Dávkování vzorku v GC (GC Inlets) - I

Příprava předmětu byla podpořena

projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Dávkování v plynové chromatografii A.Braithwaite, F.J.Smith - Chromatographic Methods, Fifth edition, Blackie Academic & Professional, 1996 Colin F. Poole and Salwa K. Poole - Chromatography Today, Elsevier Amsterdam, 1995 GC Inlets An Introduction Hewlett Packard, 1990,1991, Matthew Klee, Avondale, PA ISBN 1-880313-00-6 K.J. Hyver, P.Sandra - High Resolution Gas Chromatography, Third edition, Hewlett Packard, 1989 Ilan A. Fowlis - Gas Chromatograophy, Second edition, Analytical Chemistry by Open Learning, 1995

2.2 Dávkování vzorku v GC (GC Inlets)

� „If the column is described as the heart of chromatography, then sample introduction may, with some justification, be referred to as the Achilles heel“ V. Pretorius

� Hlavní funkcí dávkovacího zařízení je poskytovat správné, reprodukovatelné nástřiky vzorku na kolonu

� Nejčastěji jsou na kolony v GC nastřikovány kapalné vzorky pomocí stříkačky, ale je možno dávkovat i plyny s užitím ventilů a dalších pomocných zařízení

� Dávkovací zařízení se obvykle dělí na dvě skupiny. Injektory pro nastřikování do náplňových kolon tvoří skupinu první a zařízení určená pro kapilární kolony skupinu druhou

� Provedení nástřiku na náplňové kolony je jednoduché, protože veškerý tok mobilní fáze je veden na kolonu. Na druhou stranu, požadavky na techniku dávkování vzorků v oblasti kapilárních kolon jsou podstatně větší

� Existuje celá řada nástřikových metod, zejména pro kapilární kolony. Výběr vhodného dávkování je někdy rozhodujícím krokem pro naměření odpovídajících dat

2.2.1 Vybrané aspekty související s dávkováním(týká se především kapilárních kolon)

� Typ analýzy a složení vzorku jsou faktory hrající primárníúlohu při výběru následujících parametrů:Technika nástřiku, nastřikované množství vzorku, teplotana nástřiku, výběr kolony a teploty na koloně

� Rozšiřování píkůZákladní funkcí nástřiku je vnesení vzorku na kolonu ve forměúzké zóny, jejíž složení má být stejné jako původního vzorku

Šířka zóny je po nástřiku zvětšována dvěma mechanizmy:

1. Rozšiřování zóny v čase2. Rozšiřování zóny v prostoru

∗ ad 1. Je způsobeno pomalým přenosem par vzorkuz nástřikového zařízení na kolonu

∗ ad2. Pokud je nastříknut vzorek ve velkém množství,nestačí kapacita kolny k zachycení vzorku ve forměúzké zóny na jejím začátku, dojde k rozmytí vzorkupo větším úseku kolony a k velkému rozšíření zónyvzorku bezprostředně po nástřiku

Podobně, když vzorek není kompatibilní sestacionární fází, utvoří velmi nehomogenní dlouhouvrstvu na stacionární fázi, to vede také k zhoršenéúčinnosti separace ihned po nástřiku

� Fokusační techniky užívané ke zúžení šířky píků

1. Fokusace na stacionární fázi

2. Fokusace s přispěním rozpouštědla

ad 1. Jde o nejčastější fokusační techniku, kterou lze použítjen při teplotním gradientu. V GC je retence solutuexponenciální závislostí teploty. Jestliže je teplota nakoloně snížena, rychlost pohybu zón je také výrazněnižší. Pokud tedy vzorek ve formě par přichází na„chladnou“ kolonu, dojde k jeho zachycení v úzké zóně.Teprve následující zvýšení teploty na koloně vedek zahájení separace a k významnějšímu pohybu složekna koloně

ad 2. Jakmile se začne na začátku kolony odpařovatzkondenzované rozpouštědlo, má tendenci strhávats sebou těkavé složky vzorku (podobné těkavosti jakorozpouštědlo) a fokusovat je v úzké zóně

