POSTGRADUAT EN MEDECINE TROPICALE ET SANTE … · (complexonII, complexon III, K 3EDTA, Na 2EDTA,...

Instituut voor Tropische Geneeskunde Institut de Médecine Tropicale Institute of Tropical Medicine Instituto de Medicina Tropical

Nationalestraat, 155 B – 2000 Antwerpen

Stichting van Openbaar Nut 0410.057.701

POSTGRADUAT EN MEDECINE TROPICALE ET SANTE INTERNATIONALE

Module 1 & Module 2

HEMATOLOGIE TROPICALE PRATIQUE

_______________________________

Notions de base

Septembre 2014 Philippe Gillet – Idzi Potters – Hilde De Boeck - Jan Jacobs

140819_HDB_pg Hématologie tropicale pratique notions de base.doc 2 / 78

TABLE DES MATIERES

HEMATOLOGIE GENERALE :

TABLE DES MATIERES ............................................................................................................................................................ 2 PRISE DE SANG : ...................................................................................................................................................................... 4

CAPILLAIRE : ........................................................................................................................................................................................ 4

VEINEUX : ............................................................................................................................................................................................. 5

DOSAGE DE L’HEMOGLOBINE ................................................................................................................................................ 6

INTRODUCTION : .................................................................................................................................................................................... 6 VALEURS DE REFERENCE : ................................................................................................................................................................. 7 METHODE HCS (HEMOGLOBINE COLOUR SCALE) ...................................................................................................................... 8 METHODE LOVIBOND® (méthode simplifiée selon Harrison) ............................................................................................................ 9 METHODE A L’HEMATINE ACIDE SELON SAHLI :...................................................................................................................... 12 METHODE DE DRABKIN (méthode de référence) : ............................................................................................................................ 14 HEMOCUE® B ......................................................................................................................................................................................... 16 DHT (méthode à l’ammoniaque) ............................................................................................................................................................. 18

DETERMINATION DE L’HEMATOCRITE (METHODE MICRO, PAR CENTRIFUGATION) ..................................................... 21 INDICES (OU INDEX) : (MCHC) ............................................................................................................................................... 24 NUMERATION DES GLOBULES EN CELLULE DE NUMERATION ....................................................................................... 26 NUMERATION DES GLOBULES BLANCS DANS LE SANG : ................................................................................................ 29 NUMERATION DES GLOBULES ROUGES DANS LE SANG : ............................................................................................... 31 INDICES (OU INDEX) : ............................................................................................................................................................. 32

MCV .............................................................................................................................................................. 32 MCH ............................................................................................................................................................. 32

ANNEXE 1 : LISTE INDICATIVE DE PRIX POUR LES TECHNIQUES DE DETERMINATION DE L’ANEMIE ........................ 33 ANNEXE 2 : QUELQUES VALEURS DE REFERENCE EN HEMATOLOGIE .......................................................................... 34 ANNEXE 3 : MORPHOLOGIE DES ELEMENTS SANGUINS SUR FROTTIS COLORE AU MAY-GRÜNWALD-GIEMSA ...... 35


TRANSFUSION SANGUINE : Bref rappel de génétique ........................................................................................................................................................................... 38 Bref rappel d’immunologie ...................................................................................................................................................................... 38 GROUPAGE SANGUIN .......................................................................................................................................................................... 39

A Le système ABO ..................................................................................................................................... 40 B Le système Rhésus .................................................................................................................................. 43

REGLES TRANSFUSIONNELLES ....................................................................................................................................................... 46 TESTS DE COMPATIBILITE ................................................................................................................................................................ 47

Tests plus complets ....................................................................................................................................... 49 Tableau 5 : Comparaison des différents tests de compatibilité (majeure) utilisables au niveau d’un laboratoire de district. .......... 55 Tableau 6 : Usage au niveau d’un laboratoire de district des tests de compatibilité décrits dans les notes. ...................................... 56 Tableau 7 : La transfusion sanguine au niveau d’un hôpital de district : Du minimum jusqu’au extras possibles. .......................... 57 ANNEXE 1 ................................................................................................................................................................................................ 58

Lavage des globules rouges ........................................................................................................................ 58 ANNEXE 2 ................................................................................................................................................................................................ 59

Dépistage des donneurs O dangereux ........................................................................................................ 59 ANNEXE 3 ................................................................................................................................................................................................ 60

Dépistage des maladies infectieuses ............................................................................................................. 60 ANNEXE 4 ................................................................................................................................................................................................ 64

Test de compatibilité sur lame, méthode Polybrène ...................................................................................... 64 ANNEXE 5 ................................................................................................................................................................................................ 65

Liste indicative de prix pour groupages sanguins et tests de compatibilité : (Diamed) ................................ 65 Liste indicative de prix pour quelques tests sérologiques : ........................................................................... 65

ANNEXE 6 ................................................................................................................................................................................................ 66

Exemple de test HIV (mode opératoire)........................................................................................................ 66 ANNEXE 7 ................................................................................................................................................................................................ 67

Exemple de test HBs Ag (mode opératoire) .................................................................................................. 67 ANNEXE 8 ................................................................................................................................................................................................ 68

Exemple de test HCV Ac (mode opératoire) ................................................................................................. 68 ANNEXE 9 ................................................................................................................................................................................................ 69

Exemple de test RPR (mode opératoire) ....................................................................................................... 69 ANNEXE 10 .............................................................................................................................................................................................. 73

Relation entre la vitesse de rotation d’une centrifugeuse et la force centrifuge ............................................ 73 ANNEXE 11 .............................................................................................................................................................................................. 74

Sites internet utiles ........................................................................................................................................ 74 GLOSSAIRE ............................................................................................................................................................................................. 75


PRISE DE SANG : CAPILLAIRE : La technique la plus utilisée et la moins chère pour la prise d'échantillons hématologiques dans des conditions difficiles est le prélèvement de sang capillaire. Ceci est particulièrement vrai pour les enfants ou lorsque seule une petite quantité de sang est nécessaire (de l'ordre de 100 µl). Cependant, comme aucun anticoagulant n’est utilisé, le sang doit être immédiatement analysé. Il est aussi impossible de répéter un test en cas de résultat anormal. Les emplacements de choix pour le prélèvement sont le 3ième ou le 4ième doigt de la main gauche (le majeur ou l’annulaire). De préférence sur le côté du doigt qui est moins sensible que l’extrémité. Pour les nourrissons de moins de 6 mois, le talon ou le gros orteil peuvent aussi être utilisés (attention à ne pas enfoncer trop profondément la lancette : Risque d’ostéomyélite). Ne prélevez jamais du sang à un doigt ou un pied infecté. Ne prélevez jamais du sang à un bras où coule une perfusion. Le prélèvement capillaire doit être suffisamment profond pour obtenir un écoulement libre du sang. Si une pression importante doit être exercée pour obtenir un volume de sang suffisant, une erreur de dilution du sang par du liquide tissulaire sera introduite.

1. Préparez le matériel nécessaire : Lancette stérile en découpant le papier du côté opposé à la pointe. 2 morceaux de coton. Le premier sec, l’autre imbibé d’alcool à 70 %, instrument de prélèvement, …

2. Si possible, demandez au patient de se laver les mains avec un savon doux et de l’eau chaude (vasodilatation), puis de séchez-les minutieusement.

3. Massez légèrement l’endroit à prélever : La main doit être chaude et relaxée. Si nécessaire, la main froide peut être immergée dans de l’eau chaude. Les doigts du patient doivent être droits et sans tension, afin d’éviter toute stase.

4. Désinfectez l'endroit choisi : D'abord avec un tampon de coton imbibé d'alcool à 70 % (garder le tampon). Ensuite avec un tampon sec pour enlever toute trace d'alcool (garder le tampon).

5. Sortez la lancette de son emballage et piquez d'un coup sec et rapide. Jetez immédiatement la lancette dans un conteneur à aiguilles.

6. Exécutez une pression légère sur le doigt, afin de réaliser un meilleur écoulement de sang.

7. Essuyez la première goutte de sang avec le tampon de coton sec (pour éliminer l'alcool à 70 % qui restait éventuellement. Sauf dans le cadre de la recherche des microfilaires où la sensibilité de la recherche est plus grande dans la première goutte de sang). Jetez le coton dans la poubelle. La goutte de sang doit être assez grande pour compléter le volume à prélever en une seule fois.

8. Prélevez le sang pour le test à effectuer, en pressant de votre main gauche le doigt piqué pour faire sortir le sang.

9. Couvrez l'endroit de la piqûre avec le coton imbibé d'alcool à 70° et demandez au patient de le maintenir pendant quelques minutes.

Note particulière pour la détermination de la glycémie : L’usage d’éther ou d’un désinfectant cutané, quel qu’il soit, risque d’interférer avec la réaction enzymatique du réactif de la bandelette (glucose désoxyréductase). Pour la glycémie, afin de limiter le risque infectieux et l’interférence possible de débris alimentaires (trace de jus d’un fruit ou de sucre par exemple), il est recommandé de demander au patient de se laver les mains avec un savon doux puis de les sécher minutieusement avant de réaliser un prélèvement capillaire.


VEINEUX : Lorsqu'une plus grande quantité de sang est nécessaire, lorsque différents services doivent travailler sur le même échantillon ou lorsqu'un échantillon de sérum est nécessaire, la prise de sang veineuse est utilisée. Pour éviter la coagulation et pour maintenir les cellules dans un état naturel, l’usage d’un anticoagulant est alors nécessaire. Les anticoagulants fonctionnent via différents mécanismes :

- par élimination des ions calcium libres (exemples : EDTA, citrate trisodique) - par interférences avec les facteurs de la coagulation (exemple : Héparine)

� Pour les examens hématologiques courants (hémoglobine, numération globulaire, groupages

sanguins, etc.), le sel dipotassique de l'EDTA est recommandé par rapport aux autres (complexonII, complexon III, K3EDTA, Na2EDTA, …)

Des tubes contenant de l'anticoagulant peuvent être préparés de la manière suivante : verser 40 µl de la solution du sel dipotassique de l'EDTA (10 g / 100 ml d'eau distillée) dans un tube de 3 ml. Laisser sécher à température ambiante en protégeant les tubes de la poussière. Boucher les tubes après séchage. Ces tubes doivent être remplis avec 2.5 ml de sang. Il est important de respecter la concentration correcte en anticoagulant (soit plus ou moins 1,5 mg d'EDTA par ml de sang) : une concentration trop faible en anticoagulant n'évitera que partiellement la coagulation, tandis qu'une concentration trop élevée déformera les cellules. Il faut donc toujours remplir le tube du volume prévu de sang.

� Pour la vitesse de sédimentation le citrate trisodique est utilisé à la dilution suivante 1 volume

d'une solution de citrate trisodique à 32 g/l pour 4 volumes de sang.

DIFFERENCE ENTRE COAGULATION ET SEDIMENTATION :

Sans anticoagulant Avec anticoagulant

Coagulation Sédimentation (Solidification) (ou après centrifugation)

Sérum Plasma

GB (buffycoat)

(GR+GB dans une Culot GR structure de fibrine)

Prothrombine Thrombine + Ca2+

Fibrinogène Fibrine (en quelques min) puis formation d’un réseau spongieux (après quelques heures, formation de grumeaux)

SERUM = PLASMA SANS LES PROTEINES INTERVENANT DANS LA COAGULATION


DOSAGE DE L’HEMOGLOBINE

INTRODUCTION :

L’anémie est définie par une diminution du taux de l’hémoglobine (et non par une diminution du nombre de globules rouges). L’anémie correspond donc à une diminution de la masse totale de l’hémoglobine dans l’organisme ce qui se traduit par une diminution des valeurs données par l’hémogramme. L’anémie se définit par une hémoglobine inférieure à 11 g/100 ml (ce qui correspond à un hématocrite inférieur à 33 %). Une hémoglobine inférieure à 7 g/100 ml signe une anémie sévère (soit un hématocrite inférieur à 21 %). Certains auteurs (et peut être dans l’avenir l’OMS) prennent comme valeur seuil 8 g/100 ml (soit un hématocrite inférieur à 24 %).

V o l u m ep l a s m a t i q u e

V o l u m e g l o b u l a i r e

N o r m a l A n é m i e v r a i e

F a u s s e a n é m i e( h é m o d i l u t i o n )

Fig.1 : Anémie vraie et fausse anémie par hémodilution. Dans certaines circonstances, la diminution des valeurs de l’hémogramme est lié à une hémodilution par excès de plasma entraînant une fausse anémie : grossesse, splénomégalie, insuffisance cardiaque, Immunoglobuline monoclonale surtout IgM,…

L’hémoglobine est le principal constituant des globules rouges. C’est le pigment qui donne la couleur rouge au sang. L’hémoglobine est responsable du transport de l’oxygène, du gaz carbonique et des échanges gazeux tissulaires et pulmonaires. L’hémoglobine est constituée de 4 chaînes protéiques (les globines) et de 4 molécules d’hème. L’hème est une protoporphyrine qui comporte un atome de fer divalent (Fe2+). L’une des valences de ce fer ferreux se fixe à la globine, l’autre fixe l’oxygène dans la forme oxygénée (Fig. 2). Chez l’adulte, l’hémoglobine majoritaire est l’hémoglobine A, formée de 2 chaînes α et de 2 chaînes β (α2β2). Elle représente plus de 97 % de l’hémoglobine totale. Il existe une fraction minoritaire d’hémoglobine A2 (formée de 2 chaînes α et de 2 chaînes δ soit α2 δ 2). Chez le fœtus et le nouveau-né, on retrouve un type particulier d’hémoglobine : L’hémoglobine fœtale (HbF, formée de 2 chaînes α et de 2 chaînes γ, soit α2 γ 2). Son taux décroît au cours le la première année de vie, pendant laquelle elle est remplacée par de l’hémoglobine A. Au-delà de la première année, elle n’est normalement présente qu’à l’état de trace (moins de 1 %).

141 aa

146 aa

141 aa

Fig 2 : Structure de l’hémoglobine

(Hémoglobine A)

α α α α

α α α α β β β β

β β β β

hème

globine

(2-3 DPG)

Fe Fe

Fe Fe

146 aa

2-3 DPG = 2-3 diphosphoglycérate


Pour définir une anémie, il est donc important d’avoir une technique fiable et de préférence simple pour déterminer l’hémoglobine. Différentes techniques plus ou moins fiables existent. Ces techniques peuvent se regrouper sous 2 grandes familles :

1. Les techniques basées sur la couleur du sang complet, ni dilué ni hémolysé pour estimer l’hémoglobine (Talquist, HCS, Lovibond, …).

2. Les techniques basées sur la couleur du sang après hémolyse des globules rouges pour

estimer l’hémoglobine (DHT,…).

3. Les techniques hémolysant et transformant le sang avant de déterminer l’hémoglobine (Sahli, Hemocue, Drabkin,…).

Une autre alternative serait d’utiliser l’hématocrite pour définir l’anémie. Le choix de la technique utilisée dépendra de sa fiabilité, de sa reproductibilité, de son prix, de l’équipement nécessaire, du degré de difficulté, de la formation du personnel disponible, ...

VALEURS DE REFERENCE1 :

Les valeurs d’hémoglobine varient en fonction de l'âge, du sexe et de l'altitude.

Age

Sexe

Hémoglobine en g/100 ml

3 mois – 12 mois Homme et femme 10,0 – 14,0

1 an – 12 ans Homme et femme 10,5 – 15,0

12 ans – 100 ans Homme (Europe) 13,2 – 17,3

12 ans – 100 ans Femme (Europe) 11,7 – 15,5

1 Les valeurs de références varient en fonction de la population et de la méthode utilisée par le laboratoire. Chaque laboratoire devrait donc

valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour l'hématologie le plus proche.


METHODE HCS (HEMOGLOBINE COLOUR SCALE)

PRINCIPE :

La méthode HCS est une méthode visuelle simple permettant d'estimer la quantité d'hémoglobine. Il s'agit de comparer la couleur du sang total (ni hémolysé, ni dilué) absorbé en couche mince sur un papier buvard spécial, avec une série de couleurs de référence.

Les couleurs de références correspondent à différentes valeurs d’hémoglobine :

14, 12, 10, 8, 6 et 4 g /100 ml.

MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + Kit HCS contenant un livret avec une palette de six couleurs de référence, un distributeur de bandelettes tests et des bandelettes tests (papier buvard spécial. N’utiliser que les bandelettes spéciales commercialisées par Copack. D’autres bandelettes pourraient donner des résultats erronés. PRELEVEMENT :

Prélèvement de sang capillaire soit prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'EDTA dipotassique. METHODE : Les bandelettes tests doivent être conservées à l’abri de la lumière, de l’humidité et de la poussière), Trouvez un lieu convenable pour réaliser la détermination : Une pièce bien éclairée par la lumière ou par une lumière artificielle, une véranda ou sous un arbre. (EVITER LE PLEIN SOLEIL ET LA PENOMBRE). Lors de la comparaison des couleurs, la source d’éclairage doit venir par-dessus l’épaule, en évitant l’ombre projetée par l’utilisateur. Les meilleurs résultats sont obtenus en lumière naturelle.

1. Déposez une goutte de sang à l’une des extrémités de la bandelette en quantité suffisante pour couvrir toute la surface des cercles découpés dans l’échelle de comparaison (environ 1 cm de diamètre).

Suffisamment pour que la tache formée soit juste plus grande que la surface des cercles découpés dans les couleurs de références.

Trop peu de sang : La surface des cercles découpés ne sera pas entièrement recouverte de sang.

Trop de sang : La tache sera trop épaisse et le sang mettra trop de temps à sécher.

2. ATTENDEZ ENVIRON 30 SECONDES après avoir déposé le sang. Comparez ensuite

immédiatement les couleurs. Tout retard dans la lecture du résultat sera source d’erreur car la tâche de sang s’éclaircira et donnera donc une valeur faussement plus basse. Déplacez la bandelette-test de haut en bas derrière les ouvertures pratiquées dans l’échelle en commençant par la nuance la plus claire (4 g/dl) ou la plus sombre (14 g/dl), jusqu’à trouver la couleur de référence qui correspond le mieux à la tache de sang. Pendant la lecture, maintenir la bandelette test tout contre l’échelle de manière à éviter toute lumière parasite. Essayez de tenir le livret dans différentes positions : Modifiez doucement l’angle d’observation afin de trouver la meilleure position qui permet de distinguer au mieux les six nuances de rouge.


• Si la couleur de la goutte de sang correspond exactement à l’une des nuances de rouge de référence, enregistrez le taux d’hémoglobine correspondant.

• Si la couleur de la goutte de sang se situe entre deux teintes, retenez la valeur moyenne entre les deux teintes.

• En cas de doute entre deux teintes, enregistrez le taux le plus faible.

Exemple : 14 g/100 ml : Trop claire. 12 g/100 ml: Couleur identique. 10 g/100 ml: Trop sombre. 8 g/100 ml : Trop sombre. 6 g/100 ml : Trop sombre. 4 g/100 ml : Trop sombre.

ENTRETIEN : Le nettoyage de l’échelle se fait en essuyant sa surface arrière avec un mouchoir en papier humidifié avec de l’alcool à 70 %, puis avec un mouchoir sec. L’échelle de couleurs de référence doit être nettoyée après chaque usage. L’échelle peut servir à des milliers de tests. Cependant, afin d’éviter toute dégradation des couleurs, il y a lieu de toujours bien refermer le livret après utilisation et de ne jamais le laisser exposé en plein soleil. Le livret doit être périodiquement replacé (comparer périodiquement les couleurs de références avec un carnet neuf pour décider de son remplacement).

METHODE LOVIBOND® (méthode simplifiée selon Harrison)

PRINCIPE :

La méthode Lovibond est une méthode visuelle permettant d'estimer la quantité d'hémoglobine. Il

s'agit de comparer la couleur du sang total (ni hémolysé, ni dilué) étalé en couche mince d’une épaisseur calibrée dans une cellule spéciale avec une série d'étalons colorés (disques) dans le comparateur LOVIBOND®.

MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + Comparateur Lovibond, disques Lovibond 5/8 A et 5/8 B, cellule Lovibond 004, compresse, papier doux, alcool 70 %, bécher, solution de chlore à 1 %. Comparateur Lovibond

® 2000 Disque Cellule Lovibond

® 004

Pince Lamelle Protubérance Lame

La cellule spéciale est composée de deux plaques en verre de dimensions différentes (une lame et une lamelle) que l'on peut accoler au moyen d'une petite pince. Trois protubérances sur la lamelle maintiennent un espace calibré entre les plaques, dans lequel le sang à examiner est introduit latéralement par capillarité (c.-à-d. en faisant MONTER le sang dans la cellule).


PRELEVEMENT : Prélèvement de sang capillaire [ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'EDTA dipotassique].

METHODE :

1. Rincez et essuyez la cellule à l'eau filtrée.

2. Rincez et essuyez la cellule à l'alcool (Ethanol 70 %). 3. Montez la cellule de telle façon que le chiffre 004 soit lisible sur la lamelle (004 est la hauteur entre la lame et la lamelle exprimée en « inches » soit plus ou moins 0.1016 mm). Fixez la lamelle avec la pince. Une cellule est fragile et coûteuse : Toujours effectuer le montage au-dessus d'une table. Manipulez toujours la cellule pince dirigée vers le bas.

4. Vérifiez l'état de propreté des disques de comparaison. S'ils sont sales, nettoyez- les avec un chiffon doux. Vérifiez la coloration des conjonctives du patient. En fonction de leur coloration, choisissez le disque A pour les faibles valeurs d'hémoglobine ou le disque B pour les valeurs élevées d'hémoglobine. Introduisez le disque choisi dans le comparateur en s'assurant que les références numérotées font face à l'utilisateur. Réglez le comparateur sur la plus faible valeur d’hémoglobine du disque.

VERIFIEZ LA CELLULE AVANT UTILISATION :

• Il faut que la cellule soit préalablement décontaminée à l'eau de Javel puis désinfectée à l'alcool à 70 %. • Il faut qu'elle soit propre et sèche (pas de trace d'eau, d'alcool, de doigts ou de poussière). • Il faut que le chiffre 004 soit lisible sur la lamelle. • Il faut que la lamelle ne dépasse pas latéralement de la lame.

5. Utilisez du sang provenant d'une piqûre au doigt (prélèvement de sang capillaire) pour remplir COMPLETEMENT la cellule en faisant MONTER le sang dans la cellule. S'il y a des bulles d'air dans la cellule, recommencez au point 1 en utilisant une nouvelle cellule. 6. Eliminez le sang qui est sur la lamelle ou sous la lame avec un papier doux. Ne pas éliminez le sang qui est sur le côté de la lame.

7. Enlevez la pince. 8. Introduisez la cellule dans la partie gauche du comparateur, lame dirigée vers l'observateur. Tenez la cellule avec le doigt pour qu'elle soit parfaitement verticale dans le comparateur. Cherchez IMMEDIATEMENT, en lumière diffuse à 50 cm des yeux, la couleur correspondante sur l'un des deux disques (La lecture doit être rapide pour éviter la coagulation et le séchage du sang). Notez la valeur trouvée.

POUR OBTENIR UNE LUMIERE DIFFUSE :

• La journée, dirigez le comparateur en direction d’une surface blanche dans la direction opposée au soleil. • La nuit, dirigez le comparateur vers une surface blanche qui est éclairée par une lampe mate. • En dirigeant directement le comparateur vers le soleil ou vers une lampe, la détermination ne sera

pas correcte.


9. Convertissez le % trouvé en g/100 ml de sang à l'aide de la table de conversion. 10. Décontaminez la cellule (bain de 30 minutes dans une solution de Chlore à 1 %).

11. Rincez et essuyez la cellule à l'eau filtrée. 12. Rincez et essuyez la cellule à l'alcool (éthanol 70°). 13. RANGEZ LES DISQUES IMMEDIATEMENT DANS LEURS COFFRETS DE PROTECTION ET LES CONSERVER A L'ABRI DE LA LUMIERE. (La lumière a un effet décolorant sur les couleurs) 14. Montez les cellules dès la fin de leur désinfection pour être prêt pour un autre patient ou une urgence. Protégez les cellules montées en les enroulant dans du papier doux (papier hygiénique ou serviette en papier).

PETITS PROBLEMES ET SOLUTIONS :

TOUJOURS VERIFIER LA CONCORDANCE ENTRE LA VALEUR DE L'HEMOGLOBINE ET LA COLORATION DES CONJONCTIVES.

1. Aucune valeur n'apparaît dans l'ouverture inférieure du comparateur.

⇒ Le disque est placé à l'envers. Enlevez le disque et retournez le.

2. Aucune couleur ne correspond à la coloration du sang du patient.

⇒ Le disque utilisé ne correspond pas à la valeur d'hémoglobine attendue. Utilisez l'autre disque. ⇒ Le patient a un ictère (jaunisse). Ses conjonctives supérieures sont jaunes. Trouvez la couleur la plus proche et signalez dans votre réponse la présence de l'ictère.

⇒ La couleur du sang est inférieure au minimum du comparateur. Donnez comme résultat < à 20 % soit < à 3,3 g/100 ml.

