PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEASE...

PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEASE DARI MIKROORGANISME

PERAIRAN RAWA INDRALAYA SUMATERA SELATAN1

(Purification and Characterization a Protease from Microorganism Isolated from

Indralaya Swamp South Sumatera)

Oleh:

Ace Baehaki2), Rinto2)

ABSTRAK

Tujuan penelitan ini adalah untuk melakukan purifikasi dan karakterisasi protease dari

bakteri perairan rawa Indralaya. Isolat A6S3 dipilih karena memiliki aktivitas protease

tertinggi. Hasil purifikasi dengan kolom gel sephadex G-100 menunjukkan peningkatan

derajat kemurnian enzim protease bakteri isolat A6S3. Untuk fraksi 5 terjadi peningkatan

kemurnian menjadi 3,3 kali, untuk fraksi 10 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,8,

sedangkan fraksi 46 derajat kemurniannya 3,5. Protease ini mempunyai pH optimum 8

dan suhu optimum sekitar 50 oC, Inhibitor ion logam yang kuat terhadap protease dari

bakteri A6S3 adalah Fe2+ (1 mM), K+ dan Zn2+ dan dapat dihambat oleh EDTA. Analisis

SDS-PAGE dan zimogram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat

A6S3 memiliki 2 pita dengan berat molekul 106 kD dan 121 kD.

Kata Kunci: Purifikasi, Karakterisasi, Protease, Rawa Indralaya

1) Makalah pada Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II, Jakarta 9 Agustus 20102)Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Pertanian Universitas Sriwijaya Jl. Palembang-Prabumulih Km32 Indaralaya Ogan Ilir Sumatera Selatan, E-mail: [email protected]

Seminar Nasional Pengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan II, Jakarta 9 Agustus 2010

1

ABSTRACT

The purpose of the research was to study the purification and characterization of

extracellular protease produced from microorganism isolated from Indralaya Swamp

South Sumatera. The A6S3 isolate was selected due to its high protease activity The was

purified in sephadex G-100 gel permeation chromatography showed that increased degree

of purified this enzyme. The fraction 5, 10 and 46 were purified 3,3; 3,8 and 3,5 fold,

respectively. The optimum pH and temperature of proteases from A6S3 were 8 and

500C, respectively. Effect of metal ions, Fe2+, K+ and Zn2+ showed strong inhibited

protease A6S3. Effect of specific inhibitor (EDTA) showed EDTA inhibited protease

A6S3. Moleculer weights were determinited by using SDS-PAGE and zymogram

technique. Moleculer weight protease isolate A6S3 was 106 kD and 120 kD.

Keywords: Purification, Characterization, Protease, Indralaya Swamp

PENDAHULUAN

Protease adalah enzim yang mengkatalisasi pemecahan ikatan peptida dalam

peptida, polipeptida dan protein dengan menggunakan reaksi hidrolisis menjadi molekul

yang lebih sederhana seperti peptida rantai pendek dan asam amino (Naiola dan

Widyastuti 2002). Protease merupakan kelompok enzim-enzim yang kompleks yang

menduduki posisi sentral dalam aplikasinya pada bidang fisiologis dan produk-produk

komersial. Protease ekstraseluler sebagian besar berperan dalam hidrolisis substrat

polipetida besar. Enzim proteolitik intraseluler memainkan peran penting dalam


2

metabolisme dan proses regulasi pada sel hewan, tumbuhan dan mikroorganisme, seperti

mengganti protein, memelihara kesetimbangan antara degradasi dan sintesis protein.

Protease intraseluler juga berperan dalam fungsi fisiologis lainnya seperti pencernaan,

maturasi hormon, perakitan virus, respon imun, inflamasi, fertilisasi, koagulasi darah,

fibrinolisis, kontrol tekanan darah, sporulasi, germinasi dan patogenesis (Rao et al 1989).

Protease juga diimplikasikan dalam peran regulasi ekspresi gen, perbaikan DNA dan

sintesis DNA (Kalisz 1988).

Protease merupakan enzim penting yang digunakan secara luas pada aplikasi

industri melalui reaksi sintesis dan reaksi is, yang hampir mencapai 65% dari total

penjualan enazim di dunia (Huang 2006). Protease digunakan pada beberapa aplikasi

industri seperti detergen, farmasi, produk-produk kulit, pengempukan daging, hidrolisat

protein, produk-produk makanan dan proses pengolahan limbah industri.

