Development of real-time PCR technique for the estimation of population density of Pythium intermedium in forest soils Mingzhu Li, Masako Senda, Tsutomu Komatsu, Haruhisa Suga, Koji Kageyama

Presented by :

Ratna Juwita 1509 100 032

Dita Dwi Aprillia 1509 100 068

Sitatun Zunaidah 1509 100 706

P

R

S

D

T

INTRODUCTION

Pythium intermedium

PCR konvensional

real-time PCR

MATERIALS AND METHODS

Isolates and strain maintenance

Collection and preparation of soil

DNA extraction from mycelia

Cloning and sequencing

Primer design

Conventional PCR

Real-time PCR

Soil DNA extraction and purification

Isolates and strain maintenance

12 isolat P. intermedium

36 isolat dari 29 spesies Pythium yang lain

10 isolat dari 8 spesies dari genus yang lain

Corn meal agar

Collection and preparation of soil

200 gr sampel tanah

Dikumpulkan dan disimpan pada suhu 5 C⁰

pH pada 1 M potassium cloride

Populasi P. intermedium diplating dari tanah ke medium

Pythium-selective

DNA extraction from myceliaIsolat Pythium

ditumbuhkan pada medium corn meal atau potato dextrose broth dalam 4-7 hari pada 25 C hingga menghasilkan mycelial mass⁰

diinkubasi 50 C selama 30 menit dan dimasukkan suspensi 3M NaOAc⁰

divortex dan diletakkan di es 15 menit

Suspensi disentrifuge dan supernatan diletakkan dalam tabung, kemudian disentrifuge lagi

Lapisan endapan DNA ditambah etanol dan disentrifuge

DNA pellet dibilas dengan etanol, disentrifuge dan dikeringkan

Terakhir DNA ditutup dalam buffer

Cloning and sequencing

• Penjelasan DNA yang dikloning pada pT7Blue T-vector dengan ligation kit menurut intruksi pabrik

• Daerah kloning ITS menjelaskan penggunaan primer M13M4 dan M13Rv

Primer design

• Pengumpulan dari Pythium urutan daerah ITS, mencakup 5 isolat P. intermedium dan 39 isolat dari 39 spesies yang lain yang digunakan untuk primer design

• Urutan blok dan potensial primer lain dianalisis untuk struktur dimer dan haairpin loop

Conventional PCR

• Reaksi campuran yang mengandung primer, DNA polimerase, campuran dNTP, PCR buffer, dan DNA template dalam dalam volume 25 µL

• Primer ITS 1 dan ITS 4 digunakan untuk menjelaskan daerah ITS dalam siklus panas DNA pada 94 C 5 menit, diikuti 35 reaksi ⁰denaturasi pada 94 C detik, pendinginan 65 ⁰C 30 detik, dan pemanjangan 72 C 1 menit, ⁰ ⁰

dan terakhir pemanjangan 72 C 10 menit⁰• Ukuran yang terkandung diujikan dengan

elektroforesis pada media agarose L03. media pewarna menggunakan ethidium bromide and photographed under ultraviolet light.

Real-time PCR

• Jumlah DNA untuk sampel yang lain digunakan SYBR Premix Ex TaqTM II dengan sistem deteksi sequence ABI PRISM dalam volume 50 µL

• Real-time PCR dikonduksi dalam 95 C 10 ⁰menit (1 siklus), diikuti 94 C 30 detik, 65 ⁰C 31 detik dan 72 C 1 menit (40 siklus)⁰ ⁰

• Pengujian spesifik dilakukan pembangkit garis disosiasi sebelum penjelasan

• Garis peleburan diperoleh dari program ABI PRISM 7000 sistem deteksi sequence

Soil DNA extraction and purification

Tanah diambil medan

magne-tik  berupa manik2 

Langkah purifikasi Mag extraktor

(Kageyama,et.al. 2003)

Result

Primer design and specificity for P. intermedium

Pf002 Pr002b

P. intermedium

Konvensional PCRHasil spesifikasi yang dikonfirmasi 10 isolatP.intermedium dan 17 isolat dari spesies lain

dengan metodereal-time PCR . Ditampilkan pada tabel 2. 