Např. Pokud je jako rozpouštědlo užit hexan a teplotakolony je vyšší než bod varu hexanu, neprojeví se efektfokusace s přispěním rozpouštědla. Jestliže je ovšemjako rozpouštědlo užit oktan s teplotou varu nadteplotou na koloně, složky s nízkou retencí (vysokoutěkavostí) jsou fokusovány v úzké zóně a následnáseparace vede ke vzniku úzkých píků

� „Retention Gap“

∗ Jde o prázdný kus kapiláry, který je schopen pojmoutkondenzovaný vzorek, ale neretarduje rozpouštědloani složky jakmile jsou odpařeny

∗ Hlavní účel této kapiláry spočívá v její schopnostizkrátit oblast, ve které je vzorek kondenzován ponástřiku a chránit vlastní separační kapiláru přednetěkavými složkami vzorku

∗ Ve chvíli, kdy je solvent odpařen, se všechny složkyzačnou pohybovat rychlostí mobilní fáze na začátekseparační kolony, kde jsou fokusovány rozpouštědlovýmefektem a/nebo stacionární fázíObecně, píky s ~ k<5 jsou fokusovány rozpouštědlovýmefektema píky ~ k>5 jsou fokusovány stacionární fází

∗ Povrch této prázdné kapiláry je deaktivován s cílemminimalizovat délku kondenzované zóny vzorku. Kromětoho je cílem deaktivace také snížení nebezpečí degradacesložek a chvostování. Nepolární rozpouštědla vyžadujínepolárně deaktivované kapiláry a polární rozpouštědlakapiláry polárně deaktivované

� Nástřik vzroku

Nástřiková zařízení uvádějí vzorek na kolonu dvěmazpůsoby:

1. Ve formě výparů po jeho odpaření (většina technik)

2. Ve formě kapalné přímo do kolony(„Cool on-column injection“)

ad 1. Klasický postup při nástřiku na kolonu je založen nanástřiku kapalného vzorku stříkačkou do vyhřátéhovstupu (inlet), kde dojde k rychlému vypaření vzorku

Výhody této techniky• Rychlý přesun vzorku již v plynné fázi na kolonu• Ochrana kolony před netěkavými složkami, protože tyzůstanou v injektoru

Nevýhody techniky:• Možné rozšíření píku v čase a prostoru (předevšímsplitless technika)

• Diskriminace jehlou• Diskriminace v injektoru• Možnost rozkladu vzorku vysokou teplotou

Některé nevýhody lze částečně eliminovat použitím rychlýchautosamplerů pro dávkování vzorku, významně se snížídiskriminace jehlou, zlepší se přesnost a správnost nástřiků(ve srovnání s manuálním nástřikem)

Existuje více technik manuálního nástřiku, nejmenšídiskriminace jehlou je spojena s technikou horké jehly(hot-needle), kdy je v jehle vzduch a po propíchnutí septa jenástřik proveden po ~3-5s, kdy dojde nejprve k vyhřátí jehly

ad 2. Jedná se o techniku, kdy je vzorek bez převedení doplynné fáze přímo zaveden do chladné kolony

Výhody techniky:• Eliminace diskriminace jehlou a v injektoru• Snížení rizika rozkladu vzorku• Vysoká analytická přesnost

Nevýhody techniky:• Rozšiřování zóny v prostoru• Snadné přetížení kolony• Možnost kontaminace kapiláry

� Septum

∗ Jedna z klíčových komponent nástřikového systému

∗ Septum musí těsnit tak, aby nedocházelo k úniku nosnéhoplynu a do systému se nedostaly složky z okolního prostředí

� Volba kolony

∗ Fázový poměr kolony (WCOT, β = r/2df) je velmi důležitý,má velký vliv na kapacitu kolony, a tím na možnou velikostdávkovaného vzorku na kolonu

∗ Pokud se β zvyšuje, zmenšuje se množství vzorku, jenž jemožno na kolonu dávkovat

∗ Kapilární kolony pro obecné použití mají fázový poměr ~250

∗ Především na kolonách s vysokou účinností, je kvalitanástřiku zásadní věcí

∗ Počáteční teplota kolony je velmi důležitá, jestliže má dojítke kondenzaci solventu na začátku kolony a využitífokusace solventem, je třeba, aby teplota na koloně bylao ~ 20°C nižší než je bod varu rozpouštědla

