Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA...
-
Upload
angelo-guerreiro -
Category
Documents
-
view
258 -
download
1
Transcript of Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA...
![Page 1: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/1.jpg)
Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia
IBILCE-UNESP
TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e
MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS
![Page 2: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/2.jpg)
1956
Tijio e Levan
1960
Moorhead et al.
1970 1969
Gall e Pardue
cariótipo
culturas
bandeamento
ISH
1986
Pinkel et al.
1992
Kallioniemi et al.
1996
Schröck et al.
2002
Nakakuki et al.
...
FISH
CGH
SKY
aCGH
CITOGENÉTICA CLÁSSICA
CITOGENÉTICA MOLECULAR
![Page 3: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/3.jpg)
CULTURA DE LINFÓCITOSMoorhead et al, 1960
1. Colheita de 5 ml de sangue e sedimentação2. Montagem da cultura:• meio de cultura (antibióticos) e soro fetal bovino
estímulo da divisão celular: fito-hemaglutinina (feijão Phaseolus vulgaris)cultivo em estufa a 37° C, por 72 horas
3. Bloqueio da divisão celular com colquicina: impede a formação do fuso mitótico acúmulo de metáfases
4. Colheita da cultura:• hipotonização: KCl 0,075M intumescimento das células e separação
das cromátides Fixação: metanol: ácido acético (3:1) preserva a estrutura dos cromossomos
![Page 4: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/4.jpg)
www.geneticamedica.com.br/.../ citogenetica.htm
![Page 5: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/5.jpg)
BANDEAMENTO CROMOSSÔMICO
Coloração usual com GiemsaBandeamento QBandeamento GBandeamento RBandeamento CColoração Ag-NOR
![Page 6: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/6.jpg)
coloração uniforme dos cromossomos:identificação morfológica dos pares cromossômicos: 1, 2, 3, 16,
17, 18 e Y.
Classificação dos cromossomos em grupos: A - G
COLORAÇÃO USUAL
![Page 7: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/7.jpg)
CLASSIFICAÇÃO DOS CROMOSSOMOS HUMANOS (GRUPOS A – G)
Grupo A (1-3): 3 pares de cromossomos gandesA1 e A3 metacêntricosA2 submetacêntricoGrupo B (4-5): 2 pares submetacêntricos grandesGrupo C (6-12+X): 7 pares submetacêntricos médio + XGrupo D (13-15): 3 pares acrocêntricos médio (satélite)Grupo E (16-18): 3 pares de cromossomos pequenos 16 metacêntrico 17 e 18 submetacêntricosGrupo F (19-20): 2 pares metacêntricos pequenosGrupo G (21-22+Y): 2 pares acrocêntricos pequenos (satélite) + Y
![Page 8: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/8.jpg)
biocarampangue.tripod.com/ Segundo-medio.htm
46,XY
![Page 9: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/9.jpg)
BANDA GTG: Seabright (1971)
Tratamento com tripsina e coloração com GiemsaBandas claras e escuras intercaladas (450 bandas)Bandas G+ricas em AT (pobre em genes)Bandas G-ricas em GC (rica em genes)Identificação de alterações estruturais e pareamento dos cromossomos
![Page 10: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/10.jpg)
www.ucm.es/.../AVG/practicas/ cariotipo/carioP.htm http://www.scielosp.org/scielo.php?pid=S1413-81232002000300013&script=sci_arttext
![Page 11: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/11.jpg)
Décadas 70-80: estudo citogenético identificação de cromossomos e regiões cromossômicas diferentes
alterações
•Perda: deleção monossomia
•Ganho: duplicação,
amplificação trissomia, poliploidia•Relocação:
translocação inversãoinserção
![Page 12: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/12.jpg)
CULTURA CELULAR E BANDA G
500 bandas
Resolução:
~6milhões pb
~50genes/banda
>4 Mb
![Page 13: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/13.jpg)
BANDA C (Sumner, 1972)
cora regiões centroméricas e heterocromatina constitutiva: constrições secundárias dos cromossomos 1, 9, 16 e Yq.tratamento em ácido (HCl) e alcali Ba(OH)2 regiões de heterocromatina constitutiva: coradas fortemente DNA da cromatina eucromatina é extraído (solubilizado).
