Procedimiento de Laboratorio Para La Producción de Embriones en Vitro de Ganado Vacuno
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1 PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA LA PRODUCCIÓN DE EMBRIONES IN VITRO EN
GANADO VACUNO
DANILDA HUFANA-‐DURAN, Ph.D. Prometeo, Universidad Técnica de Babahoyo Scientist, Philippine Carabao Center-‐Department of
Agriculture, Philippines Documento traducido por Jorge Cevallos Bravo (Centro de Idiomas ESPAM MFL)
La producción de embriones in vitro es una biotecnología de reproducción avanzada que ofrece muchas oportunidades para la investigación en biología del desarrollo, tecnología de células madres y programas de mejoramiento en la producción de ganado. La producción de embriones in vitro es una oportunidad para otorgar a los estudiantes entendimiento claro en lo concerniente a sistemas reproductivos y sus funciones, así como a procesos subyacentes, y el posible manejo involucrado en el desarrollo de embriones.
Los procedimientos de laboratorio que aquí se describen corresponden a un sistema de co-‐cultivo
para la producción de embriones in vitro, que usa medios de cultivos preparados comercialmente. De involucrarse medios de cultivos preparados por cuenta propia, se requerirá de reactivos biológicos adicionales. Así mismo, la preparación de los espermatozoides para la fertilización in vitro (IVF) no involucra la separación de espermatozoides de buena calidad por medio de gradientes de densidad. Este procedimiento supone que la calidad del semen congelado es de antemano buena y presenta alta motilidad y movilidad.
1. Requisitos 1.1 Equipos 1.1.1. Incubador calibrado a 5% CO2, 39°C de temperatura,
equilibrado y humidificado. Para cultivos in vitro de óvulos y embriones. El incubador ideal es el de la imagen derecha porque tiene cada compartimento con su respectiva puerta de vidrio, lo que minimiza los cambios de temperatura y contenido de gases cuando se abre la puerta principal de la unidad.
1.1.2. Cabina de Flujo Laminar. Para la filtración de medios de cultivo in vitro, preparación de gotas (droplets) de cultivo in vitro y preparación de alícuotas de medios de cultivo. Una cabina de flujo laminar es muy parecida a la segunda imagen de la derecha.
1.1.3. Microscopio estéreo, con magnificación de 0-‐90x. Para la selección y observación de óvulos y embriones.
1.1.4. Microscopio de contraste de fases, con lentes de 20-‐40x. Para el análisis del semen durante la fertilización in vitro.
1.1.5. Balanza analítica, 210 g de capacidad, precisión de 0.0001g. Para pesar reactivos biológicos.
1.1.6. Baño María, capacidad de 10-‐100°C, con incremento de lectura digital de 0.1°C. Para suministrar la temperatura deseada durante la manipulación a temperatura ambiente.
2 1.1.7. Placa de calentamiento, con capacidad de 10-‐100°C, 0.1 °C incremento/lectura, digital. Para
suministrar la temperatura deseada en los óvulos, espermatozoides y embriones durante las prácticas in vitro.
1.1.8. Sistema de purificación de agua. Para suministrar agua purificada y agua destilada que se usan en la preparación de medios de cultivos y la humidificación del incubador.
1.1.9. Refrigerador y congelador. Para el almacenamiento de medios de cultivo y reactivos biológicos/soluciones.
1.1.10. Centrífuga, 1000 a 5000 rpm. Para el lavado de las células de esperma y recolección de sedimentos de esperma.
1.1.11. Limpiador de aire (Opcional). Para mantener el aire limpio dentro del laboratorio. 1.1.12. Mezclador Vortex (Opcional). Para denudar los óvulos que se necesiten en los cultivos de células
no somáticas. 1.1.13. Autoclave. Para esterilizar herramientas de laboratorio y otros instrumentos.
