Preferential Uptake of Soluble and Membrane-Bound.pdf

8/14/2019 Preferential Uptake of Soluble and Membrane-Bound.pdf

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A m e r i c a n J o u r n a l o f P a t h o l o g y , V o l . 1 3 6 , N o . 1 , January 1990C o p y r i g h t American A s s o c i a t i o n o f P a t h o l o g i s t s

S c h w a n n C e l l s a n d M y a s t h e n i a G r a v i sP r e f e r e n t i a l U p t a k e o f S o l u b l e a n d M e m b r a n e - B o u n dAChR b y N o r m a l a n d I m m o r t a l i z e d S c h w a n n C e l l s ,a n d I m m u n o g e n i c P r e s e n t a t i o n t o A C h R - S p e c i f i cT L i n e L y m p h o c y t e s

Y i p i n g Z h a n g , * S e t h P o r t e r , ta n d H a r t m u t W e k e r l e *From t h e M a x - P l a n c k - G e s e l l s c b a f t C l i n i c a l R e s e a r c h U n i tf o r M u l t i p l e S c l e r o s i s , W i u r z b u r g , F e d e r a l R e p u b l i c o fG e r m a n y , * and A t h e n a N e u r o s c i e n c e s I n c . ,San C a r l o s , C a l i f o r n i a t

T h e normal n e u r o m u s c u l a r s y n a p s e i s formed b yt h e i n t i m a t e a s s o c i a t i o n o f n e r v e e n d i n g s , p o s t s y n -a p t i c e n d - p l a t e f o l d i n g s i n t h e m u s c l e f i b e r , andn o n m y e l i n a t i n g Schwann c e l l s ( S C ) s e a l i n g t h es y n a p t i c r a mi f i c a ti o ns . B e c a u s e S C h a v e b e e n r e c -o g n i z e d r e c e n t l y t o h a v e an immunogenic p o t e n -t i a l i n d u c i b l e t o p r e s e n t p r o t e i n a u t o a n t i g e n s t oautoimmune T l y m p h o c y t e s , and c o n s i d e r i n g t h e i rc l o s e p r o x i m i t y t o t h e a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r( A C h R ) - b e a r i n g p o s t s y n a p t i c membranes, p r e s e n -t a t i o n o f s o l u b l e a nd m em br an e v e s i c l e - b o u n dAChR t o a p p r o p r i a t e T c e l l s was i n v e s t i g a t e d . S h o r t -term monolayer c u l t u r e s o f S C i s o l a t e d from n e o -n a t a l r a t s c i a t i c n e r v e s , a s w e l l a s c e l l s o f an i m -m o r t a l i z e d S C l i n e o f s i m i l a r o r i g i n , w e r e f u l l y a b l et o p r e s e n t t h e r e l e v a n t m o l e c u l a r e p i t o p e s t o majorh i s t o c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x (MHC) c o m p a t i b l eA C h R - s p e c i f i c T l i n e l y m p h o c y t e s immunogeni-c a l l y . P r e s e n t a t i o n o f A C h R w as r e s t r i c t e d b y R T I . B( I - A ) MHC c l a s s I I p r o d u c t s . B o t h t y p e s o f c u l t u r e dr a t S C were i n d u c i b l e t o e x p r e s s i o n o f MHC c l a s s Iand I I p r o d u c t s , and t h e y were a b l e t o p h a g o c y t o s eA C h R - e n r i c h e d m e m b r a n e v e s i c l e s p r e f e r e n t i a l l y .I n c o n t r a s t , p h a g o c y t o s i s o f l a t e x p a r t i c l e s b y S Cw as n e g l i g i b l e . T h e s e d a t a q u a l if y p e r i s y n a p t i c S Ca s p o t e n t i a l p r e s e n t e r c e l l s o f autoimmunogenicAChR i n m y a s t h e n i a g r a v i s . T h u s , S C m a y p l a y ac r i t i c a l and a s - y e t u n p r e d i c t e d r e g u l a t o r y r o l e i nt h e c e l l u l a r p a t h o g e n e s i s o f m y a s t h e n i a g r a v i s .( A ml P a t h o l 1 9 9 0 , 1 3 6 : 1 1 1 - 1 2 2 )

M o s t c u r r e n t s t u d i e s o f t h e i m m u n o l o g i c p r o p e r t i e s o f t h ea c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r ( A C h R ) i n e x p e r i m e n t a l a n d c l i n i c a lm y a s t h e n i a g r a v i s ( M G ) h a v e f o c u s e d o n d e t e r m i n a t i o no f t h e m a j o r i m m u n o g e n i c r e g i o n , 1 - 3 o r , m o r e r e c e n t l y , o nt h e T c e l l r e s p o n s e t o d o m i n a n t a u t o i m m u n o g e n i c e p i -t o p e s 4 1 1 o n AChR m o l e c u l e s . M u c h l e s s a t t e n t i o n h a sb e e n p a i d t o t h e m e c h a n i s m s o f a u t o a n t i g e n p r e s e n t a t i o nb y t h e c e l l e l e m e n t s f o r m i n g t h e l o c a l m i c r o e n v i r o n m e n ta r o u n d A C h R - b e a r i n g m e m b r a n e s . R e c e n t s t u d i e s h a v ea n a l y z e d t h e t h y m i c m i c r o e n v i r o n m e n t s , w h i c h a r e m o s tl i k e l y t h e s i t e o f t h e i n i t i a l s t a g e s o f t h e m y a s t h e n o g e n i ca u t o i m m u n e p a t h o g e n e s i s , 1 2 - 1 4 b u t , t o o u r k n o w l e d g e , n oc o m p a r a b l e w o r k h a s b e e n f o c u s e d o n t h e c e l l u l a r e l e -m e n t s s u r r o u n d i n g t h e n e u r o m u s c u l a r e n d - p l a t e .A p a r t f r o m t h e e n d - p l a t e a n d n e r v e e n d i n g s , n o n m y e l i -n a t i n g S c h w a n n c e l l s ( S C , ' t e l o c y t e s ) a r e t h e c e l l s m o s tc l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e n e u r o m u s c u l a r s y n a p s e , 1 5a n d t h u s t h e y a r e m o s t c l o s e l y l o c a t e d t o t h e p o t e n t i a ls o u r c e o f t h e m y a s t h e n o g e n i c a u t o a n t i g e n , A C h R . T h ei m m u n o g e n i c p r o c e s s i n g a n d p r e s e n t a t i o n o f A C h R h a sb e e n s t u d i e d u s i n g n o r m a l n e o n a t a l r a t SC a n d t h e i m m o r -t a l i z e d SC l i n e 1 . 1 7 , w h i c h d i s p l a y s m o s t o f t h e f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c s o f p r i m a r y S C c u l t u r e s . 1 6 1 7 T h i s s t u d yd e m o n s t r a t e s t h a t A C h R - b o u n d v e s i c l e s a r e e n g u l f e d b yS C s w i t h i n t h r e e h o u r s . I n i n t e r f e r o n - g a m m a ( I F N - - y ) - i n -d u c e d S C , s o l u b l e a n d m e m b r a n e - b o u n d AChR a r e p r o -c e s s e d a n d t h e i r a u t o i m m u n o g e n i c e p i t o p e s a r e p r e -s e n t e d t o a p p r o p r i a t e A C h R - s p e c i f i c T l y m p h o c y t e s .T h u s , SC a r e q u a l i f i e d a s p o t e n t i a l l o c a l m o d u l a t o r y e l e -m e n t s i n t h e c e l l u l a r p a t h o g e n e s i s o f M G .

S u p p o r t e d b y t h e H e r m a n n a n d L i l l y S c h i l l i n g F o u n d a t i o n . S P was t h e r e -c i p i e n t o f a J u n i o r I n v e s t i g a t o r A w a r d f r o m t h e N a t i o n a l N e u r o f i b r o m a t o s i sF o u n d a t i o n , New Y o r k , N Y .

A c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n A u g u s t 2 3 , 1 9 8 9 .A d d r e s s r e p r i n t r e q u e s t s t o P r o f . D r . H a r t m u t W e k e r l e , M a x - P l a n c k

I n s t i t u t e f o r P s y c h i a t r y um K l o p f e r s p i t z 1 8 , D - 8 0 3 3 M a r t i n s r i e d , F R G .

1 1 1


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1 1 2 Z h a n g , P o r t e r , a n d W e k e r l eAJPJanuary 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . 1

M a t e r i a l s a n d M e t h o d sA n i m a l sF e m a l e L e w i s r a t s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e b r e e d i n g f a c i l i -t i e s o f t h e M a x - P l a n c k - l n s t i t u t e f o r I m m u n o b i o l o g y , ( F r e i -b u r g , F R G ) a n d w e r e u s e d a t 8 t o 1 2 weeks o f a g e .

C u l t u r e M e d i aF o r l y m p h o c y t e c u l t u r e s , we u s e d as t h e c o m p l e t e m e -d i u m ( C M ) , D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s medium( G I B C O , G r a n d I s l a n d , N Y ) , s u p p l e m e n t e d w i t h 5 X 1 0 - 5M 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ( S e r v a C h e m i e , H e i d e l b e r g , F R G ) ,1 0 0 U / m l p e n i c i l l i n , 1 0 0 j i g / m l s t r e p t o m y c i n , 2 nM L - g l u t a -m i n e , a n d 1 v o l / v o l n o n e s s e n t i a l a m i n o a c i d s ( 1 O O X ) ,a l l f r o m G I B C O .

F o r S C l i n e c u l t u r e , t h e N2 m e d i u m w a s u s e d . 1 8 I t i s a1 : 1 m i x t u r e o f a D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s medium a n dF 1 2 medium s u p p l e m e n t e d w i t h i n s u l i n ( 5 , g / m l ) , t r a n s -f e r r i n ( 1 0 0 , u g / m l ) , p r o g e s t e r o n e 2 0 n M ), p u tr e sc i ne ( 1 0 0n M ) , a n d s o d i u m s e l e n i t e ( 3 0 n M ) .