![Page 14: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/14.jpg)
![Page 15: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/15.jpg)
BANDA C - POLIMORFISMOS CROMOSSÔMICOS
46,XY, inv(9q)
46,XY, 1qh+,inv(9q) 46,XX,1qh+
1
9
16
![Page 16: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/16.jpg)
BANDA Ag-NOR – COLORAÇÃO POR
PRATA destaca as regiões do rDNA: RON constrições secundárias dos cromossomos com satélite (braços curtos dos acrocêntricos) (deposição de prata)o número de NORs/ metáfase: varia entre 5 a 10Impregnação pela prata nos cistrons ribossômicos ativos na intérfase anterior
![Page 17: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/17.jpg)
COLORAÇÃO Ag-NORAssociação de satélites
![Page 18: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/18.jpg)
![Page 19: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/19.jpg)
ORDEM DAS ANOMALIAS CROMOSSÔMICASSISTEMA INTERNACIONAL DE NOMENCLATURA DOS
CROMOSSOMOS HUMANOS - 1995
Primeiro aberrações dos cr. Sexuais (X antes do Y)Aberrações dos autossomos em ordem numérica, independente do tipo de aberraçãoAberrações numéricas listadas antes das estruturaisVárias alterações estruturais em ordem alfabéticaExemplos:47,Y,t(X;13)(q27;q12),inv(10)(p13q22), +2148,X,t(Y;12)(q11;p12),del(6)(q11),+8,t(9;22)(q34;q11),+1,7,-21,+2250,XX,+1,+del(1)(p13),+dup(1)(q21q32),+inv(1)(p31q41),+8,+r(10)(p12q25),-21
![Page 20: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/20.jpg)
CARIÓTIPO COMPOSTO42,XX,-7,-8,+13,-20,-21,-22
43,XX,-6,-11,-21
43,XX,-14,-18,-22
43,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-18,-20,-20
45,XX,-7
45,XX,-16
45,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-8
46,XX [4]
46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32) [7]
46,XX, -X, ins(4;2)(q31;q24q32),+5
46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-8
Cariótipo composto:42~46,XX,-X,ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-6,-7,-8,-11,+13,-14,-16,-18,-20,-21,-22[cp20]
![Page 21: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/21.jpg)
ALTERAÇÕES CLONAIS
Clone: população de células derivada de um único progenitor.
Alteração clonal: quando um número de células têm o mesmo ou proximamente relacionado complemento cromossômico anormal.
Ter pelo menos 2 células com a mesma aberração:ganho cromossômico (trissomia) ou rearranjo estrutural
Ter pelo menos 3 células com perda cromossômica (monossomia)
![Page 22: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/22.jpg)
ALTERAÇÕES CLONAIS42,XX,-7,-8,+13,-20,-21,-22
43,XX,-6,-11,-21
43,XX,-14,-18,-22
43,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-18,-20,-20
45,XX,-7
45,XX,-16
45,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-8
46,XX [4]
46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32) [7]
46,XX, -X, ins(4;2)(q31;q24q32),+5
46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-8
Numéricas: +5[2], -8[3]
Estrutural: ins(4;2)(q31;q24q32)[11]
Cariótipo composto:42~46,XX,-X,ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-6,-7,-8,-11,+13,-14,-16,-18,-20,-21,-22[cp20]
![Page 23: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/23.jpg)
TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR
FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação)SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações)M-BAND: Bandeamento colorido (inversão, deleção/duplicação) CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos)Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)
![Page 24: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/24.jpg)
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH
Pinkel et al. (1986)
![Page 25: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/25.jpg)
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência
Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)
![Page 26: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/26.jpg)
FISH - Fluorescent “in situ” hybridization
FISH - Hibridização Fluorescente “in situ”
Blue Acqua Green Yellow Orange Red
Cláudio C. SilvaUCG/LaGeneDNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica
Sonda: segmento de DNA específico
![Page 27: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/27.jpg)
ETAPASPreparação da lâmina (DNA alvo)
Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa To de ~80oC
Hibridização sonda/DNA (estufa a 37oC – câmara úmida - overnight)
Lavagem pós-hibridização: tampão 2xSSC (citrato de sódio)
Detecção da sonda e contracoloração: iodeto de propídeo (PI) ou DAPI
Fluorocromos: SondasFITC-fluoresceína (verde)Espectrum green ( verde)Rodamina (vermelho)Texas red (vermelho)
![Page 28: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/28.jpg)
• Método para obtenção de núcleosinterfásicos a partir de tecido fresco
Desagregação dosnúcleos
Fixação dos núcleos
ETAPAS
Material:
-núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços
-cromossomos metafásicos: cultura celular
![Page 29: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/29.jpg)
4. Hibridação in situ Fluorescente - FISH
Pré-tratamento Aplicação da sonda(Ácido acético, RNase, pepsinaDesidratação Etanol)
ETAPAS
![Page 30: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/30.jpg)
Co-denaturação Lavagem pós-hibridação
Contra-coloração Análise ao microscópio
Hibridização
(câmera úmida à 37oc)
ETAPAS
Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência
http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm -ANIMAÇÃO