� „Inlet Liners“

∗ Mají přímý vliv na výsledky separace

∗ Pokud jsou analyzovány silně znečištěné vzorky, nečistotyse zachytávají na stěnách lineru a nekontaminují kolonu

∗ Objem, typ a deaktivaci (obvykle silanizace) lineru je nutnopečlivě vybírat podle aplikace

2.2.2 Dávkovače pro náplňové kolony

1. Dávkovač pro náplňové kolony (Packed-Column Inlet)

� Analýzy na náplňových kolonách jsou používány zejménapokud nejsou vysoké nároky na účinnost

� Packed-Column Inlet je svou konstrukcí poměrně jednoduchý,veškerý nosný plyn procházející zařízením jde na kolonu(v klasickém zapojení)

� Jedná se o typ odpařovacího nástřikového zařízení, z tohoplynou výhody: kolona je chráněna před netěkavými složkami,ale i nevýhody: v jistých případech dochází k rozkladu vzorkuv nástřiku, dochází k diskriminaci jehlou a adsorpci polárníchlátek na aktivních površích

� Obvykle se během analýzy pracuje za konstantního průtokunosného plynu, průtok je nastavován na základě kontinuálníhoměření teploty a tlaku v systému

� Tepelně labilní látky jsou zpravidla analyzovány pomocíintrakolonové (on-column) techniky přímého nástřikuna skleněnou náplňovou kolonu, kdy je začátek kolonyprázdný a nástřik je prováděn přímo do kolony. Vzoreknepřichází do kontaktu s kovovými částmi dávkovacíhosystému

� Pokud je vzorek znečištěný je lepší způsob nástřiku extra-kolonovou technikou, kdy je nástřik proveden do insertu(kovového) nejlépe opatřeného vyměnitelným linerem

� Teplota na nástřiku má být asi 20-30°C nad teplotou varurozpouštědla a hlavních složek vzorku. V takovém případěje zajištěn účinný přenos vzorku do kolony

� Průtok nosného plynu na náplňových kolonách bývá kolem30ml/min helia

� Flashback-nástřik příliš velkého množství vzorku může véstk jeho rychlému odpaření za vývoje takového množství par,že ani relativně vysoký tok nosného plynu nepřenese odpařenývzorek dostatečně rychle na kolonu a část vzorku se dostanena septum a do nástřikového systému, jenž je kontaminován.Výsledkem mohou být falešné píky, dekompozice vorku, špatnáreprodukovatelnost aj.

2.2.3 Dávkovače pro kapilární kolony

2. Dávkovač pro přímý nástřik na kapilární kolony

(Capillary direct Inlet)

� Dávkovač pro náplňové kolony je snadno modifikovatelnýpro široké kapilární kolony (wide-bore capillary columns)

� Princip činnosti dávkovače je velmi podobný a také výhodya nevýhody jsou v podstatě stejné

� Nastřikovaný objem je třeba důsledně omezit, nemápřesáhnout 1µl, a průtok nosného plynu má být vysoký, abynedošlo k přetížení kolony a neprojevil se flashback efekt

� Linery jsou zásadní částí nástřikového zařízení a je nutnozvolit vhodný tvar a velikost, podle charakteru vzorkua především rozpouštědla

� Průtoky na kapilárách s vnitřním průměrem 0.53 mm jsou asi3 ml/min v optimu van Deemterovy závislosti pro helium,pneumatický systém musí umožnit nastavení stabilníhoprůtoku

� Fokusace vzorku pomocí solventu a na koloně je velmidůležitým a efektivním způsobem dosažení vysokýchúčinností dělení

3. Dávkovač s děličem toku (Split Inlet)

� Kombinovaný split/splitless dávkovač je nevíce užívanýmnástřikovým zařízením pro kapilární kolony vzhledemk jeho univerzálnosti

� Dávkovač s děličem toku byl historicky prvním nástřikovýmzařízením používaným pro kapilární kolony

Kapalný vzorek je vnesen stříkačkou do horké oblastidávkovače a bleskově odpařen. Pouze malá část vzorkuje uvedena na kolonu a větší podíl par je veden mimo kolonudo odpadu, tím je zabráněno přetížení kapilární kolony