Salah satu sumber enzim protease adalah dari mikroba. Pemilihan mikroba

sebagai sumber enzim mempunyai keuntungan bila dibandingkan dengan yang diisolasi

dari tanaman ataupun hewan. Antara lain adalah sel mikroba relatif lebih mudah

ditumbuhkan, kecepatan pertumbuhan relatif lebih cepat, skala produksi sel lebih mudah

ditingkatkan bila dikhendaki produksi yang lebih besar, biaya produksinya relatif rendah,

kondisi selama produksi tidak tergantung oleh adanya pergantian musim dan waktu yang

dibutuhkan dalam proses produksi lebih pendek (Meyrath dan Volvasek 1975 dalam

Pakpahan 2009). Penelitian mikroba sebagai sumber alami penghasil enzim ini sudah

banyak dilakukan akan tetapi penelitian mikroba dengan habitat tertentu seperti dari rawa

masih sedikit. Sehingga penelitian enzim protease dari mikroba rawa penting untuk

dilakukan sebagai alternatif baru sebagai sumber penghasil enzim mengingat daerah

Sumatera Selatan termasuk daerah Indralaya memiliki daerah rawa yang sangat luas yang


3

tentunya terdapat mikroba yang memiliki keanekaragaman yang tinggi sebagai penghasil

protease ini.

METODE PENELITIAN

Metode penelitian yang dilakukan terdiri dari beberapa tahap meliputi : produksi

protease ekstrak kasar, purifikasi dengan kromatografi filtrasi gel dan karakterisasi

terhadap protease ekstrak kasar.

Produksi Protease Ekstrak Kasar

Mikroba diinokulasi sebanyak 1-2 lup pada media Luria Broth (LB) dengan

komposisi tripton 1%, NaCl 1% dan yeast extract 0,5%. Proses diawali dengan

penentuan umur prekultur (dalam media LB) yang tepat untuk keperluan produksi enzim.

Pengamatan dilakukan dengan mengukur optical density (OD) sampai nilai OD = 0,8

pada λ = 620 nm. Media LB yang sudah mempunyai OD = 0,8 diambil 10% kemudian

ditambahkan pada media LB yang baru sebagai media untuk memproduksi protease.

Pada media LB ini diukur nilai OD, aktivitas protease dan kadar protein setiap 8 jam

selama 56 jam. Untuk memisahkan sel dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000

rpm selama 15 menit pada suhu 4 0C.

Pengukuran Aktivitas Protease dan Kadar Protein

Aktivitas protease diukur dengan metode Bergmeyer (1983) dengan

menggunakan substrat kasein Hammerstein 2% (b/v). Satu unit aktivitas protease

didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu μmol produk tirosin

per menit pada kondisi pengukuran. Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford

(1976) menggunakan Bovine Serum Albumin Fraction V sebagai standar protein.


4

Purifikasi Protease

Purifikasi dilakukan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel menggunakan

Sephadex G-100. Sebelum dilakukan pemurnian terlebih dahulu dilakukan pengendapan

dengan amonium sulfat teknis dengan konsentrasi amonium sulfat 20-90% yang

dilanjutkan dengan dialisis menggunakan kantong dialisis cut-off 10 kD (Sigma).

Sebanyak 0,75 gram Sephadex G-100 (Sigma) dibasahkan dengan 75 ml air bebas

ion kemudian dipanaskan 900C sambil diaduk perlahan selama 90 menit dan dibiarkan

sampai dingin, kemudian simpan dalam ruangan 40C semalam. Larutan didekantasi lalu

supernatan diganti dengan buffer Tris-HCl 0,1 M pH 8 sambil diaduk perlahan. Larutan

protease sebanyak 1 ml dimasukan dengan pipet secara perlahan ke dalam kolom tepat di

atas permukaan gel. Kolom diisi dengan pengelusi yaitu buffer Tris-HCl 10 mM pH 8.

Diambil setiap fraksi masing-masing 70 (2 ml) tetes ditampung dalam fraction collector

(Redifrac, Pharmacia-Biotech).

