Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י...
-
date post
22-Dec-2015 -
Category
Documents
-
view
225 -
download
3
Transcript of Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י...
![Page 1: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/1.jpg)
Polymerase Chain Reaction (PCR):רקע היסטורי -
ע"י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני 1983 שיטה שפותחה ב- כל עוד ידועים רצפים המקיפים אותו.DNAעותקים של
התוצאות מתקבלות תוך מספר שעות בלבד
בהתחלה בוצע ידנית. כיום- יש מכשירים המבצעים את הריאקציה.
: פרס נובל לכימיה1993
![Page 2: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/2.jpg)
::PCRPCRמרכיבי ריאקציית ה-מרכיבי ריאקציית ה-
( נוקליאוטידים( נוקליאוטידיםdNTP’sdNTP’s -) -)A T G CA T G C)תחלים )פריימרים(תחלים )פריימרים בופר המכיל יוני בופר המכיל יוניMgMg+2+2
אנזים אנזיםTaq PolymeraseTaq Polymerase( תבנית( תבניתTemplateTemplate))
![Page 3: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/3.jpg)
Hot water bacteria: Thermus aquaticusTaq DNA polymerase
Life at High Temperaturesby Thomas D. BrockBiotechnology in Yellowstone© 1994 Yellowstone Association for Natural Sciencehttp://www.bact.wisc.edu/Bact303/b27
![Page 4: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/4.jpg)
Melting
94 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
5’3’
3’5’
![Page 5: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/5.jpg)
Melting
94 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
3’5’
5’3’
Heat
![Page 6: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/6.jpg)
Melting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
3’5’
5’3’5’
5’
Melting94 oC
![Page 7: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/7.jpg)
Melting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
30x
3’5’
5’3’
Heat
Heat
5’
5’
5’
![Page 8: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/8.jpg)
Melting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
30x
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
![Page 9: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/9.jpg)
Melting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
30x
3’5’
5’3’ 5’
5’5’
5’
5’
5’
Heat
Heat
![Page 10: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/10.jpg)
Melting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
30x
3’5’
5’3’ 5’
5’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
![Page 11: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/11.jpg)
Fragments of defined length
Melting
94 oCMelting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension72 oC
Tem
pera
ture
100
0
50
T i m e
30x
3’5’
5’3’ 5’
5’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
![Page 12: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/12.jpg)
:PCRמחזור ה-
Step 1 7 min at 94˚C Initial Denature
Step 2 45 cycles of:
20 sec at 94˚C Denature20 sec at 52˚C Anneal1 min at 72˚C Extension
Step 3 7 min at 72˚C Final Extension
Step 4 Infinite hold at 4˚C Storage
Melting
94 oC
Melting
94 oC
AnnealingPrimers
50 oC
Extension
72 oC
X30
![Page 13: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/13.jpg)
DNA Between The Primers DNA Between The Primers Doubles With Each Thermal Doubles With Each Thermal
CycleCycle
0Cycles
Number1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
![Page 14: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/14.jpg)
More Cycles = More More Cycles = More DNADNANumber of cycles
0 10 15 20 25 30Size
Marker
![Page 15: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/15.jpg)
Theoretical Yield Of PCRTheoretical Yield Of PCRTheoretical yield = 2n x y
Where y = the starting number of copies and
n = the number of thermal cycles
= 107,374,182,400
If you start with 100 copies, how many copies are made in 30 cycles?
2n x y
= 230 x 100
= 1,073,741,824 x 100
![Page 16: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/16.jpg)
::PCRPCRשימוש ב-שימוש ב-
קריאת רצף התוצריםקריאת רצף התוצריםזיהוי מחלות גנטיותזיהוי מחלות גנטיותאיבחון איפקציות ויראליות/חיידקיותאיבחון איפקציות ויראליות/חיידקיותקביעת מין העוברקביעת מין העוברמוטגנזה מכוונתמוטגנזה מכוונת
![Page 17: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/17.jpg)
ריצוף דנ"א
קביעת רצף הנוקליאוטידים של מקטע דנ"א מסויים
.70השיטה המקובלת כיום- פותחה ע"י פרדריק סנגר בשנות ה-
1980: Walter Gilbert (Biol. Labs) & Frederick Sanger (MRC Labs)
![Page 18: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/18.jpg)
Dideoxy DNA sequencing-How it works:
מעמידים ארבע ריאקציות שונות. בכל ריאקציה:
DNA templatePrimer annealed to template DNAרק פריימר אחד!!! :DNA polymerasedNTPS (dATP, dTTP, dCTP, and dGTP)
ddNTP: ddATP/ ddTTP/ ddCTP/ ddGTP אך בריאקציית הריצוף- מוסיפים גם הנוקליאוטידים הללו מסומנים
מריכוז שאר הנוקליאוטידים.1/100ריכוזם-
לא יכול להיווצר קשר פוספודיאסטרי- וההלונגציה – H’-3 יש לו OH’-3? במקום ddNTPלמה של השרשרת לא יכולה להמשיך.
![Page 19: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/19.jpg)
מהלך הריאקציה: מהלך הריאקציה: PCRPCRזהה לריאקציית זהה לריאקציית
-דנטורציה של מקטע ה-דנטורציה של מקטע הDNADNAאותו אנו מרצפים אותו אנו מרצפים
AnnealingAnnealing-של הפריימר ל- של הפריימר ל TemplateTemplate
ExtentionExtention הארכת השרשרת היא לכיוון אחד בלבד בגלל ששמנו - הארכת השרשרת היא לכיוון אחד בלבד בגלל ששמנו -רק פריימר אחדרק פריימר אחד
מתי ההארכה מסתיימת??? מתי ההארכה מסתיימת???
מעלות מעלות9494 -כאשר מעלים את הטמפרטורה ל- -כאשר מעלים את הטמפרטורה ל- ddNTPddNTP - כאשר נכנס נוקליאוטיד - כאשר נכנס נוקליאוטיד
הרצה על ג'ל מיוחד )אקרילאמיד( הרצה על ג'ל מיוחד )אקרילאמיד(אנליזה של התוצאות:אנליזה של התוצאות:
![Page 20: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/20.jpg)
מה מתקבל בריאקציה?
מסומן ddNTP ריאקציות- בכל אחת 4העמדנו אחר
מתקבלים תוצרים באורכים שונים- המסתיימים במקומות שבהם ישנו נוקליאוטיד
מסומן
![Page 21: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/21.jpg)
תוצרים ארוכים
תוצרים קצרים
Radio-labeled ddNTPs (4 rxns)
קריאת הרצף(5 ’to 3)’
GGATATAACCCCTGT
![Page 22: Polymerase Chain Reaction (PCR)- רקע היסטורי : שיטה שפותחה ב -1983 ע " י קארי מוליסת מאפשרת אמפליפיקציה של מליוני עותקים](https://reader035.fdocuments.in/reader035/viewer/2022062221/56649d7e5503460f94a61ba1/html5/thumbnails/22.jpg)
כיום- הריצוף אוטומטי ומשתמש בסימון פלורסנטי במקום רדיואקטיבי
ריצוף רדיואקטיבי: דורש הרבה זמן ושימוש בחומר רדיואקטיבי
היום הוחלף בשימוש בסימון פלורסנטי- כל נוקליאטיד מסומן בצבע אחר. ארבעת הריאקציות אוחדו לריאקצייה אחת.
ההרצה- בג'ל קפילרי מיוחדכל נוקליאוטיד מסומן- נותן פיק של צבע שנקרא ע"י המכשיר