1.2 Provisiones, Materiales y Herramientas
1.2.1. Papel de pesado. Para pesar reactivos biológicos. 1.2.2. Micro espátula. Para pesar reactivos. 1.2.3. Matraz volumétrico, 100 ml a 2 litros. Para preparar solución fisiológica salina (también se puede
usar una solución que esté disponible comercialmente). 1.2.4. Jeringa plástica estéril desechable de 10 ml. Para la aspiración de óvulos desde los ovarios y
filtración de medios bilógicos y soluciones. 1.2.5. Agujas estériles desechables de 10 ml. Para la aspiración de los óvulos. 1.2.6. Tubos estériles de centrífuga de polipropileno de 15 ml y 50 ml, desechables. Para ubicar el
material folicular aspirado, lavar las células de espermatozoides y para la conservación de los medios.
1.2.7. Cajas Petri, recubiertas de poliestireno, de 35x10 mm, 45 x 10 mm y 65 x 15 mm. Para la observación y almacenamiento de los óvulos, maduración in vitro, para medios de cultivo y fertilización.
1.2.8. Tubos estériles de polipropileno de 10 ml. Para almacenamiento de medios de alícuota. 1.2.9. Tubos estériles de polipropileno de 5 ml. Para la suspensión de esperma para el IVF. 1.2.10. Puntas azules (200-‐1000 μL) puntas amarillas (20-‐200 μL), puntas blancas (0.5-‐20 μL). 1.2.11. Dispensador de pipeta, (200-‐1000 μL), (20-‐200 μL), (0.5-‐20 μL). Para la dispensación de medios de
cultivo y células espermáticas. 1.2.12. Pipetas Pasteur de 9 pulgadas. Para sostener los óvulos y embriones. El diámetro interior
deseado se obtiene con un mechero. Para la selección y maduración in vitro de los óvulos, 150-‐180 μm. Para la fertilización in vitro, 140-‐150 μm. Para cultivos in vitro, 120-‐140 μm dependiendo del sistema de cultivo que se adopte. Para denudar los óvulos, 110-‐120 μm. Deben mantenerse estériles y deben estar disponibles siempre.
1.2.13. Boquillas estériles para las pipetas Pasteur. 1.2.14. Tollas de papel estériles. Para secar y sostener los ovarios y para limpiar la pajilla con semen
durante la fertilización in vitro. 1.2.15. Beaker. 100-‐1000 ml. Para contener los ovarios. 1.2.16. Colador de acero. Para lavar los ovarios. 1.2.17. Lámpara de alcohol o mechero de Bunsen y encendedor. Para preparar el diámetro interior
deseado de las pipetas Pasteur. 1.2.18. Cámara de Neubauer (Neubauer chamber) o hemocitómetro con placa de cubierta. Para contar
3 espermatozoides y determinar la concentración de esperma.
1.2.19. Contador. Para registrar los espermatozoides contados. 1.2.20. Pinzas estériles. Para recoger los ovarios durante la fertilización in vitro. 1.2.21. Tijeras estériles. Para cortar las pajillas de semen durante la fertilización in vitro. 1.2.22. Filtros de jeringa estériles y desechables, tamaño del poro de 0.2 μm, diámetro de 25 mm. Para
esterilizar el medio de cultivo por medio de la filtración. 1.2.23. Placas Repro-‐C1 (de 6 pocillos, pre tratadas con colágeno), Código del Producto: IFP967C, FHK
Fujihira Company, Ltd., Japan. Para el cultivo in vitro de óvulos fertilizados para el desarrollo de embriones.
1.2.24. Termos o fundas zip lock para almacenar los ovarios desde el camal hacia el laboratorio. 1.2.25. Gradillas para tubos de ensayo de 50 ml, 15 ml y 5 ml, y para tubos Eppendorf. 1.2.26. Cinta scotch o clips. Para sellar paquetes abiertos de materiales estériles. 1.2.27. Papel Aluminio. 1.2.28. Termómetro. Para el baño María y para uso dentro del incubador. 1.3 Reactivos Bilógicos 1.3.1. Cloruro de Sodio. Para la preparación de solución salina para el almacenamiento y lavado de los ovarios. 1.3.2. OCM (Medio para Recolección de Óvulos), Código del Producto: IFP9611,
FHK Fujihira Company, Ltd., Japan. 1.3.3. IVMD101 (Medio para la Maduración de Óvulos ), Código del Producto:
IFP9641, FHK Fujihira Company, Ltd., Japan. 1.3.4. IVF100 (Medio para Fertilización), Código del Producto: IFP9631 Fertilization medium-‐G set – IVF100S, FHK Fujihira Company, Ltd., Japan. 1.3.5. VD101 (Medio de Cultivo sin Cocultivo para Embriones), Código del Producto:
IFP9651, FHK Fujihira Company, Ltd., Japan. 1.3.6. Medio para el congelamiento y preservación de embriones. Código del
Producto: IFP9620, FHK Fujihira Company, Ltd., Japan. 1.3.7. Medio básico para la fertilización in vitro-‐ Solución BO, Código del
Producto: IFP963B, FHK Fujihira Company, Ltd., Japan. 1.3.8. Aceite mineral, aceite Sigma para embriones. 1.3.9. Etanol al 70%. 1.3.10. Semen congelado. 2. Prácticas y Equipos de Protección Personal 2.1. Con preferencia, el personal debe usar mandil para laboratorio, máscara para el rostro y guantes de
látex, así como el cabello recogido para las damas cuando estén dentro del laboratorio. Las manos deben limpiarse con agua y esterilizarse con etanol al 70%.
