PROBLEMI EMERGENTI NELLA VALUTAZIONE DEL RISCHIO MICROBIOLOGICO Prof. Antonello Paparella...

PROBLEMI EMERGENTI NELLA

VALUTAZIONE DEL RISCHIO

MICROBIOLOGICO

Prof. Antonello PaparellaDipartimento di Scienze degli Alimenti

Università degli Studi di Teramo

Cremona, 15 ottobre 2004

2002: ICMSF (International Commission on Microbiological

Specifications for Foods)Transizione dai sistemi HACCP alla

QRA (Analisi quantitativa del rischio)

solo per problemi sanitari rilevanti e matrici alimentari complesse

applicazione integrata di HACCP, QRA e GHP

ridimensionamento e qualificazione del controllo ufficiale

definizione degli Obiettivi di sicurezza alimentare (FSO)

FSO (Food Safety Objective)

massima frequenza e/o

carica di microorganismi di

interesse sanitario o

concentrazione di tossine al

momento del consumo

Evoluzione del mercato degli alimenti:

da unbranded commodities a

convenience foods

Tendenze nella tecnologia alimentare: applicazione estensiva di tecnologie in nuovi settori (merchandising)

Estensione della vita di scaffale (ESL)

Mild technologies (minimally processed foods)

Innovazione tecnologica: nuovi rischi microbiologici?

Salagione per microiniezione in prodotti non trattati termicamente


Semilavorati critici: carni separate meccanicamente, prodotti ricomposti, prodotti semicotti, ecc.


Distributori automatici di piatti pronti


Vendita in rete di prodotti deperibili

Ricottina al Fumo di Ginepro biologica del Parco

Forma intera (peso minimo 300 gr)

Ricottina al Fumo di Ginepro biologica del Parco € 7,00 Forma intera (peso minimo 300 gr)

AGGIUNGI IL PRODOTTO AL CARRELLO OPPURE ALLA LISTA DELLA SPESA

Valutazione del rischio

microbiologico: impatto della

biodiversità dei microrganismi

QRA: richiede piani sperimentali mirati allo studio della sopravvivenza/sviluppo di specifici ceppi microbici

Scelta dei ceppi: condiziona il rapporto tra valori predetti e valori misurati

Mild technologies: la risposta dei microrganismi ai danni subletali può essere notevolmente diversa tra ceppi e individui

Sopravvivenza ai processi della

tecnologia alimentare: patogeni ad

elevata classe di rischio

VTEC (E. coli verocitotossico o SLT): sopravvivenza a pH 3,9 (sidro, salame, maionese, ecc.)

SINDROME UREMICA EMOLITICA

INSUFFICIENZA RENALE ACUTA IN ETA’ PEDIATRICA

Dose infettante: 1 ufc g –1 (ICMSF, 2002)

Ricontaminazione post processo: patogeni

emergenti

Enterobacter sakazakii:

contaminazione di alimenti a bassa aw

(latte in polvere)

MENINGITE E SETTICEMIA NEL NEONATO

rara ma letale (tasso letalità 33-80%)segnalata correlazione epidemiologica con latte in polvere

Kandhai et al 2004: positività 9-35% in campioni ambientali da 100% stabilimenti di produzione (n=4). Positività 31% in campioni prelevati da 16 nuclei familiari.

Contaminazione di alimenti consumati

crudi

Vibrio vulnificus in OSTRICHE: può diventare vitale non coltivabile (VNC) senza perdere la virulenza (Olivier and Bockian 1995)

Abbattimento Viable Count dopo riduzione temp. a 5°C: 6D

Carica effettiva: >1 x 105 VNC ml-1

Prova biologica positiva (topo)

Effetto ac.citrico 1-10% e succo limone 50-100% (Borazjani et al 2003): abbattimento 4D ma sopravvivono >3 MPN g-1

Ieri patologia professionale

Oggi tossinfezione alimentare

Tendenzialmente ribelle al trattamento

“Patologie da frigorifero”

Listeria monocytogenes in CASI DI LISTERIOSI SPORADICA

Canada (Farber et al 2000) – Nel frigorifero dei 2 pazienti: contaminazione da L.m. sierotipo 1/2b in surimi, olive nere, insalata di pasta, ragù e maionese.

Surimi: 2,1 x 109 ufc g-1

Olive nere: 1,1 x 107 ufc g-1

Insalata di pasta: 1,3 x 106 ufc g-1

Correlazione epidemiologica con

surimiOlive nere substrato non

permissivo……MA CONTAMINATO!!