3. La Valeur d'hémoglobine mesurée semble trop basse.

⇒ Assurez-vous que la lamelle soit mise dans le bon sens (chiffre 004 lisible). Si ce n'est pas le cas, recommencez le dosage avec une autre cellule. ⇒ Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air entre la lame et la lamelle. Si c'est le cas, recommencez le dosage avec une autre cellule. ⇒ Vérifiez la propreté du disque de comparaison et le cas échéant, nettoyez le disque avec un chiffon doux. ⇒ Vérifiez la propreté de la plaque translucide du comparateur et le cas échéant, nettoyez-la avec une solution de chlore à 1 % puis à l'eau filtrée. Si aucune de ces solutions ne marche et que les valeurs sont systématiquement trop basses, effectuez une comparaison entre des nouveaux et des anciens disques (la couleur des disques se dégrade avec la lumière).

4. Valeur d'hémoglobine trop haute.

⇒ Le dessus de la lamelle ou le dessous de la lame sont souillés par du sang. Eliminez le sang qui est sur ou sous la lame avec un papier doux. ⇒ Le désinfectant utilisé pour le prélèvement est coloré (Bétadine par exemple). Recommencez le dosage en utilisant de l'Ethanol à 70 %. ⇒ Vérifiez la propreté de la plaque translucide du comparateur et le cas échéant, nettoyez-la à l'eau de Javel puis à l'eau filtrée. ⇒ Le patient a un ictère (jaunisse). Ses conjonctives supérieures sont jaunes. Pas de solution, signalez dans votre réponse la présence de l'ictère. ⇒ Le patient est déshydraté (ce qui provoque une hémoconcentration). Pas de solution, signalez la déshydratation dans votre réponse.


TABLE DE CONVERSION DU % LOVIBOND EN g / 100 ml :

AU MOMENT OU VOUS PENSEZ AVOIR TROUVE LA BONNE COULEUR, VERIFIEZ QUE LA COULEUR PRECEDENTE EST PLUS CLAIRE ET QUE LA COULEUR SUIVANTE EST

BIEN PLUS FONCEE QUE L'ECHANTILLON.

DISQUES POURCENTAGE g / 100 ml

Disque N° 5/8 A 20 3.3 (Couleurs claires) 24 4.0 28 4.7

32 5.3 Pour faibles 36 6.0

valeurs 40 6.7 d'hémoglobine 46 7.3

52 8.7 58 9.7

Disque N° 5/8 B 64 10.7 (Couleurs foncées) 70 11.7 76 12.7 84 14.0

Pour fortes 92 15.3 valeurs 100 16.7

d'hémoglobine 110 18.3 120 20.0 130 21.7

METHODE A L’HEMATINE ACIDE SELON SAHLI :

PRINCIPE : Une quantité précise de sang est diluée avec une solution acide dans un tube spécial. La solution lyse les globules rouges, libère l’hémoglobine et transforme l’hémoglobine en un composé brunâtre (l’hématine acide). Le mélange sang – acide est dilué avec de l’eau distillée, jusqu’à obtenir la même couleur que la couleur de référence de l’hémoglobinomètre de Sahli. La lecture de la graduation obtenue sur le tube donne la concentration en hémoglobine en g/100 ml. La méthode de Sahli, encore bien utilisée est à déconseiller : Elle ne donne pas un dosage exact de l’hémoglobine. En effet, tous les types d’hémoglobine ne se transforment pas en hématine acide, les changements de couleurs ne sont pas très sensibles et la couleur brune du verre de référence n’est pas vraiment semblable à celle de l’hématine acide.

MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + hémoglobinomètre de Sahli, bâtonnet en verre pour mélanger, pipette de Sahli, système d’aspiration de sécurité, tube gradué de Sahli, pipettes pasteur ou flacons compte-gouttes. L’hémoglobinomètre de Sahli est un support pour tube encadré de part et d’autre par des bâtonnets colorés en brun. Ces bâtonnets servent de couleur de référence pour la détermination de l’hémoglobine. Le tube de Sahli qui s’insère au centre du support est gradué en g/100 ml. Il peut aussi porter une deuxième graduation en % (100 % en Sahli correspondent à 16 g/100 ml).


REACTIFS : Solution d’acide chlorhydrique à 0,1 N :

Acide chlorhydrique concentré : 9,5 ml Eau distillée : jusque 1 litre

�� ATTENTION, l’acide chlorhydrique est nocif et extrêmement corrosif. Il est aussi irritant pour les yeux. Ce produit est à manipuler avec une extrême prudence, fenêtres ouvertes (ou sous hotte chimique). Ne jamais verser d'eau dans de l'Acide Chlorhydrique concentré. L'addition d'une faible quantité d'eau dans un acide produit suffisamment de chaleur pour faire exploser la bouteille. Mesurer 500 ml d’eau distillée dans un cylindre de 500 ml et la verser dans un ballon de 1.000 ml. Utiliser une pipette et un ballon à pipeter pour ajouter lentement 9,5 ml d’Acide chlorhydrique dans le jaugé. Le contenu s’échauffera. Après refroidissement, ajuster à 1.000 ml avec de l’eau distillée. La solution ainsi préparée est stable au moins 1 an à température ambiante.

Eau distillée (ou éventuellement filtrée).

PRELEVEMENT : Prélèvement de sang capillaire ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'EDTA dipotassique.

METHODE :

1. Remplissez à l’aide du compte-gouttes le tube gradué avec la solution d’HCl 0,1 N, et ce jusqu’au premier trait de la graduation (le fond du ménisque doit être au niveau du premier trait).

2. Vérifiez la pointe de la pipette de Sahli. Eliminez toute pipette ébréchée (erreur de

volume).

3. Aspirez dans la pipette de Sahli un peu plus de 20 µl de sang, provenant d’un prélèvement capillaire. Essuyez le sang sur la paroi et rapportez le volume de sang à exactement 20 µl en touchant la pointe de la pipette au moyen d’un papier absorbant.

4. Refouler les 20 µl de sang de la pipette au fond du tube contenant l’HCl 0,1 N. 5. Rincez à 3 reprises la pipette avec le mélange sang-HCl du fond du tube et

homogénéisez le tube.

6. Laissez reposer 1 minute pour permettre l’hémolyse des globules rouges et la dénaturation de l’hémoglobine en hématine acide.

7. Ajoutez goutte à goutte de l’eau distillée au moyen du compte-gouttes, tout en remuant le

contenu du tube au moyen du bâtonnet en verre, et ce jusqu’à obtenir dans le tube la même teinte que celles des comparateurs de référence. Vérifiez l’égalisation progressive des couleurs en tenant l’appareil à environ 50 cm des yeux, sous lumière diffuse.

8. Après égalisation des couleurs, recherchez la graduation de l’échelle en g/100 ml qui se

trouve à hauteur de la partie la plus basse du ménisque du liquide. 9. Notez le résultat.


METHODE DE DRABKIN (méthode de référence) :

PRINCIPE : Il s’agit de la méthode de référence (Standard d’or ou golden standard) Le sang est dilué dans du réactif de Drabkin qui hémolyse les hématies et libère l’hémoglobine. Ce même réactif transforme l’hémoglobine en un complexe stable : La cyanométhémoglobine.

Hb + K3Fe(CN)6 �� MHb MHb + KCN �� CNMHb

[Hb = hémoglobine, MHb = méthémoglobine, CNMHb = cyanométhémoglobine]

Cette réaction se déroule à un pH stabilisé par du phosphate mono potassique pour obtenir une réaction complète en un temps raisonnable. L’addition d’un détergent facilite l’hémolyse et prévient la turbidité due aux protéines plasmatiques. Une quantité précise de sang est diluée dans un volume donné de réactif de Drabkin. Après hémolyse et transformation de l’hémoglobine, la densité optique de cette solution est déterminée au photomètre à la longueur d’onde d’absorption maximale de la cyanométhémoglobine (540 nm). Cette densité optique est proportionnelle à la quantité d’hémoglobine présente dans le sang. La quantité d’hémoglobine est déterminée par comparaison avec les densités optiques mesurées pour des concentrations connues d’hémoglobine. PRELEVEMENT :

Prélèvement de sang capillaire soit prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'EDTA dipotassique. Le sang prélevé sur anticoagulant peut être congelé et conservé au moins deux ans (utilisation comme contrôle). MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + spectrophotomètre (ou colorimètre) permettant mesurer des densités optiques à 540 nm, pipette de Sahli avec un système d’aspiration de sécurité (ou pipette automatique de 20 µl), pipette graduée de 5 ml et ballon à pipeter (ou distributeur automatique de 5 ml), tubes à essai, cuvettes pour colorimètre, différents ballons jaugés et pipettes jaugées (pour la dilution des calibrateurs), papier millimétré. REACTIFS : Réactif de dilution de Drabkin (aussi disponible « prêt à l’emploi » exemple Sigma D 5941) :

Ferricyanure de potassium (K3Fe(CN)6) : 0,20 g Cyanure de potassium (KCN)� : 0,05 g Phosphate mono potassique (KH2PO4) : 0,14 g Tween 20 : 1 ml Eau distillée : jusque 1 litre

(Le Tween 20 peut être remplacé par 0,5 ml Brij-35 à 30%)

�� ATTENTION, le cyanure de potassium est hautement toxique. La solution obtenue doit être jaune pâle et limpide. Elle se conserve dans un flacon brun hermétiquement bouché pendant plusieurs mois. Si un trouble apparaît, elle ne doit plus être utilisée.

Solution de Référence cyanométhémoglobine (CNMHB) pour calibration :

Des solutions de calibration sont disponibles commercialement (ex. : Haemoglobin standard de SIGMA, HiCN BS3985 de BDH, Hemiglobincyanide standard de J.T. Baker, Haemoglobin standard de Cypress…).


Suivez le mode d’emploi du fabricant (exemple pour l’haemoglobin standard de SIGMA) :

- Ajoutez 50,0 ml de réactif de Drabkin au flacon ″Haemoglobin standard″. - Mélangez pour dissoudre le contenu. - Attendez au minimum 30 minutes avant emploi. Conservée à l’obscurité entre 2° et 8° C, cette solution de calibration est stable au moins 6 mois.

Réalisez une courbe de calibration sur base de différentes dilutions de cette solution de calibration. A 540 nm, régler le zéro de la densité optique (D.O.) sur base d’une cuvette de réactif de Drabkin, puis lire les D.O. des solutions de calibration. La calibration est linéaire et passe par l’origine.

Exemple de dilution : Sur base d'un calibrateur contenant 18 g% d’équivalente hémoglobine diluée dans 50,0 ml de Drabkin, on peut effectuer une courbe sur base de quelques points intéressants de dilution facile :

Tube N°

Volume de Drabkin

en ml

Volume de calibrateur dilué

en ml

Concentration finale

en g % 1 4 0 0 2 3.5 0.5 2.25 3 3 1 4.5 4 2 2 9 5 1 3 13.5 6 0 4 18

METHODE :

1. Allumez le spectrophotomètre, sélectionnez la longueur d’onde et laissez chauffer la lampe. 2. Préparez une série de tubes à essai (nombre d’analyses à prévoir). 3. Pipetez exactement 5,0 ml de réactif de Drabkin dans ces tubes à essai. 4. Ajoutez 0,02 ml (20 µl) de sang capillaire ou sang prélevé sur EDTA à un des tubes. 5. Rincez 3 fois la pipette avec le réactif. 6. Mélangez et attendre 5 minutes pour avoir une réaction complète (attention, la réaction peut

prendre jusqu’à 30 minutes pour un échantillon contenant une proportion élevée de carboxy hémoglobine).

7. Mesurez la densité optique (D.O.) à 540 nm dans le même spectrophotomètre que celui utilisé pour la réalisation de la courbe de calibration : Remplir une cuvette de réactif de Drabkin pour régler le zéro du spectrophotomètre à 540 nm (blanc). Lisez les D.O. des analyses et de la (ou des) solution(s) de contrôle(s). La couleur est stable durant quelques heures.

Sur base de la courbe de calibration, déterminez la valeur en hémoglobine pour chaque échantillon.

D.O. [Hb] en g/100 ml

ou D.O. analyse Calcul : ---------------------- x concentration du calibrateur = Hb concentration échantillon D.O. calibrateur


HEMOCUE® B

PRINCIPE : L’Hemocue est un exemple d’hémoglobinomètre robuste, portable et précis. Bien que son coût d’utilisation le rende (peu/in)abordable pour un hôpital de district, il peut être utile dans des enquêtes épidémiologiques. Le sang est introduit dans une cuvette réactive spéciale à usage unique. Cette cuvette, d’un volume précis contient un réactif (désoxycholate de sodium) qui hémolyse les globules rouges et transforme complètement, en moins d’une minute, l’hémoglobine en azideméthémoglobine (réaction de Vanzetti modifiée, basée sur l’azide de sodium et le nitrite de sodium). La densité optique de cette solution est déterminée par un HemoCue® (photomètre spécial utilisant deux longueurs d’ondes (570 nm et 880 nm). La densité optique à 570 nm, corrigée en fonction de la turbidité (880 nm) est proportionnelle à la quantité d’hémoglobine présente dans le sang et est automatiquement convertie en g/100 ml. Ce système est commercialisé par Hemocue : Site internet : http://www.hemocue.co.uk/ MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + cuvettes HemoCue® à usage unique, lecteur HemoCue®, cuvette HemoCue® de contrôle, batteries.

PRELEVEMENT :

Prélèvement de sang capillaire [ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'EDTA dipotassique]. METHODE : 1. Vérifiez le fonctionnement du photomètre HemoCue : Insérez dans l’appareil la cuvette de

contrôle. Le résultat obtenu doit être dans les limites recommandées par le fabricant (soit pour notre cellule de contrôle N° 0149-003-037 entre 11,0 et 11,6 g/100 ml)

2. Par prélèvement de sang capillaire, remplissez

COMPLETEMENT une cellule Hemocue neuve en faisant MONTER le sang dans la cuvette. Remplissez en une fois toute la cuvette de la cellule. N’essayez jamais d’ajouter du sang après le premier remplissage. S'il y a des bulles d'air dans la cellule, recommencez en utilisant une nouvelle cellule.

3. Enlevez l’excès de sang à l’extérieur de la cuvette à l’aide de

papier absorbant, sans aspirer le sang contenu dans la cellule. 4. Insérez immédiatement la cuvette remplie dans le portoir du lecteur Hemocue. 5. Repoussez le portoir de cuvette dans la position de mesure. 6. Le résultat d’hémoglobine de sang en g/100 ml (ou g/l ou mmol/l en fonction

de l’appareil) apparaît après 30 à 50 secondes sur l’écran de l’appareil. La cuvette doit être analysée dans les 10 minutes qui suivent le remplissage de la cuvette. Après ce délai, le résultat mesuré ne sera plus fiable suite à l’évaporation du liquide de la cellule).


N.B. : Trois modèles sont actuellement commercialisés par HemoCue® : les modèles HemoCue® B et HemoCue® 201+ pour des conditions d’utilisations « normales » (température ambiante < 30°C et faible humidité relative) et le modèle HemoCue® 301+ pour une utilisation tropicale (haute température et haute humidité). SI LES DEUX PREMIERS MODELES (B et 201) UTILISENT LE MEME PRINCIPE DECRIT PLUS HAUT, LE MODELE 301 UTILISE UNE AUTRE METHODE ANALYTIQUE : mesure de l’absorbance de sang à un point isobestique de Hb/HbO2. L’analyseur mesure à deux longueurs d’onde (506 et 880 nm) afin de compenser la turbidité. Il s’agit donc d’une adaptation automatisée d’un « LOVIBOND »

Hemocue B Hemocue 201+ Hemocue 301+

Les cuvettes B et 201 doivent être stockées entre 15 et 30°C. Les microcuvettes 301 doivent être stockées à 10-40°C (Un flacon non ouvert de microcuvettes peut être stocké pour une période de temps plus courte (6 semaines) entre -18 et 50°C). Une fois le flacon ouvert, les microcuvettes restent stables pendant 3 mois. Les microcuvettes 301 ne contiennent aucun réactif actif. Utiliser les microcuvettes avant la date de péremption imprimée sur l’emballage. NE PAS UTILISER LES MICROCUVETTES PREVUES POUR UN AUTRE MODELE DE LECTEUR

HemoCue® B-HB Photometer Hemoglobin Controls HYC84665 3x3 ml (1 low, 1 normal, 1 high) : Contrôle utilisant du sang humain stabilisé, à utiliser comme du sang frais. Expiration de 2 ans après la date de fabrication si conserve entre 2-8°C. Après ouverture, stable 60 jours à 2-8°C ou 30 jours à température ambiante


DHT (méthode à l’ammoniaque)

PRINCIPE :

Une quantité précise de sang est diluée dans un volume précis d’une solution hémolysante (ammoniaque à 0,04 %). L’hémoglobine libérée des globules rouges donne la couleur rouge au liquide. L’intensité de cette couleur est mesurée à 523 nm (longueur d’onde d’absorption maximale commune de la majorité des types d’hémoglobines) dans un photomètre qui transforme cette valeur en concentration. La mesure de la concentration en hémoglobine (en g/l) est automatiquement effectuée lors de

l’introduction d’une cuvette dans l’appareil. La valeur mesurée reste affichée durant 30 secondes, puis l’appareil passe automatiquement en position « stand by » ce qui lui permet de faire périodiquement des autocontrôles. Ce système est commercialisé par DHT (Developing Health Technology) : Site internet : www.dht-online.co.uk

Cuvette

Fenêtre en verre

Filtre d’interférence

Photodiode LED (Diode émettant une lumière verte)

MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + hémoglobinomètre DHT, tubes à hémolyse, pipette de Sahli avec un système d’aspiration de sécurité, (ou pipette automatique de 20µl), pipette graduée de 2 ml (ou distributeur automatique de 2 ml), ballon à pipeter, tubes à essai, cuvettes pour colorimètre, ballon jaugé de 1.000 ml. PRELEVEMENT :

Prélèvement de sang capillaire [ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution). Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'EDTA dipotassique]. REACTIFS : Solution d’ammoniaque à 0,04 % (v/v) :

Préparation sur base d’une solution d’ammoniaque à 28 % :

Ammoniaque à 28 % 1,4 ml (pipettes en verre de 5 ml) Eau distillée ad 1.000,0 ml (ballon jaugé de 1.000ml) �� ATTENTION : L’ammoniaque concentrée produit des vapeurs irritantes et toxiques. N’ouvrir la bouteille que dans un local bien ventilé (ou sous hotte chimique). Cette préparation donne une concentration finale en ammoniaque de 0,0392 %. La solution diluée est stable 4 semaines dans un flacon blanc hermétiquement bouché à température ambiante.

Formule utilisée pour la calculer la dilution :

C1 x V1 = C2 x V2


Où C1 = Concentration de la solution concentrée en ammoniaque V1 = Volume de la solution concentrée en ammoniaque à utiliser

C2 = Concentration en ammoniaque à atteindre V2 = Volume de la solution diluée à préparer Exemple : C1 = 28 % V1 = ? C2 = 0,04 % V2 = 1.000 ml Soit : 28 % x V1= 0,04 % x 1000 ml soit V1 = 1,429 ml

METHODE :

VERIFICATION DE LA CALIBRATION DE L’HEMOGLOBINOMETRE : (Attention : Les valeurs données ne sont valables que pour l’hémoglobinomètre N° 0931 de l’ITG) Evitez de salir les surfaces optiques des cuvettes. Ne touchez jamais les surfaces optiques. Manipulez toujours les cuvettes en les-tenant par leurs faces mates. Toutes traces de doigts, de salissures ou de condensation doivent être enlevées avec un papier doux avant mesure. Lors du remplissage de la cuvette, évitez la formation de bulles d’air qui affecterait la mesure.

A. REGLAGE DU BLANC : Insérez une cuvette PROPRE ET SECHE dans l’appareil. Attention, la cuvette doit être du même type que celles utilisées pour les dosages. La valeur obtenue doit être comprise entre 14 et 24 g/l (pour l’appareil N° 0931). Si ce n’est pas le cas, faites les vérifications suivantes :

CAUSES POSSIBLES ACTIONS

Cuvette mal insérée dans l’appareil : Insérez la cuvette en sorte que le trajet optique rencontre les faces transparentes de la cuvette.

Cuvette griffée : Changez de cuvette. Revérifier la valeur obtenue avec une cuvette neuve et sèche.

Cuvette sale, ou humide : Lavez et séchez la cuvette. Revérifiez la valeur obtenue avec la cuvette propre et sèche.

Facteur de calibration (M) incorrect : Vérifiez et ajustez si nécessaire le facteur de calibration : Enfoncez et maintenir pendant deux secondes la touche R. Le symbole HHH sera afficher puis la valeur du facteur. Relâchez la touche R dès que la valeur est affichée. Si la valeur affichée n’est pas 162 (pour l’appareil N° 0931), augmentez cette valeur en appuyant sur la touche L ou diminuez cette valeur en appuyant sur la touche R. Après ajustement, revérifiez la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche.

Réglage du zéro électronique de l’appareil incorrect :

Remplissez une cuvette propre d’eau distillée. Insérez cette cuvette dans l’appareil. Enlevez la cuvette après le signal sonore puis enfoncez et maintenez la touche L jusqu’à l’émission d’un son long. La nouvelle valeur du zéro est alors enregistrée. Revérifiez la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche.

Le type de cuvette utilisée n’est pas le même que celle utilisée pour la calibration :

Remplissez une cuvette propre d’eau distillée. Insérez la cuvette dans l’appareil. Enlevez la cuvette après le signal sonore puis enfoncez et maintenez la touche L jusqu’à l’émission d’un son long. La nouvelle valeur du zéro est alors enregistrée. Revérifiez la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche.

La fenêtre optique de l’appareil est sale : Nettoyez la fenêtre optique à l’aide d’un petit coton-tige imbibé d’alcool à 70°. Laissez sécher. Revérifiez la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche.

B. VERIFICATION ET REGLAGE DU ZERO DU DOSAGE : Insérez dans l’appareil une cuvette contenant 2 ml d’une solution d’ammoniaque à 0,04 %. La valeur mesurée et affichée doit être égale à 0. Si la valeur obtenue n’est pas 0, enlevez la cuvette et dans les deux secondes qui suivent enfoncez et maintenez la touche L jusqu’à l’émission d’un signal sonore. Insérez dans l’appareil une cuvette contenant 2 ml d’une


solution d’ammoniaque à 0,04 %. La valeur mesurée et affichée doit être égale à 0. Ce contrôle est à faire avant chaque série de mesures.

C. VERIFICATION DE LA CALIBRATION : Une cuvette de contrôle (N° 0931 pour notre appareil) est fournie avec chaque lecteur. La valeur attendue pour notre cuvette de contrôle doit être comprise entre 133 et 143. Ce contrôle est à effectuer avant chaque série de mesures Insérez dans l’appareil la cuvette de calibration. Si la valeur mesurée n’est pas comprise dans cet intervalle, réalisez les vérifications suivantes :

CAUSES POSSIBLES ACTIONS Cuvette de contrôle mal insérée dans l’appareil :

Insérez la cuvette en sorte que le trajet optique rencontre les faces transparentes de la cuvette.

Cuvette de contrôle griffée : Achetez une nouvelle cuvette de contrôle. Revérifiez la valeur obtenue avec une cuvette neuve et sèche.

Cuvette sale, ou humide : Lavez et séchez la cuvette. Revérifiez la valeur obtenue avec la cuvette propre et sèche.

Facteur de calibration (M) incorrect : Vérifiez et ajustez si nécessaire le facteur de calibration : Enfoncez et maintenez pendant deux secondes la touche R. Le symbole HHH sera afficher puis la valeur du facteur. Relâchez la touche R dès que la valeur est affichée. Si la valeur affichée n’est pas 162 (pour l’appareil 0931), augmentez cette valeur en appuyant sur la touche L ou diminuez cette valeur en appuyant sur la touche R. Revérifiez la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche.

Réglage du zéro électronique de l’appareil incorrect :


Le type de cuvette utilisée n’est pas le même que celle utilisée pour la calibration :


La fenêtre optique de l’appareil est sale : Nettoyez la fenêtre optique à l’aide d’un petit coton-tige imbibé d’alcool. Laissez sécher. Revérifiez la valeur du blanc obtenue avec la cuvette propre et sèche.

REALISATION D’UN DOSAGE : ATTENTION : La précision de la mesure dépend de la bonne concentration en ammoniaque, de la qualité de l’eau distillée utilisée pour la préparation du réactif d’hémolyse, de la précision de la mesure du volume d’ammoniaque et de la précision de la mesure du volume de sang. 1. Pour chaque échantillon, prévoyez un tube contenant 2,0 ml du réactif d’hémolyse 2. Vérifiez si la pipette de Sahli est propre, sèche et non ébréchée. 3. Prélevez 20 µl de sang (pipette de Sahli sur laquelle est adaptée une seringue à insuline). 4. Aspirez le sang un peu au dessus du trait de jauge. 5. Essuyez l’excès de sang sur la paroi extérieure de la pipette avec un papier hygiénique et ajustez

au trait de jauge avec le papier hygiénique. 6. Refouler le sang dans le tube contenant 2 ml du liquide d’hémolyse. 7. Rincer 3 fois par refoulement la pipette de Sahli avec le mélange de sang et de liquide d’hémolyse

(L’hémolyse ne demande que quelques secondes). 8. Après homogénéisation, transférez-le contenu du tube dans une cuvette optique. La couleur reste

stable pour 6 à 8 heures. 9. Insérez la cuvette dans l’appareil 10. Notez la valeur (en g/l) affichée sur l’appareil. Attention, si le signal sonore se termine avant que la cuvette soit totalement insérée dans l’appareil, la valeur affichée sera fausse. Attendre le signal sonore suivant pour utiliser la valeur.


