Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11
description
Transcript of Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11
![Page 1: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/1.jpg)
Purificação e caracterização do
anticorpo anti-DRG11
Alunas:•Cristina Pinto•Diana Trigo
![Page 2: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/2.jpg)
Sistema Nociceptivo
Injury
Peripheral Nerve
Dorsal Root
Ganglion Dorsal Horn
Lateral Thalamus
Somatosensory Cortex
percepção do estímulo
condução do estímulo
processamento da resposta
![Page 3: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/3.jpg)
DRG11: papel na nocicepção• Identificação do local de
expressão da proteína DRG11 por hibridação com RNAm
• Observação do fenótipo de ratinhos knockout [Chen et al, 2001]
Importância da proteína DRG11
no desenvolvimento
do sistema nociceptivo
Gentilmente cedido pela Prof. Sandra Rebelo
![Page 4: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/4.jpg)
DRG11, factor de transcrição com 30 DRG11, factor de transcrição com 30 kDa da família das proteínas kDa da família das proteínas homeodomainhomeodomain
11 263263HomeodomainHomeodomain
DNA bindingDNA binding
OAROAR
Interacção Proteína-proteínaInteracção Proteína-proteína
Anti-drg11Anti-drg11
OAROAR
Interacção Proteína-proteínaInteracção Proteína-proteína
Anti-drg11Anti-drg11
Glutationa S-transferaseGlutationa S-transferase
GSTGST
Proteína Recombinante (46kDa)Proteína Recombinante (46kDa)
103103
![Page 5: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/5.jpg)
•Obtenção dos anticorpos anti DRG11
Proteína de fusão GST-DRG11 (C-terminal)
Soro
![Page 6: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/6.jpg)
Purificação e caracterização do anticorpo:
SoroPurificação dos anticorpos por Cromatografia de Afinidade
Doseamento de IgG anti-DRG11
Imunoblotting
Imunofluorescência
![Page 7: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/7.jpg)
Cromatografia de AfinidadeLavagens da resina desefarose + GST-DRG11
Incubação da resina com soro “overnight”
Separação do sobrenadante
Montagem da Coluna
![Page 8: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/8.jpg)
Cromatografia de Afinidade
Eluição por adição de solução de Glicina a pH 2,3
Recolha de 10 amostras com bomba peristáltica
Neutralização com Tris a pH 8,5
![Page 9: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/9.jpg)
Doseamento Proteico: Método de Bradford
• Princípio: o reagente de Bradford (corante de azul de Coomassie em àcido fosfórico) liga-se covalentemente às proteínas , numa reacção acompanhada de alteração da cor do reagente em meio ácido. [Bradford MM (1976)]
![Page 10: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/10.jpg)
Doseamento Proteico:• Determinação da recta padrão:
– Prepararam-se 5 amostras com diferentes concentrações de “bovine serum albumin”(BSA) e reagente de Bradford
– Mediram-se as respectivas absorvâncias num espectrofotómetro a 595nm
– Traçou-se a curva de calibração
Recta Padrão
y = 33,895x - 14,067
R2 = 0,9846
05
10152025
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Absorvância
Qu
anti
dad
e B
SA
(u
g)
Gráfico 1
![Page 11: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/11.jpg)
Doseamento Proteico:
• Preparar 10 eppendorfs com:– cada amostra do
anticorpo purificado– água– reagente de Bradford
• Medir as absorvâncias
• Determinar as concentrações das amostras a partir da equação da recta padrão
imunopurificação anti-drg11
0
200
400
600
800
1000
0 2 4 6 8 10 12
fracções
Qu
anti
dad
e (u
g)
Gráfico 2
![Page 12: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/12.jpg)
Western Blotting:Montagem da cassete (sistema vertical)
Colocou-se 5µg de proteína de fusão em cada um dos poços
Electroforese
Montagem da cassete de blotting
Transferência das proteínas para a membrana de nitrocelulose
Revelação com Ponceau S
Cortou-se a membrana às tiras (1 tira para cada fracção)
kDa
97
5645
36
![Page 13: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/13.jpg)
Imunoblotting Bloqueio em solução de leite em pó
Incubação com o anticorpo primário (anti-DRG11 de cada fracção )
Incubação com o anticorpo secundário conjugado com Fosfátase Alcalina (AP)
Revelação com NBT + BCIP (substratos da AP)
![Page 14: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/14.jpg)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Conclusão:•Verificou-se a ligação do anticorpo à proteína de fusão através do aparecimento de um precipitado de cor azul, produto da actividade da AP.
•Nas fracções que possuíam uma maior quantidade de anticorpo verificou-se um sinal mais intenso.
imunopurificação anti-drg11
0
200
400
600
800
1000
0 2 4 6 8 10 12
fracções
Qu
anti
dad
e (u
g)
Gráfico 2
Imunoblotting
![Page 15: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/15.jpg)
• Conclusão: O anticorpo encontrava-se funcional, apesar
de ter sido sujeito a condições agressivas aquando da sua purificação.
• O anticorpo revelou-se funcional para proteínas desnaturadas, contudo havia
necessidade de testar a sua actividade em relação a proteínas nativas in loco.
Imunofluorescência
![Page 16: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/16.jpg)
Imunofluorescência
• Usaram-se cortes transversais da região do fígado de embriões de ratinhos com 18dias normais e “knockout”.
• Procedimento:– bloqueio com soro de cabra;– incubação com anti-DRG11 (1/200) da fracção 3;– incubação com anticorpo secundário (anti-rabbit)
conjugado com fluorocromo vermelho (Alexa 594);– observação dos locais de expressão da proteína
usando microscopia confocal;
![Page 17: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/17.jpg)
Imunofluorescência• A proteína apresentou como locais
de expressão o corno dorsal da medula espinhal e gânglios raquidianos, estruturas envolvidas no processamento de estímulos nóxicos.
+/+ -/-
![Page 18: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/18.jpg)
• Concluiu-se que os anticorpos estavam funcionais para futuros trabalhos de investigação.
NOTA: Os anticorpos já foram utilizados em experiências realizadas pelo orientador.
![Page 19: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/19.jpg)
Bibliografia:
• Alberts B. et al., Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Garland Science
• Bradford MM (1976).Anal Biochem. 72: 248-54. • Chen et al (2001).Neuron.31:59-53• http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/
protein.html• http://www.mpibpc.gwdg.dc/abtcilungcn/140/confo
cal/main.html• http://www.roche.appliedscience.com• www.bioscience.com• www4.amerishambioscience.com
![Page 20: Purificação e caracterização do anticorpo anti-DRG11](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062500/568150ee550346895dbf087a/html5/thumbnails/20.jpg)
Agradecimentos:
• Prof Doutor Carlos Reguenga• Serviço de Histologia e Embriologia
de Abel Salazar • Drª. Sandra Rebelo