Nuclear rDNA copy number

Kuantifikasi ITS region hanya dapat ditentukan jika tidak ada variasi yang tampak dalam rDNA copy number diantara isolat P. intermedium.

Untuk membandingkan jumlah salinan antara isolat P.intermedium dilakukan dengan evaluasi nilai Ct (Tabel 3).

DNA diekstraksi dari lima isolat dan diberi konsentrasi Ct values10 ng / mL. Nilai Ct berkisar dari 11.01 -11,69 di antara lima isolat (Tabel 3).

Sebagai kontrol lanjut , diamplifikasi DNA dari empat tambahan isolat, dengan konsentrasi Ct values 1ng/mL dengan rentang (15,34-15,54)

Rentang kecil nilai Ct dihasilkan dari konsentrasi DNA normal menunjukkan kemiripan tiap salinan pada ITS region isolat. P.intermedium

Sensitivity and standard curve

Empat isolat P.intermedium digunakan untuk 

mengestimasi detection limits dengan metode real-time PCR

Setiap isolat  dengan konsentrasi DNA template 1 ng memiliki detection limits 10 fg (10 kali lipat seri pengenceran DNA  template ) 

Beberapa isolat P.intermedium dapat dideteksi pada 1 fg DNA template (hasil tidak ditunjukkan) karena amplifikasi pada tingkat ini kurang akurat

Kurva standar yang dihasilkan menggunakan range DNA dari 4 isolat 10 fg -1ng. Gradien garis pada 4 isolat berkisar 3,669-3,932, dan efisiensi amplifikasi dari semua 4 isolat lebih dari 80% dengan koefisien korelasi yang tinggi (R² : A, 0,998; B, 0,999, C, 0,995; D, 0,999). 

Artinya Ct values pada semua konsentrasi sangat konsisten, pada koefisien correlation 0,994 dan efisiensi amplifikasi dari 84% (Figure2). 

Efisiensi amplifikasi DNA copy number pada P.intermedium sangat tinggi dan sangat mirip meskipun isolat berasal dari host dan lokasi geografis yang berbeda .

Real-time PCR for natural infested soil samples

• Menggunakan 11 sampel tanah yang diperoleh dari tempat yang berbeda di kota Gifu dan Mie

• Konsentrasi DNA ditentukan dengan metode real-time PCR.

• Dibuat kurva standart untuk mengetahui adanya korelasi antara kepadatan populasi Pythium intermedium dengan konsentrasi DNA

Terdapat korelasi yang signifikan antara kerapatan populasi Pythium intermedium dan konsentrasi DNA. Sehingga metode Real-time PCR dan ektrasi DNA dapat dikatakan cukup akurat untuk penentuan estimasi kerapatan populasi Pythium intermedium.

Practical use of the developed procedure to determine the distribution of P.intermedium in forest soils

Estimasi kepadatan populasi P.intermedium dilakukan pada hutan heterogen dan hutan cedar dengan membuat plot 30x30 m dan dibagi menjadi 9 subplot. Kemudian diambil 25 sampel tanah pada 4 subplot secara acak.

25 sampel tanah ditentukan kepadatan populasi pada setiap sample dengan rel-time PCR dan extrapolation algorithm

25 sampel tanah dicampur dan ditentutkan kepadatan populasi pada setiap sample dengan rel-time PCR dan extrapolation algorithm

Kepadatan populasi P.intermedium ditentukan dengan cara soil dilution plating

Menggunakan 3 metode yaitu :

Discussion

• Uji kuantitatif yang dikembangkan untuk menentukan kepadatan populasi Pythium intermedium dengang metode rel-time PCR dan ekstrasi DNA yang dilakukan bersama memiliki proses yang lebih cepat dan akurat.

• Dengan analisis regressi dapat digunakan untuk mengetahui konsentrasi DNA yang memiliki korelasi yang signifikan dengan kepadatan populasi Pythium intermedium

• Nilai kepadatan populasi yang diperoleh dari sample tanah yang telah dicampur dengan metode PCR hampir sama dengan metode dilution plating walaupun hasil dari PCR sedikit lebih besar.

Terimakasih