*
*
****
*
*
* ***
**
****
**
*
*
***
*
*
**
*
*
*
* *
**
**
*
*
* *
**
*
***
****
*
**
*** *
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
** *
*
*
** *
***
* ***
*
* * ** **
***
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
* *
*
*
*
****
*
*
***
*
*
**
**
*
**
**
**
*
*
*
*** *
**
*
**
***
*
**
***
**
**
***
*
*
*
*
*
*
* *
*
* **
*
*
*
*
**
** **
*
**
**
* ***
*
**
**
***
**
*
* * **
**
*
*
*
*
* *
*
***
***
* ***
**
*
** *
*
*
*
****
**
*
**** **
**
****
*
*
**
******
*
*
*
****
***
*
*
*
* *****
***
*
***
*
*
**
*
**
*
***
*
**
*
**
*
*
***** **
**
*
* *
**
******** ***
*
**
**
*
*
***
**
*
*************
*
*
***
*
*
***
** *
*
*
*
** **
*
***
*
****
**** ***
***** *
*
*
*
**
*
**
***
*
*
*
******
*
*
*
***
*
*
* ***
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
****
**
***
****
*
* ***
*
*
* *
*
******
*
*
*
*
*
*
* *
****
***
***
*
*
*
****
***
**
*
*****
*
*
*
*
***
**
*****
*
* ***********
*
***
*
**
*
**
**
*
*
*
***
**
***
**
* ** ********** *******
**
****
** *
***
**
***
*
* ***
*
**
**
**
**
***
*
*
*
*
*
*
*** **
* **
** *
*
*
**
*
* ***
*
***
*
** *
***
* **
*
*
** *
*
** *
*
*
*
*
*
*
** *
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
* **
*
*
****
*
*
* **
***
**
**
**
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
**
**
**
*
*
**
**
*
***
****
*
**
**
**
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
***
*
*
***
**
*
* ** *
*
*** ** *
***
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
**
*
*
*
****
*
*
* **
*
*
**
* *
*
* *
**
**
*
*
*
****
**
*
* *
***
*
* *
***
**
**
***
*
*
*
*
*
*
**
*
** *
*
*
*
*
**
* ***
*
**
**
** **
*
* *
**
***
* *
*
* ****
*
*
*
*
*
**
*
***
**
*
** **
* *
*
* **
*
*
*
****
**
*
* **** *
**
*****
*
**
******
*
*
*
** **
**
**
*
*
******* **
*
***
*
*
**
*
**
*
* **
*
**
*
**
*
*
*******
* *
*
* *
**
* ****
* ** ***
*
**
* *
*
*
***
**
*
****
* ***
*****
*
*
***
*
*
** *
***
*
*
*
** **
*
***
*
**
**
** *********
**
*
*
*
**
*
**
***
*
*
*
**** **
*
*
*
** *
*
*
* ***
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
****
**
***
****
*
****
*
*
* *
*
***
***
*
*
*
*
*
*
* *
* **
**
**
**
*
*
*
*
****
***
**
*
***
***
*
*
*
** *
**
**** *
*
****** **
* ***
*
***
*
**
*
***
*
*
*
*
** *
**
****
*********
***
* *******
***
***
***
* *** **
*** ******** *
*
* ***
*
***
*
**
***
* *********
*
*
***
** ** *
**
*
***
**
***
*
**
*
*** * * ** *
*******
* * **
**
*
** *
***
* ***** *
**
***
** *
*** ***
*
* **** *
***
*****
***
*** *
**
**
*
* ***
**
***
**** *** *
** *
**** ****
**** *
*** *****
**** **
**** * *** *
*
*** *
*
**** *
* ***
*
* ** *****
* ** ******* ******
* *** **
**
***** * **
***
**
**
****
****
*****
*****
* *
*****
* **
**
*
***
** *
******
*
****
**
* *
**
*
*
*
*
*
*** * ** ****** ** ** ****
*
****
**
***
** *
*******
*** *** *
*
*
* ****
*
*
*
***
**
* **** ***
**
***** *
*
**
**
* *
*
* * *
*
***
*
**
*
**
*
**
**
****
** **
*
* *
*****
** * **
*
*
** ** **
** *
***
**************
*
***
* ******
*
**
* **
*
** *
**
*** ** *
*
********
*
*
*
*****
*
*****
*
** *** ***
* ** **** *
**
*
* *
***
**
*
**
* **
*
**
**
**
**
*
*
*
*
******
*
*
*
**
** **
** *
* ** ** * *
* **
*
*****
*
** * *
**
******
*****
**
*
*
***
**
*
**** **************
****
* **
** **
** ** **
* *
****
**
*
*****************
** *
****
**
** ** *
** * * ** ***
*** *
*
****
*
** *
*
**
***
***** * **
**
*
*
***
*****
**
*
****
****
*
* *
*
*** * **
* *
*** ** *
** **
*
**
*
** *
** *
** ***
**
**
***
** *
**
***
*
*
* *** ****
**
****
****
* ***
** *
*
* ***
**
***
**** *
** **
**
* * *** ***** *
***** **
***
*** ***
**** ******
****
*
*****
* **
*
*
* * ** ***
** *
***** ***** **
*** *** *
**
*
****** *** *
*
**
**
****
****
**** *
** ** *
**
****
*
***
**
*
** *
** *
* *****
*
*** *
**
* *
**
*
*
*
*
*
* ** *** *
*** *
* ****** **
*
****
**
***
***** * ****
* ***** *
*
*
******
*
*
* **
*** *
** **
**
**
*** ***
*
**
* *
* *
*
***
*
***
*
**
*
**
*
**
**
****
* ** *
*
**
** ***
******
*
** *** ****
***
**** *******
***
*
***
* **** **
*
**
***
*
* **
**
****
***
*****
** *
*
*
*
** ***
*
* **
* *
*
***
*****
*** * * *****
*
* *
***
**
*
**
***
*
**
***
**
**
*
*
*
***** *
*
*
*
*****
** **
**** ***
***
*
****
*
*
* ***
**
******
**
* **
**
*
*
***
**
*
**** ***
******* * **
*
****
* * *
** **
** ****
**
*** *
**
*
***
***** ***** ****
* ** PC30.026
**
****
* ****
** ** *
********
*
****
*
** *
*
******* ********
*
*
***
** ** *
**
*
***
**
***
*
**
*
***** ***
**** ***** **
**
*
** *
***
****** *
**
** **
***** ***
*
* *****
* ****** ****
*** *
**
**
*
****
**
***
********
** *
***** **** **
*** ******
**
* ***** *
**** * ***
*** *
*
**** *****
*
***** ***
*** ******* * *******
* ***
**
** *** ** *
* **
**
**
*** *****
*** **
** **** *
*****
***
* *
*
********
****
*
*****
** *
**
*
*
*
*
*
****** *** ****** *** **
*
** **
**
***
**** **** **
** *****
*
*
* *****
*
*
***
**
* **** *
* *
**
*******
**
**
**
*
***
*
***
*
**
*
**
*
*****
***
** **
*
* *
*****
*** ***
*
***
** ****
***
* *** *********
*
*
***
*******
*
**
***
*
* * *
**
*** *
***
** ******
*
*
*
* ****
*
*****
*
** ******
* *********
*
**
***
**
*
**
***
*
**
***
***
*
*
*
*
** ****
*
*
*
**
* * **** *
*** ** * *
***
*
*****
*
** **
**
*****
*
*** **
**
*
*
***
**
*
**** ** ************
* ** ****
*** *
*** **** *
****
**
*
****** ***** ******** *
−250
−100
0****
**
* ****** ***
* *******
*
****
*
****
**** *** *** ***
* *
*
*
***
* * ***
**
*
* ***
****
*
**
*
**
** ****
** *** **
** **
**
*
** *
** *
*******
**
** *
****** **
*
*
* ********
******
**** **
**
**
*
*** *
**
***
*****
****
**
* ***** **
**********
* ******* ** *
* ***** **
*** *
*
*** **
* **
*
*
*** * ****
* **** *
** *** * *** ***
** ***
*
****** *****
**
**
* ******
** **
**
*** ****
**
***
* ****
*
** *
***
** ** **
*
* ** *
****
***
*
*
*
*
* ** ****
****
* ** ** ****
*
* ***
**
***
***
* * **** *
* ******
*
*
* *****
*
*
***
**
***
* ****
**
******
*
**
* *
* *
*
* **
*
* **
*
* *
*
**
*
**
*****
*
* ** *
*
* *
****
*
*** **
*
*
*** ** *
***
***
***** ******
***
*
***
****
***
*
**
* **
*
** *
**
*******
********
*
*
*
*****
*
***
**
*
***
****
*
* **** ***
**
*
**
****
*
*
**
* **
*
**
**
***
**
*
*
*
******
*
*
*
**
** *** **
* *** * **
***
*
****
*
*
* ***
**
*****
*
*****
**
*
*
** *
**
*
***** **
******* ***
*
****
** *
** **
*** ** ***
*** *
**
*
**** ********* ***
****
−50
50150
***
** **
**
* ***
*****
** ***
*** *** *
*
*
*** ** ***
*
*********** **
*
**
**
**
*
****
**** ***
**** *
*
** *
*
******* *
***
**
**
*
***
*
**
*****
*
*
**
*
* *****
**
*
*
*
*** *
*
***** ***
** *
**
*
*
*
***
* ***
*
*
***
**** *** *
* *
*
****
*
******
* *
***
**
***
*
*
** ***
*** *
**
**
** **
* *
* ****
*** *
** **
***
**
****
******
*
*
***** **
*
*
*
*
** **** *
**
*
****
*
*
** *****
**
***
* **
*****
*
*****
*
*
*
*
*
* **** * ****** *** ***
*
****
**
*
*
*
****
*
* ***** * **
*
*
**
**
*
***** *
*
**** * ******* *
****
**
***
*
****
****
*
*
** ** **
*
*
*
**
******
**
*
*
**
*
*
** *
*
*
**
*
*
**
**
* *****
***
***
*
**
*
******
*
***
**** *
**
*
** *
***
******************
* *** ***
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
****
*
*
**********
*
**** *
*
*** ** ** **** *** **
* ***
*
**
* ** **
**
*
*** *
*
**
*
***
**
****
*
*
* * ***** *
*
**
**** * **
*
**
*
*
* **
* ***
***** *
*
** ***
*****
******
*
***
*
****
*
****
*
************* **
**
* ****
*
**
* *
*
*
*
*
*
*****
*
*
*
*************** *** * *
*****
**** * *
*
* *** *