Karakterisasi protease

Uji karakterisasi protease yang meliputi pengaruh pH (6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9)

menggunakan buffer Tris-HCl, suhu (30 0C, 40 0C, 50 0C, 60 0C, 70 0C), ion logam (K+,

Mn2+, Zn2+ dan Fe2+) dan inhibitor spesifik (EDTA). Konsentrasi ion logam dan inhibitor

spesifik yang digunakan masing-masing adalah 1 mM dan 5 mM.

SDS PAGE dan Zimogram

Penentuan berat molekul dilakukan menggunakan SDS PAGE (Laemmli 1970).

Sedangkan zimogram menggunakan modifikasi metode Choi et al, (2001). Gel akrilamid

8% dikopolimerisasi dengan substrat kasein 2%. Setelah gel dilakukan elektroforesis, gel


5

direndam dengan Triton X-100 2,5% selama 1 jam dan dilakukan inkubasi dalam buffer

Tris-Cl 10 mM, pH 8 selama 24 jam. Pewarnaan dengan silver staining yaitu : gel

direndam dalam larutan fikasasi (25% metanol dan 12% asam asetat) selama 1 jam

kemudian direndam dalam 50% etanol selama 20 menit, kemudian diganti dengan 30%

etanol selama 2 x 20 menit, larutannya diganti dengan enhancer kemudian dicuci dengan

akuadestilata, setelah dicuci ditambahkan larutan silver nitrat selama 30 menit kemudian

dicuci lagi dengan akuadestilata 2 x 20 detik dan ditambahkan larutan campuran Na2CO3

dan formaldehida dan terakhir dengan larutan fiksasi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Produksi protease ekstrak kasar

Isolat yang digunakan untuk produksi protease ekstrak kasar dan selanjutnya

dilakukan pemurnian adalah isolat dari A6S3. Pemilihan isolat ini berdasarkan hasil

penelitian sebelumnya yaitu memiliki aktivitas protease tertinggi dibandingkan dengan

isolat lainnya.

Produksi protease dilakukan dengan cara bakteri isolat A6S3 diinokulasi sebanyak

1-2 lup pada media Luria Bertani Broth (LB) dengan komposisi tripton 1%, NaCl 1%,

yeast extract 0,5% dan skim milk Proses diawali dengan penentuan umur prekultur

(dalam media LB) yang tepat untuk keperluan produksi enzim. Pengamatan dilakukan

dengan mengukur optical density (OD) sampai nilai OD = 0,8 pada λ = 620 nm. Media

LB yang sudah mempunyai OD = 0,8 diambil 10% kemudian ditambahkan pada media

LB yang baru sebagai media untuk memproduksi protease. Media yang baru sebanyak 3

liter selanjutnya diinkubasi selama 48 jam (waktu optimum produksi protease isolat

A6S3). Untuk memisahkan sel dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama

15 menit pada suhu 4 0C. Dengan teknik ini, sel akan mengendap oleh adanya gaya


6

gravitasi sedangkan enzim tetap terdapat pada supernatan. Sentrifugasi dilakukan pada

suhu rendah untuk mencegah terjadinya kerusakan struktur enzim, selanjutnya dilakukan

pengujian aktivitas protease.

Pengendapan dengan ammonium sulfat dan dialisis

Pengendapan protease dilakukan bertujuan untuk mengendapkan protein protease.

Pengendapan dilakukan dengan menggunakan ammonium sulfat dengan beberapa

perlakuan yaitu 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% dan 90%. Penambahan

ammonium sulfat dilakukan secara perlahan-lahan sambil larutan enzim distirer pada

kondisi suhu 4 0C. Selanjutnya didiamkan semalam dan dilakukan sentrifugasi. Endapan

dan filtrat masing-masing perlakuan diuji aktivitasnya. Aktivitas tertinggi pada endapan

dan aktivitas terendah pada filtrat yang selanjutnya dipilih. Hasil pengendapan dapat

dilihat pada Gambar 1.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

20 30 40 50 60 70 80 90% pengendapan

Aktiv

itas

prot

ease

(U/m

l)

Endapan Filtrat

Gambar 1. Pengendapan dengan ammonium sulfat

Figure 1. Ammonium sulfate precipitation

Hasil pengendapan dengan ammonium sulfat menunjukkan aktivitas protease

tertinggi pada endapan adalah dengan pengendapan ammonium sulfat 70%. Sedangkan


7

aktivitas terendah pada filtrat adalah 60%, akan tetapi pada filtrat 70% memiliki aktivitas

yang rendah sehingga pengendapan selanjutnya adalah dengan ammonium sulfat 70%.