DETERMINATION DE L’HEMATOCRITE (méthode micro, par centrifugation)

PRINCIPE :

La mesure de l’hématocrite (Ht) consiste à apprécier le volume occupé par les globules rouges par rapport au volume occupé par le plasma, permettant de rechercher une hémoconcentration ou une anémie. L’hématocrite s’exprimait en pourcentage, car c’est un rapport de volume.

Volume des globules rouges Ht = -------------------------------------- x 100 Volume du sang total Les nouvelles unités sont en nombre absolu (même formule, mais sans multiplier par 100) On remplit un tube capillaire de sang que l’on centrifuge à grande vitesse. Après centrifugation, le

pourcentage du volume du sang occupé par les globules rouges est mesuré. Comme le diamètre du tube capillaire est constant, la hauteur des différentes couches est directement proportionnelle à leur volume. La mesure des hauteurs est donc suffisante.

Hauteur des globules rouges Ht = ------------------------------------------ x 100 Hauteur du sang total

MATERIEL : Matériel pour prélèvement capillaire + centrifugeuse hématocrite, tube capillaire hépariné (tubes rouges, 75 mm diamètre de 1.5 mm), lampe à alcool (ou pâte à modeler), échelle pour lecture des résultats. PRELEVEMENT :

Prélèvement de sang capillaire ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur un anticoagulant sec (pour éviter la dilution) qui en outre n'influence pas le volume des globules rouges. Les deux anticoagulants conseillés sont soit l'héparine soit l'EDTA dipotassique. Dans le cas d’un prélèvement veineux sur anticoagulant, des tubes capillaires secs (sans anticoagulant) peuvent être utilisés). Comme l’hématocrite augmente en fonction de la durée de conservation, l’examen doit être réalisé endéans les 6 heures.

METHODE : 1. Placez l’extrémité rouge du tube capillaire hépariné dans une goutte de sang. Le sang pénètre par capillarité. Remplissez le tube capillaire au trois quart de sang. 2. Scellez à la flamme (ou bouchez à la pâte à modeler) l’extrémité du tube qui n’est pas entrée en contact avec le sang. Vérifiez que le capillaire est hermétiquement bouché. 3. Déposez le tube capillaire dans une des rainures numérotées du rotor de la centrifugeuse. L’extrémité scellée du capillaire doit être placée vers l’extérieur de la centrifugeuse. Reportez le numéro de la rainure sur le bulletin de demande d’analyse du patient.


4. Equilibrez la centrifugeuse en mettant un tube capillaire en face de celui du patient. Fermez le couvercle du rotor et centrifugez à grande vitesse (12.000 RPM ou 15.000 g) pendant 5 minutes. 5. Après centrifugation, le tube contient 3 couches :

� En haut une colonne de plasma (P).

� Au milieu une fine couche (buffy coat) de globules blancs (GB) et les plaquettes.

� En bas une colonne de globules rouges (GR).

C’est exactement au sommet de cette couche de globules rouges que se mesure l’hématocrite. Mettez le tube sur l’échelle de lecture, en plaçant le bas de la colonne de globules rouges (et non le bas du tube) sur le 0 et le haut de la colonne de plasma sur le 100. Déplacez la latte mobile pour que le trait coïncide avec le haut de la colonne des globules rouges. Lisez le pourcentage donné dans la fenêtre de lecture. Après lecture, élimez immédiatement les capillaires dans un conteneur à aiguilles.

REPONSES TYPES :

Hématocrite : ___ %. REMARQUES :

L'inspection du plasma surnageant renseigne sur l'existence éventuelle : • d'une lipémie (plasma opalescent ou laiteux). • d'un ictère (plasma jaune). • d'une hémolyse (plasma rosé pour de l'hémoglobine libre ou plasma brun pour la

méthémoglobine). LE TEST EST ALORS À RECOMMENCER • d'une drépanocytose majeure (colonne des globules rouges de couleur très foncée). • d'une forte hyperleucocytose (épaississement de la couche intermédiaire). • …

Une augmentation de la couche du buffy coat indique une augmentation significative du nombre de globules blancs. Ceci est visible pour des valeurs supérieures à 20.000 leucocytes par mm³. L’examen microscopique de la couche des globules blancs et de la partie du plasma immédiatement adjacente permet de rechercher des trypanosomes (et des microfilaires). On parle alors de la technique de Woo.


VALEURS DE REFERENCES 2 :

Comme pour l'hémoglobine, les valeurs d'hématocrites varient en fonction de l'âge, du sexe et de l'altitude.

Age Hématocrite en %

(en valeurs absolues)

Nouveau-nés 50 à 58 (0.50 à 0.58) Nourrissons (3 mois) 35 à 40 (0.35 à 0.40)

1 an 31 à 36 (0.31 à 0.36) 5 ans 33 à 37 (0.33 à 0.37)

Femmes adultes 36 à 45 (0.36 à 0.45) Hommes adultes 42 à 49 (0.42 à 0.49)

INTERPRETATION DES RESULTATS : L’hématocrite est une analyse simple et précise qui permet de détecter la plupart des anémies. L’hématocrite est aussi utile dans le cadre de la dengue. L'hématocrite est influencé par le nombre de globules rouges, la taille des globules rouges et le volume plasmatique. Lorsque le volume des globules rouges est dans les limites de la normale, 1 % d'hématocrite correspond approximativement à 110.000 globules rouges par mm³ de sang. Comme le rapport entre la teneur moyenne en hémoglobine des globules rouges et le volume globulaire moyen ne varie qu'entre des limites très étroites, l'hématocrite est le reflet assez fidèle de la concentration en hémoglobine du sang complet. La valeur de l'hématocrite (en %) multiplié par 0.3 + 2 donne une idée très approximative de la concentration en hémoglobine. Ce calcul ne remplace cependant pas le dosage de l’hémoglobine.

Exemple : Pour un hématocrite de 33 %, on estime la concentration en hémoglobine à (33 x 0.3) + 0.2 soit 10.1g/100 ml.

Dans le cas d’une anémie normocytaire ou normochrome, la formule se maintient, puisque l’hématocrite et l’hémoglobine sont parallèlement diminués.

Exemple : Pour un hématocrite de 27 %, on estime la concentration en hémoglobine à : (27 x 0.3) + 0.2 soit 8.4 g/100 ml.

Dans le cas d’une anémie macrocytaire ou hypochrome ou mégaloblastique, mais aussi dans le cas d’une anémie microcytaire, cette estimation ne fonctionne pas. L’hématocrite est abaissé chez les patients anémiques.

V o l u m ep l a s m a t i q u e

V o l u m e g l o b u l a i r e

N o r m a l A n é m i e v r a i e

F a u s s e a n é m i e( h é m o d i l u t i o n )

Fig.3 : Anémie vraie et fausse anémie par hémodilution L’hématocrite est augmenté en cas de perte de plasma, de brûlure grave, de déshydratation, de diarrhée des nourrissons, de choléra, de dengue et plus rarement de polycytémie.

2 Les valeurs de références varient en fonction de la population et de la méthode utilisée par le laboratoire. Chaque laboratoire devrait valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour l'hématologie le plus proche.


INDICES (OU INDEX) : (MCHC) A partir des valeurs de l’hémoglobine et de l’hématocrite, il est possible de calculer la Concentration Corpusculaire Moyenne en Hémoglobine : CCMH (ou MCHC en anglais pour Mean Corpuscular Haemoglobin Concentration). La CCMH exprime donc la concentration en hémoglobine contenue dans les globules rouges.

La CCMH est donnée par la formule Hg/Ht x 100

Exemple : Un patient a une hémoglobine de 16 g/100 ml et un hématocrite de 45 %. Sa CCMH est de 16/45 x 100 = 36 g %.

Fig. 4 : Tableau de détermination du CCMH. La CCMH s’exprime en g/100 ml (g%). Sa valeur de référence est comprise entre 30 à 36 g%. La CCMH permet d’orienter vers la cause de l’anémie : CCMH < 30 g% Anémie hypochrome.

CCMH entre 30 et 36 g% Anémie normochrome. Il n’existe pas d’anémie hyperchrome puisque cela supposerait que les globules rouges contiendraient plus d’hémoglobine qu’ils ne peuvent en contenir (avec un cas particulier pour l’anémie mégaloblastique).

Anémies hypochromes < 30 Anémies normochromes > 36 “Anémies hyperchromes”


SOURCES D'ERREURS : Augmentation :

• Position du patient durant le prélèvement (hématocrite en position couchée est plus au moins égal à l’hématocrite en position debout + 10 %).

• Conservation longue du prélèvement (6-8 heures) avant la détermination de l’hématocrite. • Délai trop long entre la centrifugation et la lecture (évaporation du plasma). • Stase veineuse prolongée (>1 minute) lors du prélèvement sanguin (hémoconcentration). • …

Diminution :

• Fuite inapparente du capillaire. • Centrifugation trop courte ou vitesse de centrifugation trop basse (tassement incomplet). • Dégradation des globules rouges par la chaleur (hémolyse). • Utilisation de la première goutte de sang d’un prélèvement capillaire (dilution du sang par du

liquide interstitiel). • Pression excessive sur le doigt pour obtenir du sang capillaire (dilution du sang par du liquide

interstitiel). • Dégradation de l’héparine par la chaleur (température de conservation des capillaires). • Sang incorrectement oxygéné. • Lyse des globules rouges durant la centrifugation (échauffement). • Coagulation du sang dans le tube de prélèvement. • Concentration trop élevée en EDTA (diminution du volume des globules rouges). • …

Indéterminée :

• Erreur de lecture (parallaxe). • Non homogénéisation du tube de sang avant de remplir le capillaire. • Utilisation de tubes de mauvaise qualité, de diamètre non constant. • …

ASSURANCE QUALITE : Réalisation en double sur un même échantillon : La différence de mesure doit être inférieure à 3 %. Vérification du tassement optimal des globules rouges : Après réalisation et lecture de la valeur de l’hématocrite, re-centrifugez le tube pendant 2, 3 et 5 minutes. Aucune diminution de la valeur de l’hématocrite ne peut être observée. Dans le cas contraire, choisissez le temps de centrifugation minimal qui donne une valeur constante d’hématocrite.


NUMERATION DES GLOBULES EN CELLULE DE NUMERATION

PRINCIPE GENERAL : Le comptage des cellules par unité de volume est un aspect important d’aide au diagnostic qu’un laboratoire peut fournir. Des compteurs électroniques de particules peuvent être utilisés dans les grands laboratoires, mais pour des laboratoires tropicaux, une méthode manuelle utilisant un microscope peut être la seule alternative réaliste. La méthode manuelle consiste à compter sous microscope le nombre de globules présents dans un volume défini (cellule de numération). En fonction du type de liquide à analyser (et donc du nombre de cellules attendu) une dilution est éventuellement réalisée pour obtenir un nombre de globules comptables. Cette dilution peut aussi avoir pour but de détruire des globules indésirables (globules rouges si l’on désire compter des globules blancs par exemple). Un simple calcul, tenant compte du nombre d’éléments comptés, du volume utilisé pour le comptage et de la dilution éventuelle permet d’obtenir le nombre de globules par mm³ de liquide biologique. MATERIEL GENERAL : Matériel pour prélèvement + Pipette de Sahli avec un système d’aspiration de sécurité, pipette de 1 ml, ballon à pipetter, papier absorbant, tube à hémolyse, liquide de dilution, crayon noir à mine grasse, cellule de numération, lamelle plane pour cellule de numération, pipette pasteur en plastique, compteur à une touche, papier pour lentilles, microscope (objectif 10 x et 40 x), solution de chlore, éthanol. LES CELLULES DE NUMERATION : Une cellule de numération est composée d’une lame porte-objet épaisse et d’une lamelle couvre objet plane de 20mm x 26mm x 0,4 mm.

C B A B C Cellule de numération de Neubauer, vue du dessus

C B A B C Cellule de numération de Neubauer, vue latérale

B A B Cellule de numération de Neubauer, vue latérale

La lame porte objet est divisée en 5 parties (C, B, A, B et C) séparées par des rainures. La partie centrale A est de plus divisée en deux par une rainure transversale et chacune de ces deux surfaces présente un quadrillage gravé. Ce quadrillage varie suivant le type de cellule de numération (cf. infra). La partie centrale A est plus basse que les parties B. Cette différence de hauteur, variable suivant le type de cellule, est appelée profondeur de la cellule (souvent indiquée sur la partie C de la cellule).


En appliquant une lamelle plane sur la lame porte objet, on obtient ainsi un volume déterminé par la profondeur de la cellule et la surface délimitée par le quadrillage. Sont donnés ici la reproduction du quadrillage et les caractéristiques des cellules de numération les plus courantes : Cellules de numération à petit volume :

Cellule de Thoma : Surface : 1 mm x 1 mm soit 1 mm².

Profondeur : 0,1 mm.

Volume total : 0,1 mm³ ou µl.

Cellules de numération à volume moyen :

Cellule de Neubauer : Surface : 3 mm x 3 mm soit 9 mm².



Cellule de Neubauer (double improved) : Surface : 3 mm x 3 mm soit 9 mm².




Cellule de Malassez : Surface : 2 mm x 2,5 mm soit 5 mm².


Volume total : 1 mm³ ou µl.

Cellules de numération à grand volume :

Cellule de Fuchs-Rosenthal : Surface : 4 mm x 4 mm soit 16 mm².

Profondeur : 0.2 mm.


Cellule de Nageotte : Surface : 10 mm x 10 mm soit 100 mm².

Profondeur : 0,25 mm ;

0,50 mm ;

ou 1mm.

Volume total : 25 mm³ ou µl ;

50 mm³ ou µl ;

100 mm³ ou µl.

Les cellules de numération à petit volume sont utilisables pour la numération de globules dans des liquides contenant beaucoup de cellules (globules rouges dans le sang par exemple), alors que les cellules de numération à grand volume sont utilisables pour la numération de globules dans des liquides contenant peu de cellules (globules blancs dans un liquide céphalo-rachidien par exemple). Pour standardiser les techniques de numération, il est donc souhaitable d’utiliser une cellule de numération à volume moyen, utilisable dans tous les cas de figure. La cellule de numération correspondant le mieux à ce critère et la plus répandue est la cellule ce Neubauer double improved.


NUMERATION DES GLOBULES BLANCS DANS LE SANG :

REACTIFS :

Liquide de Türck : Mettez dans un flacon 96 ml d'eau distillée. Ajoutez 3 ml d'acide acétique glacial (CH3COOH)

Puis 1 ml de violet de gentiane à 1 % (ou 1 ml de bleu de méthylène aqueux). ATTENTION : L'Acide Acétique Glacial est inflammable, nocif et extrêmement corrosif. Il est aussi irritant pour les yeux. Manipulez ce produit avec précaution, loin d’une flamme, fenêtres ouvertes (ou sous hotte chimique). Ne versez jamais d'Eau dans l'Acide Acétique Glacial. L'addition d'une faible quantité d'eau dans un acide produit suffisamment de chaleur pour faire exploser la bouteille. CONSERVATION : Quelques mois au FRIGO. Eliminez tous les 3 mois.

PRELEVEMENT : Prélèvement de sang capillaire [ou prélèvement de sang veineux. Le sang doit alors être prélevé sur EDTA dipotassique]. La numération doit être réalisée dans les 6 heures qui suivent le prélèvement. METHODE : 1. Assurez-vous que la pipette de Sahli (20 µl) est intacte (éliminez toute pipette dont l'extrémité

n'est pas intacte), propre et sèche. 2. A l'aide d'une pipette graduée de 1 ml, versez 0,380 ml de liquide de Türk dans un tube en

plastique à usage unique. Utilisez un ballon à pipeter. Attention : Le liquide de Türk se conserve au frigo.

3. Inscrivez le numéro du patient sur le tube. 4. Aspirez du sang capillaire, à l’aide d’un dispositif de sécurité, jusqu'à la marque 0.02 de la

pipette de Sahli. Ne laissez pas pénétrer de bulles d'air. 5. Essuyez l'extérieur de la pipette avec du papier absorbant. Assurez-vous que le niveau du

sang coïncide avec le repère. 6. Soufflez le sang dans le tube à hémolyse contenant le liquide de Türk. Rincez la pipette de

Sahli en aspirant et refoulant le liquide à trois reprises. La dilution du sang est de 1/20. 7. Homogénéisez et attendez 3 minutes avant de remplir la cellule (temps de lyse des globules

rouges). 8. Nettoyez immédiatement la pipette de Sahli. 9. Préparez la cellule de Neubauer (Neubauer double improved) : Humidifiez les surfaces

surélevées "B". Appliquez la lamelle en exerçant une pression suffisante. Si la lamelle est bien en place, on voit apparaître les couleurs de l'arc en ciel (anneau de Newton) aux niveaux des surfaces surélevées "B".

C B A B C Cellule de numération de Neubauer, vue du dessus


10. A l'aide d'une pipette Pasteur en plastique, mélangez bien le sang dilué dans le liquide de Türk, puis remplissez complètement la moitié de la chambre A de la cellule, sans que le liquide ne déborde dans les rainures. Attention : Si le liquide déborde de la zone située entre les 2 chambres, recommencez l'opération, après avoir nettoyé la lamelle et la cellule.

11. Laissez la cellule au repos sur une surface plane pendant au moins 3 minutes afin de

permettre aux leucocytes de sédimenter. 12. Placez la cellule de numération sur la platine du microscope, maintenue en position

horizontale (la numération ne doit jamais être faite sur une platine inclinée).

13. Avec l'objectif 10 x, repérer le quadrillage en évitant un éclairage trop intense (réduire le diaphragme). Mettez au point sur les lignes et les cellules. La numération se fait à l'objectif 40 x. Tous les leucocytes doivent être dans le même plan, sinon attendre quelques minutes. A l'objectif 40 x, les leucocytes apparaissent comme des cellules rondes, légèrement brillantes, dans lesquelles on distingue un noyau faiblement bleuté. Ces critères permettent de ne pas confondre les leucocytes avec des poussières, des plaquettes ou des amas d'hématies lysées. Comptez les leucocytes dans les 4 grands carrés de 1 mm². Sont comptés :

• Les leucocytes situés à l'intérieur du quadrillage. • Pour les leucocytes situés "à cheval" sur les lignes de bordure, ne

comptez pour chaque carré, que les cellules "à cheval" sur les lignes "droites" ou "supérieures", et qui ne touchent aucune autre ligne. Ceci afin de ne pas compter 2 fois la même cellule. On continue de la même façon pour le carré suivant.

14. Pour obtenir le nombre de globules blancs présents par mm³ de sang, multipliez le nombre de

cellules comptées dans 4 grands carrés par 50 :

• Facteur de dilution : 20 µl de sang + 380 µl de liquide de Türk soit une dilution de 20 x [(20+380)/20].

• Facteur de volume : 4 grands carrés analysés, soit 4 x 0.1 mm³ soit un résultat à multiplier par 2,5 pour obtenir un résultat par µl [10/4].

Soit un facteur de correction total de 50 [20 x 2,5)]. Exemple : Grand carré n° 1 25 leucocytes Grand carré n° 2 26 leucocytes Grand carré n° 3 24 leucocytes Grand carré n° 4 26 leucocytes Total pour les 4 grand carrés : 101 leucocytes

Nombre de leucocytes par mm3 (ou µl) de sang = 101 x 50 = 5.050

VALEURS DE REFERENCES :

Résultats normaux par âge (valeur absolue par mm3 de sang) 3 AGE 1 jour 15 jours 2 mois 6 mois 2 ans 6 ans 12 ans Adulte Nombre

9.000 à

30.000

6.000 à

20.000

5.500 à

18.800

6.000 à

17.500

6.000 à

17.000

5.000 à

14.500

5.000 à

13.500

4.000 à

11.000 3 Cf. aussi Annexe 2. Les valeurs de références varient en fonction de la population et de la méthode utilisée par le laboratoire. Chaque laboratoire devrait valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour l'hématologie le plus proche.


ASSURANCE QUALITE La précision d'une numération effectuée par un laborantin entraîné est d'environ 20 %. Un nombre minimal de cellules doivent être comptées pour diminuer l’erreur liée à la distribution des cellules (au moins 100). Adapter, si nécessaire, le nombre de carrés comptés (Attention, changer alors la formule de calcul). Une autre validation de la bonne distribution des cellules est de comparer le nombre de cellules comptées dans chaque grand carré. Le nombre de cellules ne doit pas varier de plus de 10 % entre chacun des 4 grands carrés. SOURCES D'ERREURS :

• SOP (Standard Operating Procedure) non adaptée aux conditions réelles de réalisation du test.

• Erreurs administratives dans l’enregistrement du patient. • Position lors du prélèvement (patient debout, assis, allongé,…). La position debout diminue le

volume plasmatique [hémoconcentration]. • Patient anémique en régénération (présence d’érythroblastes). Correction possible si le

nombre d’érythroblaste est connu). • Usage prolongé (> à 1 minute) du garrot lors du prélèvement veineux [hémoconcentration]. • Numération pour un patient déshydraté [hémoconcentration]. • Non respect du temps entre le prélèvement et la réalisation du test [maximum 6 heures pour

éviter la dégradation des leucocytes]. • Contamination du sang par le désinfectant utilisé sur la peau [hémolyse ou coagulation]. • Prélèvement du sang au niveau d’un bras ou coule une perfusion [hémodilution]. • Usage d’un anticoagulant inapproprié du type citrate (dilution par un anticoagulant liquide). • Coagulation de l’échantillon. • Mélange du sang et de l'anticoagulant insuffisant. • Agitation trop violente du sang, produisant une hémolyse mécanique et des erreurs de

pipetage. • Non homogénéisation de l’échantillon de sang avant de réaliser la dilution. • Verrerie sale ou humide [hémolyse, dilution]. • Liquide de Türck contenant des particules. • Lyse des globules rouges insuffisante, posant un problème d’identification des leucocytes. • Bulles d'air dans les pipettes ou dans la chambre de numération [erreur de volume]. • Présence de sang sur l’extérieur de la pipette. • Rinçage insuffisant de la pipette. • Chambre de numération mal montée ou montée avec une lamelle non plane. Chambre de

numération sale. • Remplissage trop important (ou trop faible) de la cellule de numération. • Non respect des temps d’attente avant lecture [temps d’hémolyse ou temps de sédimentation

dans la cellule de numération]. • Utilisation d’un éclairage trop intense lors de la lecture microscopique. • Erreur de calcul. • Erreur administrative dans le rendu des résultats. • …

NUMERATION DES GLOBULES ROUGES DANS LE SANG : La précision de la numération manuelle des globules rouges dans le sang n’est pas suffisante pour permettre de calculer les indices (MCV et MCH). Cette analyse, fastidieuse est donc d’un intérêt limité. En absence d’un compteur électronique de cellules, la plupart des laboratoires de district ne seront pas à même de calculer ces indices. L’examen d’un frottis sanguin, pour peu qu’il soit bien réalisé et coloré, peut alors être utile par la détermination de macrocytose et de microcytose.


INDICES (OU INDEX) :

MCV Mean Corpuscular Volume

Hématocrite (%)

MCV = -------------------------------------------------------------- x 10 x 10-15 l Nombre de globules rouges par µl (en millions) Valeurs de référence : 82 à 92 fl (pour les adultes ; pour les enfants : variations selon l’âge) [fl= 10-15 l]

POUR LES ADULTES

Anémies microcytaires < 82 Anémies normocytaires > 92 Anémies macrocytaires

MCH Mean Corpuscular Haemoglobin

Taux d’hémoglobine (g/l)

MCH = -------------------------------------------------------- Nombre de globules rouges par µl (en millions) Valeurs de références : 28 à 32 pg (pour les adultes ; pour les enfants : variations selon l’âge)

POUR LES ADULTES

> 32 “Anémies hyperchromes”


ANNEXE 1 : Liste indicative de prix pour les techniques de détermination de l’anémie HCS (échelle colorimétrique visuelle): • Kit de démarrage contenant : 1 boîte de protection avec 1 distributeur de bandelettes tests et 200 bandelettes tests, 1 livret avec une palette

de 6 couleurs de référence, 1 manuel d’instruction, 4 recharges de 200 bandelettes-tests chacun. 21,80 € (Février 2004, Copack).

• Kit de Recharge contenant : 10 distributeurs contenant chacun 200 bandelettes tests (soit un total de 2000 tests). 32,75 € (Février 2004, Copack).