� Split technika je vhodná především pro kolony s průměrempod 0.5 mm, které nejsou vhodné pro přímý nástřik vzhledemk jejich velmi malé kapacitě a snadnému přetížení

� Technika zaručuje, že na kolonu přichází jen velmi úzkýpás odpařeného vzorku díky vysokým průtokovýmrychlostem v nástřiku

� Tok je dělen do tří proudů:1. Oplach septa2. Do lineru3. Tok v lineru je dělen do kolony a mimo kolonu

� Split technika je zvláště vhodná pro vzorky:

1. Velmi koncentrované2. Velmi těkavé3. Které nelze ředit pro analýzu (testy rozpouštědel)4. Plyny, které nelze fokusovat5. Znečištěné, jen limitované množství vstupuje na kolonu6. Analyzované při ultravysokém rozlišení, při vysokém dělícímpoměru >1:100

7. Látky v malých koncentracích eluující se před píkemsolventu

� Liners- řada typů, obvykle plněné skelnou, křemenou vatou,apod. ke zvýšení reprodukovatelnosti a snížení diskriminace,díky zajištění dokonalého odpaření vzorku před vstupemna kolonu. Důležité je umístění plniva

� Tok nosného plynu:

1. Oplach septa: ~3-5ml/min,

2. Dělící poměr (split ratio) = tok nosného plynu nakolonu/tok nosného plynu do odpadu [ml/min]

Poměr bývá v rozmezí: 1:5 – 1:500

� Největší výhodou dávkovače s děličem je eliminacenežádoucího rozšiřování píků vlivem nástřiku, neboť vzorek jena kolonu vnášen velkými rychlostmi v úzké zóně

� Nevýhodou je ovšem možná diskriminace jehlou, ale narozdíl od předchozích technik přímého nástřiku i diskriminacev dávkovacím zařízení. K diskriminaci v dávkovači docházíneuplným odpařením určitých složek, vzájemně odlišnoudifúzní rychlostí složek od místa nástřiku k začátku kolony

Diskriminace jehlou může být omezena:

∗ Autosamplerem∗ Minimální teplotou na nástřiku∗ Nástřikem velkého objemu vzorku∗ Použitím rozpouštědla s vysokou hodnotou bodu varu

Diskriminace v dávkovacím zařízení se zpravidla týkávýševroucích komponent a může být omezena:

∗ Zvýšením teploty na nástřiku∗ Zmenšením objemu nastřikovaného vzorku∗ Volbou vhodného lineru∗ Snížením dělícího poměru

4. Dávkovač s uzavřeným děličem toku (Splitless Inlet)

� Běžný dávkovač s děličem je provozován ve splitless modu

� Vzorek je odpařen v nástřikovém zařízení s uzavřenýmděličem, takže veškerý vzorek s nosným plynem proudína kolonu. Díky nízké teplotě kolony dojde ke kondenzacirozpouštědla na začátku kolony a fokusaci vzorku. Zbytekvzorku, který nebyl převeden do kolony, je z nástřikovéhozařízení odstraněn otevřením děliče a „profoukáním“ nosnýmplynem, a pak je zahájen teplotní gradient na koloně

� Největší výhodou tohoto systému nástřiku (ve srovnáníms dávkováním se splitrem) je to, že většina vzorku je vnesenana kolonu, což je důležité při velmi malých koncentracíchanalytu.Látky eluující se na chvostu rozpouštědla mohou býtsolventovým efektem účinně fokusovány

� Nevýhodou je poměrně nízká rychlost přenosu vzorkuz dávkovače na kolonu, dochází k rozšiřování píků, protoje nutno využít některé z fokusačních technik

� Rozpouštědla pro splitless techniku musí být volena tak, abybyla kompatibilní nejen pochopitelně se vzorkem, ale také sestacionární fází na níž kondenzují. Pokud tomu tak není, jenutno použít retention gap

� Pokud jsou analyzovány komponenty s vysokým bodem varu,splitless analýza je nezávislá na bodu varu rozpouštědla a napočáteční teplotě na koloně. Přestože je teplota kolony nazačátku analýzy vyšší než je bod varu rozpouštědla a nedojdek fokusaci pomocí solventu, stačí fokusace na stacionární fázik účinnému zkoncentrování složek na začátku kolony