P r e p a r a t i o n o f AC h R f r o m T o r p e d o c a l i f o r n i c aA C h R w e r e i s o l a t e d f r o m e l e c t r i c organs o f T o r p e d o c a l i -f o r n i c a ( P a c i f i c B i o m a r i n e L a b , V e n i c e , C A ) u s i n g t h em e t h o d o f R u c h e l , W a t t e r s , a n d M a e l i c k e . 1 9 B r i e f l y , T r i t o nX s o l u b i l i z e d membrane e x t r a c t s w e r e a f f i n i t y - b o u n d onc o b r a - a - t o x i n - c o u p l e d s e p h a r o s e 6B c o l u m n s , a n de l u t e d w i t h h e x a m e t h o n i u m b r o m i d e . T h e q u a l i t y o f t h ep r e p a r a t i o n s was a s s e s s e d b y b o t h SDS g e l e l e c t r o p h o -r e s i s , a n d an 1 2 5 - l - a - b u n g a r o t o x i n ( a B g t ) r a d i o i m m u n o -a s s a y . S p e c i f i c a c t i v i t i e s o f t h e p r e p a r a t i o n s r a n g e d f r o m4 t o 6 n M o l a B g t b i n d i n g s i t e s / m g p r o t e i n .

A C h R - E n r i c h e d Membrane V e s i c l e sT h e p r o c e d u r e o f E l l i o t t e t a l 2 0 w m o d i f i e d as f o l l o w s .E l e c t r i c organ t i s s u e ( 5 0 g ) was m i n c e d i n 1 5 0 m l o f c o l dp h o s p h a t e b u f f e r a n d t h e n f u r t h e r h o m o g e n i z e d b ymeans o f a V i r t i s 60K t i s s u e h o m o g e n i z e r ( f i v e p e r i o d s o f2 0 s e c o n d s a t 4 0 , 0 0 0 rpm w i t h t w o - m i n u t e i n t e r v a l s ) . T h eh o m o g e n a t e was f i r s t c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 5 0 0 0 ga n d t h e n p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 5 0 , 0 0 0 g f o r 9 0 m i n -u t e s a t 4 C . T h e p e l l e t was r e s u s p e n d e d i n a g l a s s h o -m o g e n i z e r i n a p p r o x i m a t e l y 2 0 0 m l b u f f e r a n d c e n t r i -f u g e d . T h e f i n a l p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d b y m a n u a l h o -m o g e n i z a t i o n i n 2 t o 3 m l o f b u f f e r , y i e l d i n g t h e membranev e s i c l e h o m o g e n a t e . S p e c i f i c A C h R a c t i v i t i e s o f t h e mem

b r a n e h o m o g e n a t e r a n g e d f r o m 1 t o 2 n M o l a B g t b i n d i n gs i t e s / m g p r o t e i n .

S c h w a n n C e l l C u l t u r eS c i a t i c n e r v e s w e r e d i s s e c t e d f r o m 1 t o 3 - d a y - o l d L e w i sr a t s , m i n c e d , a n d i n c u b a t e d t w i c e i n a p r o t e a s e m e d i u mmade u p o f 0 . 1 c o l l a g e n a s e ( B o e h r i n g e r , M a n n h e i m ,F R G ) a n d 0 . 2 5 t r y p s i n ( G I B C O ) a t 3 7 C f o r 3 0 m i n u t e si n c a l c i u m a n d m a g n e s i u m - f r e e p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a -l i n e ( P B S ) . T h e s e m i - d i g e s t e d t i s s u e s w e r e w a s h e d a n dd i s s o c i a t e d f u r t h e r b y m i l d t r y p s i n i z a t i o n . 2 6 T h e c e l l s w e r ec u l t u r e d i n C M p l u s 1 f r e s h r a t s e r u m . F o r f u n c t i o n a la s s a y s , 1 X 1 0 4 f r e s h l y i s o l a t e d SC w e r e f i r s t c u l t u r e di n f l a t - b o t t o m F a l c o n m i c r o t i t e r p l a t e s ( 9 6 w e l l s , F a l c o n ,O x n a r d , C A ) i n a t o t a l v o l u m e o f 2 0 0 u l i n t h e p r e s e n c e o ra b s e n c e o f 5 0 U / m l r e c o m b i n a n t r a t I F N - , y ( o b t a i n e d f r o mt h e B o e h r i n g e r I n s t i t u t e , V i e n n a , A u s t r i a ) . A f t e r 2 4 h o u r s ,t h e s e c u l t u r e s w e r e u s e d f o r T c e l l p r o l i f e r a t i o n t e s t s .

F o r m o r p h o l o g i c s t u d i e s , 2 x 1 0 4 SC w e r e p l a t e d i n4 0 0 A l C M o n 8 - c h a m b e r L a b - T e k g l a s s s l i d e s ( M i l e s S c i -e n t i f i c , N a p e r v i l l e , I L ) . SC w e r e i d e n t i f i e d b y t h e i r c a p a c i t yt o b i n d a n t i b o d i e s a g a i n s t g a l a c t o c e r e b r o s i d e . O u r c u l -t u r e s c o n t a i n e d l e s s t h a n 10 T h y - 1 - p o s i t i v e f i b r o b l a s t sa n d n o d e m o n s t r a b l e m a c r o p h a g e s .

SC l i n e s 1 . 1 7 was d e r i v e d f r o m a p r i m a r y e m b r y o n i cS p r a g u e - D a w l e y r a t s c i a t i c n e r v e SC c u l t u r e b y r e p e t i t i v em i t o g e n i c s t i m u l a t i o n . I t s c h a r a c t e r i s t i c s h a v e b e e n d e -s c r i b e d p r e v i o u s l y . 1 6 C u l t u r e s o f SC l i n e 1 . 1 7 w e r e k e p ti n v i t r o c o n t i n u o u s l y f o r l o n g e r t h a n 1 8 m o n t h s w i t h n oa p p a r e n t d e c l i n e i n g r o w t h r a t e o r v i a b i l i t y .

P e r i t o n e a l E x u d a t e C e l l sP e r i t o n e a l e x u d a t e c e l l s ( P E C ) w e r e o b t a i n e d f r o m n o r m a lh e a l t h y L e w i s r a t s . T h e p e r i t o n e a l c a v i t y w a s r i n s e d w i t ha p p r o x i m a t e l y 1 0 0 m l s e r u m - f r e e C M . T h e c e l l s w e r ew a s h e d t w i c e b e f o r e b e i n g i n c u ba t e d o n p l a s t i c d i s h e s i nC M p l u s 5 f e t a l c a l f s e r u m ( F C S ) f o r t w o h ou r s a t 3 7 Ci n 5 C O 2 . T h e n o n a d h e r e n t c e l l s w e r e r e m o v e d b y t h r e ew a s h e s w i t h 3 7 C p r e w a r m e d m e d i u m , a n d t h e a d h e r e n tc e l l s w e r e c o l l e c t e d i n C M . T h e n 2 X 1 0 4 a d h e r e n t c e l l sw e r e p l a t e d i n 8 - c h a m b e r s l i d e s i n t h e p r e s e n c e o f r e c o m -b i n a n t r a t I N F - y ( 5 0 U / m l ) . A f t e r 2 4 h o u r s t h e s e c u l t u r e sw e r e u s e d f o r p h a g o c y t o s i s a s s a y s .

C o n t i n u o u s A C h R - S p e c i f i cCD4+ T H e l p e r C e l l L i n eE s t a b l i s h m e n t a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e A C h R - s p e c i f i cT c e l l l i n e L - R h a v e b e e n d e s c r i b e d . 6 I t was d e r i v e d a c -


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S c h w a n n C e l l s i n M y a s t h e n i a G r a v i s 1 1 3A J P J a n u a r y 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . I

c o r d i n g t o t h e p r i n c i p l e s o f B e n - N u n , W e k e r l e , a n d C o -h e n , 2 3 f r o m t h e l y m p h n o d e s o f a L e w i s r a t i m m u n i z e dw i t h AChR i n F r e u n d ' s c o m p l e t e a d j u v a n t ( F C A ) . T h ep r i m e d l y m p h o c y t e s w e r e i n c u b a t e d f o r t h r e e d a y s i n C Mp l u s 1 n o r m a l s y n g e n e i c r a t s e r u m i n t h e p r e s e n c e o fT o r p e d o AChR ( 2 , g / m l ) . A f t e r t h r e e d a y s i n c u l t u r e , t h ea c t i v a t e d b l a s t c e l l s w e r e s e p a r a t e d f r o m t h e i r r e l e v a n tr e s t i n g c e l l s b y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n . C e l l s a t t h e g r a d i -e n t i n t e r f a c e w e r e c o l l e c t e d , w a s h e d t h r e e t i m e s , a n d c u l -t u r e d i n C M w i t h 1 0 T c e l l g r o w t h f a c t o r ( T C G F , s u p e r -n a t a n t o f C o n A - a c t i v a t e d mouse s p l e e n c u l t u r e s ) , a n d15 h e a t - i n a c t i v a t e d h o rs e s e r u m . T h e c e l l s w e r e r e s t i m -u l a t e d w i t h a n t i g e n a n d i r r a d i a t e d t h y m u s c e l l s a f t e r t e nd a y s . R e s t i m u l a t i o n a n d e x p a n s i o n c y c l e s w e r e r e p e a t e de v e r y 1 0 t o 1 4 d a y s .

T C e l l P r o l i f e r a t i o n A s s a yA n t i g e n - s p e c i f i c T c e l l p r o l i f e r a t i o n w a s a s s e s s e d b y c o -c u l t u r i n g a n t i g e n - s p e c i f i c T l i n e c e l l s ( 1 X 1 0 4 / w e l l ) , a n da n t i g e n p r e s e n t i n g c e l l s ( i r r a d i a t e d t h y m u s c e l l s , 1 X 1 0 6 /w e l l ; o r S C , 1 X 1 0 4 / w e l l ) , a n d a n t i g e n i n o p t i m a l c o n c e n -t r a t i o n s i n 2 0 0 i L l o f m e d i u m i n f l a t - b o t t o m e d m i c r o t i t e rp l a t e s ( N u n c , R o s k i l d e , D e n m a r k ) . A f t e r 4 8 h o u r s , t h e c u l -t u r e s w e r e l a b e l e d w i t h t r i t i a t e d t h y m i d i n e ( 0 . 2 , u C i / w e l l ) .T h e c u l t u r e s w e r e h a r v e s t e d 1 2 t o 1 8 h o u r s l a t e r w i t h aT i t e r t e k m u l t i p l e h a r v e s t e r ( F l o w L a b o r a t o r i e s , I r v i n e , S c o t -l a n d ) . R a d i o a c t i v i t y w a s q u a n t i f i e d i n a b e t a s c i n t i l l a t i o nc o u n t e r .