** ****
******
*
*
*** ** ***
*
**** ****** * **
*
**
**
**
*
****
**** ** *
*** * *
*
** *
*
** ***** *
* **
**
* *
*
** *
*
**
** ***
*
*
***
* ** *****
*
*
*
* * **
*
*** ** ***
** ** *
*
*
*
* **
* ***
*
*
** *
** ** *** *
**
*
* * **
*
*** ** ***
***
**
***
*
*
* ****
*** *
**
**
** ****
* *****
** **
* * ** *
**
**
****** ***
*
*
** *
** ***
*
*
*
** *****
**
*
*** *
*
*
** ******
***
** *
*** * *
*
*
****
*
*
*
*
*
*
** * ** * *** *** *** ***
*
*** *
**
*
*
*
* ***
*
* ** ** * * **
*
*
**
**
*
***** *
*
*** **
** * **** *
****
**
** *
*
****
* ** *
*
*
** ** * **
*
*
**
*** * **
**
*
*
**
*
*
***
*
*
**
*
*
**
**
* *** **
***
* **
*
**
*
** *****
***
* ** * *
**
*
***
***
**** *** ****** *
****
* **** **
*
*
*
*
***
*
*
***
*
*** *
*
*
***** ** ** *
*
** ***
*
* *** * ***
* ***** **
* * **
*
**** * *
***
*
** **
*
* *
*
***
**
****
*
*
* ***** * *
*
**
**
****
*
*
**
*
*
***
** **
** *** *
*
*****
*****
** ****
*
***
*
*** *
*
****
*
*** ** **
** * ******
** * ** *
*
* *
* *
*
*
*
*
*
*** ***
*
*
*****
** ** *** ** *** ***
**
* *****
** **
**** *** ****
*******
*
* ** ** ***
*
******* *
** ***
*
**
**
* *
*
****
**** ****
** * **
***
*
********* *
*
**
**
*
***
*
**
** ***
*
*
**
*
*** ***
**
*
*
*
* * **
*
*** ** ***
** *
**
*
*
*
***
* ***
*
*
** *
** ******
* *
*
* ***
*
*** ***
* *
*****
****
*
*****
****
**
**
** **
* *
* ****
****
*******
**
** ******* **
*
***** **
*
*
*
*
** *****
***
* ***
*
*
** *****
****
** ***** **
*
** **
*
*
*
*
*
*
* ***** ***
*** *** *
**
*
**
***
*
*
*
*
*****
*** *** ***
*
*
**
**
*
* ** ** *
*
*** **** ***** *****
**
** *
*
*** *
****
*
*
** ** ***
*
*
**
** ** **
**
*
*
**
*
*
***
*
*
**
*
*
**
**
* *** **
******
*
**
*
* *****
*
***
*** **
***
***
***
******* ****** *
****
**** ***
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*** *
*
*
** *** * *** *
*
*** **
*
* **** ***
** ** ** **
*****
**** **
** *
*
** * *
*
**
*
***
**
* ***
*
*
* **** ** *
*
**
**** ***
*
**
*
*
***
** **
** *** *
*
*****
*** **
** **
**
*
***
*
*** *
*
*** *
*
*** *** ******* **
**
**** *
*
* *
**
*
*
*
*
*
* ** **
*
*
*
** ***
**** ***** ** ***
PC40.016 *
****
***
*** **
*** * *
************
*
*
* ** *** **
*
******* *** ***
*
**
*** *
*
* ***
**** ****
** ***
***
*
* *** ** ****
*
**
**
*
** *
*
**
** ** *
*
*
***
** ****
**
*
*
*
* ***
*
*** ** ** **
*** *
*
*
*
*****
* *
*
*
** *
** *** ***
* *
*
* ***
*
*** *****
*****
* ***
*
*** **
****
**
**
** **
**
*** **
*****
**** **
**
***
** *** **
*
*
***
*** **
*
*
*
*******
***
* ***
*
*
* ******
**
***
* **
* ****
*
** ***
*
*
*
*
*
** ****** **** ** **
**
*
**
****
*
*
*
* ***
*
*** **** **
*
*
**
**
*
* ** ** *
*
*** **
** **** ** ****
*****
*
****
****
*
*
*** ** *
*
*
*
**
**** **
**
*
*
**
*
*
***
*
*
**
*
*
**
**
* **** *
***
* **
*
**
*
* *****
*
***
** * ***
**
***
***
***** ** ****** *
****** ** ***
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
****
*
*
***** * *** *
*
*****
*
** **** **
**** ** **
****
*
**
** *****
*
*** *
*
* *
*
***
**
****
*
*
********
*
**
***
****
*
**
*
*
* **
** **
** ****
*
*** **
*****
** ****
*
***
*
* ** *
*
*** *
*
*** *** *
** ********
** ** *
*
* *
**
*
*
*
*
*
* ** **
*
*
*
*** ****** *** ** ** ***
−100 0 100 300
* ****
**
*
**** *
**
***** *** *
***
**** *
*** ** *** *** ****
*
* *** *
* **
***** *
*
*
**
*
***
*
**
*****
*
*
* * ******** *
*
*
*
**
**
*
*** ***
***
**
*
* *
* ** ****
*
*
* **
*
*** * **
*
*
****
**
* **
*
**
*
** ** **
**
****
****
***
**
****** **
***** *
*
***
******
*** ** **** * ***
*
** **
*
*
* ***
***
**
**
** *
**
* ****
*** ****
**
*
**** **
* ** *
** **** *** *
*
***
***
* ** ***
*
*
**
*
**
**
**** **
****
** ** ***
*** * ***
****
**
*
** **
*** *
* ** ***
**
****
*** *
*
*
**
****
*
***
*
**
*
**
*** *
******
*
**
*** ****
*
******
*
* * *
*
***
**
***
*******
*** *
*
**
* *
*
**
*
****
**
* **
*
**
****** *
**
**
* ******
*
*
***
****
*
**
*** *
***
***************
*** **
***** **
*
*
**
*
***
***
** ** **********
** *****
*
*
******
* * *** ****
*
* **
*
* **
**
*****
**
**
**
**
****
*
*
***
** ** * *****
**
*
**
***
* ** *
**
**
**
*
***
****** *
**
* ***
******
*****
*** *
***
*
*****
*
*
*************** **
**
*** *
***
*
**
**
*****
**
* ****************
*** *
** ***
**
*
* **
*** *
***** *** *
***
*** **
**
* ** **
**** ****
*
* **
* *
* **
*******
*
**
*
***
*
**
****
*
*
*
* ** **
** *** **
*
*
**
**
*
** **
* *
** *
**
*
* *
* * * ** **
*
*
* **
*
** ** *
*
*
*
**
**
**
* **
*
**
*
** ** *
*
**
***
*** **
***
**
*** * *** *
**
** **
*
***
***
* **** **
***** ****
*
** **
*
*
* ***
**
**
*
***
**
**
* **
**
*** * *
**
**
*
* *** **
* ***
** ********
*
***
***
* *****
*
*
**
*
**
**
** *
***
***
** * *****
* ** * * **
***
***
*
** **
** **
** ***
**
** *
***
* * **
*
**** *
*
*
***
*
**
*
**
**
* ** * ****
*
**
**** ** *
*
******
*
***
*
**
**
**
******* **
* ***
*
**
* *
*
**
*
***
*
**
* **
*
**
* ****
* **
*
**
**** ****
*
**** *
**
*
**
****
***
**** **********
*
*** **
*** ***
**
*
***
* *****
*** ** ****
***
* *
***
** **
*
*
* **
* **
* *******
*
*
* **
*
*****
****
**
**
**
**
*
****
*
*
***
*** * ***** * **
*
****
***
***
**
***
*
**
*
***
*** *
* *
****
******
*****
* ** *
***
*
** ****
*
***** ***
** **
*** **
**
*** **
**
*
**
**
*****
*********** *
* ******
** **
−250 −100 0
* *** **
**
*******
***** ****
***
*** ****
* ** **
**** ****
*
* **
**
* ****** * **
*
**
*
***
*
**
*****
*
*
** ******
****
*
*
**
**
*
*** ***
** *
**
*
**
** *** **
*
*
* **
*
** ***
*
*
*
****
**
* ***
**
*
** ** **
**
****
* * **
**** *
*** *****
***** *
*
******** *
***** *********
** **
*
*
* ***
***
**
*****
**
* *** *
*** *** *
**
*
**** **** * *** *****
* ***
**
*
***
* *****
*
*
**
*
**
**
** ** **
** *
** *** **
*
**** ***
***
***
*
** ***
** ** ** *******
***** **
*
******
*
***
*
**
*
**
****
* *****
*
**
**** ** *
*
*** * **
*
* **
*
**
****
****** **
*
* ** *
*
****
*
**
*
***
*
**
***
*
**
* *** *
* ***
**
*******
*
*
*****
**
*
***
***** *
**************
*
*** **
***** ***
*
**
*
* **
** **** ** *
** ******
** **** *
*
*
* **
***
* *** **
***
*
***
*
****
*******
**
**
**
*
*** **
*
* **
** ** **** **
**
*
**
*****
****
****
*
**
*
***
*** *
**
****
*** ***
***
***** *
***
*
*****
*
*
********
****
*** **
**
**
* ****
*
**
**** **
*
**
**** ******* ******
****
* *** **
**
*******
*** *********
*** *********** ** ****
*
* ****
* **
***** *
*
*
**
*
***
*
**
*****
*
*
** **** ******
*
*
**
**
*
* ** ***
***
**
*
**
** *****
*
*
* **
*
******
*
*
******
****
**
*
** ****
**
***
****
*
**** *
******* *
*** ** *
*
***
***** *
****** **
*** * **
****
*
*
* ***
**
***
*****
**
* **
**
*** ****
**
*
*** ***
*** **** *** *
* ***
***
***
** ****
*
*
**
*
**
**
**** **
** **
* ** * ***
**** ***
******
*
*** *
***** ** ****
** *
***** **
*
**
** **
*
** *
*
**
*
**
***********
* *
** ** ***
*
**** **
*
* **
*
****
**
* *******
*
* ***
*
**
* *
*
**
*
***
*
**
* **
*
**
**** ** ***
**
* *******
*
***
* ***
*
**
****
***
**** **********
*
********** **
*
*
**
*
* **
** *
** * ** *** ******
** ** ***
*
*
******** ******
*
*
***
*
******
* ***
**
***
***
****
*
*
***
*** *** *****
*
*
**
* ****
* **
**
***
*
***
*******
**
****
**** **
*****
*** *
****
*****
*
*
***
**********
* ** *
**
****
** *
*
**
**
*****
**
** ***** ***** *****
*** *
−100 0 100
−100
0100
PC50.011
PCA SC het genes (2451), color by Pitx3
PC10.172
−100 0 100 200
** *
*
***
**
** *
*
* **
* ****
****
**
**
*
*
*
****
* ***
*
*** * ****
** *
**
*