Hasil pengendapan ammonium sulfat 70% selanjutnya dilakukan dialisis dengan

menggunakan kantong dialisis untuk menghilangkan garam-garam ammonium sulfat.

Purifikasi dengan kromatografi kolom Sephadex G-100

Purifikasi atau pemurnian protease isolat A6S3 dengan kromatografi filtrasi gel

menggunakan Sephadex G-100 sebagai matriks, dan bufer Tris-HCl 0,05 M, pH 8

sebagai pengelusinya. Sebelum dilakukan pemurnian dengan kromatografi gel, terlebih

dahulu dilakukan pengendapan amonium sulfat 70% yang dilanjutkan dengan dialisis.

Setiap fraksi yang keluar dari kolom diukur aktivitas protease dan kadar protein, hasil

tertera pada Gambar 2. Hasil kromatografi menunjukkan terdapat 3 (tiga) puncak fraksi

yang memiliki aktivitas tertinggi yaitu fraksi 6, 10 dan 46.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 50 100 150 200

Nomor Fraksi

Abs

orba

nsi 2

80 n

m d

an

Akt

ivita

s Pr

otea

se(U

nit/m

l)

Protein Aktivitas Protease

Gambar 2. Kromatogram protease isolat A6S3 dengan Sephadex G-100


8

Figure 2. Kromatogram of isolate A6S3 protease with Sephadex-G-100

Hasil purifikasi protease bakteri isolat A6S3 dilakukan dengan kolom Sephadex

G-100 tertera pada Tabel 1. Dibandingkan dengan crude protease hasil ekstraksi dengan

ammonium sulfat terjadi peningkatan derajat kemurnian enzim dengan kromatografi

kolom ini. Untuk fraksi 5 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,3 kali, untuk fraksi

10 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,8, sedangkan fraksi 46 derajat kemurniannya

3,5.

Tabel 1. Tahapan purifikasi protease isolat A6S3

Table 1. Purification steps of isolate A6S3 protease

Tahapan pemurnian

Aktivitas Protease (IU/ml)

Kadar protein (mg)

Volume (ml)

Total aktivitas

(IU)

Total protein (mg)

Aktivitas spesifik (IU/mg)

Derajat kemurnian

relatif

Pengendapan (NH4)2SO4

0,0261 0,14 1600 41,76 224 0,186 1

Sephadex G-100

Fraksi 5 0,0169 0,0273 3 0,0507 0,0819 0,619 3,3Fraksi 10 0,022 0,0306 3 0,066 0,0918 0,719 3,8Fraksi 46 0,0086 0,013 3 0,0258 0,039 0,662 3,5

Protease yang telah dimurnikan dengan filtrasi gel menggunakan Sephadex G-100

mempunyai aktivitas spesifik dan tingkat kemurnian yang lebih tinggi dari tahap

sebelumnya. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa Sephadex G-100 dapat

digunakan untuk memisahkan protein yang dikhendaki yaitu enzim dari senyawa-

senyawa lain sebagai pengotor. Ekstrak kasar protein tercampur dengan asam nukleat,

karbohidrat dan garam organik. Logam berat dan asam nukleat biasanya mengganggu


9

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

6.5 7 7.5 8 8.5 9

pH

Akt

ivita

s Pr

otea

se

kerja enzim, sehingga dapat menghilangkan kontaminan tersebut terjadi peningkatan

aktivitas enzim (Haris dan Angal 1989).

Karakterisasi Protease ekstrak kasar

Pengaruh pH

Perubahan pH pada skala deviasi kecil dapat menyebabkan turunnya aktivitas

enzim karena dengan perubahan ionisasi gugus-gugus fungsionilnya. Gugus ionik

berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk mengikat dan

mengubah substrat menjadi produk. Pada perubahan skala deviasi besar, perubahan pH

akan mengakibatkan enzim mengalami denaturasi karena adanya gangguan terhadap

berbagai interaksi nonkovalen yang menjaga kestabilan struktur tiga dimensi enzim

(Hames dan Hopper 2000)

Gambar 3. Pengaruh pH pada protease isolate A6S3

Figure 3. Effect of pH on isolate A6S3 protease

pH sangat berpengaruh terhadap aktivitas protease bakteri A6S3 (Gambar 3). pH

optimum aktivitas protease berkisar 8. Protease bakteri Pseudomonas aeruginosa


10

memiliki pH yang sama dengan isolat A6S3 yaitu pada pH 8 (Baehaki et al 2008).