M e m b r a n e S u r f a c e A n t i g e n o f S c h w a n n C e l l sT h e m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x ( M H C ) c l a s s a n d 1 1s u r f a c e m a r ke r o n S C s was a s s e s s e d b e f o r e a n d a f t e rI F N - y i n d u c t i o n ( 5 0 U / m l ) b y i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s -c e n c e u s i n g mouse a n t i - r a t m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s ( M A b ,c l a s s O X 1 8 , c l a s s 1 1 O X 3 , O X 6 ) , a n d F I T C - l a b e l e d r a t a n t i -mouse I g G a n t i b o d i e s ( D i a n o v a , H a m b u r g , F R G ) I m m u -n o f l u o r e s c e n c e was m e a s u r e d w i t h a C y t o f l u o r o g r a p hS y s t e m 3 0 - 5 0 ( O r t h o I n s t r u m e n t s , W e s t w o o d , M A ) . B e -f o r e s t a i n i n g , d i s s o c i a t e d S C s u s p e n s i o n s w e r e r e c o v -e r e d i n s e r u m - f r e e m e d i u m b y m i l d t r y p s i n i z a t i o n o f 1 . 1 7c e l l c u l t u r e s w i t h t r y p s i n - E D T A s o l u t i o n ( G I B C O ) .L a b e l i n g o f A C h R - B o u n d M e m b r a n eV e s i c l e s w i t h D i lA C h R - c o n t a i n i n g e l e c t r o p l a x m e m b r a n e v e s i c l e s w e r e l a -b e l l e d w i t h t h e l i p o p h i l i c f l u o r e s c e n t m a r K e r d y e 1 , 1 - d i o c -t a d e c y l - 3 , 3 , 3 ' , 3 ' - t e t r a m e t h y l - i n d o c a r b o c y a n i n e p e r c h l o -

r a t e ( D i l , M o l e c u l a r P r o b e s , I n c , E u g e n e , O R ) , a c c o r d i n gt o t h e m e t h o d o f P i t a s e t a l . 2 4 B r i e f l y , 5 0 A l o f f r e s h l y d i s -s o l v e d D i l ( 2 m g / m l i n a b s o l u t e e t h a n o l ) w a s a d d e d t o 2 0 0g g p r o t e i n o f m e m b r a n e v e s i c l e s i n t o t a l v o l u m e o f 4 m ls e r u m - f r e e C M t o a f i n a l D i l c o n c e n t r a t i o n o f 2 5 A g / m l .T h e s t e r i l e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r2 0 m i n u t e s a n d a g i t a t e d g e n t l y . T h e D i l - l a b e l e d v e s i c l e sw e r e w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h c o l d s e r u m - f r e e C M ( 2 0 0 0r p m c e n t r i f u g a t i o n f o r t e n m i n u t e s ) . T h e p e l l e t s w e r e r e -s u s p e n d e d i n 1 m l C M a n d s o n i c a t e d i n a w at e r ba t h u l t r a -s o n i c a t o r .

P h a g o c y t o s i s A s s a y sB o t h m o n o d i s p e r s e c a r b o x y l a t e d g r e e n f l u o r e s c e n t m i -c r o s p h e r e s ( d i a m e t e r , 1 . 7 2 u ; P o l y s c i e n c e s , I n c . , W a r -r i n g t o n , P A ) a n d f r e s h l y w a s h e d , r e d f l u o r e s c e n t , D i l - l a -b e l e d , A C h R - r i c h m e m b r a n e v e s i c l e s w e r e u s e d a sp r o b e s . T h e S C s a n d PEC c u l t u r e s u s e d f o r u p t a k e a s -s a y s w e r e g r o w n i n c h a m b e r s l i d e s a n d p r e t r e a t e d w i t hI N F - y f o r 2 4 h o u r s . A f t e r t h r e e r i n s i n g s w i t h p r e w a r m e ds e r u m - f r e e m e d i u m , 2 0 , u o f a 1 : 1 m i x t u r e o f v e s i c l e s ( 3, u g p r o t e i n c o n t e n t / m l ) a n d s p h e r e s ( 0 . 0 1 ) w a s a d d e dt o t h e c h a m b e r s . T h e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 C , i n10 C 0 2 f o r t h r e e h o u r s . A f t e r a n o t h e r t r i p l e r i n s i n g r o u n dw i t h p r e w a r m e d P B S , t h e s l i d e s w e r e f i x e d w i t h 4 f o r -m a l d e h y d e a t 4 C f o r 3 0 m i n u t e s . P h a g o c y t o s i s w a s m o n i -t o r e d u n d e r a Z e i s s u n i v e r s a l f l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e w i t he p i f l u o r e s c e n t i l l u m i n a t i o n u s i n g e i t h e r a F I T C ( 4 5 0 t o 4 9 0n m ) o r a r h o d a m i n e ( 5 1 0 t o 5 6 0 n m ) f i l t e r p a c k a g e . P h o t o -m i c r o g r a p h s w e r e t a k e n u s i n g K o d a k T r i - X p a n c h r o m a t i cf i l m ( A S A 4 0 0 ) .

R e s u l t sA C h R - S p e c i f i c T C e l l L i n e L - RT h e AChR s p e c i f i c T l y m p h o c y t e l i n e L - R , w h i c h h a d b e e ni s o l a t e d f r o m l y m p h n o d e s o f a n A C h R / F C A p r i m e d L e w i sr a t , i s m o n o s p e c i f i c f o r A C h R f r o m T o r p e d o c a l i f o r n i c a . I tr e c o g n i z e s AChR i n t h e m o l e c u l a r c o n t e x t o f R T 1 . B m o l e -c u l e s , t h e r a t c o r r e l a t e t o m o u s e H - 2 I - A a n t i g e n s . 2 5 T h ed o m i n a n t t a r g e t e p i t o p e o f l i n e L - R i s a p e p t i d e s e q u e n c eo f t h e AChR a - c h a i n r e p r e s e n t i n g a m i n o a c i d p o s i t i o n s9 7 t o 1 1 2 , w h i c h p a r t l y c r o s s r e a c t s w i t h a m i n o r e p i t o p ep o s i t i o n e d o n s e q u e n c e 4 4 t o 5 9 s h a r i n g t w o c o n t i g u o u sa n d t w o s p a c e d a m i n o a c i d s . 6 F i n a l l y , l i n e L - R e x p r e s s e st h e CD4 T s u b s e t p h e n o t y p e b i n d i n g MAbs W 3 / 1 3 a n dW 3 / 2 5 , b u t n o t O X 8 . 2 5 L - R l i n e c e l l s h a v e t h e c a p a c i t yt o r e c o g n i z e e q u a l l y e i t h e r s o l u b l e o r m e m b r a n e - b o u n d


4/12

1 1 4 Z h a n g , P o r t e r , a n d W e k e r l eA / l P J a n u a r y 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . I

0 0 . 0 3 0 . 1 0 . 3 1AChR i f p r e s e n t e d b y p r o f e s s i o n a l t h y m i c a n t i g e n - p r e -s e n t i n g c e l l s ( A P C ) ( F i g u r e 1 ) .

MHC E x p r e s s i o n o n S C sI n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e a n d c y t o f l u o m e t r y d e m o n -s t r a t e t h a t r a t r e c o m b i n a n t I F N - y e n h a n c e s t h e e x p r e s -s i o n o f MHC a n t i g e n s o n t h e s u r f a c e o f SC 1 . 1 7 c e l l s ( F i g -u r e 2 ) . B e f o r e t r e a t m e n t w i t h I F N - y , u p t o 9 2 o f t h e S C se x p r e s s some c l a s s a n t i g e n ( O X 1 8 ) , a l t h o u g h w i t h l o wi n t e n s i t y . A s m a l l p e r c e n t a g e o f u n t r e a t e d c e l l s a r e a l -r e a d y p o s i t i v e f o r c l a s s 1 1 a n t i g e n ( O X 3 , a n d O X 6 ) . I n c o n -t r a s t , t r e a t m e n t w i t h I F N - y e n h a n c e s t h e p r o p o r t i o n o fc e l l s b i n d i n g O X 1 8 , OX3 a n d , OX6 b y 5 . 6 , 1 7 . 3 , a n d2 8 . 2 , r e s p e c t i v e l y . I n a l l c a s e s , t h e f l u o r e s c e n c e i n t e n -s i t y c u r v e s a r e m a r k e d l y s h i f t e d t o t h e r i g h t . T h u s , SC l i n e

F i g u r e 1 . P r o f e s s i o n a l t h y m i c A P C p r e s -e n t b o t h s o l u b l e and membrane boundACbR t o ACbR s p e c i f i c T c e l l s . L y m p b o c y t ep r o l i f e r a t i o n i n d u c e d b y s o l u b l e AChR/ m 1 t ) ( o - - - o ) o r A C h R - V ( * - - - * ) w a s d e t e r -mined a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h -o d s . E a c h d o t r e p r e s e n t s t h e mean cpm3 v a l u e o f t r i p l i c a t e c u l t u r e s .1 . 1 7 b e h a v e s i n a w a y s i m i l a r t o s h o r t - t e r m SC l i n e s i s o -l a t e d f r o m n e o n a t a l r a t n e r v e s . 2 6 ' 2 7