*
*
**
**
*
***
*
****
** *
*
** **
*
*
* *
*
** ** ***
*
*
*
*
*
*
* *
*
** *
*
*
*** *
*
*
*
*
*
*
*
**
* **
*
**
*
*
*
* * *
*
*
**
* *****
*
* *
*
*
*
*
*
* **
***
*
*
*
** *
*
* **
*
**
***
*
* * **
*
*** ** **
*
***
*
*** **
*
* ***
*
*
** *
**
*
**
***
*
*
****
*
* **
*
*
*
*
*
*
**
**
***
**** *
**
**
** **
***
*
*
*
*
**
***** **
*
*** *
*
*
***
*
*
**
*
***
*
**
*
** * **
*
**** *
*
*
*
*
*
*
*
* *
**
*** ***
***
**
*
*
*
***
*
*
*
*
*
* **
*
*
*
** ** * * *
*
*
*
**
**
*
*****
*
*
*** *
**
* * ****
* **
**
*
*
*
*
*
*
****
**
**
*
*
*
* *** *
*
*
*
**
*** * *
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
****
*
*
*
*
**
*
**
*
*****
* *
*
*
*
*
*
** ***
*
*
****
*
* *
**
*
*
***
**
*
**** *** ****** ** ****
*
*** **
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** **
*** *
*
*
***** ** ** *
*
** **
*
*
* *** *
**
*
*
*****
*
*
** * **
*
**
*
**
***
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*** **
*
* *
*
***
**
*
**
*
*
*
**
*
** *
*
** ***
*
*
*
**
**
*****
** ** **
*
**
*
*
**
* *
*
****
*
*** ** **** * ***
**** ** *
* *
**
*
*
**
**
*
*
*** **
*
*
*
******* ** *** ** *** *
* * **
*
*****
** *
*
***
* ******* *
**
**
*
*
*
* ***
* ***
*
******* *
** **
*
*
*
*
**
* *
*
***
*
****
***
*
** ***
*
**
*
****** **
*
*
*
*
*
**
*
***
*
*
*** *
*
*
*
*
*
*
*
**
* **
*
**
*
*
*
* * *
*
*
**
* *****
*
* *
*
*
*
*
*
***
****
*
*
** *
*
* **
*
**
* * *
*
* ***
*
*** ***
*
*
***
*
* ****
*
****
*
*
***
**
*
**
****
*
****
*
* ***
*
*
*
*
*
**
**
** ******* *
**
*** *
****
*
*
*
**
****** *
*
* ***
*
*
****
*
**
*
***
*
**
*
*****
*
** * **
*
*
*
*
*
*
*
**
*********
**
**
*
*
*
* **
*
*
*
*
*
***
*
*
*
** *** *
**
*
*
**
* *
*
* ** **
*
*
*** *
**
* *****
***
**
*
*
*
*
*
*
*** *
**
**
*
*
*
* ****
*
*
*
**
** ** *
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
****
*
*
*
*
**
*
**
*
*** ****
*
*
*
*
*
* ****
*
*
****
*
* *
**
*
*
***
**
*
******* ****** * ******
** ***
*
*
*
*
*
*
*
*
*
****
****
*
*
** *** * *** *
*
*** *
*
*
* **** ***
*
* ** **
*
*
*****
*
**
*
**
** *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
** ***
*
**
*
** *
**
*
**
*
*
*
**
*
** *
*
** ***
*
*
*
**
**
*** **
** ****
*
**
*
*
**
* *
*
*** *
*
*** *** *******
*****
**
* *
**
*
*
**
**
*
*
* ** **
*
*
*
** ******* ***** ** ***
−50 50 150
* **
*
****
*
***
*
***
** *****
* *
**
**
*
*
*
********
*
****** **
*****
*
*
*
**
**
*
***
*
*******
*
****
*
*
**
*
*** *****
*
*
*
*
*
**
*
* **
*
*
****
*
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
*
*
***
*
*
****** **
*
**
*
*
*
*
*
***
** **
*
*
***
*
***
*
**
* **
*
****
*
**** **
*
*
* **
*
* ****
*
****
*
*
***
* *
*
**
***
*
*
****
*
****
*
*
*
*
*
****
***
*******
* *
********
*
*
*
**
****** *
*
****
*
*
****
*
**
*
***
*
**
*
***
* *
*
* ** **
*
*
*
*
*
*
*
**
***
** ******
***
*
*
***
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*** ** ***
*
*
**
**
*
** ****
*
*****
*
**** **
***
**
*
*
*
*
*
*
****
**
**
*
*
*
* ****
*
*
*
**
*****
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
****
*
*
*
*
**
*
**
*
*** ****
*
*
*
*
*
*****
*
*
* ***
*
**
**
*
*
***
**
*
* *** ********** *****
*
*****
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** *
*
** **
*
*
** ********
*
* ***
*
*
*******
*
*
******
*
**** *
*
**
*
***
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
* * *
**
*
**
*
*
*
* *
*
***
*
*****
*
*
*
**
**
**** *
**** **
*
**
*
*
**
**
*
****
*
* ************
* ** ****
**
* *
*
*
* *
**
*
*
**** *
*
*
*
***** ***** *********
−100
100
300
***
*
** **
*
** *
*
**** ******
* *
**
**
*
*
*
* ***** **
*
*** **** *
** *
**
*
*
*
*** *
*
* **
*
****
***
*
** **
*
*
**
*
**** ** **
*
*
*
*
*
**
*
** *
*
*
*** *
*
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
*
*
* **
*
*
**
* **** *
*
**
*
*
*
*
*
*******
*
*
** *
*
* **
*
**
** *
*
* ***
*
*** ****
*
***
*
** ***
*
***
*
*
*
* **
**
*
**
***
*
*
*** *
*
* **
*
*
*
*
*
*
**
**
***
** *** **
* *
*** *** **
*
*
*
**
****
* **
*
* ***
*
*
* ***
*
**
*
***
*
**
*
*****
*
** ***
*
*
*
*
*
*
*
**
**** ** **
** *
**
*
*
*
* **
*
*
*
*
*
* **
*
*
*
** ****
**
*
*
**
* *
*
* ** **
*
*
*** ***
* **** *
* **
**
*
*
*
*
*
*
****
**
**
*
*
*
** ** *
*
*
*
**
**** *
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
** **
*
*
*
*
**
*
**
*
*****
* *
*
*
*
*
*
* ****
*
*
* ***
*
* *
**
*
*
***
**
*
***** ** ****** * *****
*
** ***
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** **
****
*
*
***** * *** *
*
****
*
*
********
*
*** ***
*
*** **
*
**
*
*****
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
** *
**
*
**
*
*
*
* *
*
** *
*
** ***
*
*
*
**
**
******
* ****
*
**
*
*
* *
* *
*
*** *
*
*** *** *** ****
*****
* *
* *
**
*
*
* *
**
*
*
* ** **
*
*
*
*** ****** *** ** ** ***
−100
0100
***
** **
***
**
****
****
*
**
**
* *
**
**
*
*
*
*
*
*
*
** ***
***
***
*
*
* *
*
****
*
** *
*
** *
**** ***
*
***
*
***
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
***
*
*
* ** *
*
*
* ***
**
****
**
*
*
***
*
*
**
*
*
*
* *
**
**
*
*
**
**
*
***
****
*
**
*** *
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
***
*
*
***
**
*
****
*
*** ***
***
**
**
*
**
*
*
**
* *
*
*
**
*
*
*
****
*
*
***
*
*
**
**
*
**
**
**
*
*
*
*** *
**
*
**
***
*
**
** *
**
**
***
*
*
*
*
*
*
* *
*
***
*
*
*
*
**
** **
*
**
**
* ***
*
**
**
* **
**
*
** **
**
*
*
*
*
* *
*
***
***
** **
**
*
***
*
*
*
****
**
*
******
**
* ***
*
*
**
* *****
*
*
*
* ***
**
**
*
*
* *****
** *
*
* **
*
*
**
*
* *
*
***
*
**
*
**
*
*
**
*****
**
*
* *
**
*****
** * ***
*
**
**
*
*
** *
**
*
*************
*
*
***
*
*
** *
** *
*
*
*
** * *
*
***
*
****
*******
***** *
*
*
*
**
*
**
***
*
*
*
*** ***
*
*
*
***
*
*
** ***
*
**
*
**
*
*
*
*
*
****
**
***
** **
*
****
*
*
**
*
****
* *
*
*
*
*
*
*
* *
****
***
***
*
*
*
* ***
***
**
*
*****
*
*
*
*
***
**
*****
*
************
*
***
*
* *
*
**
**
*
*
*
* **
**
*****
** **************** ****
PC20.063
**
**** *
***
**
****
* ***
*
**
**
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*****
***
** *
*
*
**
*
****
*
** *
*
** *
**** ***
*
** *
*
** *
*
*
*
*
*
*
** *
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
***
*
*
****
*
*
***
**
*
**
**
***
*
**
*
*
*
***
*
*
**
**
**
*
*
**
**
*
***
* ***
*
**
****
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
** *
*
*
***
***
****
*
******
***
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
**
*
*
*
* ***
*
*
***
*
*
**
* *
*
**
***
*
*
*
*
****
**
*
* *
***
*
**
***
**
**
****
*
*
*
*
*
**
*
** *
*
*
*
*
**
** **
*
**
**
****
*
**
**
* **
* *
*
** **
**
*
*
*
*
**
*
***
***
** **
* *
*
* **
*
*
*
****
**
*
* *****
**
*****
*
**
**** **
*
*
*
****
**
**
*
*
* **** *
* * *
*
* **
*
*
**
*
**
*
***
*
**
*
**
*
*
***
** **
**
*
**
**
* ****
******
*
**
**
*
*
***
**
*
****
****
*****
*
*
***
*
*
** *
** *
*
*
*
** **
*
* **
*
****
**** ***
***** *
*
*
*
**
*
* *
***
*
*
*
** ** **
*
*
*
***
*
*
* ****
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*** *
**
* **
** **
*
*** *
*
*
* *
*
******
*
*
*
*
*
*
**
***
**
**
**
*
*
*
*
****
***
**
*
**
***
*
*
*
*
***
**
**** *
*
*****
* ******
*
***
*
**
*
****
*
*
*
***
**
****
** **** ***
***
* *****
*****
**
**** *
***
**
****
** **
*
**
**
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*** **
***
* **
*
*
**
*
****
*
** *
*
***
*******
*
***
*
***
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
***
*
*
****
*
*
* ***
**
****
**
*
*
***
*
*
**
*
*
*
* *
**
**
*
*
* *
**
*
***
****
*