Hémoglobinomètre LOVIBOND® (méthode simplifiée selon Harrison) : • Comparateur Lovibond® 2000 : 456,22 € (Janvier 2004, MSF Supply) • Cellule capillaire spéciale Pour Lovibond® TINT606700 36,40€ (juillet 2007, VWR) • Disque de comparaison 5/8 A (valeurs d’hémoglobine basses) : 90,05 € (Janvier 2004, MSF Supply) • Disque de comparaison 5/8 B (valeurs d’hémoglobine hautes) : 161,98 € (Janvier 2004, MSF Supply) SAHLI (méthode à l’hématine acide): • Sahli kit complet contenant : un comparateur, un tube de Sahli, une pipette de Sahli, un goupillon de nettoyage, un agitateur en verre, un

flacon compte-gouttes pour l’HCl et un autre pour l’eau distillée: 57,35 € (Févier 2004, VWR)

• Acide chlorhydrique min. 37 % 1 litre (PRODUIT TRES CORROSIF ET IRRITANT) : 9,35 € (Févier 2004, VWR) Hémoglobinomètre DHT (méthode à l’ammoniaque) [www.dht-online.co.uk] : • Hémoglobinomètre DHT HB 523 : 543,00 € (Févier 2004, DHT) • Ammoniaque à 30 % 1 litre (PRODUIT CORROSIF ET IRRITANT) : 5,35 € (Févier 2004, VWR) • Pipette de Sahli 20µl : 1,34 € (Février 2004, DHT) • Pipette graduée en verre de 2 ml: 1,93 € (Févier 2004, VWR)

OU Distributeur automatique 2 ml Ceramus : 217,00 € (Févier 2004, VWR).

• Ballon de sécurité pour pipette en verre : 2,92 € (Févier 2004, VWR) • Cuvettes optique en plastique 10 mm (100 cuvettes) : 4,58 € (Févier 2004, DHT) • Batteries 4 (Type N alcaline) : 6,35 € (Févier 2004, DHT) • + Bouteilles + éprouvettes graduées + tubes à essais + support pour tubes HEMOCUE® (méthode simplifié utilisant des consommables à usage unique) : • Photomètre Hemocue® B avec cuvette de contrôle : 555,00 € (Févier 2004, Hemocue) • Cuvette à usage unique Hemocue® B (50 cuvettes) 60,00 € (Février 2004, Hemocue)

Photomètre Hemocue® automatique 201+ 327,80 € (juillet 2006, MSF Supply) • Cuvettes à usage unique Hemocue® 201 (200 cuvettes) : 84,66 € (mars 2007, MSF Supply)

Photomètre Hemocue® automatique 301+ 350,00 € (juillet 2007, Hemocue) • Cuvettes à usage unique Hemocue® 301 (200 cuvettes) : 65,00€ (juillet 2007, Hemocue) • Batteries 4 (Type N alcaline) : 6,35 € (Févier 2004, DHT) Méthode colorimétrique au DRABKIN (technique de référence) : • Colorimètre WPA C0700D, gamme de λ : 400-700 nm : 734,00 € (Février 2004, DHT) • Kit Hémoglobine Sigma 525-A 1000 déterminations : 80,74 € (Décembre 2003, Sigma)

(TRANSPORT ET CONSERVATION ENTRE 2-8°C) Ou Hemiglobincyanide standard de JT Baker 3061 € (AML) Hemoglobin reagent solution de JT Baker 3060 € (AML)

• Pipette de Sahli 20µl : 1,34 € (Février 2004, DHT) • Pipette graduée en verre de 5 ml: 1,93 € (Févier 2004, VWR)

OU Distributeur automatique 5 ml Ceramus : 217,00 € (Févier 2004, VWR)

• Ballon de sécurité pour pipette en verre : 2,92 € (Févier 2004, VWR) • Cuvettes optique en plastique 10 mm (100 cuvettes) : 4,58 € (Févier 2004, DHT) • + Bouteilles + éprouvettes graduées + tubes à essais + support pour tubes Détermination de l’HÉMATOCRITE : • Centrifugeuse (modèle DHT 590): 832,25 € (Février. 2004, DHT) • Centrifugeuse (modèle MSF Supply) : 1.500,00 € (Février. 2004, MSF Supply) • Tubes capillaires héparinisé 75 mm (200 tubes): 4,80 € (Février 2004, DHT) • Pâte de scellement pour capillaires (6 pièces): 4,00 € (Février 2004, DHT) + MATERIEL GENERAL : • Vaccinostyles • Décontaminant (hypochlorite de sodium ou autre désinfectant libérant du chlore) • Cotton • Gants à usage unique • Alcool à 70 % • …


ANNEXE 2 : QUELQUES VALEURS DE REFERENCE EN HEMATOLOGIE4

Age

Sexe Hémoglobine

Globules Rouges

Hématocrite MCHC MCV Globules

blancs

Unités g/100 ml par µl

% g/100 ml fl par µl

x 10 6 x 10 ³

3 mois – 12 mois Homme 10,0 – 14,0 3,0 – 5,6 26 – 41 28,4 – 40,0 70 - 105 5,5 – 17,5

3 mois – 12 mois Femme 10,0 – 14,0 3,0 – 5,6 26 – 41 28,4 – 40,0 70 – 105 5,5 – 17,5

1 an – 12 ans Homme 10,5 – 15,0 3,8 – 5,5 32 – 42 32,0 – 37,0 72 - 94 5,0 – 14,0

1 ans – 12 ans Femme 10,5 – 15,0 3,8 – 5,5 32 – 42 32,0 – 37,0 72 – 94 5,0 – 14,0

12 ans – 100 ans Homme (Europe) 13,2 – 17,3 4,3 – 5,7 39 – 49 32,0 – 36,0 81 - 100 4,0 – 11,0

12 ans – 100 ans Femme (Europe) 11,7 – 15,5 3,8 – 5,1 35 – 45 31,5 – 36,0 81 – 100 4,0 – 11,0

N.B. : Homme et femme (Asiatique) : 4.000 – 10.000 leucocytes /µl Homme et femme (Africain) : 2.600 – 8.300 leucocytes /µl

Formule leucocytaire :

Types cellulaires Valeurs relatives (valeurs absolues)

Polymorphonucléaires Européen + Asiatique Africain

Basophiles 0 – 1 % (0 - 200) 0 – 1 % (0 - 200)

Eosinophiles 0 – 4 % (0 - 400) 0 – 5 % (0 - 500)

Neutrophiles non segmentés 0 – 5 % (0 - 700) 0 – 5 % (0 - 700)

Neutrophiles segmentés 50 – 75 % (1.800 - 7.000) 30 – 40 % (900 - 4.000)

Monomorphonucléaires Européen + Asiatique Africain

Lymphocytes 30 – 40 % (1.000 - 4.000) 40 – 60 % (1.200 - 6.000)

Monocytes 0 – 8 % (0 - 800) 0 – 8 % (0 - 800)

Réticulocytes :

Valeurs relatives : Adulte et enfant : 2 - 15 / 1.000 globules rouges Nouveau-né : 20 - 60 / 1.000 globules rouges

Valeurs absolues : Adulte et enfant : 25.000 - 160.000 / µl

Nouveau-né : jusqu'à 150.000 /µl Plaquettes sanguines : 150.000 - 400.000 / µl

4 Les valeurs de références varient en fonction de la population et de la méthode utilisée par le laboratoire. Chaque laboratoire devrait valider ces valeurs de références avec le laboratoire de référence pour l'hématologie le plus proche.


ANNEXE 3 : MORPHOLOGIE DES ELEMENTS SANGUINS SUR FROTTIS COLORE AU MAY-GRÜNWALD-GIEMSA

TYPE CELLULAIRE TAILLE NOYAU CYTOPLASME

GRANULOCYTES µm FORME COULEUR STRUCTURE

DE LA CHROMATINE

QUANTITE COULEUR GRANULATIONS

LEUCOCYTES : GRANULOCYTES POLYMORPHONUCLEAIRES

NEUTROPHILES NON SEGMENTES 12 – 15

En boudin ou en forme de fer à cheval, Incurvation centrale égale au maximum au tiers de la largeur des extrémités des lobes 5

Bleu pourpre clair

Réseau peu épais +++ Rose pâle

Très fines granulations, Rose ou violacée. (parfois absentes)

NEUTROPHILES SEGMENTES

12 – 15 2 à 5 lobes 6 Bleu pourpre foncé

Réseau assez épais et grossier +++ Rose

Très fines granulations, Rose ou rose violet

EOSINOPHILES 12 – 15

Le plus souvent à 2 lobes (pince-nez) (parfois 3 lobes)

Bleu pourpre Epaisse, grossière +++ Rose

Grosses granulations de calibre uniforme, Jaune orange, Grains accolés.

BASOPHILES 11 – 13

Lobes mal séparés (polymorphe) peu visible

Bleu pourpre

Epaisse, grossière, recouverte par les granules

+++ Rose pâle

Grosses granulations de calibre variable, Bleu très foncé, Grains bien séparés, Peu nombreuses.

5 Déviation à gauche de la formule d’Arneth : Les neutrophiles segmentés constituent la majorité des neutrophiles dans la formule leucocytaire normale. Une augmentation des non segmentés au-dessus de 16 % signifie une

déviation à gauche (vers les formes plus jeunes). Cela se retrouve dans les processus inflammatoires, mais aussi dans des conditions de stress,… 6 Déviation à droite de la formule d’Arneth : Contrairement à la déviation à gauche où les noyaux segmentés sont rares voire absents, la déviation à droite présente des neutrophiles hyper-segmentés, c’est-à-dire à cinq

segments ou davantage. Une hyper-segmentation est caractéristique des anémies mégaloblastiques. A leur début, celles-ci révèlent sur 100 granulocytes plus d’un neutrophile à 6 segments, plus de 3 à 5 segments ou plus de 25 à 4 segments.


TYPE CELLULAIRE TAILLE NOYAU CYTOPLASME

AGRANULOCYTES µm FORME COULEUR STRUCTURE

DE LA CHROMATINE

QUANTITE COULEUR GRANULATIONS

LEUCOCYTES : AGRANULOCYTES MONOMORPHONUCLEAIRES

PETIT LYMPHOCYTES 7 -10

Rond ou ovoïde Parfois échancré

Rouge pourpre foncé

Grandes masse d’intensité de coloration hétérogène ou pycnotique

(-) ou +

Bleu ciel (parfois apparemment absent

GRAND LYMPHOCYTES 10 – 15

Rond ou ovoïde Parfois échancré

Rouge pourpre clair

Grandes masse formant des zones foncées et d’autres plus claires

++ Bleu ciel

Absentes ou quelques granules azurophiles (rose violet)

MONOCYTES 15 – 25 Rond, ovoïde ou en forme de haricot

Bleu violet clair

Fine, réseau ressemblant à une l’intérieur d’un éponge

+++ Contient généralement des vacuoles.

Gris ou gris bleu

Très fines granulation (poussière), azurophiles (rose violet)

ERYTHROCYTES

6,7 – 7,7 Disque biconcave, rose Aucunes

TROMBOCYTES

1,5 – 2 (5) Légèrement bleu Rougeâtres

Instituut voor Tropische Geneeskunde Institut de Médecine Tropicale Institute of Tropical Medicine Instituto de Medicina Tropical

Nationalestraat, 155 B – 2000 Antwerpen

Stichting van Openbaar Nut 0410.057.701

POSTGRADUAT EN MEDECINE TROPICALE ET SANTE INTERNATIONALE

Module 1 & Module 2

TRANSFUSION SANGUINE

(En situation isolée) ________________________

Notes pratiques

Févier 2009 Philippe Gillet – Luc Boel - Jan Jacobs

[email protected] , [email protected] , [email protected]


Bref rappel de génétique L’ADN constitue le support de toute l’information génétique nécessaire à la vie cellulaire. Les cellules humaines contiennent un total de 23 paires de chromosomes (cellules diploïdes). Les chromosomes sont les formes concentrées de chromatine (ADN + histones) qui apparaissent durant la multiplication cellulaire (mitose ou méiose). Durant le développement des cellules reproductives mâles ou femelles, un type de division cellulaire spéciale se produit : La méiose. Cette division cellulaire diminue de moitié le nombre de chromosomes présents dans les spermatozoïdes ou les ovules (cellules haploïdes). De cette façon, lorsqu’un ovule est fécondé par un spermatozoïde, le zygote résultant contiendra de nouveau un nombre diploïde de chromosomes (46, 23 provenant du père et 23 provenant de la mère). Les chromosomes d'une même paire sont dits homologues.

Les gènes sont les unités responsables de la production des caractères héréditaires. Deux gènes occupant la même position (ou locus) sur une paire de chromosomes homologues mais qui présentent, l'un par rapport à l'autre, de légères différences sont appelés allèles. Lorsque le même locus sur chaque paire de chromosomes homologues est occupé par le même allèle, la personne est dite homozygote (ZZ ou zz par exemple) pour le caractère donné. Si les deux allèles sont différents pour un gène donné, la personne est dite hétérozygote pour le caractère donné (Zz par exemple).

La plupart du temps, lorsqu'il y a deux allèles différents pour un même caractère, l'un domine l'autre, c'est-à-dire qu'un gène exprime le caractère pour lequel il code, mais pas l'autre. Cet allèle est dit dominant par rapport à l'autre dit récessif. Si les deux caractères sont exprimés en même temps, les allèles sont dits codominants. Les allèles sont généralement désignés par une lettre de l'alphabet, en majuscule pour l'allèle dominant et en minuscule pour l'allèle récessif.

Le patrimoine génétique d’un individu, dépendant des gènes hérités de ses parents est appelé le génotype, alors que ses manifestations ou ses effets biologiques sont appelés le phénotype.

Bref rappel d’immunologie Les réactions immunitaires, utilisées ou intervenant, dans la détermination des groupes sanguins, dans les réactions immunologiques post transfusionnelles et dans les tests de compatibilité sont essentiellement de type humorale. Caractéristiques de la réponse immunitaire humorale :

1. Contact nécessaire avec l’antigène. 2. Différence soi / non soi et immunotolérance. 3. Réponse par un anticorps spécifique vis-à-vis de l’antigène. 4. Puissance antigénique variable des différents antigènes. 5. Etapes dans la réponse humorale : Production de différentes classes d’anticorps. 6. Mémoire et différence entre la réaction primaire et secondaire.

Taux (titre) d’anticorps

Introduction de l’antigène

Réintroduction de l’antigène

REPONSE PRIMAIRE REPONSE SECONDAIRE

IgM

Fig. 1 : Evolution de la réponse immunitaire humorale dans le temps

Latence 8 à 15 jours Latence 2 à 3 jours

IgG

IgG

IgM

Temps (en jours)


GROUPAGE SANGUIN On appelle groupe sanguin un ensemble d’individus ayant en commun un caractère (allotypique) qui le distingue des autres. Ce caractère est porté par les éléments du sang et a une activité antigénique. Par restriction de langage, l’usage réserve cependant l’expression « groupes sanguins » aux seuls groupes érythrocytaires, mais il existe aussi des groupes sanguins de plaquettes, de polynucléaires, de lymphocytes et de protéines. Les antigènes de groupes sanguins se retrouvent sur la membrane des globules rouges (soit exclusivement, soit aussi sur d’autres types de cellules). Ce sont parfois des protéines, mais le plus souvent, il s’agit de glucides (sucres) complexes : Glycoprotéines, glycolipides etc. Ils sont essentiellement connus par leurs propriétés antigéniques; leurs fonctions biologiques sont le plus souvent peu connues : Transporteurs et canaux membranaires (protéines assurant les transports de molécules à travers la membrane), d’enzymes, de protéines structurales de la membrane (« charpente » du globule), de molécules d’adhésions ou de récepteurs membranaires (protéines capables de lier une molécule signal ou informative,…). L’immunologie des groupes sanguins est essentiellement humorale (immunité faisant intervenir les anticorps et le complément). Leur étude doit donc envisager les antigènes et les anticorps qui leur correspondent. La classification se fait sur deux niveaux :

1. Le premier niveau est constitué de tous les antigènes de groupes sanguins. On en recense actuellement plus de 650. (Exemples : Ag A, Ag B, Ag D, Ag Fya, …).

2. Tous ces antigènes sont regroupés dans un second niveau en systèmes. On appelle système de groupes sanguins

l’ensemble des antigènes élaborés par les allèles d’une même unité génétique mono factorielle. Un système est donc constitué de l’ensemble des variants antigéniques d’un composé membranaire.

Les antigènes ont donc une définition immunologique, tandis que les systèmes ont une définition génétique. 29 systèmes sanguins humains sont actuellement décrits [International Society of Blood transfusion]. (Exemples : ABO, Rhésus, Duffy, Kell, Lewis, P, Diego, Lutheran, Chido/Rodgers, …) Dans la pratique transfusionnelle minimale courante, on ne tiendra compte que des 2 systèmes les plus importants :

• Le système ABO qui représente l'obstacle majeur à toute transfusion du fait de la présence d'anticorps naturels réguliers (il fait aussi partie du système d’antigènes tissulaires d'histocompatibilité HLA).

• Et le système Rhésus car l'antigène D est l'antigène le plus immunogène de tous les antigènes des groupes sanguins.

La détermination des groupes sanguins est régie par la règle du "4 x 2"7 :

� Deux techniciens. � Deux séries de réactifs provenant de firmes différentes, utilisant des techniques

différentes (en tubes, sur lames, en gel, …). � Deux techniques différentes (épreuve et contre épreuve). � Deux échantillons prélevés à des moments différents.

Cette règle du "4 x 2" permet de donner une carte définitive de groupe sanguin. Dans la pratique d'un petit laboratoire cette règle des "4 x 2" n'est cependant pas toujours applicable. Sans donner de carte de groupe sanguin, il est possible de réaliser des transfusions relativement sûres sur base d'une seule détermination, par une personne sur un échantillon. Il faut cependant alors absolument réaliser les tests de compatibilité ou au minimum un « rapid cross match » (vérification de la compatibilité ABO).

7 République Française, Ministère de la santé, de la famille et des personnes handicapées : CIRCULAIRE DGS/DHOS/AFSSAPS N° 03/ 582 du 15 décembre 2003 relative à la réalisation de l’acte transfusionnel et CIRCULAIRE DGS/SQ 3 N° 99/14 du 12 janvier 1999 relative au respect de la réglementation en vigueur pour la détermination des groupes sanguins ABO.


A Le système ABO Le système ABO est le premier système sanguin découvert. C’est à Karl Landsteiner que l’on attribue le mérite de la découverte du groupe ABO en 1901 (prix Nobel 1930). Le système ABO présente une caractéristique importante qui est à la fois à l’origine des techniques du groupage sanguin et qui explique aussi son rôle crucial en transfusion sanguine : La présence constante d’anticorps anti-A et anti-B correspondants aux antigènes absents sur les globules rouges du sujet. Les antigènes ABO se retrouvent à la surface des globules rouges, mais aussi de toutes nos cellules : Il s’agit d’antigènes du système HLA. Les antigènes ABO sont des sucres terminaux de macromolécules complexes de la membrane. L'addition de ces sucres est codée par un gène. Ce gène comporte 3 allèles :

1. O : enzyme inactive (pas de sucre ajouté). 2. A : enzyme N-Acetylgalactosamine transférase. 3. B : enzyme Galactose transférase.

La transmission des groupes ABO obéit aux lois de Mendel :

A et B sont codominants vis-à-vis de O. O est récessif vis-à-vis de A et de B.

Les anticorps ABO sont principalement des anticorps naturels, réguliers, complets, froids (optimum à 4°C, mais ils agglutinent encore à 37°C), de type IgM. Ils apparaissent spontanément pendant la petite enfance par stimulation antigénique croisée avec des antigènes de surface de bactéries saprophytes de la flore intestinale. Ils apparaissent habituellement entre le 3ième et le 6ième mois de la vie et leur concentration atteint un maximum vers l’âge de 10 ans. Ils se retrouvent chez tout individu qui ne possède pas l’antigène correspondant sur ses propres globules rouges.

Résume du système ABO

ANTICORPS TOUJOURS PRESENTS DANS LE PLASMA

ANTIGENES A LA SURFACE DES GLOBULES

GROUPE SANGUIN

Tableau 1 : Estimation de la fréquence en fonction de la couleur de la peau 8 :

Groupe ABO AB A B O

Estimation de la fréquence en fonction de la couleur de la peau

Blanche 4 % 44 % 9 % 43 % Jaune 13 % 28 % 23 % 36 % Noire 4 % 27 % 21 % 48 %

N.B. 1 : Les sous-groupes A1 et A2. Très rapidement un premier niveau de complexité a été rapporté à propos du phénotype A : Le phénotype A1 qui est retrouvé pour 80 % des sujets A et le phénotype A2 chez 20 %. Le phénotype A1 est caractérisé par la présence de l’antigène A1, alors que le phénotype A2 ne possède pas l’antigène A1 Le nombre de sites antigéniques A chez les sujets de phénotype A1 est beaucoup plus élevé (1.000.000) que chez les sujets de phénotype A2 (environ 200.000 par globule rouge). Il en résulte des intensités de réactions plus faibles pour les phénotypes A2 que pour les phénotypes A1 (d’où l’importance de la qualité des réactifs utilisés dans le groupage sanguin). La distinction pratique entre ces deux phénotypes n’a aucun intérêt sur le plan transfusionnel. On peut cependant parfois observer des anti-A1 ou des anti-H naturels irréguliers, mais il s’agit le plus souvent d’anticorps froids de faible titre, sans conséquence sur le plan transfusionnel. D’autres phénotypes rares ont aussi été décrits (phénotypes cis-AB, phénotype B(A) et A(B), phénotype A acquis,…). D’autres variants du groupe A (A3, Aerd, Abantu, Ax, etc.) et plus exceptionnellement du groupe B réagissant faiblement ont été rapportés. N.B. 2 : On peut aussi retrouver des anticorps immuns irréguliers dans le système ABO. Il s’agit alors d’IgG qui peuvent apparaître après immunisation par grossesse, ou exceptionnellement après transfusion non iso-groupe ou après vaccination. Ils peuvent aussi apparaître suite à une hétéro immunisation par contact de l’organisme avec des substances d’origine animale ou bactérienne. Ils sont impliqués dans certaines maladies hémolytiques du nouveau-né (les IgG passent la barrière placentaire) et dans certains accidents transfusionnels (cf. O dangereux page 59 ).

8 Pourcentage approximatif. Des différences importantes peuvent exister entre groupes ethniques.

[ ]

]

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Technique pour le groupage ABO sur carte

(Méthode de Beth-Vincent ou épreuve érythrocytaire) La détermination du groupe ABO repose sur la mise en évidence des antigènes à la surface des globules rouges. Pour cela on utilise des sérums connus, dirigés contre ces antigènes. Ces sérums agglutinent les globules rouges qui possèdent les antigènes contre lesquels ils sont dirigés. Il existe également la détermination inverse (épreuve sérique), qui met en évidence les anticorps présents dans le sérum : Des globules rouges connus sont alors utilisés. L’épreuve sérique est utilisée en confirmation de l’épreuve érythrocytaire.

Exemple : Sérum + Globules Rouges = Agglutination

Anti-A A Echantillons :

Sang à déterminer, obtenu par prélèvement capillaire (ou sang veineux sur EDTA). Réactifs et matériel :

Sera test anti-A, anti-B, [anti-AB] humains Diamed (Diaclon), pour méthode sur lame. Carte de groupage (ou lames porte objet ou plaque d’opaline), minuterie.

Technique 9 :

1. Déposez sur une carte (ou sur une lame porte objet ou sur une plaque d'opaline) 2 [ou 3] gouttes de sang à déterminer.

2. A côté de chaque goutte de sang, déposez une goutte de chacun des sera test (anti-A, anti-B, [anti-AB]).

3. Pour chaque goutte de sang, mélangez le sang et le sérum test à l'aide du fond d'un tube.

4. Chaloupez la lame pendant 1 minute.

5. Lisez et notez immédiatement le résultat des agglutinations.

Anti-A Anti-B Anti-AB Groupe ABO +++ - +++ A

- +++ +++ B - - - O

+++ +++ +++ AB +++ = agglutinations (le plus souvent très fortes). - = absence d’agglutinations. Une agglutination indique la présence de l’antigène correspondant à la surface des globules rouges

Problèmes possibles dans le groupage ABO :

Réactions faussement négatives : � Immaturité des antigènes A et B (nouveau-né). � Variants génétiques : Groupes A ou B faibles, ... � Antisérum de groupage de mauvaise qualité (titre en anticorps trop faible,…). � …

Réactions faussement positives :

� Coagulation du sang à grouper. � Présence d’agglutinines froides dans le sang à grouper. � Contamination bactérienne des réactifs de groupage. � Modifications antigéniques au cours de pathologies malignes. � Infections chroniques (formation de rouleaux due à l’augmentation en protéines plasmatiques). � Infection par la trypanosomiase (présence d’auto-agglutinines et formation de rouleaux).

9 Cette technique est uniquement valable pour les antiséra humains Diacon (Diamed). La technique peut varier en fonction des réactifs utilisés. Toujours suivre les instructions particulières indiquées dans la notice du fabriquant. Vérifier que les antiséra peuvent être utilisés pour une détermination sur lame.