S C / T C e l l I n t e r a c t i o nA C h R - s p e c i f i c L e w i s T l i n e l y m p h o c y t e s c u l t u r e d t o g e t h e rw i t h s y n g e n e i c n o r m a l S C s ( F i g u r e 3 A ) a n d MHC c o m p a t -i b l e i m m o r t a l i z e d SC l i n e 1 . 1 7 d o n o t s h o w a n y d i r e c t e di n t e r c e l l u l a r i n t e r a c t i o n . B o t h c e l l t y p e s seem t o f o r m r a n -dom c e l l - t o - c e l l c o n t a c t s , a n d t h e T l y m p h o c y t e s r e m a i ni n t h e r e s t i n g s t a t e ( F i g u r e 3 A 1 , B 1 ) . A d d i t i o n o f AChRc h a n g e s t h e m o r p h o l o g i c p a t t e r n p r o f o u n d l y , h o w e v e r .W i t h i n a f e w h o u r s o f a n t i g e n a d d i t i o n , m o s t o f t h e f r e e Tc e l l s a d h e r e t i g h t l y t o t h e s p i n d l e s h a p e d o r f l a t S C s .W i t h i n 3 6 h o u r s , m o s t , i f n o t a l l , o f t h e T l i n e c e l l s w i l l t r a n s -f o r m t o l a r g e a c t i v a t e d l y m p h o b l a s t s a n d b e g i n t o p r o l i f e r -a t e ( F i g u r e 3 A 2 , B 2 ) . C o n A , a s t r o n g T c e l l m i t o g e n , t r i g -


5/12

S c h w a n n C e l l s i n M y a s t h e n i a G r a v i s 1 1 5A J P J a n u a r y 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . 1

F i g u r e 2 . E x p r e s s i o n o fMHC c l a s s I and c l a s sI I m o l e c u l e s o n t h e SC l i n e 1 . 1 7 . MHC a n t i -g e t n e x p r e s s i o n was a s s e s s e d b e f o r e ( l e f t s i d e )and a f t e r ( r i g h t s i d e ) I F N - y ( 5 0 U / m l ) t r e a t -ment ( 3 7 C f o r 3 6 h o u r s ) b y i n d i r e c t s t a i n -i n g w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s O X 1 8 ( c l a s sI ) , 0 X 3 , o r 0 X 6 ( c l a s s I I , m o n o m o r p h i c o rp o l y m o r p h i c , r e s p e c t i v e l y ) . F l u o r e s c e n c e i n -t e n s i t y was m e a s u r e d w i t h a c y t o f l u o r o g r a p hs y s t e m .

gers s i m i l a r S C / T c e l l i n t e r a c t i o n s ( F i g u r e 3 A 3 , B 3 ) . T h e s eprocesses c an b e e n h a n c e d a n d a c c e l e r a t e d b y I F N - - yp r e t r e a t m e n t o f S C s .

P r o l i f e r a t i o n a s s a y s s h o w t h a t a c t i v a t i o n o f t h e T - l i n e s c e l li n t h e presence o f SC a n d AChR r e f l e c t s c l a s s i c a l i m m u n o -g e n i c p r e s e n t a t i o n a n d r e c o g n i t i o n o f t h e r e l e v a n t AChR e p i -t o p e s ( F i g u r e 4 ) . T h e s e r e s p o n s e s c r i t i c a l l y d e p e n d on t h ed o s e o f s o l u b l e a n t i g e n ( T a b l e 1 ) . F u r t h e r m o r e , as e x p e c t e d ,t h e y can b e b l o c k e d b y MAbs b i n d i n g t o p r o d u c t s o f t h eR T 1 . B s u b r e g i o n . I n c o n t r a s t , a n t i b o d i e s d i r e c t e d t o MHCc l a s s d e t e r m i n a n t s o r t o c l a s s 1 1 R T 1 - D , c o rr e sp o nd i ng t ol - E m o l e c u l e s , a r e i n e f f e c t i v e ( T a b l e 2 , 3 ) .

L i n e 1 . 1 7 S C s n o t o n l y a r e a b l e t o p r e s e n t s o l u b l eAChR t o T h e l p e r l i n e c e l l s i m m u n o g e n i c a l l y , b u t a l s o ,much l i k e p r o f e s s i o n a l t h y m i c A P C , a n d c e r t a i n h y b r i d -oma c e l l s , 2 5 t h e y r e a d i l y p r e s e n t m e m b r a n e - i n c o r p o r a t e dAChR ( F i g u r e 4 ) . I n f a c t , s o l u b l e a n d v e s i c l e - b o u n d AChRa r e p r e s e n t e d w i t h e q u a l e f f i c i e n c y b y immune a s s o c i -a t e d a n t i g e n ( l a ) - i n d u c e d S C s ( T a b l e 1 ) .

L -

C

DzFluoes I n . s i t y *F l u o r e s c e n t I n t e n s i t y - - - - - - - - - - - -

S e l e c t i v e I n g e s t i o n o f A C h R - B o u n dV e s i c l e s b y S CT h e p h a g o c y t o t i c p o t e n t i a l o f S C s w a s a s s e s s e d d i r e c t l yi n p a r t i c l e u p t a k e t e s t s b y s i m u l t a n e o u s l y u s i n g F I T C - l a -b e l e d l a t e x m i c r o s p h e r e s a l o n g w i t h D i l - l a b e l e d T o r p e d oe l e c t r i c m e m b r a n e v e s i c l e s . F i g u r e s 5 a n d 6 d o c u m e n tt h a t a f t e r a n i n c u b a t i o n p e r i o d o f 3 h o u r s , l a r g e n u m b e r so f D i l - p o s i t i v e A C h R - e n r i c h e d m e m b r a n e v e s i c l e s h a db e e n e n g u l f e d b y b o t h s h o r t - t e r m SC c u l t u r e s a n d i m m o r -t a l i z e d S C l i n e s . I n c o n t r a s t , e v e n a f t e r a n i n c u b a t i o n p e -r i o d o f 1 5 h o u r s , f e w , i f a n y , F I T C - m i c r o s p h e r e s w e r ep h a g o c y t o s e d . I t s h o u l d b e s t r e s s e d t h a t p e r i t o n e a l m a c -r o p h a g e s p h a g o c y t o s e b o t h F I T C - l a t e x b e a d s a n d D i l - l a -b e l e d m e m b r a n e v e s i c l e s w i t h i n 3 h o u r s ( F i g u r e 5 ) .D i s c u s s i o nS C s , t h e g l i a l e l e m e n t s o f p e r i p h e r a l n e r v e s , h a v e i n t e r e s t -i n g i m m u n o l o g i c p o t e n t i a l . R a t a n d h u m a n SC c a n b e


6/12

1 1 6 Z h a n g , P o r t e r , a n d W e k e r l eA J P J a t n u i a r y 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . I

nt

A

I /i i 3 / i. .

.1 .

sJ .J

.

F i g u r e 3 . AChR-mediated S c h w a n n - c e l l / T - c e l l i n t e r a c t i o n . B o t h , f r e s h SC c u l t u r e s ( N r 1 0 7 ; A) and 1 . 1 7 S C ( B ) were cocultured withA C h R - s p e c i f i c Lewis r a t T h e l p e r l i n e c e l l s i n t he a b s en ce ( A l , B 1 , p r e s e n c e ( A 2 , B2) ofAChR p r o t e i n ( 3 , s g / m l ) , o r o f Con A ( 5 M u g lm l , A 3 , B 3 ) . A f t e r 3 6 h o u r s , b o t h a n t i g e n a n d l e c t i n i n i t i a t e I y m p h o b l a s t t r a n s f o r m a t i o n . In t h e ab s e nc e o f a n t i g e n , T c e l l s remainedi n t he ir r e s t i n g s t a t e . B a r : 5 0 g m

' A li

I

. 1 , .. 4

:

., , ..

4 o

-4

J


7/12

S c h w a n n C e l l s i n M y a s t h e n i a G r a v i s 1 1 7A J P J a n u a r y 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . 1

10

x

2

1

C o n t r o l A C h R AChR V ConAF i g u r e 4 . A C h R p r e s e n t i n g c a p a c i t y o f f r e s h S C c u l t u r e s . T - c e l la c t i v a t i o n was determined i n t h e presence o f S C c u l t u r e s ( N r .1 0 9 ) a nd s o l u b l e A C h R ( 2 J A g / m l ) or membrane-bound A C h R( A C h R - V p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n 2 A g l / m l ) . S C w i t h o u t a n t i g e n ,or w i t h ConA ( 5 A i g / m l ) were n e g a t i v e or p o s i t i v e c o n t r o l s .Each b a r r e p r e s e n t s t h e mean c pm a n d standard d e v i a t i o n o ft r i p l i c a t e c u l t u r e s .

r e a d i l y i n d u c e d t o s y n t h e s i z e a n d e x p r e s s l a d e t e r m i -n a n t s on t h e i r m e m b r a n e s . 2 6 - 2 8 A f t e r l a i n d u c t i o n , S C a r ea b l e t o p r e s e n t n o t o n l y s o l u b l e f o r e i g n a n t i g e n t o s p e c i f i cs y n g e n e i c T l y m p h o c y t e s , b u t a l s o e n d o g e n o u s p e r i p h -e r a l nerve m y e l i n p r o t e i n s . - 6 T h e s e o b s e r v a t i o n s w e r e t h eb a s i s f o r t h e c o n c l u s i o n t h a t S C p l a y a c e n t r a l r o l e , n o t

o n l y i n t h e i n d u c t i o n o f m y e l i n - s p e c i f i c p e r i p h e r a l a u t o i m -mune n e u r o p a t h i e s , b u t a l s o b y a c t i n g as t a r g e t s f o r c y t o -t o x i c a u t o i m m u n e T l y m p h o c y t e s .

