Physicochemical analysis of inks and methods of evidence ... analysis of inks and methods of...

Problems of Forensic Sciences 2015, vol. 104, 245–278

Physicochemical analysis of inks and methods of evidence evaluation − a review

Alicja MENŻYK1, Grzegorz ZADORA1, 2, Mieczysław SAJEWICZ1

1 Institute of Chemistry, University of Silesia, Katowice, Poland2 Institute of Forensic Research, Kraków, Poland

abstractInk analysis is an important field in the forensic science discipline of questioned document examination. Inks may be differ-entiated based on their composition (e.g. colourants, solvents, resins or additives) by employing a two-step approach, which includes optical and visual examination followed by instrumental analysis. Many analytical methods have been applied, each offering particular advantages, among which Thin Layer Chromatography occupied a special position for a long time. How-ever, a significant evolution in the methods available to forensic scientists has resulted in increased adoption of less invasive spectroscopic techniques, diminishing the role of previously employed separation methods. This paper provides an overview of methods applied in the forensic examination of inks, with special consideration given to articles published between 2000 and 2015. Both chromatographic and spectroscopic techniques are presented, highlighting the advantages as well as the possible disadvantages of the developed methods. Furthermore, the paper focuses on the problem of inadequate statistical interpretation of forensic ink evidence. Greater attention should be paid to the proper evaluation of obtained results, as communicating reliable conclusions in a transparent way to decision-makers in court is undoubtedly of the utmost importance.

key wordsInk analysis; Chromatographic and spectroscopic methods; Comparison and identification; Evidence interpretation.

Received 27 January 2016; accepted 13 June 2016

list of acronyms and abbreviations

acronym/abbreviation

description

ALS Alternative Light SourceAPI Atmospheric Pressure IonizationATR Attenauted Total ReflectionCA Cluster AnalysisCI Colour IndexDAD Diode Array DetectorDART Direct Analysis in Real TimeDB-FFAP Nitroterephthalic-acid-modified

polyethylene glycol stationary phaseDESI Desorption Electrospray IonizationDMSO Dimethyl sulfoxide


description

DP Discrimination PowerECE Empirical Cross EntropyESI Electrospray IonizationFID Flame Ionization DetectorFTIR Fourier Transform Infrared SpectroscopyGC Gas ChromatographyHP-5 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane stationary

phaseHPLC High-Performance Liquid ChromatographyHPTLC High-Performance Thin Layer

Chromatography

A. Menżyk, G. Zadora, M. Sajewicz246



description

HSI Hyperspectral ImagingIP-HPLC Ion-Pair High-Performance Liquid

ChromatographyIR Infrared SpectroscopyIRL Infrared LuminescenceIRR Infrared ReflectanceLA-ICP-MS Laser Ablation Inductively Coupled Plasma

Mass SpectrometryLDA Linear Discriminant AnalysisLDI Laser Desorption IonizationLIBS Laser Induced Breakdown SpectroscopyLOD Limit of DetectionLR Likelihood RatioMS Mass SpectrometryMSP MicrospectrophotometryNIR Near Infrared (radiation)PCA Principal Component AnalysisPLS-DA Partial Least Squares Discriminant AnalysisR-A IR Reflection-Absorption Infrared

SpectroscopySERS Surface-Enhanced Raman SpectroscopySFE Supercritical Fluid ExtractionSIMCA Soft Independent Modelling by Class

AnalogySIMS Secondary Ion Mass SpectrometrySR-FTIR Synchrotron Radiation-based FTIRSVM Support Vector MachineTBABr Tetra-n-butylammonium bromideTD Thermal DesorptionTOF-MS Time-of-Flight Secondary Ion Mass

SpectrometryTHF TetrahydrofuranTLC Thin Layer ChromatographyUV Ultraviolet (radiation)VIS Visible (radiation)XRF X-ray fluorescence analysis

1. introduction

Documents are an integral part of our everyday life. They accompany us in various forms from the moment we are born until the day we die − from let-ters, diaries or identity documents to prescriptions, in-surance agreements and testimonies. The ongoing pro-cess of digitalization has led to considerable changes in methods of exchanging information, and therefore

using traditional forms of documents is not as com-mon as just a few years ago. However, in many cases, transactions or agreements are still concluded in a con-ventional way, which in turn involves the application of ink.

Basically, ink is a complex mixture of components responsible for providing the desired appearance, vis-cosity, drying kinetics and many other properties – dictated by the type of writing instrument. Fountain pens utilize water-based ink. Fast-drying ballpoint pen inks are primarily composed of dyes and organic sol-vents that are responsible for their oily consistency, whereas rollerball pens are filled with gel inks, which are based on pigments dispersed in water vehicles. Yet all of them can serve as a tool for committing a crime, regardless of the type of writing instrument in which they are applied.

Forgery of documents can take two main forms: falsifying a document (introducing changes/modifi-cations in an original document) and making a false document, i.e., creating a new document from scratch according to an existing model (Wilk, 2013).