2.2. En la medida de lo posible, evite hablar durante el trabajo cuando no esté usando una mascarilla para el rostro.
2.3. Con preferencia, el ambiente del laboratorio debe estar limpio y libre de polvo y contaminantes presentes en el aire. El limpiador de aire debe mantenerse encendido dependiendo de la situación.
4 2.4. El área de trabajo y cualquier lugar donde se ubique las cajas Petri fuera del incubador deben ser
desinfectadas con etanol al 70% antes de que el trabajo empiece. 2.5. Los envases con los que los óvulos, espermatozoides y embriones deban tener contacto, deberán ser
preparados, precalentados, pre incubados y pre esterilizados. 2.6. Asegúrese de que las pipetas, puntas y tubos Eppendorf sean estériles. 2.7. Si se debe usar materiales reciclados (lo cual no es recomendable), asegúrese de que sean lavados
usando ultrasonido, enjuagados completamente tanto con agua corriente como con agua destilada, secados, envueltos con papel aluminio y esterilizados con el autoclave a 121°C por 15 min.
3. Procedimiento
DÍA 1 3.1 Maduración In Vitro (IVM)
3.1.1 Para preparar la caja del IVM: Abra la cabina de flujo laminar. Esterilice el área de trabajo con etanol al 70% y permita el flujo de aire limpio mientras se prepara los materiales necesarios.
3.1.2 Pipetas de 200-‐1000mL, con puntas azules estériles, aceite mineral, IVMD101 (desde el refrigerador). Traer esto a una vitrina de flujo laminar.
3.1.3 Dependiendo del numero de óvulos esperados para el medio de cultivo, prepare los platos de óvulos para el IVM con 4 gotas de 300μL/gotas. Use cajas de 60 x 15 mm,
3.1.4 Para preparar las gotas, primero calibre 100μL, luego cubra hasta la mitad usando aceite mineral, antes de que se añada los 200μL finales. Esto se lo realiza para obtener una gota con la forma de una esfera.
3.1.5 Equilibre el plato de IVM dentro del incubador humidificado a 39°C, 5% CO2 por un periodo no menor a una hora antes de ubicar los óvulos.
3.2 Recolección de los Óvulos (PUEDE HACERSE CON ANTERIORIDAD, POR LO MENOS 12 HORAS ANTES DEL DÍA 1)
3.2.1. Usando tijeras afiladas, recolecte los ovarios del animal sacrificado. 3.2.2 Guarde los ovarios en un termo o funda zip lock con solución salina fisiológica, 28-‐33°C, si los
ovarios deben ser usados en las primeras 6 horas posteriores a su extracción. Use temperaturas de almacenamiento de 15 a 20°C si los ovarios deben ser usados después de 6 o más horas.
3.3. Selección y Aspiración de los Óvulos
3.3.1 Prepare el baño María a 37°C; 3.3.2. Esterilice el área de trabajo con 70% etanol; 3.3.3. Ubique los tubos de centrifuga de 2 x 15 mL (para los medios de aspiración y
lavado de óvulos) en baño María; 3.3.4. Lave los ovarios cuidadosamente en solución salina fisiológica a temperatura ambiente y guarde
en un beaker con una mínima cantidad de solución salina que sea sólo suficiente para mantener los ovarios humedecidos;
3.3.5. Usando una jeringa estéril de 10 mL, con aguja estéril número 18, aspire alrededor de 1 mL de OCM (como medio contenedor para los óvulos). Evite que la punta de la aguja toque cualquier superficie que pueda causar contaminación.