� …


B Le système Rhésus La découverte du système Rhésus, comme celle de nombreux autres systèmes de groupes sanguins érythrocytaires a été le résultat de l’exploration d’incidents transfusionnels et de maladies hémolytiques du nouveau-né. L’attribution du nom de « Rhésus » à ce système est née d’une confusion historique avec un autre système : En effet, en 1939, Lévine et Stetson constatent que le sérum d’une femme ayant accouché d’un enfant atteint d’une maladie hémolytique néo-natale agglutine non seulement les hématies de l’enfant et du père, mais aussi celles de 85 % des sujets testés. Landsteiner et Wiener en 1940 constatent que le sérum dilué d’un lapin immunisé par des hématies de Macacus rhésus agglutine les hématies des mêmes sujets. En fait, compte tenu que le sérum de lapin non dilué reconnaissait 100% des sujets, il apparaissait que cet hétéro anticorps reconnaissait un antigène différent de l’antigène D, présent sur la majorité des hématies humaines mais dont la densité antigénique est plus importante chez les sujets porteur de l’antigène D que chez les sujets qui en sont dépourvus. L’antigène incriminé dans cette confusion a été nommé LW (Landsteiner et Wiener) et le terme de Rhésus a été maintenu pour désigné le système initialement concerné. Les antigènes Rhésus sont des protéines de la membrane. L'addition de ces protéines est codée par deux gènes : Un gène qui code pour le D, et un gène qui code pour les Cc et Ee. C'est un système très polymorphe : 52 antigènes sont actuellement décrits (Parmi ceux-ci, les antigènes D, C, c, E, e sont par ordre d’importance les plus immunogènes). Sa nomenclature, quelque peu désordonnée, repose sur 3 hypothèses génétiques, à la base de 3 théories, qui chacune est utilisée selon les circonstances : On écrit en DCE (conception de Fisher et de Race), on parle en « Rh » (conception de Wiener), et on informatise en chiffres (conception de Rosenfield).

Pour la pratique transfusionnelle minimale courante, seul l’antigène D est important. Il est propre à l'homme et aux globules rouges. C'est l’antigène le plus immunogène des systèmes de groupes sanguins.

Un sujet qui possède l'antigène D à la surface de ces globules rouge est dit Rhésus positif (parfois écrit D + ou Rh +) Un sujet qui ne possède pas l'antigène D est dit Rhésus négatif (parfois écrit D - ou Rh – ou d) Ce système ne possède pas d'anticorps naturels : Un sujet « normal » ne possède donc pas d’anticorps anti-Rhésus dans son plasma. Ces anticorps n’apparaissent que par immunisation soit suite à des transfusions sanguines soit suite à des grossesses. Les anticorps Rhésus sont des anticorps immuns, chauds (optimum à 37°C, agglutination plus faible à la température du laboratoire), de type IgG, incomplets (non agglutinant en milieu salin). Tableau 2 : Répartition géographique de l’antigène D :

Pourcentage de personnes Rhésus positif 10

Asie du sud-est et Pacifique 98 à 100 %

Equateur et Chili 91 à 97 %

Brésil et Argentine 82 à 94 %

Afrique (Bantous, Ethiopiens) 94 à 97 %

Afrique (autres) 82 à 94 %

Europe Occidentale et Amérique du Nord 80 à 85 %

10 Pourcentage approximatif. Des différences importantes peuvent exister entre groupes ethniques.


Technique pour le groupage Rhésus sur lame (limitée à l’antigène D) La détermination minimale du groupe Rhésus repose sur la mise en évidence de l’antigène D à la surface des globules rouges. Pour cela on utilise un sérum connu, dirigé contre l’antigène D. Ce sérum agglutine les globules rouges qui possèdent l’antigène D. Pour la technique sur lame, le sérum anti-D doit être de type IgM. Echantillons :

Sang à déterminer obtenu par prélèvement capillaire (ou sang veineux sur EDTA). Réactifs et matériel :

Anti-D monoclonal Diaclon de Diamed pour méthode sur lame. Carte de groupage (ou lames porte objet ou plaque d’opaline), minuterie, [lampe à alcool].

Technique 11 :

1. [Préchauffez une lame porte objet ou une plaque d’opaline à 37°C : En raison de la qualité actuelle des sera test, ce préchauffage n’est nécessaire qu’en cas de test négatif].

2. Déposez sur la lame porte objet (ou sur une plaque d'opaline ou une carte de groupage) une goutte de sang à déterminer.

3. A côté de la goutte de sang, déposez une goutte de l'anti-D.

4. Mélangez le sang et le sérum test à l'aide du fond d'un tube.

5. Chaloupez la lame pendant 1 minute.

6. Lisez et notez immédiatement le résultat de l'agglutination. Une réaction positive (présence d'agglutinations assez fines) indique un Rhésus positif. L'absence d'agglutination indique un Rhésus négatif. S'il y a des doutes, observez la lame sous microscope (grossissement 100x) pour mieux distinguer les agglutinations. Pour faciliter la lecture, Inclinez légèrement la lame avant de l’observer sous le microscope, pour observer les globules rouges en mouvement.

Microphotographie d’une suspension de globules rouges dans du sérum, présentant une faible proportion de rouleaux (globules rouges en pile d’assiettes). Grossissement équivalent à 100x. [N.B. : La formation de rouleaux est liée à la concentration en protéines du plasma].

Microphotographie d’une suspension de globules rouges dans du sérum montrant une agglutination faible (globules rouges en petits amas). Grossissement équivalent à 100x.

11 Cette technique est uniquement valable pour l’antisérum anti-D monoclonal Diacon (Diamed). La technique peut varier en fonction du réactif utilisé. Toujours suivre les instructions particulières indiquées dans la notice du fabriquant. Vérifier que l’antisérum peut être utilisé pour une réaction sur lame et qu’il contient des IgM.


Problèmes possibles dans le groupage Rhésus :

Réactions faussement négatives :

� D faible (faible expression de l’antigène). � D partiel (Du). � Qualité du réactif anti-D (titre en anticorps trop faible, ou IgG et non IgM). � …


� Coagulation du sang à grouper. � Présence d’agglutinines froides dans le sang à grouper. � Contamination bactérienne du réactif de groupage. � Modifications antigéniques au cours de pathologies malignes. � Infections chroniques (formation de rouleaux due à l’augmentation en protéines

plasmatiques). � Infection par la trypanosomiase (présence d’auto-agglutinines et formation de

rouleaux). � …


REGLES TRANSFUSIONNELLES

1. Evitez les conflits antigènes – anticorps On distingue deux types de conflits antigènes-anticorps : Les conflits majeurs et les conflits mineurs. La différence d’importance entre ces deux types de conflits est liée à la quantité et à la concentration en anticorps impliqués.

Conflits majeurs :

Le sang du receveur ne doit pas posséder d'anticorps dirigés contre les antigènes des hématies du donneur (Principe défini par Ottemberg en 1911) Sur base de ce principe, la compatibilité dans le système ABO est donc un impératif transfusionnel qui peut être résumée par le schéma suivant (pour du sang):

En plus du groupage sanguin, le test de compatibilité majeure (et le « rapid cross-match ») permettent de détecter la présence de ce type d’anticorps

Conflits mineurs :

Il est aussi important d’éviter de transfuser du sang (surtout s’il est complet) contenant des anticorps dirigés contre les globules rouges du receveur. En transfusant en iso-groupe, on évite en grande partie ce problème. Pour détecter la présence de ces anticorps, on peut aussi réaliser un test de compatibilité mineure.

2. Evitez autant que possible la production d’anticorps

Une autre notion importante en transfusion sanguine est d’éviter d’introduire un antigène (surtout s’il est très immunogène) que le receveur ne possède pas (Principe non nocere). En effet, cette introduction entraînerait la production d’anticorps qui pourraient avoir des conséquences fâcheuses pour des transfusions futures (ou pour des grossesses futures). Sur base de ce principe, une personne Rhésus négatif ne peut recevoir que du sang Rhésus négatif.

Résumé pour les transfusions au niveau d’un hôpital de district

(En sang complet, avec groupage ABO et Rhésus) :

� Transfusez, dans la mesure du possible en iso-groupe ABO, en cas d’impossibilité, suivre

le tableau 3 page suivante.

� Transfusez un patient Rhésus négatif avec du sang Rhésus Négatif.


Tableau 3 : Ordre de choix dans la sélection d’un donneur de sang (pour du sang complet, sur base du groupe ABO et de la détermination de l’antigène D du système Rhésus) :

Groupe sanguin du receveur

Groupe préférentiel du donneur

Ordre de choix en cas d’impossibilité de trouver du sang iso-groupe et iso-Rhésus

A Rh + A Rh + A Rhésus –, O Rhésus +, O Rhésus –

A Rh – A Rh – O Rhésus –

B Rhésus + B Rhésus + B Rhésus –, O Rhésus +, O Rhésus –

B Rhésus – B Rhésus – O Rhésus –

AB Rhésus + AB Rhésus + AB Rhésus –, A Rhésus +, A Rhésus –, B Rhésus +, B Rhésus –, O Rhésus +, O Rhésus –

AB Rhésus – AB Rhésus – A Rhésus –, B Rhésus –, O Rhésus –

O Rhésus + O Rhésus + O Rhésus –

O Rhésus – O Rhésus – /

N.B. : Dans des situations de transfusion non iso-groupe en sang complet, les IgM anti-A ou anti-B présents dans le sang du donneur ne posent le plus souvent que peu de problèmes car elles sont en quantité insuffisante pour provoquer une hémolyse importante au cours d’une transfusion standard. (Dans tous les cas de transfusion en sang complet, il est cependant recommandé de ne pas mélanger la pochette de sang pour diminuer par sédimentation la quantité de plasma transfusé). Il existe cependant une situation à risque d’accident hémolytique lorsque l’on transfuse du sang provenant d’un donneur présentant une IgG anti-A ou plus rarement anti-B. Ce type d’hémolysine rare se retrouve surtout chez les personnes du groupe O et apparaît par commutation à partir d’une IgM anti-A ou anti-B (cf. N.B.2 du groupe ABO page 40). Le potentiel hémolytique d’une IgG est beaucoup plus important que celui des IgM ce qui explique que des accidents se produisent pour des quantités très faibles d’hémolysines transfusées au cours d’une transfusion standard (ceci est même vrai pour des concentré globulaires !). On parle de donneurs universels dangereux pour les individus du groupe O présentant une hémolysine du système ABO. Leur sang doit être réservé à des transfusions iso-groupes (donc à un receveur O). Comme un petit laboratoire n’a pas la possibilité de détecter les donneurs O dangereux, il est primordial de privilégier autant que possible les transfusions iso-groupes. Une technique basique permettant des détecter une partie des O dangereux est cependant décrite page 59. Cette technique difficile à mettre en œuvre est rarement utilisée au niveau d’un laboratoire de district, en raison à la fois de la rareté des donneurs dangereux et de la politique iso-groupe préférentielle.

TESTS DE COMPATIBILITÉ En plus des anticorps ABO (le plus souvent naturels et réguliers), on peut retrouver d’autres anticorps dirigés contre les antigènes érythrocytaires non ABO. Il s’agit alors le plus souvent d’anticorps immuns et irréguliers (IgG) nécessitant des techniques particulières pour être mis en évidence. Leur présence dans le sang d’un individu est le plus souvent due à une immunisation contre un ou plusieurs antigènes lors d’une transfusion sanguine antérieure ou chez la femme lors d’une grossesse. Les risques dépendent de l’immunogénécité des antigènes soit par ordre d’importance : Dans le système Rhésus D, E, c, e, C ; le K du système Kell ; le Fya du système Duffy ; le Jka du système Kidd,… Pour bien faire, il faudrait donc tenir compte de tous les antigènes (ou du moins des antigènes les plus immunogènes) avant de réaliser une transfusion. Ceci est bien évidemment impossible, même pour un laboratoire particulièrement bien équipé. Dans des situations isolées, où seuls les groupes ABO et l’antigène D du Rhésus sont déterminés, la recherche des anticorps irréguliers (tests de compatibilité en Coombs indirect) est d’autant plus importante. Le but des tests de compatibilité est de prévenir une réaction transfusionnelle immunologique en mettant en évidence une incompatibilité entre donneur et receveur (ABO ou anticorps immuns). Il permet donc d’assurer au receveur le bénéfice d’une transfusion à risque immunologique diminué. En cas de test de compatibilité positif dû à la présence d’anticorps irréguliers, la recherche d’un sang compatible ne sera pas facile au niveau d’un laboratoire de district : Sans connaître ni l’antigène ou les antigènes en causes, ni les groupes sanguins complets des donneurs, trouver un sang compatible dépendra juste de la persévérance dans la recherche d’un donneur et d’une bonne part de chance. Ne seront abordés en pratique dans ces notes que le « rapid cross match» et la compatibilité majeure en milieu salin associée au Coombs indirect en milieu LISS-albumine. La majorité des techniques envisageables pour un laboratoire de district sont résumées dans les tableaux 5 (page 55) et 6 (page 56). Dans ces tableaux, les principaux avantages mais aussi les principaux inconvénients sont envisagés pour chaque technique.


Test rapide (rapid cross match) Pour éviter les erreurs de confusion de patient, il est conseillé de faire un contrôle ultime au lit du malade afin de détecter les erreurs ABO. Dans les conditions d'un laboratoire peu équipé, ce test de « compatibilité » minimale peut être effectué au laboratoire comme test de compatibilité. Il ne doit cependant pas remplacer le test de compatibilité majeure (détection des IgM et IgG). Il n’est utilisable que pour les transfusions en iso-groupe (en raison de la présence d’anticorps anti-A et d’anti-B dans le sang d’une personne du groupe O par exemple). Ce test n’a donc qu’une portée limitée, puisqu’il ne détectera, presque exclusivement, qu’une erreur de groupage ABO (détection limitée aux IgM) dans le cadre d’une transfusion iso-groupe. Réactifs :

Alcool 70°.

Matériel :

Lancettes stériles, lames porte objet, aiguilles.

Technique :

1. Vérifiez l'identité du patient à transfuser. S’il est en état de le faire, faites confirmer ces informations de vive voix par le patient.

2. Vérifiez que le groupe sanguin du patient correspond au groupe sanguin de la poche.

3. Préparez une lame porte-objet.

4. Désinfectez à l'alcool à 70° la tubulure de la pochette de sang et le doigt du patient.

5. Piquez à l'aide d'une lancette stérile le doigt du receveur.

6. Déposez une goutte de sang du receveur sur la lame.

7. Piquez à l'aide d'une aiguille la tubulure de la poche de sang (!!! Pour éviter la contamination de la poche de sang, piquez entre deux nœuds ou entre deux soudures).

8. Déposez une goutte de sang de la tubulure sur la lame.

9. Mélangez les deux gouttes de sang à l'aide du coin d'une autre lame.

10. Chaloupez pendant une minute au minimum.

11. Regardez s'il y a apparition d'une agglutination. Si une agglutination se forme : Incompatibilité ABO ou présence d'anticorps dirigés contre les globules rouges de type IgM. NE TRANSFUSEZ PAS LA POCHE, vérifiez le groupage du donneur et du receveur.

En absence d’agglutination : La poche peut être transfusée.

En cas de doutes, observez la lame sous microscope (objectif 10x) pour mieux distinguer les agglutinations. Pour faciliter la lecture, inclinez légèrement la lame avant de la mettre sous le microscope pour observer les globules rouges en mouvement (cf. microphotographie page 44 pour interprétation).

Problèmes possibles dans le « rapid cross match » :

Réactions faussement négatives :

� Concentration globulaire trop faible entraînant une difficulté de lecture ou une réaction négative (patient très anémique, avec peu de globules rouges par exemple).

� Temps de réaction trop court. � …


� Coagulation du sang du donneur ou du receveur. � Présence d’agglutinines froides dans le sang du donneur ou du receveur. � Infections chroniques chez le donneur ou le receveur (formation de rouleaux due à

l’augmentation en protéines plasmatiques). � Infection par la trypanosomiase (présence d’auto-agglutinines et formation de

rouleaux). � …


Tests plus complets

Test de compatibilité majeure complet en milieu salin suivi d’un Coombs indirect12 en milieu LISS-albumine Recherche des anticorps du receveur vis-à-vis des hématies du donneur (IgM en milieu salin et IgG en milieu Liss-albumine). Echantillon :

Sérum du receveur (parfois difficile à obtenir chez un nouveau né anémique). Globules rouges du donneur (sang prélevé sur anticoagulant).

Réactifs :

� Sérum de Coombs polyvalent dirigé contre les IgG et les fractions C3 du complément. Diaclon Coombs sérum (Diamed).

� Milieu LISS-albumine (Diamed). [Low Ionic Strength Solution]

� Eau physiologique à 0,9 % (p/v) en NaCl. [=salin ou solution saline]

Chlorure de Sodium (NaCl)............................................................ 9 g Eau Distillée................................................................................... 1000 ml CONSERVATION : Quelques mois. CONDITIONNEMENT : Flacon brun ou blanc de 1000 ml. Etiqueter : EAU PHYSIOLOGIQUE et inscrire la date de préparation.

Matériels :

Tubes à hémolyse en plastique 10mm x 75mm, pipettes Pasteur en plastique, pissette pour eau physiologique, centrifugeuse pour banque de sang, (trompe à vide), bain-marie 37°C, miroir de microscope [lames, microscope].

Technique 13 :

1. Prenez un échantillon des globules rouges du donneur dans un tube à hémolyse.

2. Lavez les globules rouges 3 fois à l'eau physiologique (cf. page 58).

3. Diluez les globules rouges à 5 % en eau physiologique (50 µl de culot de globules rouges lavés + 950 µl d’eau physiologique). Homogénéisez bien le tube.

4. Prenez 2 tubes à hémolyse :

12 Le principe de la réaction est expliqué page 51. 13 Cette technique est uniquement valable pour l’antisérum Diaclon Coombs sérum (Diamed), associé au milieu DiaLISS-albumine (Diamed). La technique peut varier en fonction des réactifs utilisés. Toujours suivre les instructions particulières indiquées dans la notice du fabriquant.


TUBE 1 Compatibilité majeure en milieu salin

2 gouttes de globules rouges du donneur lavés 3 fois et dilués à 5 % en eau physiologique. 2 gouttes de sérum du receveur. Incubez 5 minutes à T° ambiante (22°C). Centrifugez 1 minute à 1.000 rpm (100g). Lisez et interprétez le résultat.

[Le test est positif en cas d’une agglutination ou d’une hémolyse (totale ou partielle) des globules rouges]

Anticorps mis en évidence (complets du type IgM) :

Erreur ABO Alloanticorps froids Autoanticorps froids

ACTIONS (CF. EXPLICATIONS PLUS DÉTAILLÉES PAGE 51)

EXCLUEZ L’ERREUR ABO AVANT DE TRANSFUSER

Vérifiez le groupe ABO donneur Vérifiez le groupe ABO receveur

Excluez un faux positif [faire un auto-test chez le receveur cf. page 53]

TUBE 2

Compatibilité majeure, Coombs indirect en milieu LISS-albumine

2 gouttes de globules rouges du donneur lavés 3 fois et dilués à 5 % en eau physiologique. 2 gouttes de sérum du receveur. 4 gouttes de LISS (DiaLISS-Albumine). Incubez 5 minutes à 37°C. (étape de sensibilisation) Lavez trois fois en eau physiologique. Décantez complètement le surnageant après le dernier lavage (cf. page58). Ajoutez 2 gouttes de sérum de Coombs polyvalent. (étape de révélation) Centrifugez 1 minute à 1.000 rpm (100 g). Lisez et interprétez le résultat.

[Le test est positif en cas d'une agglutination ou d’une hémolyse (totale ou partielle) des globules rouges]

Anticorps mis en évidence (incomplets du type IgG) :

Alloanticorps chauds Autoanticorps chauds

ACTIONS (CF. EXPLICATIONS PLUS DÉTAILLÉES PAGE 51)

Excluez un faux positif Il s'agit toujours d'un anticorps dangereux

NE TRANSFUSEZ PAS, CHERCHEZ UN AUTRE DONNEUR


PROBLEMES ET INTERPRETATION DES TESTS DE COMPATIBILITÉ MAJEURE :

Réactions faussement négatives (en milieu salin et/ou en milieu LISS albumine) :

� Concentration globulaire incorrecte entraînant une difficulté de lecture. � Lavage de globules rouges incorrect entraînant une inhibition du sérum de Coombs. � Propreté insuffisante du matériel entraînant une inhibition du sérum de Coombs. � Qualité du sérum de Coombs (péremption, spécificité, activité, titre,…). � Concentration incorrecte des réactifs (Coombs ou LISS-albumine). � Température et/ou temps d’incubation incorrects. � …

REACTION POSITIVE EN MILIEU SALIN :

� Faux positifs :

� Présence de fibrine ou contamination bactérienne du sérum. � …

1. Hémolyse :

� Centrifugation trop rapide entrainant une hémolyse. � Hémolyse de l’échantillon par une eau physiologique mal préparée. � …

2. Rouleaux : Regardez l'agglutination au microscope (cf. microphotographie page 44 pour interprétation) :

� Infections chroniques (formation de rouleaux due à l’augmentation en protéines plasmatiques).

� Infection par la trypanosomiase (présence d’auto-agglutinines et formation de rouleaux). � …

� Erreur ABO : Ne transfusez pas, vérifiez le groupage sanguin du donneur et du receveur trouvez un

donneur compatible.

Réalisez éventuellement un autotest (cf. page 53), [peu utile au niveau d’un laboratoire de district].

Exclusion de l'erreur ABO et exclusion des faux positifs, avec autotest positif : Présence d'agglutinines froides (les agglutinines froides sont des autoanticorps froids qui sont actifs entre 4 et 22°C). En pratique, on peut transfuser le sang à 37°C (sauf si le test de Coombs indirect en milieu LISS-albumine est positif).

Exclusion de l'erreur ABO et exclusion des faux positifs, avec auto-test négatif : Présence d'alloanticorps froids (ces alloanticorps froids ne sont pas dangereux d'un point de vue transfusionnel à condition qu'ils ne soient pas actifs à 37°C. En pratique, on peut transfuser le sang à 37°C (sauf si le test de Coombs indirect en milieu LISS-albumine est positif).

REACTION POSITIVE EN COOMBS INDIRECT EN MILIEU LISS-ALBUMINE :

� Faux positifs :

� Présence de fibrine ou contamination bactérienne du sérum. � Qualité du sérum de Coombs (adsorption des anticorps anti globules rouges humains) � Globules rouges insuffisamment lavés ou solution de lavage contaminé par de la silice.

1. Hémolyse :

� Centrifugation trop rapide entrainant une hémolyse. � Hémolyse de l’échantillon par une eau physiologique mal préparée.

2. Rouleaux : Regardez l'agglutination au microscope (cf. microphotographie page 44 pour interprétation) :

� Infections chroniques (formation de rouleaux due à l’augmentation en protéines plasmatiques).

� Infection par la trypanosomiase (présence d’auto-agglutinines et formation de rouleaux).

Si un faux positif est exclu, il s'agit toujours d'un anticorps dangereux au point de vue transfusionnel. NE TRANSFUSEZ PAS, RECHERCHEZ UN AUTRE DONNEUR COMPATIBLE.


PRINCIPE DU TEST COMPATIBILITÉ MAJEURE EN COOMBS INDIRECT 14

14 Sur base des dessins de Diamed.

1. Antigènes présents à la surface des globules rouges du donneur. (En bleu par exemple les antigènes Fya)

2. Le sérum du receveur est ajouté. Les anticorps anti Fya présents dans ce sérum vont se lier à l’antigène correspondant. Tous les autres anticorps présents restent libres dans le sérum. Etape de sensibilisation.

3. Après triple lavage, tous les anticorps non fixés aux globules rouges sont éliminés.

4. Après ajout du sérum de Coombs, les anticorps anti-humains se fixent aux anticorps anti-Fya. Etape de révélation.

5. La fixation des anticorps anti-humains à deux anticorps différents anti-Fya forme un “pont” entre les globules rouges. Ceci résulte en une agglutination

6. Cette agglutination est visible macroscopiquement dans le tube sous forme de caillots.


Autotest chez le receveur

(À faire en cas d’un test de compatibilité positif en milieu salin) : L’autotest peut être réalisé en cas de test de compatibilité positif en milieu salin, pour faire la distinction entre des agglutinines froides et des alloanticorps froids. Comme ces deux types d’anticorps sont peu dangereux du point de vue transfusionnel et qu’en pratique on peut transfuser le sang dans les deux cas (mais à 37°C), ce test n’est pas très utile au niveau d’un laboratoire de district. Echantillon :

Sérum du receveur. Globules rouges du receveur (sang prélevé sur anticoagulant de type EDTA).

Réactifs : Eau physiologique (cf. préparation page 49).

Matériels :

Tubes à hémolyse en plastique 10mm x 75mm, pipettes Pasteur en plastique, pissette pour eau physiologique, centrifugeuse pour banque de sang, trompe à vide, frigo, miroir de microscope [lames porte-objets, lamelles 22mm x 22mm, microscope].

Technique :

1. Prélevez un tube de sang du receveur (sur EDTA).

2. Lavez les globules rouges 3 fois à l'eau physiologique (cf. page 58).

3. Diluez les globules rouges à 5 % en eau physiologique. (50 µl de culot de globules rouges lavés + 950 µl d’eau physiologique). Homogénéisez parfaitement le tube.