Forensic examination of ink is performed for three main reasons:1. to identify the source of an ink;2. to compare two or more ink entries;3. to date an ink entry or establish the sequence of in-

tersecting lines. Identification procedure aims at determining the

source of an ink entry present on a questioned doc-ument. This source is understood as a specific brand or model of a writing instrument, a manufacturer or a production batch of an ink which was used to cre-ate the questioned entry. The identification process is carried out by browsing ink databases in search of a reference sample that is qualitatively identical to the analysed ink. The aim of comparison is to establish whether the questioned specimen and reference ink sample originate from the same source, which is in most cases conducted by comparing physicochemical properties of both specimens. Comparative analysis that is aimed at matching a questioned ink entry to a specific writing instrument, e.g., a ballpoint pen or rubber stamp, is performed far less often.

A solution to those problems is usually achieved by applying a two-step procedure. Prior to any chemi-cal analysis, preliminary examinations are conducted, which include, e.g. an evaluation of the optical proper-ties of the ink entry by examining its UV, VIS or IR re-sponses. Unfortunately, preliminary examinations are usually insufficient to answer the questions posed by the judiciary and, therefore, the second part of the pro-cedure is required: far more detailed chemical analy-

Physicochemical analysis of inks and methods of evidence evaluation − a review 247


sis, which may include application of destructive and non-destructive methods. Obviously, from the foren-sic point of view, non-destructive methods are often preferred as they will leave the entry intact and allow further characterisation of the given piece of evidence.

It also worth noting that forensic examination of inks tends to have a screening character. It is not fea-sible to exhaustively identify all the components of a given ink. Examiners focus on comparing the results of physicochemical analysis that have been obtained both for evidence and reference material rather than on naming individually each component. Neumann, Ramotowski and Genessay (2011) bring up another problem, which is the lack of a direct link between inks and manufacturers of writing instruments. Since many different manufacturers of writing instruments are supplied by the same ink producers or even change them during the production process, it cannot be as-sumed that a particular ink is characteristic for a spe-cific model of writing instrument. This has a signifi-cant influence on the analytical procedure, especially the process of estimating the evidential value of find-ings. What is more, the composition of an ink entry is not stable over time. Various factors, for instance en-vironmental conditions, may trigger aging processes, leading to the degradation of ink deposited on paper.

The purpose of this article is to provide an over-view of physicochemical techniques that are used for ink examination and methods of interpretation of the

Table 1Main components of ink (Zlotnick & Smith, 1999)

Colourant

Ink component Characteristics Function

DyesPigments

Organic compounds, soluble in vehicleOrganic/inorganic compounds, insoluble in vehicle Provide desired appearance (colour)

Vehicle


Solvents

Resins

Organic solvents, water and/or their mixtures

Macromolecular organic compounds of both natural and synthetic origin

Dissolve the colourant (dye) and deliver it to the substrateSuspend, deliver and bond pigment to the substrate; provide desired viscosity

Additives


Surfactants

BiocidesWaxes

Soaps or detergents

Compounds of natural or synthetic origin Hydrocarbon waxes, greases, vaseline

Decrease the surface tension of ink; increase metal, polymer or rubber wettabilityInhibit microbes development Regulate ink flexibility

results in a forensic context. This paper constitutes the first of a two-part literature review, with part II focus-ing on dating studies and the problem of establishing sequences of intersecting lines. It has to be emphasized that the review is not intended to cover all aspects of the forensic analysis of questioned documents. It is aimed at presenting the most important procedures, from the authors’ perspective, with special considera-tion given to methods proposed in recent years.

2. composition of inks

Despite the vast diversity of ink products availa-ble on current markets (ballpoint pen inks, printing inks, stamp inks, etc.) the main categories of their ingredients are basically the same. The majority of these constituents are organic compounds. All inks are composed of colourant(s) (dyes or pigments) that are dissolved or suspended in a vehicle (solvent or resin). There are also a number of organic and inorganic com-pounds that act as additives, providing the writing in-strument with desired characteristics. Table 1 presents the main ingredients that are usually present in inks.

Apart from the above mentioned substances, inks contain many other minor additives, which enhance their properties, depending on the type of writing instrument. LaPorte and Stephens (2013) point out that, in spite of low concentrations of these ingredi-



ents, their value should not be underestimated, for it is possible that it is precisely the unique combination of these components that may allow otherwise similar inks to be discriminated.

3. methods applied in forensic comparison and identification of inks

3.1. Preliminary examinations

Before proceeding with chemical analysis, a num-ber of preliminary examinations of ink entries (speci-mens) are performed. These are methods of a non-de-structive nature, which do not require the ink to be removed from the substrate and therefore preserve the document’s (evidence’s) integrity. What is more, preliminary tests can be conducted without applying highly sophisticated or expensive instrumental tech-niques, and, furthermore, the interpretation of the ob-tained results does not usually pose any serious prob-lems. This kind of examination usually consists of:1. visual observation using a stereomicroscope (mor-

phological characteristics of ink entries), which is aimed at determining the type of ink, prelimi-narily assessing its colour and revealing any ad-ditional characteristics, such as visual defects generated, for example, by a damaged writing tip (Brunelle, Crawford, 2003);