3.3.6. Usando pinzas estériles, recoja los ovarios desde el beaker y séquelos usando toallas de papel estériles.
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3.3.7. Aspire los óvulos desde los folículos de 2-‐8 mm y ubique el material aspirado en un tubo de centrifuga vacío de 15 o 50 mL.
3.3.8 Una vez que todos los óvulos han sido aspirados, permita que el material aspirado se precipite hasta el fondo del tubo por lo menos por 5 minutos mientras se prepara las pipetas para los óvulos.
3.3.9. Encienda la placa de calentamiento a 37°C. Para la selección de los óvulos, esterilice el ambiente de trabajo con etanol al 70%.
3.3.10. Prepare la pipeta para la selección de los óvulos. Manténgala en un lugar seguro. No permita que la punta entre en contacto con cualquier otra superficie que pueda causar contaminación.
3.3.11. Prepare la caja Petri para la identificación de los óvulos. Usualmente, se usa una caja de poliestireno de 60x15mm. Dibuje líneas rectas en la cubierta del plato. La cubierta también puede ser usada como caja de observación si el recipiente principal no es suficiente.
3.3.12. Prepare el almacenamiento de los óvulos (1) y plato de lavado (3) platos de poliestireno estériles de 35x10mm, añadiendo 2.5 ml de OCM. Si el área es critica, cubra el OCM con aceite mineral. Ponga los platos en una placa de calentamiento a 37 °C.
3.3.13. Usando una pipeta Pasteur estéril, recolecte el sobrenadante del fondo de los tubos de centrifugado que contienen el material folicular aspirado. Viértalo dentro de la caja que usará para la observación de los óvulos.
3.3.14. Añada el volumen de OCM deseado dentro de la caja de observación si se busca diluir el material sobrenadante.
3.3.15. Busque los óvulos por medio de un estéreo microscopio. 3.3.16. Usando la pipeta Pasteur esterilizada, que se utiliza para
recolectar y sostener los óvulos, recolecte los óvulos que se encuentran rodeados por >3 capas de células cúmulo con ooplasma granulado (la imagen inferior de la derecha) y ubíquelos en la caja de almacenamiento.
3.3.17. Una vez que todos los óvulos han sido encontrados y agrupados, lávelos tres veces en los platos de lavado precalentados, eliminando de esta forma todo el material folicular aspirado restante.
3.4. Maduración in vitro
3.4.1. Después del lavado final en el OCM, saque la caja Petri con IVM pre incubado que contiene gotas de IVMD101. Ubíquela en la placa de calentamiento.
3.4.2. Lave los óvulos en 2 o 3 gotas del medio IVMD101 antes de ponerlos en las gotas finales. Distribuya los óvulos en las gotas de IVM en una distribución de 1 ovulo por cada 10 μL de medio IVM.
3.4.3. Incube la caja Petri con IVM dentro del incubador para la maduración in vitro de los óvulos durante 20-‐22 horas. Esto ha sido todo del primer día de la producción in vitro.
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DÍA 2 3.5. Fertilización In Vitro (IVF)
3.5.1. Revise la disponibilidad del semen fresco. 3.5.2. Encienda la cabina de flujo laminar y esterilice el
mesón de trabajo con etanol al 70%. 3.5.3. Dentro de la cabina de flujo laminar, prepare las
cajas con medio IVF: En una caja esterilizada de 35x10mm, vierta 25 μL del medio IVF IVF100, forme las gotas. Cubra con aceite mineral completamente.
3.5.4. En un tubo de centrifuga de 2x15ml, ubique 6mL de medio BO en cada tubo e incube junto con las cajas que contienen el IVF por un periodo no menor a 1 hora.
3.5.5. Dentro de la cabina de flujo laminar, vierta 1mL de solución BO (IFP963B) en un tubo Eppendorf estéril.
3.5.6. Prepare el baño María a 35°C. Usando una gradilla para tubos apropiada, ponga el 1mL de solución BO y otro tubo Eppendorf estéril vacío o un tubo de ensayo de 5mL (para ubicar la suspensión del esperma).