**
*** *
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
** *
*
*
** *
***
* ***
*
* * ** **
***
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
* *
*
*
*
****
*
*
***
*
*
**
**
*
**
**
**
*
*
*
*** *
**
*
**
***
*
**
***
**
**
***
*
*
*
*
*
*
* *
*
* **
*
*
*
*
**
** **
*
**
**
* ***
*
**
**
***
**
*
* * **
**
*
*
*
*
* *
*
***
***
* ***
**
*
** *
*
*
*
****
**
*
**** **
**
****
*
*
**
******
*
*
*
****
***
*
*
*
* *****
***
*
***
*
*
**
*
**
*
***
*
**
*
**
*
*
***** **
**
*
* *
**
******** ***
*
**
**
*
*
***
**
*
*************
*
*
***
*
*
***
** *
*
*
*
** **
*
***
*
****
**** ***
***** *
*
*
*
**
*
**
***
*
*
*
******
*
*
*
***
*
*
* ***
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
****
**
***
****
*
* ***
*
*
* *
*
******
*
*
*
*
*
*
* *
****
***
***
*
*
*
****
***
**
*
*****
*
*
*
*
***
**
*****
*
* ***********
*
***
*
**
*
**
**
*
*
*
***
**
***
**
* ** ********** *******
**
****
** *
***
**
***
*
* ***
*
**
**
**
**
***
*
*
*
*
*
*
*** **
* **
** *
*
*
**
*
* ***
*
***
*
** *
***
* **
*
*
** *
*
** *
*
*
*
*
*
*
** *
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
* **
*
*
****
*
*
* **
***
**
**
**
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
**
**
**
*
*
**
**
*
***
****
*
**
**
**
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
***
*
*
***
**
*
* ** *
*
*** ** *
***
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
**
*
*
*
****
*
*
* **
*
*
**
* *
*
* *
**
**
*
*
*
****
**
*
* *
***
*
* *
***
**
**
***
*
*
*
*
*
*
**
*
** *
*
*
*
*
**
* ***
*
**
**
** **
*
* *
**
***
* *
*
* ****
*
*
*
*
*
**
*
***
**
*
** **
* *
*
* **
*
*
*
****
**
*
* **** *
**
*****
*
**
******
*
*
*
** **
**
**
*
*
******* **
*
***
*
*
**
*
**
*
* **
*
**
*
**
*
*
*******
* *
*
* *
**
* ****
* ** ***
*
**
* *
*
*
***
**
*
****
* ***
*****
*
*
***
*
*
** *
***
*
*
*
** **
*
***
*
**
**
** *********
**
*
*
*
**
*
**
***
*
*
*
**** **
*
*
*
** *
*
*
* ***
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
****
**
***
****
*
****
*
*
* *
*
***
***
*
*
*
*
*
*
* *
* **
**
**
**
*
*
*
*
****
***
**
*
***
***
*
*
*
** *
**
**** *
*
****** **
* ***
*
***
*
**
*
***
*
*
*
*
** *
**
****
*********
***
* *******
***
***
***
* *** **
*** ******** *
*
* ***
*
***
*
**
***
* *********
*
*
***
** ** *
**
*
***
**
***
*
**
*
*** * * ** *
*******
* * **
**
*
** *
***
* ***** *
**
***
** *
*** ***
*
* **** *
***
*****
***
*** *
**
**
*
* ***
**
***
**** *** *
** *
**** ****
**** *
*** *****
**** **
**** * *** *
*
*** *
*
**** *
* ***
*
* ** *****
* ** ******* ******
* *** **
**
***** * **
***
**
**
****
****
*****
*****
* *
*****
* **
**
*
***
** *
******
*
****
**
* *
**
*
*
*
*
*
*** * ** ****** ** ** ****
*
****
**
***
** *
*******
*** *** *
*
*
* ****
*
*
*
***
**
* **** ***
**
***** *
*
**
**
* *
*
* * *
*
***
*
**
*
**
*
**
**
****
** **
*
* *
*****
** * **
*
*
** ** **
** *
***
**************
*
***
* ******
*
**
* **
*
** *
**
*** ** *
*
********
*
*
*
*****
*
*****
*
** *** ***
* ** **** *
**
*
* *
***
**
*
**
* **
*
**
**
**
**
*
*
*
*
******
*
*
*
**
** **
** *
* ** ** * *
* **
*
*****
*
** * *
**
******
*****
**
*
*
***
**
*
**** **************
****
* **
** **
** ** **
* *
****
**
*
*****************
** *
****
**
** ** *
** * * ** ***
*** *
*
****
*
** *
*
**
***
***** * **
**
*
*
***
*****
**
*
****
****
*
* *
*
*** * **
* *
*** ** *
** **
*
**
*
** *
** *
** ***
**
**
***
** *
**
***
*
*
* *** ****
**
****
****
* ***
** *
*
* ***
**
***
**** *
** **
**
* * *** ***** *
***** **
***
*** ***
**** ******
****
*
*****
* **
*
*
* * ** ***
** *
***** ***** **
*** *** *
**
*
****** *** *
*
**
**
****
****
**** *
** ** *
**
****
*
***
**
*
** *
** *
* *****
*
*** *
**
* *
**
*
*
*
*
*
* ** *** *
*** *
* ****** **
*
****
**
***
***** * ****
* ***** *
*
*
******
*
*
* **
*** *
** **
**
**
*** ***
*
**
* *
* *
*
***
*
***
*
**
*
**
*
**
**
****
* ** *
*
**
** ***
******
*
** *** ****
***
**** *******
***
*
***
* **** **
*
**
***
*
* **
**
****
***
*****
** *
*
*
*
** ***
*
* **
* *
*
***
*****
*** * * *****
*
* *
***
**
*
**
***
*
**
***
**
**
*
*
*
***** *
*
*
*
*****
** **
**** ***
***
*
****
*
*
* ***
**
******
**
* **
**
*
*
***
**
*
**** ***
******* * **
*
****
* * *
** **
** ****
**
*** *
**
*
***
***** ***** ****
* ** PC30.026
**
****
* ****
** ** *
********
*
****
*
** *
*
******* ********
*
*
***
** ** *
**
*
***
**
***
*
**
*
***** ***
**** ***** **
**
*
** *
***
****** *
**
** **
***** ***
*
* *****
* ****** ****
*** *
**
**
*
****
**
***
********
** *
***** **** **
*** ******
**
* ***** *
**** * ***
*** *
*
**** *****
*
***** ***
*** ******* * *******
* ***
**
** *** ** *
* **
**
**
*** *****
*** **
** **** *
*****
***
* *
*
********
****
*
*****
** *
**
*
*
*
*
*
****** *** ****** *** **
*
** **
**
***
**** **** **
** *****
*
*
* *****
*
*
***
**
* **** *
* *
**
*******
**
**
**
*
***
*
***
*
**
*
**
*
*****
***
** **
*
* *
*****
*** ***
*
***
** ****
***
* *** *********
*
*
***
*******
*
**
***
*
* * *
**
*** *
***
** ******
*
*
*
* ****
*
*****
*
** ******
* *********
*
**
***
**
*
**
***
*
**
***
***
*
*
*
*
** ****
*
*
*
**
* * **** *
*** ** * *
***
*
*****
*
** **
**
*****
*
*** **
**
*
*
***
**
*
**** ** ************
* ** ****
*** *
*** **** *
****
**
*
****** ***** ******** *
−250
−100
0****
**
* ****** ***
* *******
*
****
*
****
**** *** *** ***
* *
*
*
***
* * ***
**
*
* ***
****
*
**
*
**
** ****
** *** **
** **
**
*
** *
** *
*******
**
** *
****** **
*
*
* ********
******
**** **
**
**
*
*** *
**
***
*****
****
**
* ***** **
**********
* ******* ** *
* ***** **
*** *
*
*** **
* **
*
*
*** * ****
* **** *
** *** * *** ***
** ***
*
****** *****
**
**
* ******
** **
**
*** ****
**
***
* ****
*
** *
***
** ** **
*
* ** *
****
***
*
*
*
*
* ** ****
****
* ** ** ****
*
* ***
**
***
***
* * **** *
* ******
*
*
* *****
*
*
***
**
***
* ****
**
******
*
**
* *
* *
*
* **
*
* **
*
* *
*
**
*
**
*****
*
* ** *
*
* *
****
*
*** **
*
*
*** ** *
***
***
***** ******
***
*
***
****
***
*
**
* **
*
** *
**
*******
********
*
*
*
*****
*
***
**
*
***
****
*
* **** ***
**
*
**
****
*
*
**
* **
*
**
**
***
**
*
*
*
******
*
*
*
**
** *** **
* *** * **
***
*
****
*
*
* ***
**
*****
*
*****
**
*
*
** *
**
*
***** **
******* ***
*
****
** *
** **
*** ** ***
*** *
**
*
**** ********* ***
****
−50
50150
***
** **
**
* ***
*****
** ***
*** *** *
*
*
*** ** ***
*
*********** **
*
**
**
**
*
****
**** ***
**** *
*
** *
*
******* *
***
**
**
*
***
*
**
*****
*
*
**
*
* *****
**
*
*
*
*** *
*
***** ***
** *
**
*
*
*
***
* ***
*
*
***
**** *** *
* *
*
****
*
******
* *
***
**
***
*
*
** ***
*** *
**
**
** **
* *
* ****
*** *
** **
***
**
****
******
*
*
***** **
*
*
*
*
** **** *
**
*
****
*
*
** *****
**
***
* **
*****
*
*****
*
*
*
*
*
* **** * ****** *** ***
*
****
**
*
*
*
****
*
* ***** * **
*
*
**
**
*
***** *
*
**** * ******* *
****
**
***
*
****
****
*
*
** ** **
*
*
*
**
******
**
*
*
**
*
*
** *
*
*
**
*
*
**
**
* *****
***
***
*
**
*
******
*
***
**** *
**
*
** *
***
******************
* *** ***
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
****
*
*
**********
*
**** *
*
*** ** ** **** *** **
* ***
*
**
* ** **
**
*
*** *
*
**
*
***
**
****
*
*
* * ***** *
*
**
**** * **
*
**
*
*
* **
* ***
***** *
*
** ***
*****
******
*
***
*
****
*
****
*
************* **
**
* ****
*
**
* *
*
*
*
*
*
*****
*
*
*
*************** *** * *
*****
**** * *
*
* *** *
** ****
******
*
*
*** ** ***
*
**** ****** * **
*
**
**
**
*
****
**** ** *
*** * *
*