Semakin jauh dari pH optimal enzim semakin tidak stabil sehingga aktivitasnya semakin

rendah. Hal ini karena enzim merupakan protein yang tersusun atas asam amino,

pengaruh pH berhubungan dengan sifat asam basa yang dimiliki oleh protein. PH

ekstrim dapat menyebabkan denaturasi protein enzim yang mengubah susunan ruang tiga

dimensi molekul protein enzim. Menurut Naz (2002) perubahan keaktifan enzim akibat

perubahan lingkungan menyebabkan terjadinya perubahan ionisasi enzim. Wong (1995)

menambahkan, pH ekstrim berpengaruh terhadap struktur enzim dan muatan substrat.

Kelebihan atau kekurangan ion H+ menyebabkan perubahan konformasi sisi aktif enzim,

sehingga substrat tidak lagi berikatan dengan enzim, selanjutnya berakibat pula pada

pembentukan produk.

Pengaruh Suhu

Pada umumnya setiap enzim memiliki aktivitas maksimum pada suhu tertentu,

aktivitas enzim akan semakin meningkat dengan bertambahnya suhu sampai suhu

optimum tercapai. Setelah itu kenaikan lebih lanjut akan menyebabkan aktivitas enzim

menurun. Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease ekstrak kasar bakteri isolat air rawa

terdapat pada Gambar 4.

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

30 40 50 60 70

Suhu

Akt

ivita

s Pr

otea

se


11

Gambar 4. Pengaruh suhu pada protease isolate A6S3

Figure 4. Effect of temperature on isolate A6S3 protease

Dari hasil pengukuran aktivitas enzim pada berbagai suhu, suhu optimum protease

bakteri isolat A6S3 dengan suhu inkubasi 500C. Penelitian protease bakteri lain

menujukkan bakteri yang berasal dari perairan memiliki suhu optimum yang cukup

tinggi, yaitu protease bakteri laut Alteromonas sp strain O7 memiliki suhu optimum 60 0C

(Miyamoto et al 2002) dan protease Pseudoalteromonas sp strain P96-47 dari laut

Artartik yang memiliki suhu optimum 45 0C (Vazquez et al 2008). Suhu mempengaruhi

laju reaksi katalisis enzim dengan dua cara. Pertama, kenaikan suhu akan meningkatkan

energi molekul substrat dan pada akhirnya meningkatkan laju reaksi enzim. Peningkatan

suhu juga berpengaruh terhadap perubahan konformasi substrat sehingga sisi aktif

substrat mengalami hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim dan menyebabkan

turunnya aktivitas enzim. Kedua, peningkatan energi termal molekul yang membentuk

struktur protein enzim itu sendiri akan menyebabkan rusaknya interaksi-interaksi non

kovalen (ikatan hidrogen, ikatan van der walls, ikatan hidrofobik dan interaksi

elektrostatik) yang menjaga struktur 3D enzim secara bersama-sama sehingga enzim

mengalami denaturasi. Denaturasi menyebabkan struktur lipatan enzim membuka pada

bagian permukaannya sehingga sisi aktif enzim berubah dan mengakibatkan terjadi

penurunan aktivitas enzim (Hames dan Hooper 2000).

Pengaruh ion logam dan inhibitor spesifik

Beberapa enzim membutuhkan ion logam sebagai kofaktor untuk mendukung

efisiensi katalitik enzim. Logam tersebut membantu reaksi katalitik dengan cara mengikat

substrat pada sisi pemotongan. Selain berperan dalam pengikatan enzim dengan substrat,

beberapa logam juga dapat mengikat enzim secara langsung untuk menstabilkan


12

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

aktivitasjam ke-48

FeCl2 KCl MnCl2 ZnCl2

aktiv

itas

prot

ease

1 mM

5 mM

konformasi aktifnya atau menginduksi formasi situs pengikatan atau situs aktif suatu

enzim. Gambar 6 memperlihatkan pengaruh ion logam terhadap aktivitas protease bakteri

isolat A6S3.