3.5.7. Para determinar la concentración de esperma, prepare un tubo Eppendorf (no es necesario que sea estéril) y ponga una capa de agua fría de 495 μL. Póngalo a un lado. Esto producirá un factor de dilución de esperma de 100.
3.5.8. Esterilice el área de trabajo con etanol al 70%. Tenga a la mano unas tijeras estériles, pinzas y toallas de papel.
3.5.9. Descongelamiento y lavado del esperma: En agua a 35°C de temperatura, descongele el semen durante 1 minuto. Limpie, corte el otro extremo y ubique una capa de semen descongelado dentro de los 6mL del medio BO pre incubado (sacado del incubador); Revise la calidad del esperma por medio de un microscopio estéreo mientras se vierte el semen restante que se encuentra en la pajilla descongelada.
3.5.10. Centrifugue a 1500 rpm, a temperatura ambiente, por 7 minutos. Haga este procedimiento dos veces.
3.5.11. Elimine el material sobrenadante y deje el sedimento celular intacto. 3.5.12. Determine y ajuste la concentración de esperma: Usando
una punta blanca estéril, pipetee 5 μL del sedimento y añádalo al tubo ependorf que contiene los 495 μL de agua fría. Mezcle bien. Tome 10 μL y cárguelos en las dos cámaras, cámara de Neabeaur o hemocitómetro. Cuente el esperma en un total de 25 cuadros en ambas cámaras y calcule el promedio. El promedio no debe exceder al 15% del valor contado. Si este valor se excede, repita el procedimiento. Contar el esperma en 25 cuadros implica
7 multiplicar el numero de esperma contado por el factor de dilución 10,000 (1000μL/0.1μL). Debido a que el volumen del esperma en los 25 cuadros es 0.1μL y la concentración de esperma se expresa comúnmente por unidad de mL para obtener la concentración de esperma por cada mL. Una vez que se haya realizado el conteo del esperma, por ejemplo, en el caso de que el promedio de esperma sea 30. En tal caso, tome 100 μL del sedimento de esperma, ponga el tubo Eppendorf precalentado en el baño María, luego añada 200 μL del 1mL de solución BO precalentada. Esta es la suspensión de esperma que cuando es añadida a un mismo volumen de gotas de IVF dará una concentración de esperma de 5x106 células de esperma/mL.
3.5.13. Fertilización in Vitro: Mantenga la suspensión de esperma a 37 °C . Saque la caja con medio IVF pre encubado. Añada 25 μL de la suspensión de esperma en cada una de las gotas de IVF. Esto hace que la concentración de esperma llegue 5x106 células/mL. Saque la caja con medio IVM que se encuentra en el incubador. Usando una pipeta estéril, remueva suavemente las células cúmulo que rodean a cada óvulo (para asegurar la penetración rápida de las células espermáticas). Tome los óvulos y lávelos 3 veces en las gotas con el medio IVF antes de ser puestos en las gotas de IVF definitivas. Regrese las cajas al incubador e incube por 6 horas para la fertilización in vitro. Esto corresponde al Día 0 de la producción de embriones in vitro.
3.6. Cultivo in Vitro para el Desarrollo de Embriones 3.6.1. Una vez realizado el IVF o durante el periodo de preparación de las gotas con IVF, las gotas de IVC
también pueden ser preparadas; Usando la placas Repro-‐C1 de 6 pocillos (IFP967C, FHK),cargue 250 μL IVMD101 (IFP9641, FHK) para cada uno de los 6 pocillos, luego cubra con 150 μL de aceite mineral. Encube hasta que comience el IVC.
3.6.2. En un tubo de ensayo de 10 mL, cargue entre 7 a 8 mL de OCM. Cierre el tubo e incube para mantenerlo caliente antes del IVC.
3.6.3. Después del IVF por 6 horas, ubique 2.5 mL del OCM (del tubo pre incubado de 10mL) en 3 cajas esterilizadas de poliestireno de 35x10mm y cubra con aceite mineral pre incubado (opcional). Si el laboratorio se encuentra en condiciones sanitarias controladas, no hay necesidad de usar aceite mineral. Ponga todo en la placa de calentamiento a 39 °C.