4. Prenez 1 tube à hémolyse.

5. Mettez 2 gouttes de globules rouges du receveur, lavés 3 fois et dilués à 5 % en eau physiologique (point 3).

6. Ajoutez 2 gouttes de sérum du receveur.

7. Incubez 5 minutes à 22°C, centrifuger 1 minute à 1.000 rpm (100 g), lisez et interprétez les résultats.

8. Incubez 20 minutes à 4°C, centrifuger 1 minute à 1.000 rpm (100 g), lisez et interprétez les résultats.

Un test est positif s’il y a une agglutination des globules rouges.

Tableau 4 : Interprétations d’un autotest.

4°C 22°C Interprétations

+ + Présence d’agglutinines froides (si la compatibilité majeure est aussi positive en milieu salin).

+ - Présence d’agglutinines froides (si la compatibilité majeure est aussi positive en milieu salin).

- - Présence d’alloanticorps froids (si la compatibilité majeure est aussi positive en milieu salin).

- + Test incorrect.

+ = présence d’agglutinations. - = absence d’agglutinations.


Test de compatibilité mineure Recherche des anticorps du donneur vis-à-vis des hématies du receveur. Ce test n’a de sens bien évidemment que pour des transfusions en sang en iso-groupe (en raison de la présence d’anticorps anti-A et anti-B dans le sérum d’une personne du groupe O par exemple) Ce test n’est que très rarement effectué en routine dans un laboratoire de district. Compte tenu du fait que le test mineur détecte les anticorps du donneur et que ceux-ci seront très dilués dans le torrent circulatoire du receveur, ce test a un intérêt plus limité. En cas de transfusion de plasma, la compatibilité mineure est bien évidemment primordiale. Il s'agit d'effectuer les mêmes tests que pour la compatibilité majeure, mais en inversant le donneur et le receveur. On met donc en présence les globules rouges lavés du receveur avec le sérum du donneur.

Tableau 5 : Comparaison des différents tests de compatibilité (majeure) utilisables au niveau d’un laboratoire de district.

Type de test de compatibilité

Principe Avantages Inconvénients

« Cross match rapide » Mélangez sur lame une goutte de sang complet du donneur et une goutte de sang complet du receveur. Observez l’agglutination éventuelle des globules rouges.

� Détection des erreurs ABO (et des anticorps irréguliers de type IgM).

� Rapide (+/- 2 minutes). � Facile. � Réalisable au lit du patient. � Pas d’équipement ni d’électricité nécessaire. � Peu coûteux. � …

� Uniquement valable pour des transfusions iso-groupe. � Ne détecte que les IgM, soit presque exclusivement que les

erreurs ABO. � …

« Cross match » amélioré 15

Mélangez sur une lame ou dans un tube, une goutte de sang complet du donneur + une goutte de sérum du receveur. Observez l’agglutination éventuelle des globules rouges.


� Valable aussi pour des transfusions pour non iso-groupe. � Moyennement rapide (+/10 minutes). � Moyennement facile. � …

� Ne détecte que les IgM, soit presque exclusivement que les erreurs ABO.

� Nécessite une centrifugeuse électrique. � Nécessite une quantité assez grande de sang du receveur

(sérum) � Petits enfants anémiques ? � …

Compatibilité majeure (en milieu salin)

Mélangez dans un tube 2 gouttes de globules rouges du donneur lavés +2 gouttes de sérum du receveur. Incuber 5 minutes à T° ambiante (22°C), puis centrifugez 1 minute à 1.000 rpm (100 g). Observez l’agglutination éventuelle des globules rouges.


� Valable aussi pour des transfusions pour non iso-groupe. � …

� Ne détecte que les IgM, soit presque exclusivement que les erreurs ABO.

� Nécessite une quantité assez grande de sang du receveur (sérum) � Petits enfants anémiques ?

� Nécessite une centrifugeuse électrique. � Lent (+/30 minutes). � Relativement complexe. � …

Méthode Polybrène sur lame16 (cf. article en annexe 4 page 64)

Sur lame, 1 goutte de sang du donneur lavé et dilué à 20 % + 2 gouttes de sérum du receveur + 3 gouttes d’un milieu à faible force ionique. Mélangez 1 minute puis ajoutez 1 goutte de Polybrène, mélangez et observez l’agglutination éventuelle des globules rouges.

� Détection des erreurs ABO (et des anticorps irréguliers de type IgM et de certains IgG).

� Valable aussi pour des transfusions pour non iso-groupe. � Peu coûteux. � Assez rapide (+/- 30 minutes). � …

� Mauvaise détection de certains anticorps irréguliers de type IgG (anticorps anti-Kell par exemple donc utilisable en Asie, mais moins en Afrique ou en Europe)

� Nécessite une centrifugeuse électrique. � Nécessite une quantité assez grande de sang du receveur

(sérum) � Petits enfants anémiques ? � Réactifs assez complexes à préparer localement. � Relativement complexe. � …

Compatibilité majeure (en milieu salin + Coombs indirect en milieu albumine)

Assez complexe, cf. protocole compatibilité en milieu LISS- albumine page 49, mais en utilisant de l’albumine à la place du LISS-albumine et en augmentant les temps d’incubation.

� Détection des erreurs ABO, des anticorps irréguliers de type IgM et IgG.

� Valable aussi pour des transfusions pour non iso-groupe. � …

� Sensibilité et spécificité un peu moins bonne qu’en milieu LISS-albumine.


� Nécessite une centrifugeuse et un bain marie (électricité). � Moyennement cher. � Relativement complexe. � Lent (+/- 60 minutes). � …

Compatibilité majeure en milieu salin + Coombs indirect en milieu LISS-albumine)

Assez complexe, cf. protocole page 49.

� Détection des erreurs ABO, des anticorps irréguliers de type IgM et des IgG.

� Valable aussi pour des transfusions pour non iso-groupe. � Assez rapide (+/- 30 minutes). � Haute sensibilité. � Haute spécificité. � …


� Nécessite une centrifugeuse et un bain marie (électricité). � Assez chère. � Relativement complexe. � …

15 Une autre amélioration supplémentaire est d’utiliser des globules rouges lavés du donneur, ceci complique et rallonge le test pour un résultat équivalent. 16 Marie Lin. Compatibility testing without a centrifuge : the slide polybrene method. Transfusion 2004; 44: 410-413.


Tableau 6 : Usage au niveau d’un laboratoire de district des tests de compatibilité décrits dans les notes.

Type de test

Utilisation Anticorps mis en évidence Questions / Actions

Equipement (s) nécessaire (s)

Electricité

Centrifugeuse

Bain m

arie

Rapid Cross Match. Transfusion de sang complet ou de globules rouges concentrés :

En Iso-groupe.

IgM chez le receveur contre les globules rouges donneur :

Erreur ABO

Autoanticorps froids

Alloanticorps froids

¿ Erreur de groupage ABO ?

Ne pas transfuser si +

Test de compatibilité majeure en milieu salin.

Transfusion de sang complet ou de globules rouges concentrés :

En iso-groupe.

En non iso-groupe.

IgM chez le receveur contre les globules rouges donneur :

Erreur ABO



¿ Erreur de groupage ABO ?

¿ Le receveur a-t-il des anticorps (IgM) contre les globules rouges du donneur ?

Si + et erreur ABO exclue, transfusez à 37°C

X X

Test de compatibilité majeure en Coombs indirect en milieu LISS-albumine.


En iso-groupe.

En non iso-groupe.

IgG chez le receveur contre les globules rouges du donneur

Alloanticorps chauds

¿ Le receveur a-t-il des anticorps (IgG) contre les globules rouges du donneur ?

Ne pas transfuser si + x x x

Test de compatibilité mineure en milieu salin.


En iso-groupe.

Transfusion de plasma :

En iso-groupe.

En non iso-groupe.

IgM chez le donneur contre les globules rouges receveur :

Erreur ABO



¿ Le donneur a-t-il des anticorps (IgM) contre les globules rouges du donneur ?

Sang complet ou globules rouges concentrés :

SI + et erreur ABO exclue, transfusez à 37°C

Plasma :


x x

Test de compatibilité mineure en Coombs indirect en milieu LISS-albumine.


En iso-groupe.

Transfusion de plasma :

En iso-groupe.

En non iso-groupe.

IgG chez le donneur contre les globules rouges receveur :

Alloanticorps chauds

¿ Le donneur a-t-il des anticorps (IgG) contre les globules rouges du donneur ?

Sang complet ou globules rouges concentrés :


Plasma :


x x x


Tableau 7 : La transfusion sanguine au niveau d’un hôpital de district : Du minimum jusqu’au extras possibles.

Activités Le minimum Les plus… (en fonction des possibilités, listées pour chaque activité par ordre d’importance)

Dons de sang

• Donneurs de sang familiaux non-rémunérés. • Banque de sang vivante. • Mini banque de sang pour les urgences (1 à 2 pochettes). • Banque de sang basée sur des donneurs de sang

bénévoles non rémunérés et fidélisés. • …

Sélection des donneurs

• Questionnaire et sélection clinique. • Délai de réflexion entre le premier test de dépistage et le premier don de sang (pour les donneurs bénévoles).

• … Type de dépistage sérologique

• Tests rapides après/pendant prélèvement de l’unité de sang.

• Tests rapides avant prélèvement du sang. • …

Dépistage sérologique sur les donneurs

• HIV (anticorps). • HBsAg (antigènes). • Syphilis (Test non tréponémique du type RPR).

• HIV (antigènes). • HCV (anticorps). • Syphilis (Test tréponémique du type TPPA).

Et en fonction de la région un dépistage pour :

o Maladie de Chagas ? o Trypanosomiase africaine ? o Leishmaniose ? o Microfilarémie ?

• … Type de transfusion • Transfusion de sang complet « à chaud ».

o Iso-groupe (règle générale). o Non iso-groupe (exception).

• Transfusion de sang complet « à froid » (banque de sang).

• Transfusion de concentrés globulaires (banque de sang). • [Transfusion de plasma (banque de sang)]. • …

Groupage sanguin • Groupage ABO : Epreuve érythrocytaire. • Groupage Rhésus : Limité à l’antigène D sur lame.

• Groupage ABO : Epreuve sérique. • Groupage ABO en tube. • Groupage Rhésus en tube. • …

Test de compatibilité • Cross match rapide. • Test de compatibilité majeure en milieu salin associé à un Coombs indirect en milieu LISS-albumine.

• [Tests de compatibilité mineure]. • [Autotest]. • …


ANNEXE 1

Lavage des globules rouges

Le but du lavage des globules rouges est d’éliminer tous les anticorps plasmatiques libres ou fixés non spécifiquement à la surface des globules rouges.

Echantillon :

Sang prélevé sur anticoagulant. Réactifs : Eau physiologique.

Matériels :

Tubes à hémolyse en plastique 10mm x 75mm, pipettes Pasteur en plastique, pissette pour eau physiologique, centrifugeuse pour banque de sang, trompe à vide.

Technique :

1. Centrifugez l’échantillon 5 minutes à 3000 rpm (800 g).

2. Décantez le plasma à l’aide d’une trompe à vide ou d’une pipette Pasteur.

3. Mettez 1 volume du culot globulaire dans un tube à hémolyse.

4. Ajoutez au minimum 10 volumes d’eau physiologique au culot de globules rouges à l’aide d’une pissette (utiliser le jet de la pissette pour remettre les globules rouges en suspension).

5. Centrifugez le tube 5 minutes à 3000 rpm (800 g).

6. Décantez le surnageant à l’aide d’une trompe à vide ou d’une pipette Pasteur.

7. Répétez deux fois les étapes 4 à 6.


ANNEXE 2

Dépistage des donneurs O dangereux

Il peut arriver, en cas d’urgence, qu’on soit obligé de transfuser du sang O à un receveur A, B ou AB. Le plasma de certaines personnes O peut contenir une quantité importante d’anticorps anti-A ou plus rarement anti-B qui peuvent donner une réaction avec les globules rouges A, B ou AB du receveur. Ces personnes, donneurs O dangereux, doivent être détectés et ne peuvent pas être considérés comme “donneurs universels”. On peut transfuser le sang d’un “donneur O dangereux “ uniquement aux receveurs du groupe O. Le dépistage des donneurs O dangereux n’est possible qu’au sein d’une banque de sang, et devrait être réalisé systématiquement à l’entrée d’une pochette de sang O dans le frigo (durée du test). Cependant, en raison de la rareté des donneurs O dangereux et de l’usage maximal de transfusion iso-groupe, ce test est peu utile. Le sérum frais du donneur O est incubé avec des petites quantités de globules rouges A1 et B. S’il y a trop d’anticorps anti-A ou anti-B ces GR vont être hémolysés et le sérum va se colorer en rose. Echantillon :

Sérum du donneur. Globules rouges connus A1 et B dilué à 5 % en eau physiologique.

Réactifs : Eau physiologique.

Matériels :

Tubes à hémolyse en plastique 10mm x 75mm, pipettes Pasteur en plastique, pissette pour eau physiologique, centrifugeuse pour banque de sang, frigo, miroir de microscope [lames porte-objets, lamelles 22mm x 22mm, microscope].

Technique :

1. Prélevez le sérum du donneur O à tester. Le sérum doit être utilisé dans les 6 heures qui suivent le prélèvement.

2. Lavez 3 fois à l'eau physiologique des globules rouges connus A1 et B (cf. page 58).

3. Diluez ces globules rouges à 5 % en eau physiologique.

4. Prenez 2 tubes à hémolyse.

5. Mettez dans un tube 1 goutte de globules rouges A1 dilués à 5 % et dans l’autre 1 goutte de globules rouges B dilués à 5 %.

6. Ajoutez à chaque tube 9 gouttes de sérum du donneur O à tester.

7. Incubez 2 heures à 37°C.

8. Remettez les globules rouges en suspension en tapotant légèrement les tubes à hémolyse.

9. Centrifugez 1 minute à 1.000 rpm (100 g).

10. Contrôlez la couleur du surnageant. Si le sérum est jaune, avec un dépôt de globules rouges, ce donneur O peut être considéré comme universel.

Si le sérum est rose, avec un dépôt réduit de globules rouges, ce donneur O doit être considéré comme « donneur dangereux ». Son sang ne pourra être transfusé qu’à un receveur du groupe O.


ANNEXE 3 Dépistage des maladies infectieuses

En plus du risque immunologique, il existe aussi un risque infectieux : La transfusion sanguine est connue comme un moyen très efficace pour transmettre de nombreuses maladies : Maladies virales et associées :

• VHB, VHC, (VHA), VHD, VHE, VHG/VGB-C (Virus des hépatites B, C, (A), D, E,G) • VIH 1 / 2 (Virus de l’immunodéficience humaine 1 et 2). • HTLV 1 / 2 (Virus Lymphotropes T humains 1 et 2). • CMV (CytoMégaloVirus). • EBV (Epstein Barr Virus). • TTV (Virus TT) • HHV-6, HHV-8 (Herpèsvirus humain de type 6 et 8) • SEN-V (Virus SEN) • HPB-B19 (parvovirus humain) • [Prions (Maladie de Creutzfeld-Jacob par exemple)]. • [Fièvres hémorragiques]. • …

Maladies parasitaires :

• Malaria. • Leishmaniose. • Toxoplasmose. • Maladie de Chagas. • Trypanosomiases africaines. • Babésioses. • (Microfilaires). • …

Maladies bactériennes :

• Syphilis • Borrélioses. • Brucellose. • …

La contamination bactérienne du sang constitue aussi un risque directement associé à la transfusion sanguine. Ce risque est le plus souvent associé à une contamination durant le prélèvement ou durant les manipulations des produits sanguins (et exceptionnellement associé à une infection bactérienne du donneur). Cette contamination nécessite une amplification qui se déroule durant la conservation du sang. Cette contamination est parfois identifiable dans l’aspect du sang : Si la pochette est contaminée de façon importante, le sang apparaîtra hémolysé et de couleur très foncée.

Parfois, l’agent infectieux peut être détecté directement dans le sang (la présence d’antigènes HBs indique une infection par l’hépatite B par exemple). La plupart du temps, la recherche d’anticorps spécifique est utilisée. Pour certaines pathologies, la présence d’anticorps peut révéler une infection ancienne, et ne signifie pas toujours que le sang est infectieux (hépatite par exemple). Dans d’autres cas au contraire, la présence d’anticorps indique une infection transmissible (présence d’anticorps anti-VIH par exemple).

La notion de latence qui caractérise les infections doit aussi être prise en compte et ce pour deux raisons : La phase de latence est souvent infectieuse et les tests recherchant les antigènes, détectables avant l’apparition des anticorps ne sont pas toujours disponibles (HCV par exemple).

Dans les pays en voie de développement, la prévalence des maladies infectieuses dans la population générale est souvent élevée. Pour cette raison, un haut taux peut donc être attendu parmi les donneurs de sang, avec aussi un haut taux de coïnfection. Le dépistage de laboratoire des maladies infectieuses sur les donneurs de sang est donc un élément essentiel de la sécurité transfusionnelle. D’un autre côté, cette haute prévalence augmente le risque de rater un dépistage à cause de la latence (fenêtre sérologique et/ou sensibilité des tests). Ce problème peut être partiellement résolu par une bonne procédure de sélection des donneurs de sang.


NIVEAUX DES STRATÉGIES DE DÉPISTAGE

Les tests de laboratoire peuvent au moins se concevoir à 3 niveaux :

1. Les tests de dépistages sur les unités de sang : Pour que cette procédure ait un impact sur la sécurité transfusionnelle, le dépistage doit être systématique sur toutes les unités avec comme objectif d’identifier tous les agents infectieux potentiels. Cette procédure ne peut cependant pas remplacer l’interrogatoire et la sélection clinique des donneurs de sang.

2. Ce dépistage systématique peut jouer aussi un rôle de diagnostic si les donneurs de sang demandent leurs résultats sérologiques. Dans ce contexte, les tests de dépistages doivent alors obligatoirement être suivis de tests de confirmation.

3. Les résultats des tests de dépistage peuvent aussi être un indicateur de la qualité de la sélection des donneurs de sang : La proportion des échantillons « réactifs » lors des tests de dépistage donne une indication sur la prévalence de ces agents infectieux dans la population sélectionnée, permettant d’affiner ou de réviser les critères utilisés. Cet affinage permet alors de sélectionner et de recruter des donneurs de sang plus « sains ».

PARAMÈTRES INFLUENÇANT LA STRATÉGIE DE DÉPISTAGE

Avant d’aborder des considérations techniques, il faut garder à l’esprit que des paramètres environnementaux et certaines caractéristiques intrinsèques des agents infectieux influencent la prévention du risque de transmission :

• Idéalement, toute transfusion sanguine devrait être testée pour tous les agents pathogènes connus qui sont prévalent dans la population et qui, si transmis, causent une maladie grave au receveur.

• Les données épidémiologiques (si disponibles) dans la population locale doivent donc être prises en compte.

• En zone endémique, la probabilité qu’un adulte ait déjà été infecté avant la transfusion sanguine, et qu’il ait éventuellement acquis une immunité, dépend de la prévalence de la maladie dans la population. Ce fait n’est bien évidemment pas valable pour des enfants.

• Certains agents infectieux sont présents uniquement dans les cellules et ne peuvent donc être transmis par les composés sans cellules comme le plasma (malaria par exemple). [Cet aspect n’est à envisager que si la séparation des éléments sanguins est faisable]. D’autres agents sont présents et infectieux à la fois dans les composés cellulaires et acellulaires.

• Certains agents infectieux sont tués ou leur virulence est atténuée après une conservation de plus de 72 heures entre 4 et 7 °C (syphilis, trypanosomes). Cet aspect peut être envisagé si le stockage est possible et sûr.

• L’information des donneurs de sang en vue de les encourager à s’auto-exclure en cas de risque est moins chère, moins dangereuse et probablement plus efficace que le dépistage de laboratoire. Ce point concerne plus spécifiquement les maladies sexuellement transmissibles.

Lorsque le budget est limité, la priorité locale doit être donnée aux différents tests de dépistage en fonction de la prévalence de la maladie dans la population générale, de ces conséquences en cas de transmission et de l’âge des receveurs.


QUEL SONT LES TESTS A REALISER DANS DES CONDITIONS DIFFICILES ?

ELEMENTS TECHNIQUES A PRENDRE EN CONSIDERATION

• Nombre de transfusions sanguines ? Type de banque de sang ? Transfusion à chaud ? Dépistage avant / pendant / après la collecte de sang ?

• Disponibilité des tests ? • Complexité des tests ? • Temps nécessaire / disponible ? • Ressources humaines ? • …

VIH 1 / 2 : En 2005, l’OMS estime que 5 % des contaminations VIH en Afrique pourraient être dues à la transfusion. Le dépistage VIH est une obligation. Un seul test de dépistage est suffisant pour exclure une pochette de sang. Si le donneur doit être informé, toutes les précautions doivent être prises : Un résultat positif doit être confirmé selon la stratégie adaptée à la prévalence. Des tests rapides sensibles, spécifiques et relativement peu chers sont disponibles (détection d’anticorps et/ou d’anticorps et d’antigènes).

Hépatite B : L’hépatite B représente un risque important en transfusion sanguine, puisqu’il a été prouvé que du sang infecté par ce virus est infectieux à presque 100 %. Dans les pays en voie de développement, la proportion des gens infectés est très élevée et frise parfois 90 % pour les adultes. Il est essentiel de dépister le sang pour la présence d’antigènes HBs pour différentes raisons : Un grand nombre de transfusions concernent des enfants qui n’ont pas encore été infectés et les conséquences d’une transfusion infectée par l’hépatite B pour un receveur immunisé ne sont pas connues. Des tests rapides de détection d’antigènes sensibles, spécifiques et relativement peu chers sont disponibles.

Hépatite C : Peu de données épidémiologiques sont disponibles pour les pays en voie de développement (PVD). Le dépistage des anticorps anti-HCV est deux fois plus cher que le dépistage des anticorps HIV. Le virus de l’hépatite C serait responsable de plus de 90 % des hépatites post transfusionnelles, lorsque l’hépatite B a été exclue (données européennes). On estime que 80 % des personnes contaminées par une transfusion sanguine vont produire des anticorps et que probablement plus de 50 % des personnes possédant des anticorps anti-HCV vont développer une maladie chronique du foie dans les 10 à 20 ans. Des tests rapides de détection d’antigènes assez sensibles, assez spécifiques ( ?) mais relativement chers sont disponibles.

Hépatite A : L’hépatite A est rarement associée à la transfusion sanguine, et son importance clinique assez minime. Le dépistage systématique des donneurs de sang ne se justifie donc pas.

CMV : La prévalence des anticorps anti-CMV se situe entre 50 et 80 % de la population (donnée européenne). Du sang infecté par le cytomégalovirus peut être un problème en néonatologie ou pour des patients immunodéprimés. Ce problème pour cette population particulière peut être prévenu en transfusant du sang CMV négatif. Le dépistage systématique des donneurs de sang n’est pas recommandé en routine. Les tests commerciaux sont complexes et chers.

HTLV 1 / 2 : Le dépistage systématique HTLV 1 n’est pas recommandé à l’exception de zones géographiques où la prévalence est importante : Si les données sont assez incomplètes, 3 zones sont connues : Amérique centrale et du sud ainsi que les Caraïbes, sud du Japon et Afrique sub-saharienne. Le risque de transmission aux Etats-Unis serait de l’ordre de 1 sur 641.000. Le risque de développer la maladie serait estimé à 1 ou 2 par 1.000 individus infectés et par an, après une période d’incubation de 20 ans. On estime qu’environ 60 % des personnes recevant une transfusion contaminée vont s’immuniser. Les tests disponibles, chers et complexes, donnent de nombreux faux positifs.


Malaria : La meilleure méthode de diagnostic reste la recherche des parasites en goutte épaisse. Comme cette méthode nécessite un examen microscopique pour chaque échantillon, elle n’est pas envisageable à grande échelle. De plus, en zone endémique, l’absence de parasite en goutte épaisse ne signifie pas que le sang n’est pas infecté (limite de sensibilité). La recherche d’anticorps n’est pas utilisable en zone endémique. L’histoire des fièvres ou des épisodes de maladies chez le donneur de sang est donc essentielle. L’usage d’un traitement ou d’une prophylaxie antipaludéen après transfusion en zone endémique est à envisager.

Maladie de Chagas : Pour autant que la transmission de la maladie de Chagas soit liée à la transfusion sanguine, ce problème ne concerne que presque exclusivement l’Amérique du sud. Aux Etats-Unis cependant, où il existe une migration importante de personnes provenant de zone endémique, on retrouve quelques cas. Un dépistage systématique n’est cependant recommandé que dans les zones endémiques. Les examens parasitologiques permettant le diagnostic de la maladie tant en phase aigue (recherche des parasites en goutte épaisse) qu’en phase chronique (culture) ne sont pas utilisable à grande échelle. Des tests sérologiques permettant de détecter les anticorps présents chez environ 50 % des personnes en phase aigue et chez environs 95 % des personnes en phase chroniques sont disponibles. L’usage de ces tests en dépistage pré transfusionnel reste controversé en raison de leur sensibilité et leur spécificité. Dans certaines zones endémique, l’addition de violet de gentiane au sang (125 mg/ 500 ml de sang) suivi d’une conservation d’au moins 24 heures à 4°C est utilisé pour inactiver les parasites. Les informations concernant les tests à utiliser dans une zone particulière peuvent être obtenues auprès de laboratoire de référence pour la maladie de Chagas le plus proche.