SC a r e l o c a t e d n o t o n l y i n m y e l i n a t e d p a r t s o f p e r i p h -e r a l n e r v e s , h o w e v e r . A p a r t f r o m S C s h e a t h i n g u n m y e l i n -a t e d nerve f i b e r s , SC s e a l t h e t e r m i n a l b r a n c h i n g s o f mo-t o r nerve e n d i n g s o v e r l a y i n g m u s c u l a r e n d - p l a t e s . 1 5 T h ep e r i j u n c t i o n a l SC s e e m t o b e s p e c i a l i z e d , f a i l i n g t o p r o -d u c e m y e l i n , b u t e x p r e s s i n g h i g h l e v e l s o f i o n c h a n n e l s . 2 9A t l e a s t some o f t h e s e s p e c i a l i z e d f u n c t i o n s may b e i n -d u c e d b y c o n t a c t w i t h s k e l e t a l m u s c l e c e l l ; SC c o c u l t u r e di n v i t r o w i t h m y o t u b e s a r e i n d u c e d t o express e l e v a t e dl e v e l s o f c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e . 3 0 We we re i n t r i g u e db y t h e p r o x i m i t y b e t w e e n A C h R - c o n t a i n i n g membranep a r t s o f t h e n e u r o m u s c u l a r synapse a n d S C , a n d we s u s -p e c t e d t h a t AChR p r e s e n t a t i o n b y SC c o u l d h a v e a r o l ei n l o c a l a c t i v a t i o n o f T l y m p h o c y t e s i n v o l v e d i n M G . A sd i s c u s s e d p r e v i o u s l y , 1 4 t h e r e i s e v i d e n c e s u g g e s t i n g t h a tA C h R - s p e c i f i c T c e l l s , o r i g i n a l l y e x p a n d e d w i t h i n t h et h y m i c m e d u l l a , a r e r e q u i r e d i n MG as h e l p e r s i n t h e p r o -d u c t i o n o f p a t h o g e n i c a u t o a n t i b o d i e s .

T o p o s s i b l y p r e s e n t AChR t o a u t o i m m u n e T c e l l s , SCm u s t f u l f i l s e v e r a l f u n c t i o n a l c r i t e r i a . M o s t T l y m p h o c y t e s ,e s p e c i a l l y t h o s e a c t i n g as h e l p e r s i n a n t i b o d y p r o d u c t i o n ,r e c o g n i z e s p e c i f i c a n t i g e n i c e p i t o p e s o n l y i n t h e m o l e c u -l a r c o n t e x t o f MHC c l a s s 1 1 l a a n t i g e n s . S C s , l i k e any A P C ,a r e t h e r e f o r e r e q u i r e d t o s y n t h e s i z e a n d express on t h e i rm e m b r a n e l a a n t i g e n s . T h i s h a s b e e n e s t a b l i s h e d b e f o r eb o t h i n v i t r o 2 6 - 2 8 a n d i n v i V o . 3 1 , 3 2 l a e x p r e s s i o n i s neces-s a r y , b u t b y no m e a n s s u f f i c i e n t , f o r p r e s e n t a t i o n o f a l lp r o t e i n a n t i g e n s , as s h o w n b y t r a n s f e c t i o n e x p e r i m e n t s ,f o r e x a m p l e . 3 3 L a r g e p r o t e i n m o l e c u l e s o r p a r t i c l e s m u s tb e e n g u l f e d b y an A P C a n d d e g r a d e d i n t o p e p t i d e f r a g -m e n t s , a n d s o m e o f t h e s e f r a g m e n t s a r e t h e n r e e x -p r e s s e d i n p h y s i c a l a s s o c i a t i o n w i t h m e m b r a n e l a a n t i -g e n s . -

O u r f i n d i n g t h a t S C a r e a b l e t o i n g e s t , p r o c e s s , a n dp r e s e n t AChR i n p a r t i c l e f o r m i s s i g n i f i c a n t . U l t r a s t r u c t u r a l

T a b l e 1 . R a t Schwann C e l l s P r e s e n t S o l u b l e and Membrane-BoundAChR t o MHC C o m p a t i b l e T L i n e C e l l sA n t i g e n p r e s e n t i n g c e l l s ( C P M S D )

T h y m u s APC S C / - I F N - y S C / + I F N - , yAChR A C h R - V AChR A C h R - V AChR A C h R - V

D o s e ( a g / m l )3 6 6 4 9 4 4 4 5 7 3 5 1 4 2 8 1 2 1 6 8 7 4 3 6 3 0 1 6 4 4 0 4 7 5 4 7 9 1 3 3 1 7 1 3 5 6 7 4 2 0 6 61 6 1 4 3 8 4 5 6 0 2 5 6 7 4 8 6 6 1 4 3 3 5 1982 1 2 3 6 3 8 9 9 3 6 6 1 6 1 3 3 3 2 1 4 6 7 3 0 6 50 . 3 3 6 3 5 5 6 4 4 2 1 1 4 0 3 3 3 5 1 1 5 3 2 7 0 7 6 5 4 9 329 2 0 8 9 2 1 4 2 1 0 3 2 0 3 7 80 1 3 7 2 1 3 3 2 7 2 1 5 8 7 1 7 2 9 7 5ConA ( 5 A g / m l ) 1 1 6 9 4 3 4 3 1 3 1 9 7 4 8 1 3 0 3 2 8 9 9 5 2 5 0 4I r r a d i a t e d t h y m u s c e l l s , o r 1 . 1 7 S C s w i t h o r w i t h o u t I F N - - y t r e a t m e n t , w e r e c u l t u r e d w i t h A C h R - s p e c i f i c T l i n e c e l l s i n t h e p r e s e n c e o f l o g 3 d i l u t e d A C h R ,A C h R - b o u n d m e m b r a n e v e s i c l e s ( A C h R - V ) , o r C o n A ( 5 J g / m l ) f o r 7 2 h o u r s a n d w e r e h a r v e s t e d w i t h 3 H - t h y m i d i n e f o r t h e f i n a l 1 6 h o u r s . C P M v a l u e s a r emeans o b t a i n e d f r o m t r i p l i c a t e c u l t u r e s .


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1 1 8 Z h a n g , P o r t e r , a n d W e k e r l eAJPJanuary 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . 1

T a b l e 2 . P r e s e n t a t i o n o f A C b R b y S C 1 . 1 7Line I s R e s t r i c t e d b y RT1.B ( I - A ) P r o d u c t sP r o l i f e r a t i o n *T l i n e A n t i g e n m A B ( d i l u t i o n ) ( I n h i b i t i o n p e r c e n t a g e )

L - R N o n e N o n e 2 . 8 3 6L - R AChR ( 3 , u g / m l ) N o n e 4 5 . 8 9 8L - R ConA ( 5 , g / m l ) N o n e 5 5 . 0 8 1L - R AChR ( 3 A g / m l ) OX18 ( R T 1 . A ) 1 : 1 0 0 3 1 . 5 8 2 ( 3 1 )L - R AChR ( 3 g g / m l ) O X 1 8 ( R T 1 . A ) 1 : 5 0 0 4 8 . 4 3 8 ( 0 )L - R AChR ( 3 , u g / m l ) OX6 ( R T 1 . B ) 1 : 1 0 0 1 . 4 4 6 ( 9 7 )L - R AChR ( 3 / A g / m l ) OX6 ( R T 1 . B ) 1 : 5 0 0 1 6 . 0 6 0 ( 6 5 )L - R AChR ( 3 , g / m l ) OX17 ( R T 1 . D ) 1 : 1 0 0 3 6 . 5 1 1 ( 2 0 )L - R AChR ( 3 q g / m l ) O X 1 7 ( R T 1 . D ) 1 : 5 0 0 4 7 . 3 5 5 ( 0 )L - R AChR ( 3 , u g / m l ) W 3 / 1 3 ( p a n . T ) 1 : 1 0 0 3 1 . 3 6 6 ( 3 1 )L - R AChR ( 3 , u g / m l ) W 3 / 1 3 ( p a n . T ) 1 : 5 0 0 5 4 . 1 0 9 ( 0 )A f t e r p r e a c t i v a t i o n w i t h I N F - y ( 5 0 U / m l ; 2 4 h o u r s ) t h e SC 1 . 1 7 c e l l s w e r e u s e d a s A P C s . T h e r e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s mean cpm o f t r i p l i c a t e c u l t u r e s .S t a n d a r d d e v i a t i o n i n a l l c a s e s a r e i n t h e r a n g e o f 1 5 .

i n v e s t i g a t i o n s o f t h e m y a s t h e n i c e n d - p l a t e i n a c u t e MGh a v e s h o w n t h a t t h e s y n a p t i c c l e f t i s f i l l e d w i t h a b u n d a n tf u z z y d e b r i s , w h i c h s e e m s t o b e s h e d f r o m t h e e n d - p l a t eas t h e r e s u l t o f a u t o a n t i b o d y a n d c o m p l e m e n t b i n d -i n g . 3 5 3 6 A t t h e n o r m a l n e u r o m u s c u l a r synapse, S C , nervee n d i n g s , a n d p o s t s y n a p t i c e n d - p l a t e a r e e n s h e a t h e d b ya c o m p l e x s y s t e m o f b a s a l m e m b r a n e s , 3 7 w h i c h m a y s e p -a r a t e d i s t i n c t spaces w i t h i n t h i s m i c r o e n v i r o n m e n t . I n my-a s t h e n i c e n d - p l a t e a r e a s , e s p e c i a l l y w i t h s t r o n g d e s t r u c -t i v e c h a n g e s a n d b i n d i n g o f c o m p l e m e n t c o m p o n e n t s , a tl e a s t m a j o r p a r t s o f t h e b a s e m e n t membranes s e e m t ob r e a k d o w n , a p p a r e n t l y a l l o w i n g d i r e c t c o n t a c t b e t w e e nt h e v e s i c u l a r d e b r i s o f t h e s u b s y n a p t i c space a n d t h es y n a p t i c S C . - T h u s , i t i s c o n c e i v a b l e t h a t a p e r i s y n a p t i cA P C i s f a c e d w i t h p a r t i c l e - b o u n d r a t h e r t h a n s o l u b l eA C h R . C o n s e q u e n t l y , o n l y APCs a b l e t o process memb r a n e v e s i c l e s a r e g o o d c a n d i d a t e s f o r l o c a l l y s t i m u l a t i n gA C h R - s p e c i f i c T c e l l responses.