� Liners-obvykle mají objem od 0.25ml-1ml, podle způsobunástřikuPro manuální pomalý nástřik je lepší menší objem (omezenérozšíření vzorku na koloně), pro autosamplery větší (flashback)Aktivita lineru může komplikovat analýzu, protože dobakontaktu se vzorkem je reletivně velká. Linery se užívajíprázdné i plněné

� Příliš nízká teplota na nástřiku může mít za následekdiskriminaci nástřikem

� Důležité je stanovaní doby přepnutí ventilu po nástřiku (PurgeDelay Time). Obvykle se volí tak, aby 95% vzorku bylo vnesenona kolonuPro analýzu složek eluujících se na chvostu solventového píkuje lépe zvolit krátký čas pro přepnutí ventilu po nástřiku, protožeto vede k zaostření píků s malou retencíPro analýzu pozdě eluujících složek naopak dlouhý čas,protože je tím eliminován vliv diskriminace nástřikem a zvyšujese citlivost bez nebezpečí snížení účinnostiObecně ovšem platí, že použití dlouhé doby před přepnutímventilu vede k vyšší kontaminaci kolony a dlouhým dobámanalýzy

5. Dávkovač pro přímý nástřik za studena(Cool On-Column Inlet)

� Nástřik je proveden autosamplerem nebo manuálně, existujevíce technicky odlišných dávkovačů tohoto typu

� Pro manuální nástřik se používá stříkačka s jehlou z tavenéhokřemene, která je určena k vnesení kapalného vorku přímo nakolonu.Speciální ventil z měkkého elestomeru zabezpečuje těsnostsystému (duckbill valve).Při manuálním nástřiku vzorku se jehla pomocí vodiče jehlyzavede do kapilární kolony, aniž by došlo ke kontaktu jehly seseptem, pak je jehla utěsněna v septu, vzorek rychlenastříknut a jehla vyjmuta ze septaVzorek vytvoří v koloně stabilní film (flooded zone). Pak jezvýšena teplota na nástřiku a na koloně a začne separace

� Při automatickém nástřiku je pro dávkování využívána běžnájehla autosampleru, speciální ventil je nahrazen septem

� Výhody při správném provedení:

1. Eliminuje diskriminaci nástřikem

2. Diskriminace jehlou je zcela vyloučena

3. Eliminuje tepelnou degradaci vzorku v nástřiku

4. Vede k zkoncentrování složek majících malou retenciefektem solventové fokusace

5. Nejpřesnější metoda dávkování z kvantitativního hlediska

� Omezení a nevýhody techniky:

1. Maximální nastřikované objemy jsou poněkud menší(0.2-2µl) než u ostatních technik, pokud není zařazena předdělící kolonu retention gap

2. Složky, které se eluují těsně před rozpouštědlem nejsoufokusovány a je těžké je stanovit

3. Kapilární kolony lze snadno přetížit

4. Nečistoty obsažené ve vzorku mohou kontaminovat kolonu

5. Parametry na nástřiku a kolně je nutno důsledněoptimalizovat

� Příprava vzorku a nástřik vyžadují velkou pozornost, protožemusí být vyloučena možnost nepříznivých vlivů jako: přetíženíkolony, nekompatibilita solventu s kolonou, kontaminacekolony apod.

Nástřik je nutno provést velmi rychle, nemá dojít k nanesenívzorku na jehlu z vnější strany

Pokud je nástřik velký nebo průtok nosného plynu nízký,vzorek kontaminuje jehlu i septum, může dojít k deformovánípíků a jejich štěpení

� Retention gap

∗ Chrání separační kapiláru před kontaminací netěkavýmisložkami

∗ Vede k větší fokusaci vzorku na separační koloně

∗ Slouží ke spojení autosampleru s úzkými analytickýmikapilárami

∗ Lze zařadit jako interface pro multidimenzionálníchromatografické techniky-LC/GC

Deaktivace povrchu je často nutná

6. Dávkovač s programovatelnou teplotou(Programmed-Temperature Vaporizer Inlet - PTV)

� PTV dávkovač kombinuje výhody split, splitless a on-columndávkovačů, tak je nejuniverzálnějším nástřikovým zařízenímpro GC