** *
*
** ***** *
* **
**
* *
*
** *
*
**
** ***
*
*
***
* ** *****
*
*
*
* * **
*
*** ** ***
** ** *
*
*
*
* **
* ***
*
*
** *
** ** *** *
**
*
* * **
*
*** ** ***
***
**
***
*
*
* ****
*** *
**
**
** ****
* *****
** **
* * ** *
**
**
****** ***
*
*
** *
** ***
*
*
*
** *****
**
*
*** *
*
*
** ******
***
** *
*** * *
*
*
****
*
*
*
*
*
*
** * ** * *** *** *** ***
*
*** *
**
*
*
*
* ***
*
* ** ** * * **
*
*
**
**
*
***** *
*
*** **
** * **** *
****
**
** *
*
****
* ** *
*
*
** ** * **
*
*
**
*** * **
**
*
*
**
*
*
***
*
*
**
*
*
**
**
* *** **
***
* **
*
**
*
** *****
***
* ** * *
**
*
***
***
**** *** ****** *
****
* **** **
*
*
*
*
***
*
*
***
*
*** *
*
*
***** ** ** *
*
** ***
*
* *** * ***
* ***** **
* * **
*
**** * *
***
*
** **
*
* *
*
***
**
****
*
*
* ***** * *
*
**
**
****
*
*
**
*
*
***
** **
** *** *
*
*****
*****
** ****
*
***
*
*** *
*
****
*
*** ** **
** * ******
** * ** *
*
* *
* *
*
*
*
*
*
*** ***
*
*
*****
** ** *** ** *** ***
**
* *****
** **
**** *** ****
*******
*
* ** ** ***
*
******* *
** ***
*
**
**
* *
*
****
**** ****
** * **
***
*
********* *
*
**
**
*
***
*
**
** ***
*
*
**
*
*** ***
**
*
*
*
* * **
*
*** ** ***
** *
**
*
*
*
***
* ***
*
*
** *
** ******
* *
*
* ***
*
*** ***
* *
*****
****
*
*****
****
**
**
** **
* *
* ****
****
*******
**
** ******* **
*
***** **
*
*
*
*
** *****
***
* ***
*
*
** *****
****
** ***** **
*
** **
*
*
*
*
*
*
* ***** ***
*** *** *
**
*
**
***
*
*
*
*
*****
*** *** ***
*
*
**
**
*
* ** ** *
*
*** **** ***** *****
**
** *
*
*** *
****
*
*
** ** ***
*
*
**
** ** **
**
*
*
**
*
*
***
*
*
**
*
*
**
**
* *** **
******
*
**
*
* *****
*
***
*** **
***
***
***
******* ****** *
****
**** ***
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*** *
*
*
** *** * *** *
*
*** **
*
* **** ***
** ** ** **
*****
**** **
** *
*
** * *
*
**
*
***
**
* ***
*
*
* **** ** *
*
**
**** ***
*
**
*
*
***
** **
** *** *
*
*****
*** **
** **
**
*
***
*
*** *
*
*** *
*
*** *** ******* **
**
**** *
*
* *
**
*
*
*
*
*
* ** **
*
*
*
** ***
**** ***** ** ***
PC40.016 *
****
***
*** **
*** * *
************
*
*
* ** *** **
*
******* *** ***
*
**
*** *
*
* ***
**** ****
** ***
***
*
* *** ** ****
*
**
**
*
** *
*
**
** ** *
*
*
***
** ****
**
*
*
*
* ***
*
*** ** ** **
*** *
*
*
*
*****
* *
*
*
** *
** *** ***
* *
*
* ***
*
*** *****
*****
* ***
*
*** **
****
**
**
** **
**
*** **
*****
**** **
**
***
** *** **
*
*
***
*** **
*
*
*
*******
***
* ***
*
*
* ******
**
***
* **
* ****
*
** ***
*
*
*
*
*
** ****** **** ** **
**
*
**
****
*
*
*
* ***
*
*** **** **
*
*
**
**
*
* ** ** *
*
*** **
** **** ** ****
*****
*
****
****
*
*
*** ** *
*
*
*
**
**** **
**
*
*
**
*
*
***
*
*
**
*
*
**
**
* **** *
***
* **
*
**
*
* *****
*
***
** * ***
**
***
***
***** ** ****** *
****** ** ***
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
****
*
*
***** * *** *
*
*****
*
** **** **
**** ** **
****
*
**
** *****
*
*** *
*
* *
*
***
**
****
*
*
********
*
**
***
****
*
**
*
*
* **
** **
** ****
*
*** **
*****
** ****
*
***
*
* ** *
*
*** *
*
*** *** *
** ********
** ** *
*
* *
**
*
*
*
*
*
* ** **
*
*
*
*** ****** *** ** ** ***
−100 0 100 300
* ****
**
*
**** *
**
***** *** *
***
**** *
*** ** *** *** ****
*
* *** *
* **
***** *
*
*
**
*
***
*
**
*****
*
*
* * ******** *
*
*
*
**
**
*
*** ***
***
**
*
* *
* ** ****
*
*
* **
*
*** * **
*
*
****
**
* **
*
**
*
** ** **
**
****
****
***
**
****** **
***** *
*
***
******
*** ** **** * ***
*
** **
*
*
* ***
***
**
**
** *
**
* ****
*** ****
**
*
**** **
* ** *
** **** *** *
*
***
***
* ** ***
*
*
**
*
**
**
**** **
****
** ** ***
*** * ***
****
**
*
** **
*** *
* ** ***
**
****
*** *
*
*
**
****
*
***
*
**
*
**
*** *
******
*
**
*** ****
*
******
*
* * *
*
***
**
***
*******
*** *
*
**
* *
*
**
*
****
**
* **
*
**
****** *
**
**
* ******
*
*
***
****
*
**
*** *
***
***************
*** **
***** **
*
*
**
*
***
***
** ** **********
** *****
*
*
******
* * *** ****
*
* **
*
* **
**
*****
**
**
**
**
****
*
*
***
** ** * *****
**
*
**
***
* ** *
**
**
**
*
***
****** *
**
* ***
******
*****
*** *
***
*
*****
*
*
*************** **
**
*** *
***
*
**
**
*****
**
* ****************
*** *
** ***
**
*
* **
*** *
***** *** *
***
*** **
**
* ** **
**** ****
*
* **
* *
* **
*******
*
**
*
***
*
**
****
*
*
*
* ** **
** *** **
*
*
**
**
*
** **
* *
** *
**
*
* *
* * * ** **
*
*
* **
*
** ** *
*
*
*
**
**
**
* **
*
**
*
** ** *
*
**
***
*** **
***
**
*** * *** *
**
** **
*
***
***
* **** **
***** ****
*
** **
*
*
* ***
**
**
*
***
**
**
* **
**
*** * *
**
**
*
* *** **
* ***
** ********
*
***
***
* *****
*
*
**
*
**
**
** *
***
***
** * *****
* ** * * **
***
***
*
** **
** **
** ***
**
** *
***
* * **
*
**** *
*
*
***
*
**
*
**
**
* ** * ****
*
**
**** ** *
*
******
*
***
*
**
**
**
******* **
* ***
*
**
* *
*
**
*
***
*
**
* **
*
**
* ****
* **
*
**
**** ****
*
**** *
**
*
**
****
***
**** **********
*
*** **
*** ***
**
*
***
* *****
*** ** ****
***
* *
***
** **
*
*
* **
* **
* *******
*
*
* **
*
*****
****
**
**
**
**
*
****
*
*
***
*** * ***** * **
*
****
***
***
**
***
*
**
*
***
*** *
* *
****
******
*****
* ** *
***
*
** ****
*
***** ***
** **
*** **
**
*** **
**
*
**
**
*****
*********** *
* ******
** **
−250 −100 0
* *** **
**
*******
***** ****
***
*** ****
* ** **
**** ****
*
* **
**
* ****** * **
*
**
*
***
*
**
*****
*
*
** ******
****
*
*
**
**
*
*** ***
** *
**
*
**
** *** **
*
*
* **
*
** ***
*
*
*
****
**
* ***
**
*
** ** **
**
****
* * **
**** *
*** *****
***** *
*
******** *
***** *********
** **
*
*
* ***
***
**
*****
**
* *** *
*** *** *
**
*
**** **** * *** *****
* ***
**
*
***
* *****
*
*
**
*
**
**
** ** **
** *
** *** **
*
**** ***
***
***
*
** ***
** ** ** *******
***** **
*
******
*
***
*
**
*
**
****
* *****
*
**
**** ** *
*
*** * **
*
* **
*
**
****
****** **
*
* ** *
*
****
*
**
*
***
*
**
***
*
**
* *** *
* ***
**
*******
*
*
*****
**
*
***
***** *
**************
*
*** **
***** ***
*
**
*
* **
** **** ** *
** ******
** **** *
*
*
* **
***
* *** **
***
*
***
*
****
*******
**
**
**
*
*** **
*
* **
** ** **** **
**
*
**
*****
****
****
*
**
*
***
*** *
**
****
*** ***
***
***** *
***
*
*****
*
*
********
****
*** **
**
**
* ****
*
**
**** **
*
**
**** ******* ******
****
* *** **
**
*******
*** *********
*** *********** ** ****
*
* ****
* **
***** *
*
*
**
*
***
*
**
*****
*
*
** **** ******
*
*
**
**
*
* ** ***
***
**
*
**
** *****
*
*
* **
*
******
*
*
******
****
**
*
** ****
**
***
****
*
**** *
******* *
*** ** *
*
***
***** *
****** **
*** * **
****
*
*
* ***
**
***
*****
**
* **
**
*** ****
**
*
*** ***
*** **** *** *
* ***
***
***
** ****
*
*
**
*
**
**
**** **
** **
* ** * ***
**** ***
******
*
*** *
***** ** ****
** *
***** **
*
**
** **
*
** *
*
**
*
**
***********
* *
** ** ***
*
**** **
*
* **
*
****
**
* *******
*
* ***
*
**
* *
*
**
*
***
*
**
* **
*
**
**** ** ***
**
* *******
*
***
* ***
*
**
****
***
**** **********
*
********** **
*
*
**
*
* **
** *
** * ** *** ******
** ** ***
*
*
******** ******
*
*
***
*
******
* ***
**
***
***
****
*
*
***
*** *** *****
*
*
**
* ****
* **
**
***
*
***
*******
**
****
**** **
*****
*** *
****
*****
*
*
***
**********
* ** *
**
****
** *
*
**
**
*****
**
** ***** ***** *****
*** *
−100 0 100
−100
0100
PC50.011
PCA SC het genes (2451), color by EGFP
PC10.172
−100 0 100 200
** *
*
***
**
** *
*
* **
* ****
****
**
**
*
*
*
****
* ***
*
*** * ****
** *
**
*
*
*
**
**
*
***
*
****
** *
*
** **
*
*
* *
*
** ** ***
*
*
*
*
*
*
* *
*
** *
*