T h e p r e s e n t s t u d i e s u s e d t wo i n v i t r o s y s t e m s t o t e s tA C h R / m e m b r a n e p r e s e n t a t i o n b y S C . F i r s t , s h o r t - t e r m S Cc u l t u r e s d e r i v e d f r o m n e o n a t a l s c i a t i c nerves were u s e d . T od e f i n i t e l y e x c l u d e e f f e c t s c o n t r i b u t e d b y any n o n - S C c e l l u l a rc o n t a m i n a n t s , o u r e x p e r i m e n t s were p a r a l l e d u s i n g an i m -m o r t a l SC l i n e d e r i v e d f r o m a n e o n a t a l r a t . T h e s e c e l l s a r ek n o w n t o e x h i b i t p r a c t i c a l l y a l l f u n c t i o n a l o p t i o n s o f n o r m a lc u l t u r e d S C , i n c l u d i n g e n s h e a t h i n g o f a x o n s , a n d m y e l i n a -t i o n , 1 6 a n d as s h o w n h e r e , t h e s e c e l l s were r e a d i l y i n d u c i b l et o l a e x p r e s s i o n b y I F N - , y . M o r e o v e r , i t s h o u l d b e n o t e d t h a tt h e S C l i n e 1 . 1 7 , a l t h o u g h o f S p r a g u e - D a w l e y r a t o r i g i n , w a sl a c o m p a t i b l e w i t h T l i n e s f r o m L e w is r a t s . N o r m a l a n di m m o r t a l S C were t h e r e f o r e i n d i s t i n g u i s h a b l e i n t h e i r i m m u -n o l o g i c p o t e n t i a l .

A l t h o u g h S C ar e g e n e r a l l y c o n s i d e r e d poor p h a g o -c y t e s , s e v e r a l r e p o r t s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t S C a r ea b l e t o p h a g o c y t o s e c e r t a i n p a r t i c l e s s e l e c t i v e l y . F o r e x -a m p l e , m y e l i n p a r t i c l e s - 6 3 8 b u t n o t a x o l e m m a l f r a g -

T a b l e 3 . P r e s e n t a t i o n o f S o l u b l e andMembrane-BoundAChR b y F r e s h S C s I s R T 1 . B ( I - A ) R e s t r i c t e dC o m b i n a t i o n P r o l i f e r a t i o nT c e l l A n t i g e n mAB* ( P e r c e n t a g e o f i n h i b i t i o n ) tL - R N o n e N o n e 2 5 1 0L - R AChR ( 2 j g / m l ) N o n e 3 1 5 2 8L - R A C h R - V ( 2 , g / m l ) N o n e 2 2 2 3 3L - R C o n A ( 5 , u g / m l ) N o n e 1 0 5 1 8 5L - R AChR ( 2 A g / m l ) O X 1 8 ( R T 1 . A O 2 7 0 5 5 ( 1 4 . 1 )L - R AChR ( 2 j g / m l ) OX3 ( R T 1 . B ) 1 0 6 9 ( 9 6 . 5 )L - R AChR ( 2 j g / m l ) OX1 7 ( R T 1 . D ) 3 3 2 5 3 ( 0 )L - R AChR ( 2 , u g / m l ) W 3 / 1 3 ( P a n . T ) 3 3 4 5 0 ( 0 )L - R A C h R - V ( 2 j g / m l ) O X 1 8 ( R T 1 . A ) 2 1 6 3 4 ( 2 . 7 )L - R A C h R - V ( 2 , g g / m l ) OX3 ( R T 1 1 . B ) 6 8 1 0 ( 6 9 . 4 )L - R A C h R - V ( 2 A g / m l ) OX17 ( R T 1 . D ) 2 4 3 0 7 ( 0 )L - R A C h R - V ( 2 j g / m l ) W 3 / 1 3 ( P a n . T ) 2 2 7 3 0 ( 0 )

APCs a r e f r e s h p r e p a r e d SC c u l t u r e s ( N r . 1 1 5 ) t h a t h a v e b e e n p r e a c t i v a t e d w i t h r e c o m b i n a n t I F N - y ( 5 0 U / m l ; 2 4 h r s . ) . T h e r e s u l t s a r e e x p r e s s e d a smean cpm o f t r i p l i c a t e c u l t u r e s . S t a n d a r d d e v i a t i o n s i n a l l c a s e s a r e i n t h e r a n g e o f 1 5 .* T h e m o n o c l o n a i a n t i b o d i e s a r e u s e d a t 1 : 3 0 0 d i l u t i o n .t T h e p e r c e n t a g e o f i n h i b i t i o n i s c a l c u l a t e d a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g f o r m u l a : ( c o n t r o l C P M - e x p e r i m e n t a l C P M / c o n t r o l C P M ) X 1 0 0 ) .


9/12

L U

.0 1

f i ' f t ; ) , ; \ . t.

C ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ -410~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~N

F i g u r e 5 . S e l e c t i v e u p t a k e o f A C h R e n r i c h e d membrane v e s i c l e s b y 1 . 1 7 SC l i n e . A f t e r I E N y j t r e a t m e n t ( 5 0 U / 1 2 , P E C s and SC l i n e1 . 1 7 were c u l t u r e d w i t h F I T C - m i c r o s p h e r e ( g r e e n f l u o r e s c e n c e ) and D i l - l a b e l e d A C h R V ( r e d f l u o r e s c e n c e ) . A f t e r t h r e e h o u r s , P E C s( A ) had p h a g o c y t o s e d n o t o n l y F I T C - m i c r o s p b h e r e ( B ) b u t a l s o A C h R - V ( C ) . U s i n g p h a s e c o n t r a s t ( D ) and t w o - c o l o r e x p o s u r e ( E ) , t h r e e o ff i v e 1 . 1 7 S C s , h a d i n c o r p o r a t e d A C h R - V Bar 1 0 g A m .


10/12

1 2 0 Z h a n g , P o r t e r , a n d W e k e r l eA J P J a n u a r y 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . 1

F i g u r e 6 . S e l e c t i v e u p t a k e o f A C h R - e n -r i c h e d membrane v e s i c l e s b y a f r e s h S Cc u l t u r e . Tw o p a r t l y o v e r l a p p i n g f r e s h S C s( c u l t u r e N r . 1 1 1 ; A ) , s h o w u p t a k e o f D i l -l a b e l e d A C h R - V , a s i d e n t i f i e d b y r e d f l u o -r e s c e n c e ( B ) . T h e D i l - l a b e l e d v e s i c l e s ( r e d )a r e a c c u m u l a t e d i n t h e p e r i n u c l e a r a r e a .B ar 1 0 A m .m e n t s 3 8 a r e r e a d i l y i n c o r p o r a t e d b y SC i n v i t r o . M y e l i np h a g o c y t o s i s b y S C i n v i v o , h o w e v e r , s e e m s t o b e a m o r ec o n t r o v e r s i a l i s s u e . 3 4 ' F u r t h e r m o r e , p h a g o c y t o s i s o fc e r t a i n b a c t e r i a i s w e l l d o c u m e n t e d . 4 2 4 3 I n f a c t , u p t a k ea n d i n t r a c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n o f M y c o b a c t e r i u m l e p r a e i nSC i s a h a l l m a r k f o r l e p r o m a t o u s l e p r a . 4 4 We e x t e n d e d t h es e l e c t i v e p h a g o c y t i c a c t i v i t y b y SC w i t h r e g a r d t o e l e c t r i cm e m b r a n e p a r t i c l e s . We f a i l e d t o r e c o r d a n y u p t a k e o ff l u o r e s c e n t l a t e x p a r t i c l e s b y SC w i t h i n 3 h o u r s o f c o n t a c t ,a p e r i o d s u f f i c i e n t t o a l l o w l a t e x p a r t i c l e u p t a k e b y p e r i t o -n e a l m a c r o p h a g e s . T o r p e d o c a l i f o r n i c a e l e c t r i c o r g a nm e m b r a n e v e s i c l e s w e r e a v i d l y i n g e s t e d d u r i n g t h e samep e r i o d , h o w e v e r .

SC may b e a c t i v e i n l o c a l l y p r e s e n t i n g a u t o i m m u n o -g e n i c AChR e p i t o p e s t o m i g r a t i n g T l y m p h o c y t e s . A n u m -b e r o f o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t MG i s i n d u c e d f i r s t w i t h i nt h e t h y m u s , w i t h t h y m i c m y o i d c e l l s p r o d u c i n g AChR t h a t ,a f t e r u p t a k e b y l o c a l i n t e r d i g i t a l c e l l s , c a n b e p r e s e n t e d

a u t o i m m u n o g e n i c a l l y t o s p e c i f i c T l y m p h o c y t e s . ' 4 I t i sa l s o c l e a r , h o w e v e r , t h a t , e s p e c i a l l y i n l o n g s t a n d i n g M G ,t h e d i s e a s e c a n p r o c e e d a f t e r r e m o v a l o f t h e t h y m u s . I nt h e s e c a s e s , l o c a l p r e s e n t a t i o n o f AChR i n t h e v i c i n i t y o fn e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n s h a s s p e c i a l i m p o r t a n c e . SC mayh a v e a n a s - y e t u n r e c o g n i z e d a c t i v e r o l e i n t h e s e p r o -c e s s e s .