� Vzorek je nastříknut do chladného lineru, pak je zvyšovánateplota nástřiku a vzorek je odpařen. Lze nastavit dělící poměra teplotu, tím docílit split nebo splitless funkce

� Výhody PTV:

∗ Vyloučení diskriminace vzorku jehlou

∗ Minimální diskriminace nástřikem

∗ Možnost nastřikovat velké objemy vzroku (>200µl)

∗ Možnost selektivního odstranění rozpouštědlaa nízkovroucích komponent

∗ Zachycení netěkavých složek v lineru, omezení kontaminacekolony

∗ Možnost techniky split/splitless

∗ Reprodukovatelnost retenčních časů a ploch téměř stejnájako u techniky cool on-colunm

∗ Lze provést zkoncentrování plynů z nástřikových ventilů,headspace aj.

∗ Není třeba speciální jehla pro nástřik

� Nejběžnější techniky nástřiku s PTV:

1. Nástřik za studena s děličem (Cold Split PTV Injection)

� Nástřik kapaliny se provede do chladné odpařovací komory,to vyloučí diskriminaci jehlou. Po vyjmutí jehly je otevřendělič a komora je vyhřáta. Toky par jsou děleny mezi kolonua odpad, stejně jako při split technice. Vzorek je aleodpařován postupně, odpařování se děje v pořadí těkavostisložek, které se také postupně dostávají na kolonu, toumožňuje dávkovat větší objemy vzorku bez ztráty rozlišení

2. Nástřik za studena s uzavřeným děličem (Cold SplitlessInjection)

� Technika vhodná pro stopovou analýzu, podobně jakoběžná splitless metoda, ale s výhodou sníženého nebezpečídiskriminace jehlou a rozkladu vzorku vysokou teplotou nanástřiku

� Nástřik kapaliny je proveden do chladné odpařovací komory,pak je nástřik vyhřát a vzorek postupně odpařen a nanesenna kolonu, která je udržována na nízké teplotě, analogickyjako pro normální splitless techniku, dojde k rekondenzacirozpouštědla a fokusaci solventem. Po celou dobu jeuzavřen splitovací ventil. Jakmile je vzorek kvantitativněpřenesen na kolonu, je splitr otevřen a zbylé páry jsouz odpařovací komory odstraněny rychlým průtokem nosnéhoplynu

3. Nástřik s odstraněním rozpouštědla(Solvent Elimination Split/Splitless Injection)

� Je používán pro selektivní odstranění rozpouštědlaze vzorku, lze nastřikovat stovky mikrolitrů vzorku

� Kapalný vzorek je nastříknut do odpařovací komorypři uzavřeném splitovacím ventilu. Teplota na nástřikuje těsně pod bodem varu rozpouštědla, nástřik vzorkuje proveden pomalu aby se zabránilo efektu flashback.Po nástřiku je otevřen splitovací ventil a aplikován vysokýprůtok nosného plynu, ~1000ml/min pro odpařenírozpouštědla.Po odstranění větší části rozpouštědla ze vzorku sesplitovací ventil uzavře a teplota na nástřiku postupnězvýší. Vzorek je přemístěn na kolonu a začne separace

� Technika umožňuje zvýšit citlivost analýzy pro ménětěkavé látky bez negativního vlivu přetížení kolony

� Látky těkavé jsou ovšem částečně eliminovány spolus rozpouštědlem

� Látky středně těkavé mohou být uvedeným postupemseparovány, ale s využitím plněného lineru adsorbentem,skelnou vatou, Tenaxem, polymerním materiálem atd.Pro desorpci se užívá vysokých teplot 300°C-možnádekompozice vzorku

� Chlazení nástřiku je prováděno Peltierovou technikou,kapalným dusíkem a oxidem uhličitým

� Vyhřívání elektricky nebo předehřátým stlačeným vzduchem

� Liners-obvykle stačí menší objem. Tvar lineru a správná volbapřípadné náplně a její deaktivace je velmi podstatná. Často seužívá deformovaný liner umožňující velké objemy nástřiku