*
*** *
*
*
*
*
*
*
*
**
* **
*
**
*
*
*
* * *
*
*
**
* *****
*
* *
*
*
*
*
*
* **
***
*
*
*
** *
*
* **
*
**
***
*
* * **
*
*** ** **
*
***
*
*** **
*
* ***
*
*
** *
**
*
**
***
*
*
****
*
* **
*
*
*
*
*
*
**
**
***
**** *
**
**
** **
***
*
*
*
*
**
***** **
*
*** *
*
*
***
*
*
**
*
***
*
**
*
** * **
*
**** *
*
*
*
*
*
*
*
* *
**
*** ***
***
**
*
*
*
***
*
*
*
*
*
* **
*
*
*
** ** * * *
*
*
*
**
**
*
*****
*
*
*** *
**
* * ****
* **
**
*
*
*
*
*
*
****
**
**
*
*
*
* *** *
*
*
*
**
*** * *
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
****
*
*
*
*
**
*
**
*
*****
* *
*
*
*
*
*
** ***
*
*
****
*
* *
**
*
*
***
**
*
**** *** ****** ** ****
*
*** **
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** **
*** *
*
*
***** ** ** *
*
** **
*
*
* *** *
**
*
*
*****
*
*
** * **
*
**
*
**
***
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*** **
*
* *
*
***
**
*
**
*
*
*
**
*
** *
*
** ***
*
*
*
**
**
*****
** ** **
*
**
*
*
**
* *
*
****
*
*** ** **** * ***
**** ** *
* *
**
*
*
**
**
*
*
*** **
*
*
*
******* ** *** ** *** *
* * **
*
*****
** *
*
***
* ******* *
**
**
*
*
*
* ***
* ***
*
******* *
** **
*
*
*
*
**
* *
*
***
*
****
***
*
** ***
*
**
*
****** **
*
*
*
*
*
**
*
***
*
*
*** *
*
*
*
*
*
*
*
**
* **
*
**
*
*
*
* * *
*
*
**
* *****
*
* *
*
*
*
*
*
***
****
*
*
** *
*
* **
*
**
* * *
*
* ***
*
*** ***
*
*
***
*
* ****
*
****
*
*
***
**
*
**
****
*
****
*
* ***
*
*
*
*
*
**
**
** ******* *
**
*** *
****
*
*
*
**
****** *
*
* ***
*
*
****
*
**
*
***
*
**
*
*****
*
** * **
*
*
*
*
*
*
*
**
*********
**
**
*
*
*
* **
*
*
*
*
*
***
*
*
*
** *** *
**
*
*
**
* *
*
* ** **
*
*
*** *
**
* *****
***
**
*
*
*
*
*
*
*** *
**
**
*
*
*
* ****
*
*
*
**
** ** *
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
****
*
*
*
*
**
*
**
*
*** ****
*
*
*
*
*
* ****
*
*
****
*
* *
**
*
*
***
**
*
******* ****** * ******
** ***
*
*
*
*
*
*
*
*
*
****
****
*
*
** *** * *** *
*
*** *
*
*
* **** ***
*
* ** **
*
*
*****
*
**
*
**
** *
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
** ***
*
**
*
** *
**
*
**
*
*
*
**
*
** *
*
** ***
*
*
*
**
**
*** **
** ****
*
**
*
*
**
* *
*
*** *
*
*** *** *******
*****
**
* *
**
*
*
**
**
*
*
* ** **
*
*
*
** ******* ***** ** ***
−50 50 150
* **
*
****
*
***
*
***
** *****
* *
**
**
*
*
*
********
*
****** **
*****
*
*
*
**
**
*
***
*
*******
*
****
*
*
**
*
*** *****
*
*
*
*
*
**
*
* **
*
*
****
*
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
*
*
***
*
*
****** **
*
**
*
*
*
*
*
***
** **
*
*
***
*
***
*
**
* **
*
****
*
**** **
*
*
* **
*
* ****
*
****
*
*
***
* *
*
**
***
*
*
****
*
****
*
*
*
*
*
****
***
*******
* *
********
*
*
*
**
****** *
*
****
*
*
****
*
**
*
***
*
**
*
***
* *
*
* ** **
*
*
*
*
*
*
*
**
***
** ******
***
*
*
***
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*** ** ***
*
*
**
**
*
** ****
*
*****
*
**** **
***
**
*
*
*
*
*
*
****
**
**
*
*
*
* ****
*
*
*
**
*****
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
****
*
*
*
*
**
*
**
*
*** ****
*
*
*
*
*
*****
*
*
* ***
*
**
**
*
*
***
**
*
* *** ********** *****
*
*****
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** *
*
** **
*
*
** ********
*
* ***
*
*
*******
*
*
******
*
**** *
*
**
*
***
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
* * *
**
*
**
*
*
*
* *
*
***
*
*****
*
*
*
**
**
**** *
**** **
*
**
*
*
**
**
*
****
*
* ************
* ** ****
**
* *
*
*
* *
**
*
*
**** *
*
*
*
***** ***** *********
−100
100
300
***
*
** **
*
** *
*
**** ******
* *
**
**
*
*
*
* ***** **
*
*** **** *
** *
**
*
*
*
*** *
*
* **
*
****
***
*
** **
*
*
**
*
**** ** **
*
*
*
*
*
**
*
** *
*
*
*** *
*
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
*
*
* **
*
*
**
* **** *
*
**
*
*
*
*
*
*******
*
*
** *
*
* **
*
**
** *
*
* ***
*
*** ****
*
***
*
** ***
*
***
*
*
*
* **
**
*
**
***
*
*
*** *
*
* **
*
*
*
*
*
*
**
**
***
** *** **
* *
*** *** **
*
*
*
**
****
* **
*
* ***
*
*
* ***
*
**
*
***
*
**
*
*****
*
** ***
*
*
*
*
*
*
*
**
**** ** **
** *
**
*
*
*
* **
*
*
*
*
*
* **
*
*
*
** ****
**
*
*
**
* *
*
* ** **
*
*
*** ***
* **** *
* **
**
*
*
*
*
*
*
****
**
**
*
*
*
** ** *
*
*
*
**
**** *
*
*
*
*
*
**
*
*
*
**
** **
*
*
*
*
**
*
**
*
*****
* *
*
*
*
*
*
* ****
*
*
* ***
*
* *
**
*
*
***
**
*
***** ** ****** * *****
*
** ***
*
*
*
*
*
*
*
*
*
** **
****
*
*
***** * *** *
*
****
*
*
********
*
*** ***
*
*** **
*
**
*
*****
*
*
*
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*****
*
**
*
** *
**
*
**
*
*
*
* *
*
** *
*
** ***
*
*
*
**
**
******
* ****
*
**
*
*
* *
* *
*
*** *
*
*** *** *** ****
*****
* *
* *
**
*
*
* *
**
*
*
* ** **
*
*
*
*** ****** *** ** ** ***
−100
0100
***
** **
***
**
****
****
*
**
**
* *
**
**
*
*
*
*
*
*
*
** ***
***
***
*
*
* *
*
****
*
** *
*
** *
**** ***
*
***
*
***
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
***
*
*
* ** *
*
*
* ***
**
****
**
*
*
***
*
*
**
*
*
*
* *
**
**
*
*
**
**
*
***
****
*
**
*** *
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
***
*
*
***
**
*
****
*
*** ***
***
**
**
*
**
*
*
**
* *
*
*
**
*
*
*
****
*
*
***
*
*
**
**
*
**
**
**
*
*
*
*** *
**
*
**
***
*
**
** *
**
**
***
*
*
*
*
*
*
* *
*
***
*
*
*
*
**
** **
*
**
**
* ***
*
**
**
* **
**
*
** **
**
*
*
*
*
* *
*
***
***
** **
**
*
***
*
*
*
****
**
*
******
**
* ***
*
*
**
* *****
*
*
*
* ***
**
**
*
*
* *****
** *
*
* **
*
*
**
*
* *
*
***
*
**
*
**
*
*
**
*****
**
*
* *
**
*****
** * ***
*
**
**
*
*
** *
**
*
*************
*
*
***
*
*
** *
** *
*
*
*
** * *
*
***
*
****
*******
***** *
*
*
*
**
*
**
***
*
*
*
*** ***
*
*
*
***
*
*
** ***
*
**
*
**
*
*
*
*
*
****
**
***
** **
*
****
*
*
**
*
****
* *
*
*
*
*
*
*
* *
****
***
***
*
*
*
* ***
***
**
*
*****
*
*
*
*
***
**
*****
*
************
*
***
*
* *
*
**
**
*
*
*
* **
**
*****
** **************** ****
PC20.063
**
**** *
***
**
****
* ***
*
**
**
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*****
***
** *
*
*
**
*
****
*
** *
*
** *
**** ***
*
** *
*
** *
*
*
*
*
*
*
** *
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
***
*
*
****
*
*
***
**
*
**
**
***
*
**
*
*
*
***
*
*
**
**
**
*
*
**
**
*
***
* ***
*
**
****
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
** *
*
*
***
***
****
*
******
***
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
**
*
*
*
* ***
*
*
***
*
*
**
* *
*
**
***
*
*
*
*
****
**
*
* *
***
*
**
***
**
**
****
*
*
*
*
*
**
*
** *
*
*
*
*
**
** **
*
**
**
****
*
**
**
* **
* *
*
** **
**
*
*
*
*
**
*
***
***
** **
* *
*
* **
*
*
*
****
**
*
* *****
**
*****
*
**
**** **
*
*
*
****
**
**
*
*
* **** *
* * *
*
* **
*
*
**
*
**
*
***
*
**
*
**
*
*
***
** **
**
*
**
**
* ****
******
*
**
**
*
*
***
**
*
****
****
*****
*
*
***
*
*
** *
** *
*
*
*
** **
*
* **
*
****
**** ***
***** *
*
*
*
**
*
* *
***
*
*
*
** ** **
*
*
*
***
*
*
* ****
*
**
*
**
*
*
*
*
*
*** *
**
* **
** **
*
*** *
*
*
* *
*
******
*
*
*
*
*
*
**
***
**
**
**
*
*
*
*
****
***
**
*
**
***
*
*
*
*
***
**
**** *
*
*****
* ******
*
***
*
**
*
****
*
*
*
***
**
****
** **** ***
***
* *****
*****
**
**** *
***
**
****
** **
*
**
**
**
**
**
*
*
*
*
*
*
*
*** **
***
* **
*
*
**
*
****
*
** *
*
***
*******
*
***
*
***
*
*
*
*
*
*
***
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
***
*
*
****
*
*
* ***
**
****
**
*
*
***
*
*
**
*
*
*
* *
**
**
*
*
* *
**
*
***
****
*
**
*** *
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
** *
*
*
** *
***
* ***
*
* * ** **
***
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
* *
*
*
*
****
*