R e f e r e n c e s1 . T z a r t o s S J , L in d s t ro m J M : M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s u s e d t o

p r o b e a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r s t r u c t u r e : L o c a l i z a t i o n o f t h em a j o r i m m u n o g e n i c r e g i o n a n d d e t e c t i o n o f s i m i l a r i t i e s b e -t w e e n s u b u n i t s . P r o c N a t l A c a d S c i USA 1 9 8 0 , 7 7 : 7 5 5 - 7 5 9

2 . B a r k a s T , M a u r o n A , R o t h B , T z a r t o s S J , B a l l i v e t M : M a p p i n gt h e m a i n i m m u n o g e n i c r e g i o n a n d t o x i n - b i n d i n g s i t e o f t h en i c o t i n i c a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r . S c i e n c e 1 8 7 , 2 3 5 : 7 7 - 8 0


11/12

S c h w a n n C e l l s i n M y a s t h e n i a G r a v i s 1 2 1AJPJanuary 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . I

3 . T z a r t o s S J , K o k l a A , W a l g r a v e S L , C o n t i - T r o n c o n i B M : L o c a l -i z a t i o n o f t h e m a i n i m m u n o g e n i c r e g i o n o f h u m a n m u s c l ea c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r t o r e s i d u e s 6 7 - 7 6 o f t h e a - s u b u n i t .P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 8 8 , 8 5 : 2 8 9 9 - 2 9 0 3

4 . L e n n o n V A , M c C o r m i c k D J , L a m b e r t E H , G r i e s m a n n G E ,A t a s s i M Z : R e g i o n o f p e p t i d e 1 2 5 - 1 4 7 o f a c e t y l c h o l i n e r e -c e p t o r a - s u b u n i t i s e x p o s e d a t n e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n a n di n d u c e s e x p e r i m e n t a l a u t o i m m u n e m y a s t h e n i a g r a v i s , T c e l li m m u n i t y a n d m o d u l a t i n g a u t o a n t i b o d i e s . P r o c N a t l A c a dS c i USA 1 9 8 5 , 8 2 : 8 8 0 5 - 8 8 0 9

5 . Y o k o i T , M u l a c - J e r i c e v i c B , K u r i s a k i J , A t a s s i M Z : T l y m p h o -c y t e r e c o g n i t i o n o f a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r : L o c a l i z a t i o n o ft h e f u l l T c e l l r e c o g n i t i o n p r o f i l e o n t h e e x t r a c e l l u l a r p a r t o ft h e a l p h a - c h a i n o f T o r p e d o c a l i f o n i a a c e y t y l c h o l i n e r e c e p t o r .E u r J I m m u n o l 1 9 8 7 , 1 7 : 1 6 9 7 - 1 7 0 2

6 . Z h a n g Y , B a r k a s T , J u i l l e r a t M , S c h w e n d i m a n n B , W e k e r l eH : T c e l l e p i t o p e s i n e x p e r i m e n t a l a u t o i m m u n e m y a s t h e n i ag r a v i s o f t h e r a t : S t r a i n s p e c i f i c e p i t o p e s a n d c r o s s - r e a c t i v i t yb e t w e e n t w o d i s t i n c t s e g m e n t s o f t h e a - c h a i n o f t h e n i c o -t i n i c a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r . E u r J I m m u n o l 1 9 8 8 , 1 8 : 5 5 1 -5 5 7

7 . F u j i i Y , L i n d s t r o m J : S p e c i f i c i t y o f t h e T c e l l i m m u n e r e -s p o n s e t o a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r i n e x p e r i m e n t a l a u t o i m -mune m y a s t h e n i a g r a v i s : R e s p o n s e t o s u b u n i t s a n d s y n -t h e t i c p e p t i d e s . J I m m u n o l 1 9 8 8 , 1 4 0 : 1 8 3 0 - 1 8 3 7

8 . H o h l f e l d R , T o y k a K V , M i n e r L L , W a l g r a v e S L , C o n t i - T r o n -c o n i B M : A m p h i p a t h i c s e g m e n t o f t h e n i c o t i n i c a c e t y l c h o l i n er e c e p t o r a l p h a s u b u n i t c o n t a i n s e p i t o p e s r e c o g n i z e d b y Tl y m p h o c y t e s i n m y a s t h e n i a g r a v i s . J C l i n I n v e s t 1 9 8 8 , 8 1 :6 5 7 - 6 6 0

9 . H a r c o u r t G C , S o m m e r N , R o t h b a r d J , W i l l c o x H N A , N e w -s o m - D a v i s J : A j u x t a - m e m b r a n e e p i t o p e o n t h e h u m a n a c e -t y l c h o l i n e r e c e p t o r r e c o g n i z e d b y T c e l l s i n m y a s t h e n i a g r a -v i s . J C l i n I n v e s t 1 9 8 8 , 8 2 : 1 2 9 5 - 1 3 0 0

1 0 . B r o c k e S , B r a u t b a r C , S t e i n m a n L , A b r a m s k y 0 , R o t h b a r dJ , N e i m a n n D , F u c h s S , M o z e s E : I n v i t r o p r o l i f e r a t i o n r e -s p o n s e s a n d s e r u m a n t i b o d y t i t e r s s p e c i f i c t o h u m a n a c e t y l -c h o l i n e r e c e p t o r s y n t h e t i c p e p t i d e s d i s c r i m i n a t e b e t w e e np a t i e n t s w i t h m y a s t h e n i a g r a v i s a n d h e a l t h y c o n t r o l s . J C l i nI n v e s t 1 9 8 8 , 8 2 : 1 8 9 0 - 1 8 9 6

1 1 . M e l m s A , C h r e s t e l S , S c h a l k e B C G , W e k e r l e H , M a u r o n A ,B a l l i v e t M , B ar ka s T : A u t o i m m u n e T l y m p h o c y t e s i n m y a s -t h e n i a g r a v i s : D e t e r m i n a t i o n o f t a r g e t e p i t o p e s u s i n g T l i n e sa n d r e c o m b i n a n t p r o d u c t s o f t h e mouse n i c o t i n i c a c e t y l c h o -l i n e r e c e p t o r g e n e . J C l i n I n v e s t 1 9 8 9 , 8 3 : 7 8 5 - 7 9 0

1 2 . S c h l u e p M , W i l l c o x H N A , V i n c e n t A , D h o o t G K , N e w s o m -D a v i s J : A c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r s i n h u m a n t h y m i c m y o i dc e l l s i n s i t u : A n i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d y . A n n N e u r o l1 9 8 7 , 2 2 : 2 1 2 - 2 2 2

1 3 . K i r c h n e r T , T z a r t o s S J , H o p p e F , S c h a l k e B C G , W e k e r l e H ,M u l l e r - H e r m e l i n k , H K : P a t h o g e n e s i s o f m y a s t h e n i a g r a v i s :A c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r - r e l a t e d a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s i n t u -m o r - f r e e t h y m u s e s a n d t h y m i c e p i t h e l i a l t u m o r s . A m J P a t h o l1 9 8 8 , 1 3 0 : 2 6 8 - 2 8 0

1 4 . M e l m s A , S c h a l k e B C G , K i r c h n e r T , M u l l e r - H e r m e l i n k H K ,W e k e r l e H : T h e t h y m u s i n m y a s t h e n i a g r a v i s : I s o l a t i o n o f Tl y m p h o c y t e l i n e s s p e c i f i c f o r t h e n i c o t i n i c a c e t y l c h o l i n e r e -

c e p t o r f r o m t h y m u s e s o f m y a s t h e n i c p a t i e n t s . J C l i n I n v e s t1 9 8 8 , 8 1 : 9 0 2 - 9 0 7

1 5 . O g a t a T , Y a m a s a k i Y : T h e t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o fm o t o r e n d p l a t e s i n d i f f e r e n t f i b r e t y p e s o f r a t i n t e r c o s t a l m u s -c l e . C e l l T i s s u e R e s 1 9 8 5 , 2 4 1 : 4 6 5 - 4 7 21 6 . P o r t e r S , C l a r k M B , G l a s e r L , B u n g e R P : S c h w a n n c e l l s s t i m -u l a t e t o p r o l i f e r a t e i n t h e a b s e n c e o f n e u r o n s r e t a i n s f u l l f u n c -t i o n a l c a p a b i l i t y . J N e u r o s c i 1 9 8 6 , 6 : 3 0 7 0 - 3 0 7 8

1 7 . P o r t e r S , G l a s e r L , B u n g e R P : R e l e a s e o f a u t o c r i n e g r o w t hf a c t o r b y p r i m a r y a n d i m m o r t a l i z e d S c h w a n n c e l l s . P r o c N a t lA c a d S c i USA 1 9 8 7 , 8 4 : 7 7 6 8 - 7 7 7 2

1 8 . B o t t e n s t e i n J , S a t o G : G r o w t h o f a r a t n e u r o b l a s t o m a c e l ll i n e i n s e r u m - f r e e s u p p l e m e n t e d m e d i u m . P r o c N a t I A c a dS c i U S A 1 9 7 9 , 7 6 : 5 1 4 - 5 1 7

1 9 . R u c h e l R , W a t t e r s D , M a e l i c k e A : M o l e c u l a r f o r m s a n d h y -d r o d y n a m i c p r o p e r t i e s o f a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r f r o m e l e c -t r i c t i s s u e . E u r J B i o c h e m 1 9 8 1 , 1 1 9 : 2 1 5 - 2 2 3

2 0 . E l l i o t t J , B l a n c h a r d S , Wu W , M i l l e r J , S t r a d e r C , H a r t i g P R ,M o o r e H P , R a c s J , R a f t e r y M : P u r i f i c a t i o n o f T o r p e d o c a l .p o s t - s y n a p t i c m e m b r a n e a n d f r a c t i o n a t i o n o f t h e c o n s t i t u -e n t p r o t e i n . J B i o c h e m 1 9 8 0 , 1 8 5 : 6 6 7 - 6 7 8

2 1 . B r o c k e s J , F i e l d s K L , R a f f M C : S t u d i e s o n c u l t u r e d S c h w a n nc e l l s : I . E s t a b l i s h m e n t o f p u r i f i e d p o p u l a t i o n s f r o m c u l t u r e so f p e r i p h e r a l n e r v e . B r a i n R e s 1 9 7 9 , 1 6 5 : 1 0 5 - 1 1 8

2 2 . M i r s k y R , W h i t e J , A b n e y E R , P r u s s R M , G a v r i l o v i c J , R a f fM C : M y e l i n - s p e c i f i c p r o t e i n s a n d g l y c o l i p i d s i n r a t S c h w a n nc e l l s a n d o l i g o d e n d r o c y t e s i n c u l t u r e . J C e l l B i o l 1 9 8 0 , 8 4 :4 8 3 - 4 9 4

2 3 . B e n - N u n A , W e k e r l e H , C o h e n I R : T h e r a p i d i s o l a t i o n o f c l o -n a b l e a n t i g e n - s p e c i f i c T l y m p h o c y t e l i n e s c a p a b l e o f m e d i -a t i n g a u t o i m m u n e e n c e p h a l o m y e l i t i s . E u r J I m m u n o l 1 9 8 1 ,1 1 : 1 9 5 - 1 9 9

2 4 . P i t a s E , I n n e r a r i t y T L , W e i n s t e i n J N , M a h l e y R W : A c e t o a c y -l a t e d l i p o p r o t e i n s u s e d t o d i s t i n g u i s h f i b r o b l a s t s f r om m a c r o -p h a g e s i n v i t r o b y f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . A t h e r o s c l e r o -s i s 1 9 8 1 , 1 : 1 7 7 - 1 8 5