3.6.4. Saque la caja del IVF del incubador. Note: Sólo mantenga la caja del IVF dentro del incubador porque la exposición prolongada de la caja de IVF fuera del incubador causará cambios en el pH del IVMD101.
3.6.5. Usando una pipeta estéril, tome los óvulos e intente removerlos de las células de esperma sobrante, pero al mismo tiempo mantenga las células cúmulos circundantes de manera intacta.
3.6.6. Lave tres veces los óvulos de las células de esperma sobrantes. Mantenga los óvulos en la tercera caja de lavado, luego saque la caja de IVC del incubador (imagen en la derecha).
3.6.7. Transfiera todos los óvulos fertilizados hacia la caja de IVC por
8 medio del lavado con las 2 gotas iniciales, luego ubíquelos en las gotas IVC definitivas. Regrese la caja dentro del incubador. Esto dentro del Día 0 de la producción de embriones in vitro.
DÍA 5 3.7. Examinación de Fisura y Cambios en el Medio IVC
3.7.1. Durante el 3cer día del cultivo in vitro, examine el ritmo de fisura y cambie el medio en las gotas de IVC.
3.7.2. En un tubo Eppedorf estéril, pre incube un IVMD101 por un periodo no menor a una hora. La cubierta debe dejarse parcialmente abierta para permitir el flujo de gases en el medio.
3.7.3. Una vez que el IVMD101 ha sido gasificado y su temperatura equilibrada, prepare una pipeta Pasteur estéril con un diámetro interior de 120-‐130 μm. Usando la misma pipeta Pasteur, libere los óvulos del grupo de células cúmulo. Remueva los óvulos que no estén abiertos junto con el cúmulo flotante y cualquier exceso de células de espermatozoide que aun se encuentren en la gota. Remueva el medio antiguo y reemplace con el IVMD101 fresco pre incubado en el tubo Eppendorf.
3.7.4. Regrese la caja IVC al incubador y déjelo allí por otros 4 días de cultivo in vitro para que los óvulos fisurados se desarrollen en embriones en estado de blastocitos.
DÍA 9 3.8. Revisión del Desarrollo de los Blastocitos
3.8.1 Esterilice la platina del microscopio estéreo con etanol al 70%.
3.8.2. Saque la caja de IVC del incubador. Revise el desarrollo de los blastocitos por medio del conteo de embriones que se han desarrollado en los estados inicial, intermedio, expandido, y eclosionando/eclosionado.
3.9. Congelado para la Identificación del Sexo en Embriones 3.9.1. Identificación del Sexo en Embriones Completos: Lave los embriones con la solución salina
fisiológica o con el OCM, luego guárdelos individualmente en un tubo Eppendorf de 0.5 a 1 mL y manténgalos en un congelador hasta que se deban usar para PCR.
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PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA LA IDENTIFICACIÓN DEL SEXO EN EMBRIONES
PERRY LORRAINE HUFANA-‐DURAN Investigadora, Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí-‐Manuel Félix López Calceta, Manabí
Académica, Departamento de Ciencia y Tecnología, Filipinas
La identificación del sexo en embriones es una técnica que se basa en la diferencia cromosomática que existe entre los embriones de sexo distinto, la presencia o ausencia del cromosoma Y (los embriones machos contienen cromosoma Y). Para resaltar esta diferencia, se debe remover un grupo pequeño de células de los embriones por medio del corte o aspiración de un número mínimo de trofoblasto. El ADN de las células recolectadas es amplificado por medio de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), lo que permite encontrar la presencia o ausencia del cromosoma masculino. Con la obtención de la señal del cromosoma Y, se debe obtener una segunda señal de control para todas las muestras analizadas independientemente del sexo. Estas señales son visibles como bandas fluorescentes después de la electroforesis de las muestras de ADN en un gel de agarosa. El resultado se interpreta por medio de la presencia de una sola banda que indica que la biopsia ha sido tomada de un embrión hembra mientras que la presencia de dos bandas indica que la biopsia ha sido tomada de un embrión macho. El procedimiento de identificación del sexo es efectivo en un 97%. Los embriones clasificados según su sexo pueden ser congelados de la misma forma en la que se hace con los embriones no clasificados.