Trypanosomiase Africaine : La maladie du sommeil peut se transmettre par transfusion sanguine si le sang du donneur contient T.b. gambiense (ou moins probablement T.b. rhodesiense). Si la contamination sanguine est possible, peu de cas ont été rapportés en zone endémique (collecte des informations ?). Le dépistage sérologique par CATT test devrait être envisagé en zone (hyper)endémique pour T.b. gambiense. Si le donneur doit être informé, toutes les précautions doivent être prises : Un résultat positif doit être confirmé selon la stratégie du pays.

Leishmaniose : Partout dans le monde, le nombre de cas de leishmaniose contracté lors d’une transfusion sanguine est en augmentation. Cette augmentation est aussi liée à l’augmentation du HIV. Le dépistage systématique des unités de sang devrait être envisagé en zone endémique de leishmaniose viscérale. Les tests disponibles sont cependant assez lents, complexes et chers.

Microfilaires : Elles peuvent être transmises par transfusion sanguine, et peuvent provoquer des réactions allergiques graves. La larve ne peut cependant se développer chez l’homme et la transmission d’une filariose est donc impossible. L’examen à frais d’une goutte de sang du donneur peut être envisagé en zone endémique pour éviter les réactions allergiques.

Syphilis : Le dépistage de la syphilis (par RPR ou VDRL) est toujours recommandé, même si un résultat positif ne signifie pas que le sang soit infectieux et si une conservation de 3 jours du sang à 4 °C inactive la bactérie. Même si le risque de transmission post transfusionnel est faible, le dépistage des donneurs peut être utilisé comme indicateur d’un risque d’autres infections à transmission sexuelle. Si le donneur doit être informé, toutes les précautions doivent être prises : Un résultat positif doit être confirmé. Dans les pays développés, les tests de dépistage non tréponémiques (RPR ou VDRL) sont le plus souvent remplacés par des tests tréponémiques du type TPHA (ou les deux tests sont utilisés en parallèle). Les tests tréponémiques, plus chers et plus complexes ne sont cependant pas recommandés pour le dépistage au niveau du district.

Borrélioses : Une bonne sélection des donneurs de sang en zone endémique pour les fièvres récurrentes, est la meilleure garantie pour sécuriser le sang. En effet, la meilleure méthode diagnostique pour les fièvres récurrentes (recherche des bactéries en goutte épaisse colorée au Giemsa) n’est pas envisageable à grande échelle. De plus, même un résultat négatif ne signifie pas une absence de risque (bactériémie fluctuante limitant la sensibilité du test).

…

Exemple de répartition de quelques marqueurs infectieux : RWANDA 1991

(n = 500) CONGO 2005

(n= 2500) MARQUEURS POSSITIF % POSITIF % HIV (Ac) 18 3,5 199 8 HBsAg 30 6 175 7 Syphilis (Ac) 15 3,0 50 2 HCV (Ac) 15 3,0 (113) ? 4,5 (Sur 250) Total 78 537

Coïnfections : - Rwanda (18) : 12 % des unités de sang collectées doivent donc être éliminées. - Congo (134) : 16 % des unités de sang collectées doivent donc être éliminées.


ANNEXE 4

Test de compatibilité sur lame, méthode Polybrène


ANNEXE 5

Liste indicative de prix pour groupages sanguins et tests de compatibilité : (Diamed)

http://www.diamed.ch/

Items Conditionnements Références (Diamed)

Prix (€) 09/2006

Nombre de tests

réalisables17 Coombs-serum, polyvalent anti-IgG (rabbit), anti-C3d (monoclonal), Diaclon, green

10 ml 107140 29,0 100

LISS modified for red cell suspension DiaLISS (LISS-albumin)

10 ml 106510 11,2 50

Anti-A, blood grouping monoclonal IgM Diaclon for slide and tube test

10 ml 100710 8,5 200

Anti-B, blood grouping monoclonal IgM Diaclon for slide and tube test

10 ml 100810 8,5 200

Anti-AB, blood grouping monoclonal IgM Diaclon for slide and tube test

10 ml 100910 8,5 200

Anti-D, blood grouping monoclonal IgG and IgM antibodies, D(VI-) Diaclon for slide and tube test

10 ml 101070 17,7 200

Items Conditionnements Prix (€) 08/2007

Nombre de tests

réalisables

Centrifugeuse hématologique pour banque de sang : Immufuge II (Baxter©)

1 675 S.O

Liste indicative de prix pour quelques tests sérologiques :

Items Conditionnements Prix (€) 03/2007

Nombre de tests

réalisables18

Determine HIV 1 / 2 100 80 100

Determine HBsAg 100 90 100

HCV SPOT 100 325 100

CATT 250 150 250

RPR card antigen suspension Becton Dickinson 500 150 500

17 Sans tenir compte des contrôles à réaliser et des pertes. 18 Sans tenir compte des contrôles à réaliser et des pertes.


ANNEXE 6 Exemple de test HIV (mode opératoire)


ANNEXE 7

Exemple de test HBs Ag (mode opératoire)


ANNEXE 8

Exemple de test HCV Ac (mode opératoire)


ANNEXE 9 Exemple de test RPR (mode opératoire)

BD Tests RPR sur carte Macro-Vue ver: 26/09/2005 Cercle de 18 mm qualitatifs et quantitatifs Coffret de diagnostic de Brewer pour la détection sérologique de la syphilis APPLICATION Le test RPR (réagine rapide de plasma) sur carte avec cercle de 18 mm Macro-Vue est une méthode de diagnostic de la syphilis par sérologie non tréponémique.1,2 RESUME ET EXPLICATION Le test sur carte de goutte de RPR Macro-Vue (qui fait appel à un prélèvement de sang par ponction digitale) a été le premier test sur carte. Il a été mis au point pour être utilisé sur le terrain, où les tests peuvent être réalisés sans équipement de laboratoire.3,4 En y associant une agitation mécanique, des zones de test annulaires, et d’autres modifications techniques, le test RPR sur carte a pu être utilisé dans des tests à grande échelle dans le domaine de la santé publique et des laboratoires cliniques. Le test RPR sur carte avec cercle de 18 mm est recommandé pour les prélèvements de sang veineux, et lorsqu’un grand volume de sérum est disponible, comme c’est généralement le cas dans le domaine de la santé publique et des laboratoires cliniques.5-12 Lorsqu’un prélèvement contient des anticorps, une floculation se produit en même temps qu’une coagglutination des particules de carbone de l’antigène de la carte RPR, et apparaît comme des amas noirs contrastant sur le fond blanc de la carte plastifiée. Par contraste, les prélèvements non-réactifs ont une couleur gris clair uniforme. Dans les situations particulières où des résultats rapides d’analyse par sérologie non tréponémique sont requis, et où le sang est prélevé sous forme de plasma EDTA, le test RPR sur carte avec cercle de 18 mm peut être utilisé, s.il est effectué dans les 24 h.13,14 PRINCIPES DE LA METHODE La suspension antigénique pour RPR sur carte est constituée de particules de carbone antigénées1 qui détectent les « réagines », substances similaires aux anticorps présents dans le sérum et le plasma de personnes syphilitiques, et occasionnellement dans le sérum et le plasma de personnes affectées d’autres états aigus ou chroniques. Les réagines s’attachent à l’antigène, constitué de particules de cholestérol recouvertes de complexes cardiolipide-lécithine, provoquant ainsi une floculation macroscopique. REACTIFS Les composants* de la suspension antigénique pour RPR sur carte sont 1 : 0,003 % de cardiolipide, 0,020-0,022 % de lécithine, 0,09 % de cholestérol, 0,0125 M EDTA, 0,01 M Na2HPO4, 0,01 M KH2PO4, 0,1 % de thiomérosal (agent conservateur), 0,02 % de charbon (spécialement préparé, BD), 10 % de chlorure de choline, p/v et d’eau désionisée/distillée.*Ajustés et/ou supplémentés en fonction des critères de performance imposés. Avertissements et précautions : Réservé au diagnostic in vitro. Des microorganismes pathogènes, notamment les virus de l’hépatite et de l’immunodéficience humaine, sont susceptibles d’être présents dans les échantillons cliniques. Respecter les " Précautions standard "15-18 et les consignes en vigueur dans l’établissement pour manipuler tout objet contaminé avec du sang ou d’autres liquides organiques. Stériliser à l’autoclave les récipients contenant les échantillons et d’autres matériaux contaminés avant de les éliminer. Antigène : il est recommandé de ne conserver au réfrigérateur que la suspension antigénique sur carte de RPR. Il faudra éviter de conserver en plein soleil ou à des températures dépassant 30 °C ; ces conditions peuvent conférer un aspect granulaire à l’antigène lors de son utilisation avec des sérums négatifs. Si l’ampoule d’antigène a gelé pendant son expédition, celle-ci peut être reconstituée une fois en la réchauffant à température ambiante ; éviter les cycles de congélation et de décongélation. L’utilisation de l’antigène dès sa sortie du réfrigérateur peut réduire la sensibilité du test. Pour cette raison, après l’avoir sorti du réfrigérateur, laisser l’antigène revenir à température ambiante (entre 23 et 29 °C) avant de l’utiliser. Ne pas utiliser l’antigène au-delà de sa date de péremption. Cartes de diagnostic pour test : ce sont des cartes spécialement préparées, plastifiées, conçues pour être utilisées avec l’antigène de RPR sur carte. Lors de la manipulation, veiller à ne pas poser les doigts sur les zones tests, les dépôts graisseux des empreintes pouvant entraîner des résultats inexacts. Lors de l’étalement d’un échantillon à l’intérieur des limites de la zone test, éviter de rayer la carte avec le dispositif Dispenstirs ou l’agitateur. Si l’échantillon ne s’étale pas jusqu’au périmètre extérieur de la zone test, utiliser une autre zone test de la carte. Dispenstirs et capillaires : lors de l’exécution des tests sur carte, un dispositif Dispenstirs (seulement pour le test qualitatif sur cercle de 18 mm) ou un capillaire peut être utilisé pour déposer l’échantillon sur la carte. Un nouveau dispositif Dispenstirs ou un nouveau capillaire doit être employé pour chaque prélèvement à tester. Lors du prélèvement à partir du tube d’origine, l’échantillon ne doit pas être aspiré dans la poire en caoutchouc attachée au capillaire, sous peine de lectures erronées pour les tests qui suivent. Aiguilles : afin d’éviter l’obturation de l’aiguille compte-gouttes (précision de la méthode), enlever l’aiguille du flacon distributeur après avoir terminé les analyses et la rincer à l’eau désionisée/distillée. Ne pas essuyer l’aiguille, ceci enlevant son revêtement de silicone et affectant la précision du volume de la goutte d’antigène qui est distribuée. Lecture des résultats du test sur carte : lire immédiatement après avoir agité, à l’état « humide » à la lumière d’une lampe à incandescence de forte puissance ou sous forte lumière du jour. Rotation : la vitesse de rotation mécanique recommandée est 100 ± 2 tpm (tours par minute). L’appareil rotateur doit décrire un cercle d’approximativement deux centimètres de diamètre à l’horizontale. Il faut utiliser un protège-carte humidificateur mouillé pour empêcher que les échantillons ne se dessèchent pendant la rotation. Conservation de l‘antigène : réfrigérer à une température comprise entre 2 et 8 °C. Tous les autres composants du coffret devront être conservés dans un endroit sec à température ambiante, dans leur emballage d’origine. Voir « Avertissements et précautions » pour un complément d’information. Une fois placé dans le flacon distributeur (fourni avec chaque coffret) et au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C), la réactivité de l’antigène reste satisfaisante pendant environ trois mois, ou jusqu’à la date de péremption, si celle-ci survient plus tôt. Etiqueter le flacon distributeur avec le numéro de lot de l’antigène, sa date de péremption et la date à laquelle l’antigène a été mis dans le flacon. PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS Aucune préparation spéciale du patient n’est requise avant le prélèvement des échantillons. Pour l‘analyse du sérum non chauffé : prélever le sang par ponction veineuse dans un tube propre et sec sans anticoagulant et laisser coaguler. Centrifuger l’échantillon à vitesse suffisante pour séparer les éléments cellulaires. Laisser le sérum dans ce tube d’origine ou transférer le dans un tube propre et sec si l’analyse du sérum est retardée. Le sérum, retiré du caillot, peut être réfrigéré entre 2 et 8 °C, pendant un maximum de 5 jours ou congelé à -20 °C ou à une température inférieure dans un flacon en Pyrex (ou l’équivalent) ou dans un tube à essai bouché.1 Éviter de congeler et décongeler plusieurs fois les échantillons. Pour l‘analyse du sérum chauffé : après prélèvement et centrifugation comme pour le sérum non chauffé, transférer le sérum dans un tube propre et sec, et mettre au bain-marie à 56 °C, ou dans un bloc thermique pendant 30 min. Pour l’analyse du plasma non chauffé : prélever le sang par ponction veineuse sur un tube contenant de l’anti coagulant tel que l’EDTA, l’héparine, l’oxalate de potassium, la séquestrène de potassium, ou le fluorure de sodium. L’EDTA et l’héparine présentent l’avantage de n’être pas critiques quant à leur concentration ; une quantité aussi faible que 1 mL de sang dans un tube normalement utilisé pour prélever 7 mL de sang donne des résultats satisfaisants. Avec les autres anticoagulants, il est conseillé de ne pas prélever moins d’un demi-tube de sang. Centrifuger comme recommandé ci-dessus. Laisser le plasma dans le tube d’origine, et en cas de conservation, conserver l’échantillon entre 2 et 8 °C. Effectuer l’analyse dans les 24 h.


MODE OPERATOIRE ET RESULTATS Matériel fourni : divers coffrets de test RPR sur carte sont disponibles (voir .Matériel disponible.). Ils contiennent suffisamment de suspension antigénique sur carte pour exécuter le nombre voulu de contrôles sur carte et de tests sur carte quotidiens, ainsi que le flacon distributeur nécessaire, l’aiguille distributrice, les cartes et les capillaires, les agitateurs ou les dispositifs Dispenstirs. Matériaux requis mais non fournis : 1. Des contrôles avec des profils établis de réactivité devront être inclus dans les essais quotidiens pour s’assurer de la réactivité optimale de l’antigène. Voir « Matériel disponible » pour les cartes de contrôle du test Macro-Vue RPR sur carte avec cercle de 18 mm. 2. Un agitateur, à 100 ± 2 tpm, décrivant un cercle de 2 cm de diamètre, avec une minuterie automatique, un entraînement à friction, et un protège-carte contenant une éponge ou un papier-buvard humide. 3. Une solution saline (0,9 %) pour le test quantitatif. La préparer en ajoutant 900 mg de chlorure de sodium sec, ACS à 100 mL d’eau désionisée/distillée. 4. Du sérum non-réactif pour la syphilis dans une solution saline à 0,9 % ; requis pour diluer les échantillons à analyser donnant un résultat réactif à la dilution à 1:16. L’équipement et le matériel de laboratoire utilisés pour la préparation, la conservation et la manipulation des échantillons sérologiques sont également nécessaires. Préparations préliminaires : relire « Avertissements et précautions » et « Prélèvement et préparations des échantillons » Avant d’exécuter les tests sur carte. Lors de l’exécution des tests, la suspension antigénique devra être vérifiée à l’aide des contrôles à réactivité graduée en suivant la technique particulière à ce test. Seuls les antigènes présentant les réactions attendues devront être utilisés. Les contrôles, la suspension antigénique sur carte de RPR et les prélèvements à analyser devront être à température ambiante lors de leur utilisation. Avant l’utilisation, agiter vigoureusement l’ampoule pendant 10 à 15 secondes afin de remettre l’antigène en suspension et de distribuer toute particule de charbon qui se serait logée dans le goulot de l’ampoule. Si du charbon devait rester dans le goulot de l’ampoule après l’avoir agitée, ne pas insister, car cela pourrait produire un antigène granulaire. Vérifier le débit de l’aiguille en plaçant fermement l’aiguille sur une pipette ou une seringue de 1 mL ; remplir la pipette ou la seringue avec la suspension antigénique, et en maintenant la pipette ou la seringue en position verticale, compter le nombre de gouttes distribuées pour 0,5 mL. Le nombre correct de gouttes est donné dans le tableau ci-contre. Attacher l’aiguille au raccord conique du flacon distributeur. S’assurer que l’antigène est sous le niveau de la ligne de rupture ; casser le goulot de l’ampoule et vider tout l’antigène dans le flacon distributeur en écrasant le flacon et en l’utilisant comme un dispositif d’aspiration. Etiqueter le flacon distributeur avec le numéro de lot de l’antigène, sa date de péremption et la date à laquelle l’antigène a été mis dans le flacon. Agiter doucement le flacon distributeur d’antigène avant chaque série de gouttes d’antigène. L’aiguille et le flacon distributeur devront être jetés lorsque le coffret est utilisé complètement. Il est impératif que les techniques décrites ici soient suivies en détail. Test qualitatif sur carte de 18 mm avec utilisation des dispositifs Dispenstirs : 1. Prendre un dispositif Dispenstirs entre le pouce et l’index près de l’extrémité agitateur ou scellée. Presser et ne relâcher la pression que lorsque l’extrémité ouverte est en dessous de la surface de l’échantillon, en maintenant le tube d’échantillon verticalement pour éviter la remise en suspension des éléments cellulaires lorsqu’il est fait usage du tube de sang d’origine. Relâcher la pression des doigts pour aspirer l’échantillon. 2. En le maintenant en position verticale exactement au dessus de la zone test de la carte sur laquelle l’échantillon doit être déposé (sans toucher la surface de la carte), presser le dispositif Dispenstirs pour laisser tomber une goutte (environ 0,05 mL ; chaque dispositif Dispenstirs est conçu pour expulser légèrement plus de 0,05 mL pour compenser la petite quantité d’échantillon restant à l’extrémité de l’agitateur). 3. Retourner le dispositif Dispenstirs et en utilisant l’extrémité agitateur scellée, étaler l’échantillon en couvrant toute la surface du cercle (si désiré, ce qui reste de l’échantillon peut être remis dans le tube à échantillon d’où il a été aspiré). Jeter le dispositif Dispenstirs . Répéter le procédé autant de fois qu.il y a d’échantillons à tester. 4. Agiter doucement le flacon distributeur d’antigène avant de l’utiliser. En le maintenant verticalement, distribuer plusieurs gouttes dans le bouchon du flacon distributeur pour être sûr que le passage de l’aiguille est dégagé. Mettre une « goutte tombant librement » (20 G, garde de l’aiguille de couleur jaune) sur chaque zone test. Ne pas remélanger ; le mélange de l’antigène et de l’échantillon se produit pendant l’agitation. Reprendre dans le bouchon du flacon l’antigène qui s’y trouve. 5. Agiter pendant 8 min (± 30 s), avec le protège-carte humidifiant, sur l’agitateur mécanique réglé à 100 ± 2 tpm. Après l’agitation, pour faciliter la différenciation entre les résultats non-réactifs et réactifs faibles, il faut agiter et incliner brièvement la carte à la main (3 ou 4 mouvements de va-et-vient). Lire immédiatement et d’une manière macroscopique à l’état « humide » à la lumière d’une lampe à incandescence de forte puissance ou sous forte lumière du jour. Interpréter : Réactif : Présentant une agglutination caractéristique allant de légère mais définie (minimale à modérée) jusqu’à

marquée et intense. Non-réactif : Présentant aucune agglutination. Voir le guide de lecture.

Nota : il n’y a que deux interprétations définitives possibles avec le test sur carte : réactif ou non-réactif, quelle que soit l’intensité de la réactivité. Une réactivité minimale à modérée (présentant une agglutination légère mais définie) est toujours retenue comme réactif. Une réaction légèrement granuleuse ou d’apparence rugueuse devrait être répétée avec une méthode alternative. Lors du dépistage de donneurs ces tests peuvent être rapportés comme « indéterminés », en attendant une étude sérologique complémentaire. Voir la section « Limites de la méthode ». Tous les tests de syphilis réactifs devront être répétés en utilisant une méthode alternative. Test qualitatif sur carte de 18 mm avec utilisation des capillaires : 1. En utilisant un nouveau capillaire, y attacher la poire en caoutchouc et prélever 0,05 mL d’échantillon du tube de sang en laissant l’échantillon monter jusqu’à la graduation du capillaire. Veiller à ne pas prélever d’éléments cellulaires. (Si désiré, une pipette sérologique peut être utilisée, mais ne pas pipeter à la bouche.) 2. Placer l’échantillon mesuré sur le cercle de la carte de diagnostic pour test, en pressant la poire en caoutchouc, tout en gardant un doigt sur le trou de la poire. 3. En utilisant un nouvel agitateur pour chaque échantillon (extrémité large), étaler sur tout le cercle. Jeter l’agitateur. Répéter la procédure pour tous les échantillons à tester. 4. Agiter doucement le flacon distributeur d’antigène avant de l’utiliser. En le maintenant verticalement, distribuer plusieurs gouttes dans le bouchon du flacon distributeur pour être sûr que le passage de l’aiguille est dégagé. Mettre une goutte tombant librement (20 G, garde de l’aiguille de couleur jaune) sur chaque zone test. Ne pas remélanger ; le mélange de l’antigène et de l’échantillon se produit pendant l’agitation. Reprendre dans le bouchon du flacon l’antigène qui s’y trouve.


5. Agiter pendant 8 min (± 30 s), avec le protège-carte humidifiant, sur l’agitateur mécanique réglé à 100 ± 2 tpm. Après l’agitation, pour faciliter la différenciation entre les résultats non-réactifs et réactifs faibles, il faut agiter et incliner brièvement la carte (3 ou 4 mouvements de va-et-vient). Lire immédiatement et d.une manière macroscopique à l’état « humide » à la lumière d’une lampe à incandescence de forte puissance ou sous forte lumière du jour. Interpréter : Réactif : Présentant une agglutination caractéristique allant de légère mais définie (minimale à modérée) jusqu’à

marquée et intense. Non-réactif : Présentant aucune agglutination. Voir le guide de lecture.

Nota : il n‘y a que deux interprétations définitives possibles avec le test sur carte : réactif et non-réactif, quelle que soit l’intensité de la réponse. Une réactivité minimale à modérée (présentant une agglutination légère mais définie) est toujours retenue comme réactif. Une réaction légèrement granuleuse ou d’apparence rugueuse devrait être répétée avec une méthode alternative. Lors du dépistage de donneurs ces tests peuvent être rapportés comme « indéterminés », en attendant une étude sérologique complémentaire. Voir la section « Limites de la méthode ». Tous les tests de syphilis réactifs devront être répétés en utilisant une méthode alternative. Test quantitatif sur carte avec cercle de 18 mm : 1. Pour chaque échantillon à tester, mettre 0,05 mL de solution saline à 0,9 % dans les cercles numérotés de 2 à 5. Un capillaire (à ligne rouge) ou pipette sérologique de 1 mL ou moins peut être utilisé. NE PAS ETALER LA SOLUTION SALINE ! 2. En utilisant un capillaire (à ligne rouge graduée à 0,05 mL jusqu’à l’extrémité) surmonté de sa poire, mettre 0,05 mL de L’échantillon sur le cercle 1. 3. Remplir à nouveau jusqu’à la ligne rouge avec l’échantillon à tester, et en le maintenant en position verticale, préparer une série de dilutions de deux en deux en aspirant et refoulant le mélange de solution saline et d’échantillons à analyser 5 ou 6 fois dans le capillaire. Eviter la formation de bulles. Transférer 0,05 mL du cercle 2 vers le 3, vers le 4, vers le 5. Mélanger après chaque transfert. Eliminer 0,05 mL du cercle 5 après avoir mélangé son contenu. 4. En utilisant un nouvel agitateur (extrémité large) pour chaque échantillon, commencer par le sérum à la plus grande dilution (cercle 5) et l’étaler sur toute la surface du cercle. Se déplacer aux cercles 4, 3, 2 et 1 et étaler de la même manière. 5. Agiter doucement le flacon distributeur d’antigène avant de l’utiliser. En le maintenant verticalement, distribuer plusieurs gouttes dans le bouchon du flacon distributeur pour être sûr que le passage de l’aiguille est dégagé. Mettre une « goutte tombant librement » (20 G, garde de l’aiguille de couleur jaune) sur chaque zone test. Ne pas remélanger ; le mélange de l’antigène et de l’échantillon se produit pendant l’agitation. Reprendre dans le bouchon du flacon l’antigène qui s’y trouve. 6. Agiter pendant 8 min (± 30 s), avec le protège-carte humidifiant, sur l’agitateur mécanique réglé à 100 ± 2 tpm. Après l’agitation, pour faciliter la différenciation entre les résultats non-réactifs et de réactivité minimale à modérée (RM), il faut agiter et incliner brièvement la carte (3 ou 4 mouvements de va-et-vient). Lire immédiatement et d.une manière macroscopique à l’état « humide » à la lumière d.une lampe à incandescence de forte puissance ou sous forte lumière du jour. Etablir l’interprétation : retenir la dilution la plus élevée présentant une réaction « réactif », y compris minimale à modérée. Exemples : (Phénomène de prozone . voir « Limites de la méthode »)

R = Réactif N = Non-réactif RM = Réactif minimale à modérée

Sérum non chauffé ou chauffé : si la dilution la plus élevée essayée (1:16) est réactive, procéder comme suit : 1. Préparer une dilution à 1:50 du sérum non-réactif avec une solution saline à 0,9 %. (Cette dilution doit être utilisée pour préparer des dilutions à 1:32 ou plus des échantillons à quantifier). 2. Préparer une dilution à 1:16 de l’échantillon à tester en ajoutant 0,1 mL de sérum à 1,5 mL de solution saline à 0,9 %. Mélanger parfaitement. 3. Mettre 0,05 mL de sérum non-réactif à 1:50 dans les cercles 2, 3, 4 et 5. 4. En utilisant un capillaire, mettre 0,05 mL de dilution à 1:16 de l’échantillon à tester dans le cercle 1. 5. Remplir à nouveau le capillaire jusqu’à la ligne rouge, faire une série de dilutions de deux en deux et terminer les tests suivant la description des points 3 à 6. (Voir « Test quantitatif sur carte avec cercle de 18 mm ») Si nécessaire, des dilutions plus importantes sont préparées en utilisant le sérum non-réactif à 1:50. Plasma : s’il faut établir un taux à partir duquel des modifications de titre peuvent être déterminées, l’analyse doit être répétée sur du sérum non chauffé (voir « Sérum non chauffé »). Lecture et rapport des tests sur carte RPR Macro-Vue : les réactions individuelles devront être évaluées à l’état « humide » à la lumière d’une lampe à incandescence de forte puissance ou sous forte lumière du jour. Immédiatement après l’agitation, lire et interpréter comme réactif ou non-réactif.