Gambar 5. Pengaruh ion logam pada protease isolate A6S3

Figure 5. Effect metal ions on isolate A6S3 protease

Inhibitor ion logam yang kuat terhadap protease dari bakteri A6S3 adalah Fe2+, K+

dan Zn2+ (Gambar 5). Adanya penghambatan ion logam terhadap aktivitas protease pada

konsentrasi tertentu berkaitan dengan kekuatan ion, dimana kekuatan ion itu sendiri

mempengaruhi konformasi atau struktur tiga dimensi dari protein enzim atau protein

substrat (Suhartono 1989). Pada konsentrasi tertentu ion logam tertentu dapat bertindak

sebagai inhibitor, tetapi dapat juga bertindak sebagai aktivator pada konsentrasi lain

(Richardson dan Hyslop 1985).

Berdasarkan mekanisme reaksi yang dikatalisis, endopeptidase dapat

dikelompokkan menjadi empat yaitu: protease serin, protease aspartat, protease sistein

dan protease logam. Dalam penelitian ini penggolongan protease hasil produksi dilakukan


13

dengan cara mereaksikan dengan senyawa-senyawa inhibitor spesifik. Adapun pengaruh

inhibitor spesifik EDTA pada protease tanah rawa terdapat pada Tabel 2.

Tabel 2. Pengaruh inhibitor spesifik pada protease isolate A6S3

Table 2. Effect specific inhibitor on isolate A6S3 protease

Jenis bakteri

Aktivitas residu (%)EDTA

1 mM 5 mM

A6S3 19,6 18,9

Tabel 2 menunjukkan EDTA (1mM dan 5 mM) dapat menghambat protease

isolat A6S3 hal ini dimungkinkan karena EDTA mengkelat logam-logam yang berperan

penting menjaga stabilitas serta logam yang berperan sebagai kofaktor enzim protease.

Karena protease ini dihambat oleh EDTA sehingga protease ini digolongkan sebagai

metaloprotease (protease logam). Protease bakteri lain dari perairan yang termasuk

metalloprotease adalah Alteromonas sp O-7 (Miyamoto et al 2002).

Penentuan berat molekul dengan SDS PAGE dan Zimogram protease ekstrak kasar

Penentuan berat molekul dilakukan dengan teknik SDS-PAGE (Sodium dodesil

sulfat-Poliakrilamida gel elektroforesis) dan Zimogram merupakan metode yang sudah

digunakan secara luas. Pada penelitian ini ada dua macam gel yang digunakan yaitu gel

penahan (resolving gel) dan gel pemisah (stacking gel) yang mengandung akrilamid,

SDS, APS dan TEMED. Gel poliakrilamid diperoleh dengan cara polimerisasi akrilamid

dengan sejumlah cross linking agent metilena bis akrilamid dan amonium persulfat

(APS) sebagai katalisator. Radikal bebas yang terbentuk dari pelarutan ammonium

persulfat dalam air akan bereaksi dengan akrilamid membentuk akrilamid aktif yang


14

dapat bereaksi satu sama lain membentuk polimer. Hasil SDS-PAGE dan Zimogram

protease isolat bakteri air rawa dapat dilihat pada Gambar 6.

M A6S3 M A6S3

Gambar 6. SDS-PAGE dan Zimogram protease isolat A6S3 (M=marker)

Figure 6. SDS-PAGE and Zymogram of isolate A6S3 protease (M=marker)

Analisis SDS-PAGE pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat A6S3

memiliki 12 pita dengan BM sekitar antara 19 kD sampai dengan 153 kD. Analisis

Zimogram pada protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat A6S3 memiliki 2

pita dengan BM 106 kD dan 120 kD. Bakteri TPS-2 yang diisolasi dari kawah

Tangkupan Perahu juga memiliki 2 pita dengan berat molekul 80 kD dan 45 kD

(Wahyuntari et al 2000).