1. Equipos
1.1. Congelador -‐20°C , que se utiliza para el almacenamiento de los embriones hasta su ensayo. 1.2. Máquina centrifugadora, que se usa para la separación de fluidos, gaseosos o líquidos, con base
en sus densidades. 1.3. Termociclador de ADN, que se usa para amplificar segmentos de ADN.
1.4. Máquina de electroforesis de gel, que se utiliza para separar y analizar las macromoléculas (DNA, RNA y proteína) y sus fragmentos, a partir de su tamaño y carga.
1.5. Vortex para suspender las células, para mezclar los agentes del ensayo. 1.6. Máquina para registro de gel, para observar los resultados del PCR después de ser usado en la
maquina de electroforesis de gel.
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2. Materiales 2.1. Tubos Eppendorf de 1.5 ml, que sirven como recipiente para embriones durante el lavado. 2.2. Tubos PCR, que se usan como recipiente donde el reactivo PCR se transfiere para ser usado en el
termociclador. 2.3. Pipetas, que se usan para transportar un volumen de liquido medido, también como un
dispensador de medio. 2.4. Puntas de pipeta, que son cambiadas con frecuencia en cada procedimiento con el objetivo de
prevenir la contaminación de los reactivos y muestras.
3. Reactivos 3.1. 100 bp de escala baja, que sirve como referencia para la estimación del tamaño del resultado del
PCR comparándolo con la banda mas cercana en la escala. 3.2. Gel de agarosa, que se usa para observar el ADN, para cuantificarlo o para aislar una banda
particular. 3.3. 5% Chelex 100, que se usa para la extracción de ADN en la preparación del PCR. 3.4. dATP, que se usa en las reacciones de síntesis de ADN. 3.5. dCTP, que se usa para la polimerasa ADN. 3.6. dGTP, que se utiliza en métodos como PCR. 3.7. dTTP, que se usa en las reacciones de síntesis de ADN tales como PCR. 3.8. Bromuro de Etidio, que se usa para visualizar el ADN en la electroforesis del gel de agarosa. 3.9. Tampón Fosfato, que se usa para lavar los blastómeros. 3.10. Imprimaciones PCR: BRY 1 e imprimaciones de secuencia de satélite especificas para bovinos,
que provee un grupo 3’-‐OH “gratis” al que el polímero de DNA puede añadir dNTPs. 4. Equipos de Protección Personal
4.1. Utilice la vestimenta apropiada durante los procedimientos que se ejecuten en el laboratorio y en el manejo de muestras (Mandil de laboratorio, guantes desechables, y máscara facial). Esto se lo hace para evitar la contaminación de las muestras y materiales.
4.2. La manipulación de las muestras y productos PCR debe hacerse dentro de la cabina de flujo laminar.
4.3. Limpie con alcohol el área donde se efectuará el procedimiento de laboratorio. 4.4. Limpie con alcohol los materiales como pipetas, antes y después de usarse. 5. Procedimientos
a. Lave los blastómeros en el PBS y transfiéralos a un tubo de micro centrifugado de 0.6mL que contiene 40mL 5% Chelex 100.
b. Las células son lisadas al hervirlas a 100 °C por 10 minutos. c. Mezcle con el vortex por 15 segundos. d. Guarde los blastómeros a -‐20 °C hasta el ensayo.
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e. Las muestras son descongeladas a temperatura ambiente y luego centrifugadas a 12000 rpm por 3 minutos antes de ser mezcladas con los reactivos PCR.
f. Las reacciones de amplificación fueron conducidas en un volumen total de 50 mL, conteniendo los tampones PCR: 200 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 0.5 unidades de Taq polimerasa ADN y 2 pares (25 mM BRY 1a, 5μM secuencia satélite).
g. La amplificación se lleva a efecto en un termociclador por 40 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 58 °C por 45 segundos y 72 °C por 10 minutos.
h. 10 μL de cada producto PCR fueron analizados en gel agarosa al 2% y tinturado con Bromuro de Etidio. El gel es visualizado por medio de iluminación ultravioleta para la banda positiva 300bp de BRY y 216bp de la secuencia satélite.