*
***
*
*
**
**
*
**
**
**
*
*
*
*** *
**
*
**
***
*
**
***
**
**
***
*
*
*
*
*
*
* *
*
* **
*
*
*
*
**
** **
*
**
**
* ***
*
**
**
***
**
*
* * **
**
*
*
*
*
* *
*
***
***
* ***
**
*
** *
*
*
*
****
**
*
**** **
**
****
*
*
**
******
*
*
*
****
***
*
*
*
* *****
***
*
***
*
*
**
*
**
*
***
*
**
*
**
*
*
***** **
**
*
* *
**
******** ***
*
**
**
*
*
***
**
*
*************
*
*
***
*
*
***
** *
*
*
*
** **
*
***
*
****
**** ***
***** *
*
*
*
**
*
**
***
*
*
*
******
*
*
*
***
*
*
* ***
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
****
**
***
****
*
* ***
*
*
* *
*
******
*
*
*
*
*
*
* *
****
***
***
*
*
*
****
***
**
*
*****
*
*
*
*
***
**
*****
*
* ***********
*
***
*
**
*
**
**
*
*
*
***
**
***
**
* ** ********** *******
**
****
** *
***
**
***
*
* ***
*
**
**
**
**
***
*
*
*
*
*
*
*** **
* **
** *
*
*
**
*
* ***
*
***
*
** *
***
* **
*
*
** *
*
** *
*
*
*
*
*
*
** *
*
*
*
*
*
***
*
*
*
**
*
*
**
*
* **
*
*
****
*
*
* **
***
**
**
**
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*
**
**
**
*
*
**
**
*
***
****
*
**
**
**
*
**
*
*
*
**
**
*
**
***
***
*
*
***
**
*
* ** *
*
*** ** *
***
**
**
*
**
*
*
**
**
*
*
**
*
*
*
****
*
*
* **
*
*
**
* *
*
* *
**
**
*
*
*
****
**
*
* *
***
*
* *
***
**
**
***
*
*
*
*
*
*
**
*
** *
*
*
*
*
**
* ***
*
**
**
** **
*
* *
**
***
* *
*
* ****
*
*
*
*
*
**
*
***
**
*
** **
* *
*
* **
*
*
*
****
**
*
* **** *
**
*****
*
**
******
*
*
*
** **
**
**
*
*
******* **
*
***
*
*
**
*
**
*
* **
*
**
*
**
*
*
*******
* *
*
* *
**
* ****
* ** ***
*
**
* *
*
*
***
**
*
****
* ***
*****
*
*
***
*
*
** *
***
*
*
*
** **
*
***
*
**
**
** *********
**
*
*
*
**
*
**
***
*
*
*
**** **
*
*
*
** *
*
*
* ***
*
*
**
*
**
*
*
*
*
*
****
**
***
****
*
****
*
*
* *
*
***
***
*
*
*
*
*
*
* *
* **
**
**
**
*
*
*
*
****
***
**
*
***
***
*
*
*
** *
**
**** *
*
****** **
* ***
*
***
*
**
*
***
*
*
*
*
** *
**
****
*********
***
* *******
***
***
***
* *** **
*** ******** *
*
* ***
*
***
*
**
***
* *********
*
*
***
** ** *
**
*
***
**
***
*
**
*
*** * * ** *
*******
* * **
**
*
** *
***
* ***** *
**
***
** *
*** ***
*
* **** *
***
*****
***
*** *
**
**
*
* ***
**
***
**** *** *
** *
**** ****
**** *
*** *****
**** **
**** * *** *
*
*** *
*
**** *
* ***
*
* ** *****
* ** ******* ******
* *** **
**
***** * **
***
**
**
****
****
*****
*****
* *
*****
* **
**
*
***
** *
******
*
****
**
* *
**
*
*
*
*
*
*** * ** ****** ** ** ****
*
****
**
***
** *
*******
*** *** *
*
*
* ****
*
*
*
***
**
* **** ***
**
***** *
*
**
**
* *
*
* * *
*
***
*
**
*
**
*
**
**
****
** **
*
* *
*****
** * **
*
*
** ** **
** *
***
**************
*
***
* ******
*
**
* **
*
** *
**
*** ** *
*
********
*
*
*
*****
*
*****
*
** *** ***
* ** **** *
**
*
* *
***
**
*
**
* **
*
**
**
**
**
*
*
*
*
******
*
*
*
**
** **
** *
* ** ** * *
* **
*
*****
*
** * *
**
******
*****
**
*
*
***
**
*
**** **************
****
* **
** **
** ** **
* *
****
**
*
*****************
** *
****
**
** ** *
** * * ** ***
*** *
*
****
*
** *
*
**
***
***** * **
**
*
*
***
*****
**
*
****
****
*
* *
*
*** * **
* *
*** ** *
** **
*
**
*
** *
** *
** ***
**
**
***
** *
**
***
*
*
* *** ****
**
****
****
* ***
** *
*
* ***
**
***
**** *
** **
**
* * *** ***** *
***** **
***
*** ***
**** ******
****
*
*****
* **
*
*
* * ** ***
** *
***** ***** **
*** *** *
**
*
****** *** *
*
**
**
****
****
**** *
** ** *
**
****
*
***
**
*
** *
** *
* *****
*
*** *
**
* *
**
*
*
*
*
*
* ** *** *
*** *
* ****** **
*
****
**
***
***** * ****
* ***** *
*
*
******
*
*
* **
*** *
** **
**
**
*** ***
*
**
* *
* *
*
***
*
***
*
**
*
**
*
**
**
****
* ** *
*
**
** ***
******
*
** *** ****
***
**** *******
***
*
***
* **** **
*
**
***
*
* **
**
****
***
*****
** *
*
*
*
** ***
*
* **
* *
*
***
*****
*** * * *****
*
* *
***
**
*
**
***
*
**
***
**
**
*
*
*
***** *
*
*
*
*****
** **
**** ***
***
*
****
*
*
* ***
**
******
**
* **
**
*
*
***
**
*
**** ***
******* * **
*
****
* * *
** **
** ****
**
*** *
**
*
***
***** ***** ****
* ** PC30.026
**
****
* ****
** ** *
********
*
****
*
** *
*
******* ********
*
*
***
** ** *
**
*
***
**
***
*
**
*
***** ***
**** ***** **
**
*
** *
***
****** *
**
** **
***** ***
*
* *****
* ****** ****
*** *
**
**
*
****
**
***
********
** *
***** **** **
*** ******
**
* ***** *
**** * ***
*** *
*
**** *****
*
***** ***
*** ******* * *******
* ***
**
** *** ** *
* **
**
**
*** *****
*** **
** **** *
*****
***
* *
*
********
****
*
*****
** *
**
*
*
*
*
*
****** *** ****** *** **
*
** **
**
***
**** **** **
** *****
*
*
* *****
*
*
***
**
* **** *
* *
**
*******
**
**
**
*
***
*
***
*
**
*
**
*
*****
***
** **
*
* *
*****
*** ***
*
***
** ****
***
* *** *********
*
*
***
*******
*
**
***
*
* * *
**
*** *
***
** ******
*
*
*
* ****
*
*****
*
** ******
* *********
*
**
***
**
*
**
***
*
**
***
***
*
*
*
*
** ****
*
*
*
**
* * **** *
*** ** * *
***
*
*****
*
** **
**
*****
*
*** **
**
*
*
***
**
*
**** ** ************
* ** ****
*** *
*** **** *
****
**
*
****** ***** ******** *
−250
−100
0****
**
* ****** ***
* *******
*
****
*
****
**** *** *** ***
* *
*
*
***
* * ***
**
*
* ***
****
*
**
*
**
** ****
** *** **
** **
**
*
** *
** *
*******
**
** *
****** **
*
*
* ********
******
**** **
**
**
*
*** *
**
***
*****
****
**
* ***** **
**********
* ******* ** *
* ***** **
*** *
*
*** **
* **
*
*
*** * ****
* **** *
** *** * *** ***
** ***
*
****** *****
**
**
* ******
** **
**
*** ****
**
***
* ****
*
** *
***
** ** **
*
* ** *
****
***
*
*
*
*
* ** ****
****
* ** ** ****
*
* ***
**
***
***
* * **** *
* ******
*
*
* *****
*
*
***
**
***
* ****
**
******
*
**
* *
* *
*
* **
*
* **
*
* *
*
**
*
**
*****
*
* ** *
*
* *
****
*
*** **
*
*
*** ** *
***
***
***** ******
***
*
***
****
***
*
**
* **
*
** *
**
*******
********
*
*
*
*****
*
***
**
*
***
****
*
* **** ***
**
*
**
****
*
*
**
* **
*
**
**
***
**
*
*
*
******
*
*
*
**
** *** **
* *** * **
***
*
****
*
*
* ***
**
*****
*
*****
**
*
*
** *
**
*
***** **
******* ***
*
****
** *
** **
*** ** ***
*** *
**
*
**** ********* ***
****
−50
50150
***
** **
**
* ***
*****
** ***
*** *** *
*
*
*** ** ***
*
*********** **
*
**
**
**
*
****
**** ***
**** *
*
** *
*
******* *
***
**
**
*
***
*
**
*****
*
*
**
*
* *****
**
*
*
*
*** *
*
***** ***
** *
**
*
*
*
***
* ***
*
*
***
**** *** *
* *
*
****
*
******
* *
***
**
***
*
*
** ***
*** *
**
**
** **
* *
* ****
*** *
** **
***
**
****
******
*
*
***** **
*
*
*
*
** **** *
**
*
****
*
*
** *****
**
***
* **
*****
*
*****
*
*
*
*
*
* **** * ****** *** ***
*
****
**
*
*
*
****
*
* ***** * **
*
*
**
**
*
***** *
*
**** * ******* *
****
**
***
*
****
****
*
*
** ** **
*
*
*
**
******
**
*
*
**
*
*
** *
*
*
**
*
*
**
**
* *****
***
***
*
**
*
******
*
***
**** *
**
*
** *
***
******************
* *** ***
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
****
*
*
**********
*
**** *
*
*** ** ** **** *** **
* ***
*
**
* ** **
**
*
*** *
*
**
*
***
**
****
*
*
* * ***** *
*
**
**** * **
*
**
*
*
* **
* ***
***** *
*
** ***
*****
******
*
***
*
****
*
****
*
************* **
**
* ****
*
**
* *
*
*
*
*
*
*****
*
*
*
*************** *** * *
*****
**** * *
*
* *** *
** ****
******
*
*
*** ** ***
*
**** ****** * **
*
**
**
**
*
****
**** ** *
*** * *
*
** *
*
** ***** *
* **
**
* *
*
** *
*
**
** ***
*
*
***
* ** *****
*
*
*
* * **
*
*** ** ***
** ** *
*
*
*
* **
* ***
*
*
** *
** ** *** *
**
*
* * **
*
*** ** ***
***
**
***
*
*
* ****
*** *
**
**
** ****
* *****
** **
* * ** *
**
**
****** ***
*
*
** *
** ***
*
*
*
** *****
**
*