Siringatura per Siringatura per

microiniezione emicroiniezione e

biodiversità di biodiversità di

L.monocytogenes L.monocytogenes nel nel

salmone affumicatosalmone affumicato

Rischi derivanti da innovazioni

tecnologiche

Paparella et al 2003

SIRINGATURA PER SIRINGATURA PER MICROINIEZIONEMICROINIEZIONE

Possibile fonte di

contaminazione da L.

monocytogenes, a

causa del ricircolo

della salamoia e/o

della formazione di

biofilm

(soprattutto in

prodotti non destinati

a cottura!!)

BIODIVERSITA’ DI BIODIVERSITA’ DI LISTERIA MONOCYTOGENESLISTERIA MONOCYTOGENES

Gli stress applicati all’ecosistema microbico Gli stress applicati all’ecosistema microbico

esaltano le differenze di comportamento tra gli isolatiesaltano le differenze di comportamento tra gli isolati

Non tutti gli

isolati

manifestano lo

stesso potenziale

di sopravvivenza

e sviluppo!!!!

Evoluzione di isolati di L. monocytogenes (origine: industria del salmone) a 6°C in due substrati: BHI (linee continue) e Brodo di salmone (linee

tratteggiate)


Evoluzione di isolati di L. monocytogenes (origine: industria del salmone) a 9°C in due substrati: BHI (linee continue) e Brodo di salmone (linee

tratteggiate)


Effetto dell’aggiunta di estratto di lievito (3% in SBm3; 10% in SBm10) al Brodo di Salmone (SB):

ceppo LM16

SBm10

SBm3

SBs

BHI

Growth of L. monocytogenes LM16 at 10°C in BHI, SBs, SBm3, SBm10

Time (hours)

D.O

.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120


Biodiversità in isolati di L.monocytogenes provenienti dall’industria del salmone


M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 M M 17 18 19 22 23 M 24 25 26 27 28 M 29 30 31 32 33 34 M M 35 36 37 38 39 M 42 43 44 45 46 47 48 49 50 M

M e 7 = ceppi ATCC

CEPPI SALAGIONE TRADIZIONALE: 50 (2103 b1), 39 (2103 b4), 26 (2103 b6)

CEPPI MICROINIEZIONE: 31 (641/7 I), 13 (648/2 I), 48 (648/7 I)

CEPPI AMBIENTALI: 34 (LM 16), 29 (LM37)

(Vannini,Paparella,Guerzoni 2002)

Valutazione della sopravvivenza di una popolazione di L.monocytogenes in un prodotto con fisiologica eterogeneità merceologica

BIODIVERSITA’ NELLA DIVERSITA’

EFFETTO MATRICE NEI PRODOTTI A BASE DI CARNE IMPANATI PREFRITTI: RUOLO DEL GRASSO (Vannini,Paparella,Guerzoni 2002)

7

Figure 1 – Evolution of dynamometric index and survival curves of Listeria monocytogenes inoculated in poultry meat added with different percentages of fat and collagen

EFFETTO MATRICE NEI PRODOTTI A BASE DI CARNE IMPANATI PREFRITTI: RUOLO DEL COLLAGENE (Vannini,Paparella,Guerzoni 2002)

7

Figure 2a – Survival curves of Listeria monocytogenes inoculated in poultry meat added with 8% fat and 3% collagen

Figure 2b – Survival curves of Listeria monocytogenes inoculated in poultry meat added with 8% fat and 6% collagen

Test inoculazione con Listeria monocytogenes in cotolette: effetto di % grasso e % collagene a F70

10 variabile da 0 a 4 min

Aumento % collagene: effetto protettivo su L.m.POSSIBILI CAUSE:

stabilizzazione della membrana citoplasmatica

effetto tampone

riduzione della perdita di soluti

Aumento % grasso: potenziamento dell’effetto letale su L.m.POSSIBILE CAUSA:

riduzione indiretta della aw

(maggiore solubilità di H2O in grasso ad alta temp.)

I LIMITI DELL’ESAME

BATTERIOLOGICO:

LE CELLULE VITALI NON COLTIVABILI

Cellule VNC: condizione di vitalità con perdita di coltivabilità (viable not culturable)

Strategia di sopravvivenza in batteri non sporigeni. Dimostrata in Salmonella, Campylobacter, Escherichia, Vibrio, Streptococcus, Micrococcus ma anche in sporigeni come Bacillus subtilis. Riduzione volumetrica da forme coccobastoncellari a piccoli corpi sferici non dotati di involucri.