KESIMPULAN


15

97 KDa

66 KDa

45 KDa

24 KDa

120 kD

106 kD

Hasil purifikasi dengan kolom gel sephadex G-100 menunjukkan peningkatan

derajat kemurnian enzim protease bakteri isolat A6S3. Untuk fraksi 5 terjadi peningkatan

kemurnian menjadi 3,3 kali, untuk fraksi 10 terjadi peningkatan kemurnian menjadi 3,8,

sedangkan fraksi 46 derajat kemurniannya 3,5. Protease ini mempunyai pH optimum 8,

suhu optimum sekitar 50 oC, Inhibitor ion logam yang kuat terhadap protease dari bakteri

A6S3 adalah Fe2+ (1 mM), K+ dan Zn2+ dan dapat dihambat oleh EDTA. Analisis SDS-

PAGE pada protease ekstrak kasar didapatkan protease isolat A6S3 memiliki 12 pita

dengan BM sekitar antara 19 kD sampai dengan 153 kD. Analisis Zimogram pada

protease ekstrak kasar didapatkan protease untuk isolat A6S3 memiliki 2 pita dengan

BM 106 kD dan 120 kD.

UCAPAN TERIMA KASIH

Peneliti berterima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Depdiknas

yang telah membiayai penelitian ini melalui program Hibah Bersaing XVI tahun 2008.

DAFTAR PUSTAKA

Baehaki, A., Suhartono, M.T., Palupi, N.S. dan Nurhayati, T. 2008. Purifikasi dan karakterisasi protease dari bakteri patogen Psudomonas aeruginosa. Jurnal Teknol dan Industri Pangan 19: 80-86.

Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., and Graβl, M. 1983. Methods of Enzymatic Analysis. Vol 2. Verlag Chemie., Weinheim.

Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive methodfor quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye-binding. Anal Biochem 72:234-254.

Choi, N.S., Yoon, K.S., Lee, J.Y., Han, K.Y., and Kim, S.H. 2001. Comparision of three substrates (casein, fibrin, and gelatin) in zimographic gel. J Biochim Mol Biol 34:531-536.


16

Hames, B.D., and Hooper, N.M. 2000. Biochemistry: The Instant Notes. Ed.ke-2. Springer-Verlag., Hongkong.

Harris, E.L.V., S, Angal. 1989. Protein Purification Methods.A Practical approach. IRL Press., Oxford.

Huang, G., Ying, T., Huo, P., and Jiang, J. 2006. Purification and characterization of a protease from thermophilic Bacillus strain HS08. African Biotecnol 5:2433-2438.

Kalisz, H.K. 1988. Microbial proteinases. Adv Biochim Eng Biotechnol 36; 1-65.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the heat of bacteriophag T4. Nature 227:680-685.

Miyamoto, K., Tsujibo, H., Nukui, E., Itoh, H., Kaidzu, Y., and Inamori, Y. 2002. Isolation and characterization of the genes encoding two metalloproteases (MprI and MprII) from a marine bacterium, Alteromonas sp. strain O-7. Biosci Biotecnol Biochem 66:416-21

Naiola, E., dan Widhyastuti, N. 2002. Isolasi, seleksi dan optimasi produksi protease dari beberapa isolat bakteri. Hayati 6:467-473.

Naz, S. 2002. Enzymes and Food. Oxford University Press., Pakistan.

Pakpahan R. 2009. Isolasi bakteri dan uji aktivitas protease termofilik dari sumber air panas Sipoholon Tapanuli Utara Sumatera Utara. Tesis. Universitas Sumatera Utara. Medan.

Rao, M.M., Tanksale, A.M., Gatge, M.S., and Desphande, V.V. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol And Mol Biol Rev 62:597-635.

Richardson, T., and Hyslop, D.B. 1985. Enzyme. In Fennema, O.R (Eds). Food Chemistry. Mac Kerel Bekker, New York.

Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB-Depdikbud. Bogor.

Vázquez, S.C., Hernández, E., and Cormack, W.P.M. 2008. Extracellular proteases from the Antarctic marine Pseudoalteromonas sp. P96-47 strain. Revista Argentina Microbiologia 40:63-71.

Wahyuntari, B., Suhartono, M.T., and Pyun, Y. 2000. Properties of extracelullar protease from an extreme thermophilic microorganism isolated from Tangkupan Prahu crater. Hayati 7: 6-10.

Wong, D.W.S. 1995. Food Enzymes: structure and mechanism. Chapman & Hall., New York.


17

PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEASE...

Documents

Transcript of PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI PROTEASE...