2 5 . Z h a n g . Y , T z a r t o s S J , W e k e r l e H : B - T l y m p h o c y t e i n t e r a c -t i o n s i n e x p e r i m e n t a l a u t o i m m u n e m y a s t h e n i a g r a v i s : A n t i -g e n p r e s e n t a t i o n b y r a t / m o u s e h y b r i d o m a l i n e s s e c r e t i n gm o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e n i c o t i n i c a c e t y l c h o l i n e r e -c e p t o r . E u r J I m m u n o l 1 9 8 8 , 1 8 : 2 1 1 - 2 1 8

2 6 . W e k e r l e H , S c h w a b M , L i n i n g t o n C , M e y e r m a n n R : A n t i g e np r e s e n t a t i o n i n t h e p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m : S c h w a n nc e l l s p r e s e n t e n d o g e n o u s m y e l i n a u t o a n t i g e n s t o l y m p h o -c y t e s . E u r J I m m u n o l 1 9 8 6 , 1 6 : 1 5 5 1 - 1 5 5 7

2 7 . S a m u e l N M , J e s s e n K R , G r a n g e J M , M i r s k y R : Gamma i n t e r -f e r o n , b u t n o t M y c o b a c t e r i u m l e p r a e , i n d u c e s m a j o r h i s t o -c o m p a t i b i l i t y c l a s s 1 1 a n t i g e n s o n c u l t u r e d r a t S c h w a n n c e l l s .J N e u r o c y t o l 1 9 8 7 , 1 6 : 2 8 1 - 2 8 7

2 8 . S a m u e l N M , M i r s k y R , G r a n g e J M , J e s s e n K R : E x p r e s s i o no f m a j o r h i s t o c o m p a t i i b l i t y c o m p l e x c l a s s a n d c l a s s 1 1 a n t i -g e n s i n h u m a n S c h w a n n c e l l c u l t u r e s a n d e f f e c t s o f i n f e c t i o nw i t h M y c o b a c t e r i u m l e p r a e . C l i n E x p I m m u n o l 1 9 8 7 , 6 8 :5 0 0 - 5 0 9

2 9 . B o u d i e r J L , J o v e r E , C a u P : A u t o r a d i o g r a p h i c l o c a l i z a t i o n o fv o l t a g e - d e p e n d e n t s o d i u m c h a n n e l s o n t h e mouse n e u r o -m u s c u l a r j u n c t i o n u s i n g 2 5 1 - a l p h a s c o r p i o n t o x i n : I . P r e f e r e n -


12/12

1 2 2 Z h a n g , P o r t e r , a n d W e k e r l eA J P J l a n u a r y 1 9 9 0 , V o l . 1 3 6 , N o . I

t i a l l a b e l l i n g o f g l i a l c e l l s o n t h e p r e s y n a p t i c s i d e . J N e u r o s c i1 9 8 8 , 8 : 1 4 6 9 - 1 4 7 83 0 . B r o c k e s J P : A s s a y s f o r c h o l i n e r g i c p r o p e r t i e s i n c u l t u r e d r a t

S c h w a n n c e l l s . P r o c R o y S o c B 1 9 8 4 , 2 2 2 : 1 2 1 - 1 3 43 1 . P o l l a r d J D , McCombe P A , B a v e r s t o c k J , G a t e n b y P A ,M c L e o d J G : C l a s s I I a n t i g e n e x p r e s s i o n a n d T l y m p h o c y t es u b s e t s i n c h r o n i c i n f l a m m a t o r y d e m y e l i n a t i n g p o l y n e u r o p a -t h y . J N e u r o i m m u n o l 1 9 8 6 , 1 3 : 1 2 3 - 1 3 43 2 . M a n c a r d i G L , C a d o n i A , Z i c c a A , S c h e n o n e M , T a b a t o n M ,D e M a r t i n i I Z a c c h e o D : H L A - D R S c h w a n n c e l l r e a c t i v i t y i np e r i p h e r a l n e u r o p a t h i e s o f d i f f e r e n t o r i g i n s . N e u r o l o g y 1 9 8 8 ,3 8 : 8 4 8 - 8 5 13 3 . S h a s t r i N , M a l i s s e n B , H o o d L : l a - t r a n s f e c t e d L - c e l l f i b r o -b l a s t s p r e s e n t a l y s o z y m e p e p t i d e b u t n o t t h e n a t i v e p r o t e i ni n l y s o z y m e - s p e c i f i c T c e l l s . P r o c N a t l A c a d S c i USA 1 9 8 5 ,8 2 : 5 8 8 5 - 5 8 8 93 4 . U n a n u e E R , A l l e n P M : T h e b a s i s f o r t h e i m m u n o r e g u l a t o r yr o l e o f m a c r o p h a g e s a n d o t h e r a c c e s s o r y c e l l s . S c i e n c e1 9 8 7 , 2 3 6 : 5 5 1 - 5 5 8

3 5 . E n g e l A G , S a k i k a b a r a H , S a h a s h i K , L i n d s t r o m J M , L a m b e r tE H , L e n n o n V A : P a s s i v e l y t r a n s f e r r e d e x p e r i m e n t a l m y a s -t h e n i a g r a v i s . S e q u e n t i a l a n d q u a n t i t a t i v e s t u d y o f t h e m o t o re n d - p l a t e f i n e s t r u c t u r e a n d u l t r a s t r u c t u r a l l o c a l i z a t i o n o f i m -mune c o m p l e x e s ( I g G a n d C 3 ) a n d o f t h e a c e t y l c h o l i n e r e -c e p t o r . N e u r o l o g y 1 9 7 9 , 2 9 : 1 7 9 - 1 8 83 6 . S a h a s h i K , E n g e l A G , L a m b e r t E H , H o w a r d F : U l t r a s t r u c t u r a ll o c a l i z a t i o n o f t h e t e r m i n a l a n d l y t i c n i n t h c o m p l e m e n t c o m -p o n e n t ( C 9 ) a t t h e m o t o r e n d p l a t e i n m y a s t h e n i a g r a v i s . JN e u r o p a t h o l E x p N e u r o l 1 9 8 0 , 3 9 : 1 6 0 - 1 7 23 7 . E l l i s m a n M H , R a s h J E , S t a e h e l i n L A , P o r t e r K R : S t u d i e s o fe x c i t a b l e m e m b r a n e s : I I . A c o m p a r i s o n o f s p e c i a l i z a t i o n s a tn e u r o m u s c u l a r j u n c t i o n s o n d n o n - j u n c t i o n a l s a c r o l e m m a so f m a m m a l i a n f a s t a n d s l o w t w i t c h m u s c l e f i b e r s . J C e l l B i o l1 9 7 6 , 6 8 : 7 5 2 - 7 7 4

3 8 . M a e d o r - W o o d r u f f J H , Y o s h i n o J E , B i g b e e J W , L e w i s B L ,D e V r i e s G : D i f f e r e n t i a l p r o l i f e r a t i v e r e s p o n s e s o f c u l t u r e dS c h w a n n c e l l s t o a x o l e m m a a n d m y e l i n - e n r i c h e d f r a c -t i o n s : I I . M o r p h o l o g i c a l s t u d i e s . J N e u r o c y t o l 1 9 8 5 , 1 4 : 6 1 9 -6 3 5

3 9 . B e u c he W , F r i e d e R L : M y e l i n p h a g o c y t o s i s i n W a l l e r i a n d e -g e n e r a t i o n o f p e r i p h e r a l n e r v e s d e p e n d s o n s i l i c a - s e n s i t i v e ,b g / b g - n e g a t i v e a n d F c - p o s i t i v e m o n o c y t e s . B r a i n R e s 1 9 8 6 ,3 7 8 : 9 7 - 1 0 64 0 . H i l d e b r a n d C , M u s t a f a G Y , Waxman S G : R e m o d e l l i n g o f i n -t e r n o d e s i n r e g e n e r a t e d r a t s c i a t i c n e r v e : E l e c t r o n m i c r o -s c o p i c o b s e r v a t i o n s . J N e u r o c y t o l 1 9 8 6 , 1 5 : 6 8 1 - 6 9 24 1 . C u l l e n M J : F r e e z e - f r a c t u r e a n a l y s i s o f m y e l i n m e m b r a n ec h a n g e s i n W a l l e r i a n d e g e n e r a t i o n . J N e u r o c y t o l 1 9 8 8 , 1 7 :1 0 5 - 1 1 74 2 . S a i t o H , T o m i o k a H , S a t o K , W a t a n a b e T : A b i l i t i e s o f h u m a no l i g o d e n d r o g l i a l c e l l s a n d m o u s e S c h w a n n c e l l s t o p h a g o c y -t o s e M y c o b a c t e r i u m l e p r a e a n d o t h e r m y c o b a c t e r i a . I n f e c tI m m u n o l 1 9 8 6 , 5 1 : 1 5 7 - 1 6 2

4 3 . S t e i n h o f f U , K a u f m a n n S H E : S p e c i f i c l y s i s b y C D 8 + T c e l l so f S c h w a n n c e l l s e x p r e s s i n g M y c o b a c t e r i u m l e p r a e a n t i -g e n s . E u r J I m m u n o l 1 9 8 8 , 1 8 : 9 6 9 - 9 7 24 4 . D a s t u r D K : L e p r o s y , H a n d b o o k o f C l i n i c a l N e u r o l o g y , V o l3 3 , P a r t I . E d i t e d b y P J V i n k e n , GW B r u y n . A m s t e r d a m ,E l s e v i e r N o r t h - H o l l a n d , 1 9 7 8 , p p 4 2 1 - 4 6 8

A c k n o w l e d g m e n t sT h e a u t h o r s t h a n k M r s . B . G o e b e l f o r p r o c e s s i n g t h e m a n u s c r i p t ,a n d D r . G . A d o l p h , B o e h r i n g e r I n s t i t u t e , V i e n n a , f o r d o n a t i n g t h er e c o m b i n a n t I F N - - y .

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