![Page 31: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/31.jpg)
TIPOS DE SONDASSondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas:-sonda alfa-satélite (centromérica)-sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G)-sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y)-sonda telomérica (telômeros)Sondas de cópia única ou locus específicaSondas de cromossomo inteiro (WCP)
![Page 32: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/32.jpg)
SONDAS CENTROMÉRICAS
Enumeração dos cromossomos e aneuploidias
![Page 33: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/33.jpg)
APLICAÇÃO:
aneuploidias em núcleos interfásicos
Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)
gastrite:+7 gastrite: -7
úlcera: +8
SONDAS CENTROMÉRICAS
![Page 34: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/34.jpg)
SONDAS TELOMÉRICAS
Aplicação:
-Deleções terminais
-perdas teloméricas
![Page 35: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/35.jpg)
SONDAS TELOMÉRICAS
(cromossomo 5)
![Page 36: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/36.jpg)
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
del (22q11.2)
Diagnóstico de doenças com microdeleção
![Page 37: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/37.jpg)
Mucosa normal:
TP53 (vermelho)
17 (verde)
Adenocarcinoma gástrico:
Deleção TP53
1 sinal vermelho
Deleção do gene TP53 em câncer gástrico
SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
![Page 38: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/38.jpg)
SONDAS WCP – Cromossomo Total
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842005000100018
![Page 39: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/39.jpg)
A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4; material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), B- Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta).
SONDAS WCP – Cromossomo Total
![Page 40: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/40.jpg)
APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH
Mapeamento de genes e sequências gênicas
Estrutura e organização dos cromossomos
Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções
Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos
Identificação de alterações cromossômicas em esperma
Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação
Diagnóstico de neoplasias
Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto)
![Page 41: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/41.jpg)
MICRODISSECÇÃO
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/microDissection.php
![Page 42: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/42.jpg)
![Page 43: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/43.jpg)
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO
APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH
![Page 44: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/44.jpg)
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X: aneuploidias mais comuns relacionadas com idade materna avançada e malformações fetais Citogenética convencional: diagnóstico em 8-15 diasFISH: resultado rápido (2-3 dias) em células do líquido amniótico não cultivadas
![Page 45: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/45.jpg)
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
![Page 46: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/46.jpg)
Trissomia do 21 Triplo X
DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Normal
![Page 47: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/47.jpg)
DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO
3 sinais verde: blastômero com trissomia do 21
![Page 48: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/48.jpg)
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
AMPLIFICAÇÃO GÊNICA
CCND1, c-MYC, HER2/Neu
TRANSLOCAÇÕES
t(9,22); t(8;14)
DELEÇÕES
TP53 (17p13), RB (13q13)
![Page 49: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/49.jpg)
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIASAmplificação Gênica
![Page 50: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/50.jpg)
(C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico
(E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIASAmplificação Gênica
![Page 51: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/51.jpg)
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO
![Page 52: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/52.jpg)
DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO
![Page 53: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/53.jpg)
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
![Page 54: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/54.jpg)
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKYSchrock et al., Science 273:494-497, 1996
Identificação precisa e simultânea de todos os cromossomos humanos: diferentes cores
Princípio: medição simultânea de todos os pontos do espectro emitidos pela amostra na faixa espectral visível e próxima a infra-vermelha: uso de múltiplas sondas sobrepondo-se espectralmente
Sondas: com 5 diferentes fluorocromos : Cy2, Spectrum green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas combinações
![Page 55: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/55.jpg)
Sondas dos 24 cromossomos humanos marcadas com 5 fluorocromos em combinação resultando em uma cor diferente para cada cromossomo.