*** *
*
*
** ******
***
** *
*** * *
*
*
****
*
*
*
*
*
*
** * ** * *** *** *** ***
*
*** *
**
*
*
*
* ***
*
* ** ** * * **
*
*
**
**
*
***** *
*
*** **
** * **** *
****
**
** *
*
****
* ** *
*
*
** ** * **
*
*
**
*** * **
**
*
*
**
*
*
***
*
*
**
*
*
**
**
* *** **
***
* **
*
**
*
** *****
***
* ** * *
**
*
***
***
**** *** ****** *
****
* **** **
*
*
*
*
***
*
*
***
*
*** *
*
*
***** ** ** *
*
** ***
*
* *** * ***
* ***** **
* * **
*
**** * *
***
*
** **
*
* *
*
***
**
****
*
*
* ***** * *
*
**
**
****
*
*
**
*
*
***
** **
** *** *
*
*****
*****
** ****
*
***
*
*** *
*
****
*
*** ** **
** * ******
** * ** *
*
* *
* *
*
*
*
*
*
*** ***
*
*
*****
** ** *** ** *** ***
**
* *****
** **
**** *** ****
*******
*
* ** ** ***
*
******* *
** ***
*
**
**
* *
*
****
**** ****
** * **
***
*
********* *
*
**
**
*
***
*
**
** ***
*
*
**
*
*** ***
**
*
*
*
* * **
*
*** ** ***
** *
**
*
*
*
***
* ***
*
*
** *
** ******
* *
*
* ***
*
*** ***
* *
*****
****
*
*****
****
**
**
** **
* *
* ****
****
*******
**
** ******* **
*
***** **
*
*
*
*
** *****
***
* ***
*
*
** *****
****
** ***** **
*
** **
*
*
*
*
*
*
* ***** ***
*** *** *
**
*
**
***
*
*
*
*
*****
*** *** ***
*
*
**
**
*
* ** ** *
*
*** **** ***** *****
**
** *
*
*** *
****
*
*
** ** ***
*
*
**
** ** **
**
*
*
**
*
*
***
*
*
**
*
*
**
**
* *** **
******
*
**
*
* *****
*
***
*** **
***
***
***
******* ****** *
****
**** ***
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
*** *
*
*
** *** * *** *
*
*** **
*
* **** ***
** ** ** **
*****
**** **
** *
*
** * *
*
**
*
***
**
* ***
*
*
* **** ** *
*
**
**** ***
*
**
*
*
***
** **
** *** *
*
*****
*** **
** **
**
*
***
*
*** *
*
*** *
*
*** *** ******* **
**
**** *
*
* *
**
*
*
*
*
*
* ** **
*
*
*
** ***
**** ***** ** ***
PC40.016 *
****
***
*** **
*** * *
************
*
*
* ** *** **
*
******* *** ***
*
**
*** *
*
* ***
**** ****
** ***
***
*
* *** ** ****
*
**
**
*
** *
*
**
** ** *
*
*
***
** ****
**
*
*
*
* ***
*
*** ** ** **
*** *
*
*
*
*****
* *
*
*
** *
** *** ***
* *
*
* ***
*
*** *****
*****
* ***
*
*** **
****
**
**
** **
**
*** **
*****
**** **
**
***
** *** **
*
*
***
*** **
*
*
*
*******
***
* ***
*
*
* ******
**
***
* **
* ****
*
** ***
*
*
*
*
*
** ****** **** ** **
**
*
**
****
*
*
*
* ***
*
*** **** **
*
*
**
**
*
* ** ** *
*
*** **
** **** ** ****
*****
*
****
****
*
*
*** ** *
*
*
*
**
**** **
**
*
*
**
*
*
***
*
*
**
*
*
**
**
* **** *
***
* **
*
**
*
* *****
*
***
** * ***
**
***
***
***** ** ****** *
****** ** ***
*
*
*
*
**
*
*
*
**
*
*
****
*
*
***** * *** *
*
*****
*
** **** **
**** ** **
****
*
**
** *****
*
*** *
*
* *
*
***
**
****
*
*
********
*
**
***
****
*
**
*
*
* **
** **
** ****
*
*** **
*****
** ****
*
***
*
* ** *
*
*** *
*
*** *** *
** ********
** ** *
*
* *
**
*
*
*
*
*
* ** **
*
*
*
*** ****** *** ** ** ***
−100 0 100 300
* ****
**
*
**** *
**
***** *** *
***
**** *
*** ** *** *** ****
*
* *** *
* **
***** *
*
*
**
*
***
*
**
*****
*
*
* * ******** *
*
*
*
**
**
*
*** ***
***
**
*
* *
* ** ****
*
*
* **
*
*** * **
*
*
****
**
* **
*
**
*
** ** **
**
****
****
***
**
****** **
***** *
*
***
******
*** ** **** * ***
*
** **
*
*
* ***
***
**
**
** *
**
* ****
*** ****
**
*
**** **
* ** *
** **** *** *
*
***
***
* ** ***
*
*
**
*
**
**
**** **
****
** ** ***
*** * ***
****
**
*
** **
*** *
* ** ***
**
****
*** *
*
*
**
****
*
***
*
**
*
**
*** *
******
*
**
*** ****
*
******
*
* * *
*
***
**
***
*******
*** *
*
**
* *
*
**
*
****
**
* **
*
**
****** *
**
**
* ******
*
*
***
****
*
**
*** *
***
***************
*** **
***** **
*
*
**
*
***
***
** ** **********
** *****
*
*
******
* * *** ****
*
* **
*
* **
**
*****
**
**
**
**
****
*
*
***
** ** * *****
**
*
**
***
* ** *
**
**
**
*
***
****** *
**
* ***
******
*****
*** *
***
*
*****
*
*
*************** **
**
*** *
***
*
**
**
*****
**
* ****************
*** *
** ***
**
*
* **
*** *
***** *** *
***
*** **
**
* ** **
**** ****
*
* **
* *
* **
*******
*
**
*
***
*
**
****
*
*
*
* ** **
** *** **
*
*
**
**
*
** **
* *
** *
**
*
* *
* * * ** **
*
*
* **
*
** ** *
*
*
*
**
**
**
* **
*
**
*
** ** *
*
**
***
*** **
***
**
*** * *** *
**
** **
*
***
***
* **** **
***** ****
*
** **
*
*
* ***
**
**
*
***
**
**
* **
**
*** * *
**
**
*
* *** **
* ***
** ********
*
***
***
* *****
*
*
**
*
**
**
** *
***
***
** * *****
* ** * * **
***
***
*
** **
** **
** ***
**
** *
***
* * **
*
**** *
*
*
***
*
**
*
**
**
* ** * ****
*
**
**** ** *
*
******
*
***
*
**
**
**
******* **
* ***
*
**
* *
*
**
*
***
*
**
* **
*
**
* ****
* **
*
**
**** ****
*
**** *
**
*
**
****
***
**** **********
*
*** **
*** ***
**
*
***
* *****
*** ** ****
***
* *
***
** **
*
*
* **
* **
* *******
*
*
* **
*
*****
****
**
**
**
**
*
****
*
*
***
*** * ***** * **
*
****
***
***
**
***
*
**
*
***
*** *
* *
****
******
*****
* ** *
***
*
** ****
*
***** ***
** **
*** **
**
*** **
**
*
**
**
*****
*********** *
* ******
** **
−250 −100 0
* *** **
**
*******
***** ****
***
*** ****
* ** **
**** ****
*
* **
**
* ****** * **
*
**
*
***
*
**
*****
*
*
** ******
****
*
*
**
**
*
*** ***
** *
**
*
**
** *** **
*
*
* **
*
** ***
*
*
*
****
**
* ***
**
*
** ** **
**
****
* * **
**** *
*** *****
***** *
*
******** *
***** *********
** **
*
*
* ***
***
**
*****
**
* *** *
*** *** *
**
*
**** **** * *** *****
* ***
**
*
***
* *****
*
*
**
*
**
**
** ** **
** *
** *** **
*
**** ***
***
***
*
** ***
** ** ** *******
***** **
*
******
*
***
*
**
*
**
****
* *****
*
**
**** ** *
*
*** * **
*
* **
*
**
****
****** **
*
* ** *
*
****
*
**
*
***
*
**
***
*
**
* *** *
* ***
**
*******
*
*
*****
**
*
***
***** *
**************
*
*** **
***** ***
*
**
*
* **
** **** ** *
** ******
** **** *
*
*
* **
***
* *** **
***
*
***
*
****
*******
**
**
**
*
*** **
*
* **
** ** **** **
**
*
**
*****
****
****
*
**
*
***
*** *
**
****
*** ***
***
***** *
***
*
*****
*
*
********
****
*** **
**
**
* ****
*
**
**** **
*
**
**** ******* ******
****
* *** **
**
*******
*** *********
*** *********** ** ****
*
* ****
* **
***** *
*
*
**
*
***
*
**
*****
*
*
** **** ******
*
*
**
**
*
* ** ***
***
**
*
**
** *****
*
*
* **
*
******
*
*
******
****
**
*
** ****
**
***
****
*
**** *
******* *
*** ** *
*
***
***** *
****** **
*** * **
****
*
*
* ***
**
***
*****
**
* **
**
*** ****
**
*
*** ***
*** **** *** *
* ***
***
***
** ****
*
*
**
*
**
**
**** **
** **
* ** * ***
**** ***
******
*
*** *
***** ** ****
** *
***** **
*
**
** **
*
** *
*
**
*
**
***********
* *
** ** ***
*
**** **
*
* **
*
****
**
* *******
*
* ***
*
**
* *
*
**
*
***
*
**
* **
*
**
**** ** ***
**
* *******
*
***
* ***
*
**
****
***
**** **********
*
********** **
*
*
**
*
* **
** *
** * ** *** ******
** ** ***
*
*
******** ******
*
*
***
*
******
* ***
**
***
***
****
*
*
***
*** *** *****
*
*
**
* ****
* **
**
***
*
***
*******
**
****
**** **
*****
*** *
****
*****
*
*
***
**********
* ** *
**
****
** *
*
**
**
*****
**
** ***** ***** *****
*** *
−100 0 100−100
0100
PC50.011
PCA SC het genes (2451), color by Olig1
Pitx3EGFPOlig1
Conclusions
• Trytoplanyourexperimentinawaysothatthebiologicalsignalyouarelookingforisnotconfoundedbytechnicalartifacts.
• Thinkaboutwhatdistributionofcellsyouareexpectinginyourdatasetwhenlookingattheqc-measures.Whenyouhavehomogeneouscells–deviantcellswillbefailedlibrary.Otherwisebecarefulwhatyouremove.
• Distinguishingduplicatecellsisveryhard,sometimesitwilltakesomeclustering
AlwaysgobacktoQC-statsafterdoingclustering/lineageanalysisetc.
-Youmayhaveclustersoflowqualitycells/doublets!