Contrôle de qualité réalisé par l’utilisateur Effectuer les contrôles de qualité conformément aux réglementations nationales et/ou internationales, aux exigences des organismes d’homologation concernés et aux procédures de contrôle de qualité en vigueur dans l’établissement. Il est recommandé à l’utilisateur de consulter les directives de la NCCLS et la réglementation CLIA concernées pour plus d’informations sur les modalités de contrôle de qualité.


LIMITES DE LA METHODE Le diagnostic de la syphilis ne devra pas reposer sur un seul résultat réactif du test sans le support d’un antécédent de réactivité ou d’un signe clinique. Dès lors, comme pour toute autre technique sérologique, les échantillons réactifs par le test sur carte devront être soumis à une étude sérologique complémentaire. Les sérums qui sont réactifs par le test qualitatif devront être quantifiés pour établir un seuil de référence à partir duquel des modifications de titre pourront être déterminées. Ceci est important particulièrement pour l’évaluation du traitement.1 L’utilisation d’échantillons de plasma pour établir un seuil à partir duquel des modifications de titre peuvent être déterminées n’a pas été évaluée. Des résultats faussement négatifs peuvent survenir lorsqu’un phénomène de prozone n.est pas reconnu. Des phénomènes de prozone peuvent survenir avec 1 à 2 % des sérums provenant de patients ayant une syphilis secondaire. Ces échantillons peuvent montrer un patron de réactivité qui est légèrement granuleux ou d’apparence « rugueuse ». Suite à une dilution, la réactivité va augmenter puis décroître lorsque l’on s’approche de la dilution limite (titre). Tous les sérums donnant une réaction d’apparence rugueuse devraient subir une analyse plus poussée. Des tests non-tréponémiques faussement négatifs sont aussi rencontrés lors de syphilis primaire et tertiaire.1 Il n’est pas nécessaire d’exécuter la méthode quantitative sur des échantillons réactifs provenant de donneurs. Les tests RPR sur carte ne doivent pas être utilisés pour analyser les liquides rachidiens. L’échantillon idéal pour un test néonatal est un sérum d’enfant prélevé par ponction au niveau du talon. Cependant, du sang de cordon peut être utilisé pour fin de dépistage quand aucun autre échantillon n’est disponible.1 Avec les antigènes de type cardiolipine, de fausses réactions biologiques positives ont été rapportées dans des maladies telles que la mononucléose infectieuse, la lèpre, la malaria, le lupus érythémateux, la vaccine, les pneumonies virales. Pour la lèpre, Portnoy3 n’a pas rapporté de faux réactifs ; Achimastos19 a rapporté 14 cas de lèpre réactifs sur les 50 testés et Scotti20 a rapporté 1 cas réactif avec la carte RPR sur 208, tout en étant non-réactif avec les tests FTA-ABS et TPI (tests d’immunofluorescence absorption et sérologie tréponémique). Dorwart21 a étudié l’incidence des réactions biologiques faussement positives dans diverses connectivités. Six cas de lupus érythémateux systémique sur 41 étaient réactifs avec le test sur carte là où seulement 5 étaient réactifs avec le test sur lame du VDRL (Laboratoire de Recherche en matière de Maladies Vénériennes). Seulement 1 cas parmi 23 de polyarthrite rhumatoïde était réactif aussi bien avec les tests RPR sur carte et VDRL sur lame. Lors de la grossesse, plusieurs rapports ont indiqué des cas de réactions faussement positives.11,22 La toxicomanie et les affections auto-immunes peuvent également entraîner des réactions faussement positives.23 Le caraté, le pian, le béjel et d’autres tréponèmes donnent des réactions positives avec ce test.1 La lipémie n’interfère pas avec les tests sur carte. Cependant, si le degré de lipémie est élevé au point d’altérer l’état des particules d’antigène, l’échantillon devra être considéré comme non valable pour procéder au test. Ne pas tester des échantillons fortement hémolysés, contaminés ou très turbides ; dans ces cas émettre un rapport « échantillon inadéquat pour effectuer le test ».1 VALEURS ESCOMPTEES ET CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE La suspension antigénique sur carte de RPR est testée suivant un schéma établi de réactivité par rapport à des suspensions d’antigène de référence et est conforme aux spécifications du U.S. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) pour l’exécution des tests RPR sur carte avec cercle de 18 mm. Ces caractéristiques ont été établies à partir d’un grand nombre d’articles qui ont paru dans la littérature scientifique, et d’après les résultats des tests de routine journaliers dans les laboratoires d’analyses sérologiques de la syphilis et sont conformes aux spécifications CDC. Les études rapportées montrent que les tests RPR sur carte ont une sensibilité et une spécificité adaptées au diagnostic clinique et un niveau de réactivité similaire à celui du test VDRL sur lame (Laboratoire de Recherche en matière de Maladies Vénériennes).6-10,24,25. Le chauffage des échantillons de sérum à 56 °C pendant 30 min s’est révélé sans effets sur la réactivité.13 Une comparaison qualitative sur 1.104 échantillons de sérum et de plasma EDTA, récoltés en même temps, a été menée en utilisant le test RPR sur carte avec cercle de 18 mm Macro-Vue. Il y a eu une concordance complète entre les résultats de ces tests qui concernaient 134 paires réactives et 970 paires non-réactives. D’autres études ont donné des résultats comparables entre des paires de plasma et de sérum (306 échantillons) avec les tests RPR sur carte aussi bien dans les procédures qualitative et quantitative.14,26

CONDITIONNEMENT Réf. Description Tests sur carte RPR Macro-Vue : 274449 Coffret Nº 104 : (300 tests qualitatifs), contenant : deux ampoules de 3 mL d.antigène, aiguille 20 G, flacon distributeur, 350 agitateurs, 30 cartes

avec chacune dix zones circulaires de 18 mm et 300 capillaires de 0,05 mL. 275005 Coffret Nº 110 : (500 tests qualitatifs), contenant : trois ampoules de 3 mL d.antigène, aiguille 20 G, flacon distributeur, 50 cartes avec chacune dix

zones circulaires de 18 mm et 500 dispositifs Dispenstirs de 0,05 mL. 275239 Coffret Nº cat. 112 : (150 tests quantitatifs), contenant : cinq ampoules de 3 mL d.antigène, aiguille 20 G, flacon

Distributeur, 200 agitateurs, 50 cartes avec chacune quinze zones circulaires de 18 mm et 150 capillaires de 0,05 mL. 275539 Coffret Nº 115 : (150 tests qualitatifs), contenant : une ampoule de 3 mL d.antigène, aiguille 20 G, flacon distributeur, 15 cartes avec chacune dix

zones circulaires de 18 mm et 150 dispositifs Dispenstirs de 0,05 mL. 275110 Coffret en gros Nº 510 : (5.000 tests qualitatifs). 275692 Coffret en gros Nº 532 : (10.000 tests qualitatifs). 276709 Macro-Vue Cartes de contrôle pour test RPR sur carte contenant des échantillons à réactivité variable (cercles de 18 mmR, RM et N), coffret de 10

pièces. 272905 Dispenstirs (pipettes en plastique, jetables), 0,05 mL, coffret de 500. BIBLIOGRAPHIE : 1. Larsen, S.A., V. Pope, R.E. Johnson and E.J. Kennedy (ed.). 1998. A manual of tests for syphilis, 9th ed. American Public Health Association, Washington, D.C. 2. Larsen, S.A., V. Pope, and T.J. Quan. 1992. Immunologic methods for the diagnosis of spirochetal diseases, p. 467-481. In N.R. Rose, E.C. de Macario, J.L. Fahey, H. Friedman, and G.M. Penn (ed.), Manual of clinical laboratory immunology, 4th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 3. Portnoy, J., J.H. Brewer, and A. Harris. 1962. Public Health Rep., 77:645-652. 4. Portnoy, J. 1963. Military Med. 128:414-417. 5. Portnoy, J. 1965. Public Health lab. 23:43. 6. Reed, E.L. 1965. Public Health Lab. 23:96-103. 7. Reed, E.L. 1966. Public Health Lab. 24:203-206. 8. Reed, E.L. 1968. Public Health Lab. 26:123-133. 9. Reed, E.L. October 22, 1968. Presented at FTA-ABS Test Seminar, co-sponsored by Md. State Dept. of Public Health, Bureau of Laboratories, and the NCDC, VDRL. 10. Reed, E.L. 1969. J. Conf. Public Health Lab. Dir. 27:8-14. 11. Walker, A.N. 1971. Br. J. Vener. Dis. 47:259-262. 12. Croix, J.C. 1975. Feuillets de Biologie. 16:61-65. 13. Larsen, S.A., D.E. Pettit, M.W. Perryman, E.A. Hambie, R. Mullally, and W. Whittington. 1983. J. Clin. Microbiol. 17:341-345. 14. Warner, G.S., et al. 1980. Data on file. Becton Dickinson Microbiology Systems. 15. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa. 16. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory COmmittee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80. 17. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 18. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045. 19. Achimastos, A., G. Tolis, G. Papadopoulos, and K. Kousoutzakoglou. 1970. Public Health Rep. 85:66-68. 20. Scotti, A.T., D.M. Mackey, and J.R. Trautman. 1970. Arch. Dermatol. 101:328-330. 21. Dorwart, B.B., and A.R. Myers. 1974. Br. J. Vener. Dis. 50:435-436. 22. Garner, M.F., and J.L. Backhouse. 1973. Med. J. Aust. 1:737-739. 23. Kaufman, R.E., S. Weiss, J.D. Moore, V. Falcone, and P.J. Weisner. 1974. Br. J. Vener. Dis. 50:350-353. 24. Falcone, V.H., G.W. Stout, and M.B. Moore, Jr. 1964. Public Health Rep. 79:491-495. 25. Portnoy, J. 1963. Am. J. Clin. Pathol. 40:473-479. 26. Larsen, S.A., B.T. Craig, M.E. Shepherd, and B. McLaurin. 1988. Data on file. Treponema Research Branch, CDC.


ANNEXE 10

Relation entre la vitesse de rotation d’une centrifugeuse et la force centrifuge

Relation entre la force centrifuge (g) et le nombre de tours par minutes (rpm) en fonction du rayon du rotor de la centrifugeuse (r). En reliant les deux valeurs r et g par une droite, on obtient à l’intersection avec la ligne vitesse de rotation de la centrifugeuse la valeur en rpm à utiliser pour cette centrifugeuse et ce rotor. La formule de relation entre g et rpm est : g = 0.00001118 x r x rpm². (N.B. : le rayon de la centrifugeuse est à exprimer en cm)

Force centrifuge (en g)

Vitesse de rotation de la centrifugeuse

(en rpm) Rayon de la

centrifugeuse r (en cm)


ANNEXE 11

Sites internet utiles

Organisation mondiale de la santé en français, en anglais et en espagnol :

http://www.who.int/topics/blood_transfusion/fr/

Liste des documents OMS téléchargeables sur la transfusion sanguines :

http://www.who.int/bloodsafety/publications/en/index.html

International consortion for blood safety (en anglais) :

http://www.icbs-web.org/

Société internationale de transfusion sanguine en français et en anglais :

http://www.isbt-web.org/

Agence de santé publique (Canada) en français et en anglais :

http://www.phac-aspc.gc.ca/hcai-iamss/tti-it/risks_f.html#tab2

Site français de l’hémovigilance en français :

http://www.hemovigilance.org/

Site français de l’Institut National de transfusion sanguine (INTS) en français :

www.ints.fr Site du service du sang de la croix rouge de Belgique en français : http://www.transfusion.be/ Site de la société canadienne du sang en français et en anglais :

http://www.medecinetransfusionnelle.ca/ Site de l’OMS sur les évaluations des tests diagnosticques.

http://www.who.int/diagnostics_laboratory/evaluations/en/


GLOSSAIRE Agglutination: des cellules qui forme des amas. Une agglomération de cellules Agglutinines : Anticorps qui provoquent l’agglutination des globules rouges. Il s’agit toujours d’un IgM. Agglutinines froides : Autoanticorps froids retrouvés chez certaines personnes. Ces autoanticorps agglutinent les propre globules rouges du sujet, mais uniquement à basse température (agglutination maximale à 4°C, agglutination plus faible à 22°C). Ces anticorps ne sont pas actifs à 37°C. Il s’agit toujours d’IgM. Ils sont dirigés principalement contre les antigènes I et i. Alloanticorps : (= Isoanticorps) Anticorps élaboré par un organisme en réponse à un antigène provenant d'autres individus de la même espèce. Allo-immunisation: Une réponse immunitaire avec production d’anticorps en réaction aux antigènes étrangers. Anticorps : Molécule de défense de l’organisme. Protéine fabriquée par les lymphocytes en réponse à la présence d’un antigène donné et qui se combine spécifiquement avec lui. Il existe 5 classes d’anticorps : IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Anticorps complet : Un anticorps est dit complet ou agglutinant quand il est capable de produire une agglutination des hématies en eau physiologique. Un anticorps de ce type est aussi appelé agglutinine. Il s'agit d'anticorps de type IgM. Il s’agit d’anticorps froids ayant une activité maximale à 4°C.

Anticorps incomplet : Un anticorps est dit incomplet ou non agglutinant quand sa fixation à la membrane du globule rouge ne suffit pas à provoquer l'agglutination en eau physiologique. Ce sont des anticorps chauds, avec une activité maximale à 37 °C. Il s'agit d'anticorps de type IgG. Sa détection repose alors sur l'utilisation d'artifices techniques permettant de rapprocher les globules rouges :

• Le traitement par des enzymes protéolytiques, • L'addition de macromolécules au milieu, • Le test de Coombs.

Anticorps chaud : Anticorps montrant une activité maximale à 37 °C (IgG). Anticorps froids : Anticorps montrant une activité maximale à 4°C (IgM). Anticorps monoclonal : Anticorps très spécifique produit par une seule cellule ou progéniture identique de cette cellule, dirigé contre un épitope spécifique d'un antigène. (Par opposition à anticorps polyclonal). Anticorps naturels : Anticorps retrouvés dans le sérum sans pré-immunisation apparente par l'antigène correspondant. Ils apparaissent apparemment « spontanément ». Si ce n’est pas le cas, ils sont dits immuns. Anticorps réguliers : Anticorps présents chez tous les sujets lorsque l’antigène correspondant n’existe pas à la surface de leurs propres globules rouges. (Par opposition à anticorps irréguliers).

IgM

IgG

IgM

IgM

IgG

IgG


Anticorps irréguliers : Anticorps apparaissant suite à une immunisation, chez certains sujets lorsque l’antigène correspondant n’existe pas à la surface de leurs globules rouges. Antigène : Toute molécule reconnue par le système immunitaire est désignée comme antigène. Si cette molécule est considérée comme étrangère, elle déclenchera une réaction de défense (réponse immunitaire) caractérisée entre autres par la production d’anticorps qui peuvent se combiner spécifiquement avec l’antigène qui a déclenché leur production. Autoanticorps : Anticorps dirigé vis-à-vis des propres constituants antigéniques du sujet.

Auto-exclusion (confidentiel): l'élimination d'une unité de sang - après le don, suite à la demande du donneur. Banque de sang vivante : Liste de personnes résidant à proximité de l’hôpital, de groupe sanguin connu, acceptant de donner gratuitement leur sang en cas de nécessité. Ces personnes sont appelées en cas de besoin. Cellule sensibilisée: une cellule revêtue d'anticorps, mais pas agglutinés. Centrifugeuse pour banque de sang : Centrifugeuse spécifique pour banque de sang : Rotor, tubes et vitesse adaptés au lavage des globules rouges et à la centrifugation pour lire les agglutinations. Exemples : modèle Immufuge-II de Baxter©, modèle Diacent-12 de Diamed©. Il existe aussi des laveurs de globules rouges automatiques du type Diacent-CW de Diamed©. Ces laveurs permettent de faciliter le travail et de diminuer la durée d’un test de compatibilité, au prix d’un appareil relativement plus fragile.

Diacent -cellwash Diacent -12 Immufuge II Coagulation: La coagulation du sang qui a lieu lorsque le sang est recueilli dans un récipient sec ou atteint une plaie ouverte. Les comportements à risque: les comportement qui exposent une personne au risque de contracter des infections transmissibles par transfusion. Concentré globulaire : Pochette de sang obtenue après élimination du plasma (et des leucocytes). Cette pochette contient principalement des globules rouges. Cross-match (rapide) : un test, fait avant transfusion, qui utilise le sérum du patient (ou sang complet du patient en cas de cross match rapide) contre les globules rouges du donneur et vice-versa le sérum du donneur contre les cellules rouges du patient (cette dernière parti n'est pas fait en cas de cross match rapide). Cross-match rapide est le contrôle ultime au lit du malade et est uniquement utilisable pour les transfusion iso-groupe. Don direct: un don de sang donnée spécifiquement pour une transfusion à un patient nommé.

Autoanticorps

Alloanticorps


Donneur de sang bénévole et non rémunéré (régulier): Donneur de sang donnant son sang par pur altruisme, sans recevoir en échange une compensation quelconque. Régulier: si au moins trois fois donné, et en général au moins une fois par an. Donneur de sang bénévole et non rémunéré fidélisé : Donneur de sang bénévole donnant régulièrement son sang. Donneur de sang familial : Membre de la famille qui donne bénévolement son sang pour un parent nécessitant une transfusion Donneur de sang rémunéré : Personne vendant son sang. Donneur de sang de remplacement : Donneur de sang familial au sein d’une banque de sang. Si une banque de sang n’a pas assez de donneurs bénévoles, elle peut demander à la famille d’un patient transfusé de remplacer le ou les unités de sang transfusées. Dans ce cas, ce n’est pas le sang « familial » qui est donné au patient, mais une pochette de sang conservée. Ce type de donneur permet de « reconstituer » le stock de sang au sein d’une banque de sang non auto-suffisante en dons bénévoles non rémunérés. Globulines : Protéines plasmatiques qui comprennent les immunoglobulines ou anticorps. Groupage (épreuve globulaire) : Cette épreuve consiste à mettre en évidence les antigènes du système ABO de la surface des hématies à l'aide d'anticorps (antisérum), en règle générale des IgM spécifiques afin de déterminer le groupe ABO du patient. Groupage (contre-épreuve / épreuve plasmatique) : Cette épreuve consiste à mettre en évidence les anticorps du système ABO contenus dans le plasma du patient à l'aide de globules rouges de groupe ABO connu. Hémolysine : Substance détruisant les globules rouges. Il s’agit le plus souvent d’anticorps, mais ce terme est aussi utilisé pour d’autres substances (contenue dans certains venins de serpents par exemple). Hémolyse: destruction de la membrane du globule rouge, libérant le contenu. HLA : Human leucocyte antigens. Le système HLA est le système majeur d’histocompatibilité humain. Partie localisée du génome humain dont les gènes codent notamment pour les antigènes majeurs d'histocompatibilité qui interviennent dans le contrôle de la réponse immunitaire et dans les phénomènes de rejet de greffes. Immunité humorale : Mécanisme de défense d’un organisme, faisant intervenir des anticorps. Immunité cellulaire : Mécanisme de défense d’un organisme, faisant intervenir des cellules, principalement des lymphocytes. Infection transmissible par transfusion: Une infection qui est capable d'être transmis par transfusion sanguine. Isoanticorps: Anticorps élaboré par un organisme en réponse à un antigène provenant d'autres individus de la même espèce. Alloanticorps est un synonyme. La maladie hémolytique du nouveau-né (ou érythroblastose fœtal) : incompatibilité entre les groupes sanguins de la mère et du bébé, quand les anticorps de la mère (Rh négatif) traversent le placenta pour lutter les globules rouges (Rh positif) du bébé, entraînant une anémie. Milieu LISS-Albumine : Milieu de basse force ionique (Low Ionic Strength Solution) favorisant la fixation des anticorps sur les globules rouges, associé à des macromolécules (albumine) qui elles augmentent la constante diélectrique du milieu (diminuant ainsi la répulsion entre les globules rouges). Ce milieu augmente donc les possibilités de réactions entre les globules rouges et les anticorps. Associé au test de Coombs, ce milieu permet de mettre en évidence des anticorps irréguliers incomplets de type IgG Milieu Salin : Milieu physiologique, contenant 9 g de chlorure de sodium (NaCl) par litre d'eau distillée. C'est une solution isotonique, qui permet de préserver le volume cellulaire. Période de fenêtre: La période entre l'infection et l'apparition des premiers marqueurs détectables de cette infection dans la circulation. Prévalence: La proportion d'une population spécifique qui est à un moment donné infecté par l'agent infectieux.


Réaction croisée: quand un anticorps reconnaît non seulement son antigène spécifique correspondant, mais aussi d'autres antigènes qui peuvent avoir certaines ressemblances. Réponse d'anticorps primaires: La réponse immunitaire acquise développée à la suite d’un premier contact avec un antigène étranger. Réponse d'anticorps secondaires: L'augmentation du titre d'un anticorps lors de la rencontre à son antigène pour la deuxième fois. Rouleaux: une fausse agglutination, qui est généralement due à un rapport albumine / globuline anormale, caractérisé par les globules rouge en pile d’assiette. Souvent plus prononcée dans la grossesse et de graves anémies. Séroconversion: le changement de statut sérologique d'un individu de séronégatifs à séropositifs. Séroprévalence: La proportion d'une population donné qui est séropositif pour un agent infectieux. Sérum de Coombs : Anticorps anti-globulines humaines. Ils sont obtenus par immunisation d’animaux (lapin ou chèvre). Le sérum de Coombs peut être polyvalent (dirigé contre toutes les immunoglobulines humaines : IgM, IgG, IgA,…ainsi que les fractions C3 du complément) ou mono spécifique (dirigé contre une seule classe bien spécifique d’anticorps humains : anti-IgG par exemple). Test de Coombs direct (ou en France : Test direct à l’anti-globuline) : Test utilisant le sérum de Coombs, permettant de mettre en évidence des anticorps non agglutinants (IgG) fixés in vivo sur les globules rouges. Ce test permet entre-autres la recherche alloanticorps maternel fixés sur les globules rouges du nouveau-né ou du fœtus (en cas d’incompatibilité Rhésus par exemple).

Test de Coombs indirect (ou en France : Test indirect à l’anti-globuline) : Test utilisant le sérum de Coombs, permettant de mettre en évidence la présence d’anticorps non agglutinants dans un sérum (IgG). Il est utilisé entre-autres pour le test de compatibilité majeure. Transfusion à chaud : Transfusion d’une pochette de sang directement après son prélèvement, sans conservation dans un frigo. Ce système est utilisé principalement avec des donneurs de sang familiaux. Transfusion à froid : Transfusion d’une pochette de sang conservée dans un frigo. Ce système est utilisé avec des donneurs de sang bénévoles. Transfusion autologue: la transfusion de sang ou d’un composant de sang qui a été donné par le patient lui-même, par exemple chirurgie planifiée. Transfusion en sang total : Transfusion d’une pochette de sang complet, contenant les globules rouges, les globules blancs et le plasma. Par opposition à du sang fractionné, permettant de transfuser un concentré globulaire (globules rouges), du plasma, etc.

Fixation d’alloanticorps maternels sur les globules rouges du fœtus (In vivo)

Echantillon de sang lavé 3 x et dilué à 5 %

Sérum de Coombs

Agglutinations

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