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
![Page 56: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/56.jpg)
Cor capturadaClassificação das cores pseudo-coloridas
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
![Page 57: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/57.jpg)
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Cariótipo normal
Cromossomos marcadores
Limitação:
-Cultivo celular – metáfases
-Não detecta deleções/duplicações e inversão
![Page 58: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/58.jpg)
Evolução cariotípica: células de gibão hibridizadas com sondas humanas várias homologias cromossômicas
CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
![Page 59: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/59.jpg)
BANDAMENTO COLORIDOCROSS-SPECIES COLOR
BANDING
![Page 60: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/60.jpg)
Permite a coloração sub-regional dos cromossomos para análise do cariótipo humano
Sondas: derivadas de primatas (gibão) do genêro Hylobates concolor e Hylobates syndactilus: cariótipos com extensa reorganização cromossômica quando comparado ao homem
Identificação de rearranjos cromossômicos: inversões, deleções, duplicações, inserções, translocações
BANDAMENTO COLORIDO
![Page 61: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/61.jpg)
mBAND do cromossomo 5:
25 bandas coloridas: corresponde a uma resolução de 550 bandas (complemento haplóide)
BANDAMENTO COLORIDO
![Page 62: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/62.jpg)
Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem re-processada (b). Qualquer alteração pode ser detectada por este sistema.
BANDAMENTO COLORIDO
![Page 63: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/63.jpg)
![Page 64: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/64.jpg)
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
![Page 65: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/65.jpg)
Método para detectar simultaneamente ganhos e perdas de regiões genômicas sem precisar de células em divisãoExtração do DNA: células teste (tumor) e referência (normal)DNA digerido com enzimas de restrição e marcados com fluorocromos diferentes (vermelho e verde)Hibridação simultânea com ambos DNA (teste e referência) sobre lâmina com cromossomos metafásicos normaisComparação intensidade relativa dos dois fluorocromos ao longo do comprimento de cada cromossomo
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
![Page 66: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/66.jpg)
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php
![Page 67: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/67.jpg)
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
Amplificação/ganho: excesso do DNA teste (verde)
Deleção/perda: excesso do DNA normal (vermelho)
![Page 68: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/68.jpg)
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/
![Page 69: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/69.jpg)
Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em câncer gástrico câncer gástrico (Guan et al., 2000)(Guan et al., 2000)
![Page 70: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/70.jpg)
Resolução: 0,5 Mb
array - CGH
-cromossomos metafásicos substituídos por sondas de DNA ou oligonucleotídeos chips DNA
![Page 71: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/71.jpg)
Análise dos sinais fluorescentes: analisador de imagem, scanner confocal ou câmera CCD
http://www.dkfz.de/en/genetics/pages/projects/array_cgh.html
array - CGH
![Page 72: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/72.jpg)
array - CGH
![Page 73: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/73.jpg)
![Page 74: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/74.jpg)
AVANÇOS TECNOLÓGICOS
1o. Microscópio -Leeuwenhoek
![Page 75: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/75.jpg)
AVANÇOS TECNOLÓGICOS
![Page 76: Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS.](https://reader033.fdocuments.in/reader033/viewer/2022061505/570638481a28abb8238f421c/html5/thumbnails/76.jpg)
http://www.empiregenomics.com/site/technology_overview.php
Array-CGH continua transformando a Citogenética:
-fornecendo alta-resolução
-tecnologia avançada para mapeamento preciso e detecção de aberrações cromossômicas.