TRANSIZIONE DA VNC

A COLTIVABILE E VICEVERSA

Passaggio a VNC indotto da: carenza di nutrienti, cambiamenti di temperatura (es. refrigerazione), esposizione ad ipoclorito o modificazioni nella % NaCl. Ripristino della coltivabilità (“resuscitation”): può essere indotto da un aumento della temperatura o da un graduale incremento della % nutrienti (NO TERRENO DI ARRICCHIMENTO!).

Alla ricerca delle VNC…

Metodi per stimare la vitalità

cellulare

DEFT (Jakobsen et al 1984; Ruocco et al 1991)

Riduzione del 2,3,5-Trifeniltetrazolio (Chang et al 1999)

Colorazione CTC-DAPI (Cappelier et al 1997)

Bioscreen/Turbidometria(Phillips et al 1998;Paparella et

al 2003)

CO2 detection time in GC (Guerzoni et al 1985)

Citometria di flusso (Petrova e Donnelly, 2004)

METODO DEFT(Direct Epifluorescence Filter Technique)

Principio: i microorganismi, filtrati su membrana, trattati con fluorocromo ed osservati in epifluorescenza, assumono colore in funzione di RNA e permeabilità della parete

Utilizzando l’arancio di acridina, le cellule vitali assumono una colorazione giallo-arancio mentre quelle inattivate appaiono verdi

METODO DEFT

Parametro: n° cellule in almeno 15 campi

microscopici

U.M.: numero DEFT (batteri vitali)

Tempo di analisi: 30 min

Sensibilità (con risposta lineare):5 x 103-1 x

104ufc g-1

Correlazione con metodi tradizionali: R=0,89

(Ruocco, 1991), R=0,99 (Jakobsen, 1984)

Varianti: manuale ed automatico

DEFT:BIOFILM DI LISTERIA MONOCYTOGENES

Studio del danno acido e termico in Studio del danno acido e termico in L.monocytogenesL.monocytogenes con citometria di flusso con citometria di flusso

(Petrova and Donnelly 2004)(Petrova and Donnelly 2004)

DOPPIA COLORAZIONE:

Carbossifluoresceina diacetato (cFDA) attività

esterasica

Propidio ioduro (PI) danno di membrana

L.monocytogenes, esposta a diversi trattamenti termici

e acidi, si divideva in 3 sottopopolazioni:

VITALE: cFDA-positiva

DANNEGGIATA: PI-positiva e cFDA-positiva

INATTIVATA: PI-positiva

Studio del danno da olio essenziale in Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenesL.monocytogenes con riduzione del 2,3,5- con riduzione del 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (Paparella trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et alet al

2004)2004)

AGGIUNTA DI TTC AL TERRENO COLTURALE LIQUIDO:

Riduzione del TTC (incolore, idrosolubile)

formazano (rosso, insolubile)

Valutazione quantitativa della vitalità cellulare

(deidrogenasi)

- usata in studi di fisiologia vegetale -

Numerosi ceppi di L.monocytogenes sono stati esposti a

diverse % olii essenziali. La Minimal Inhibitory

Concentration (MIC) è stata valutata, in un primo

screening, con TTC.

Studio del danno da olio essenziale in Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenesL.monocytogenes con riduzione del 2,3,5- con riduzione del 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (Paparella trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et alet al

2004)2004)

Paparella Paparella et alet al 2004 2004

BIOCONSERVAZIONE DEGLI

ALIMENTI

Tecnologie per la prevenzione della contaminazione e dello sviluppo di microrganismi negli alimenti, attraverso l’uso di:

sostanze antimicrobiche naturalmente presenti negli alimenti

sostanze antimicrobiche prodotte negli alimenti dopo stimolazione fisica o chimica, oppure in seguito all’aggiunta di colture microbiche protettive

Colture protettive

Colture microbiche che possono

essere aggiunte agli alimenti al

fine di inibire microrganismi

indesiderati, senza modificare le

caratteristiche tecnologiche e

sensoriali del prodotto

Invece, nelle colture starter,

la modificazione delle

caratteristiche fisico-chimiche

è desiderata

Inibizione da LAB verso L. monocytogenes

LAB Listeria monocytogenes 641/6 II 2103 b1 2103 b6 648/7 II 641/7 I 648/2 I 659/4III

A 202 - ++ ++ ++ +++ - ++

A 203 - ++ ++ +++ ++ - ++

A 205 - +++ +++ - +++ - ++

A 211 - +++ ++ - +++ ++ ++

A 213 ++ ++ ++ ++ - - +++

B 202 ++ - - - ++ - ++

B 213 +++ ++ ++ +++ +++ +++ ++

LAT 5 +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++

LAT 7 + +++ +++ +++ ++ - +++

LAT 8 ++ +++ +++ +++ ++ ++ +++

LAT 12 ++ ++ +++ +++ - ++ +++

LAT 15 + +++ +++ +++ ++ - ++

LAT 16 ++ ++ +++ ++ ++ +++ ++

LAT 22 ++ ++ ++ ++ - - +++

LAT 28 +++ ++ + ++ ++ ++ +++

LAT 31 +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++

LAT33/2 +++ + ++ ++ + ++ ++

LAT 35 +++ ++ ++ ++ +++ ++ ++

LAT 38 +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++

LAT 40 +++ ++ +++ +++ +++ - ++

Valutazione dell’antagonismo tra LAB e Listeria monocytogenes (tutti isolati da salmone

affumicato)


BIOCONSERVAZIONE CON OLII ESSENZIALI

In genere: NO Residui tossici SI Modifica sensoriale

Interesse verso olii dearomatizzati o efficaci a

bassa conc.

Meccanismo di azione non sempre conosciuto

Componenti idrofobici di alcuni olii essenziali

possono oltrepassare la parete dei Gram neg.

attraverso le porine (Helander et al 1998) per poi

modificare la permeabilità di membrana con effetti

letali (Lambert et al 2001)

Azione selettiva degli estratti vegetali

Effetto inibente dell'estratto acquoso di origano

0

2

4

6

8

10

12

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Quantità fenoliche

LO

G U

FC

/ml

S.warneri

L.monoc.

S.aureus


Effetto degli olii essenziali di salvia e rosmarino su differenti specie di Staphylococcus (Paparella et al

2004)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

log cfu mL-1

0 0.00036 0.00072 0.0018 0.00252 0.0036 0.0108 0.018 0.0252 0.036

concentration (%)

S. aureus S. saprophyticus S. xylosus S. warneri

Influence of sage EO on the survival of Staphylococcus spp.


2004)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

log cfu mL-1

0 0.00036 0.00072 0.0018 0.00252 0.0036 0.0108 0.018 0.0252 0.036

concentration (%)

S. aureus S. saprophyticus S. xylosus S. warneri

Influence of rosemary EO on the survival of Staphylococcus spp.


2004)

Time (min)

S. aureus S. warneri S. xylosus S. saprophyticus

Sage

Rosemary

Sage

Rosemary

Sage

Rosemary

Sage

Rosemary

0 7.32 0.60* 7.32 0.60 7.30 0.28 7.30 0.28 7.50 0.04 7.50 0.04 7.60 0.15 7.6 0.15 1 5.01 0.36 4.04 0.12 4.14 0.18 5.10 0.19 4.09 0.14 5.00 0.25 4.03 0.11 5.12 0.19

30 2.51 0.06 NVC 2.05 0.03 3.00 0.51 1.20 0.36 NVC 2.99 0.22 NVC 60 NVC** NVC 1.12 0.12 NVC NVC NVC NVC NVC 90 NVC NVC NVC NVC NVC NVC NVC NVC

120 NVC NVC NVC NVC NVC NVC NVC NVC

*Mean SD.; **No viable cell growth was detected (detection limit: 10 cfu mL-1)

CONCLUSIONI

QRA: richiede ingenti risorse

economiche ed un notevole

sviluppo culturale delle imprese

alimentari

L’innovazione tecnologica può

risolvere oppure creare nuovi

rischi alimentari

CONCLUSIONI

La gestione dei rischi alimentari

deve fare i conti con la

biodiversità dei microrganismi

Sarebbe necessario promuovere

la collezione e caratterizzazione

dei ceppi microbici più

significativi per la produzione

alimentare (utili – degradativi –

patogeni)

CONCLUSIONI

La bioconservazione degli

alimenti può offrire

interessanti opportunità per

uno sviluppo sostenibile della

tecnologia alimentare

Grazie

per l’attenzione!

PROBLEMI EMERGENTI NELLA VALUTAZIONE DEL RISCHIO MICROBIOLOGICO Prof. Antonello Paparella...

Documents

Transcript of PROBLEMI EMERGENTI NELLA VALUTAZIONE DEL RISCHIO MICROBIOLOGICO Prof. Antonello Paparella...