2. optical examination using artificial light sources, in-cluding observation of ink subjected to the action of both short and long UV radiation as well as visible light (optical properties; Brunelle, Crawford, 2003; Houlgrave, LaPorte, Stephens, 2011; LaPorte, Ste-phens, 2013; Wilson, LaPorte, Cantú, 2004).This kind of preliminary examination surprisingly

often reveals that compared entries have been execut-ed with different inks. Nevertheless, if compared ink entries cannot be differentiated via optical examina-tion, this is not conclusive proof that they have been executed with the same ink. In such cases, performing chemical analysis is obligatory, as different inks of di-verse chemical composition can exhibit the same mor-phological and optical properties (LaPorte, Stephens, 2013). Combining conclusions drawn from prelim-inary observations with results of chemical analysis undoubtedly allows a more complete characterization of a given ink, thus enhancing the process of forensic examination.

3.2. Chromatographic methods

Chemical analysis usually involves extraction of ink into appropriate solvents, which necessitates re-moving a fragment of a questioned entry from the sub-strate. Brunelle and Crawford (2003) list fundamental criteria that should be respected when choosing ink sample sites. Collection of an ink sample should:1. minimize document damage;2. ensure maximum ink concentration for a fixed size

of the collected sample;3. avoid ink contamination (in particular, if possible,

sample sites with ink on both sides of the document should be rejected).Increasingly often, ink sample removal is per-

formed using specially designed devices or ink sam-pling punches with small diameters, which ensures collection of specimens of the same size.

The choice of the extracting solvent is usually dictated by the type of ink. Ballpoint pen inks and other ink formulas based on organic solvents are usually extracted at room temperature with: pyri-dine (Brunelle, Crawford, 2003; Causin et al., 2008; LaPorte, Stephens, 2013; Wilson, LaPorte, Cantú, 2004), methanol, acetonitrile (LaPorte, Stephens, 2013) or absolute ethanol (Causin et al., 2008). An al-ternative to these methods, proposed recently by Neu-mann and Margot (2010), involves extraction of ink with C2H5OH/H2O 1:1 (v/v) at 100°C. The process of isolating the ink at elevated temperature does not af-fect its chemical composition and is significantly less time-consuming.

The most common choice of an extracting sol-vent for water-based inks is a mixture of ethanol and water 1:1 (v/v) (Brunelle, Crawford, 2003; LaPorte, Stephens, 2013; Wilson, LaPorte, Cantú, 2004). If the extraction with aqueous solvents is inefficient, appli-cation of pyridine or DMSO should have the desired effect (Brunelle, Crawford, 2003). A recent study (LaPorte, Stephens, 2013) suggests that a THF/H2O 4:1 (v/v) mixture may be a suitable extracting solvent for both ballpoint and fluid inks.

Another important aspect is to perform an ex-traction of a blind sample, which in this case is a paper control. Parallel analysis of a blank paper fragment, collected near the ink sampling site, allows researchers to determine whether the substrate affects the analysis. This procedure should not be disregarded, as most pa-per substrates contain fluorescent brightening agents (Ciepliński, Świętonowska, 2008), which might be misinterpreted as a part of the ink formulation, espe-cially when optical detection methods are applied.



It should also be emphasized that, especially in the case of comparative analysis, maintaining the same conditions during the extraction process is of extreme importance. The type and volume of solvents, temper-ature, stirring intensity and length of the extraction procedure must remain unchanged (Brunelle, Craw-ford, 2003).

3.2.1. Thin Layer Chromatography (TLC) and High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC)

Since 1950, production of writing inks based on organic dyes has significantly increased. This, in turn, has created an opportunity for applying chromato-graphic techniques to document examination, with paper chromatography playing a leading role. How-ever, the incomplete separation of ink constituents by paper chromatography has drawn researchers’ atten-tion to the insufficient resolution of this method. As chromatographic methods have developed, thin layers of silica gel, cellulose and other materials have been gradually replacing filter paper used as the stationary phase. Nowadays, HPTLC is (still) one of the most frequently applied methods in the comparison and identification of writing inks.

Ballpoint pen ink analysis using TLC has been per-formed by numerous researchers. In 1972, Brunelle proposed two mixtures of solvents consisting of: ethyl acetate/ethanol/water 70:35:30 (v/v) and 1-butanol/ethanol/water 20:10:15 (v/v), which since that time have been used as mobile phases. Chromatograph-ic plates designed for ink analysis are in most cases covered with silica gel without fluorescent indicators such as zinc sulphide, addition of which might result in the undesired masking of fluorescent properties of ink components. Table 2 summarizes chromatograph-ic systems for TLC examination of inks suggested by various researchers.

Among many enhancements developed in order to improve the chromatographic separation of dyes, the introduction of high performance thin layer chroma-tography (HPTLC) probably had the biggest influence. HPTLC is a method with superior resolution, which is obtained by implementing plates with a 200 µm adsorption layer, which differ from the conventional TLC plates in that the particle size of the stationary phase is much smaller. As a consequence, the surface of the TLC plate is covered with a more homogenous layer of adsorbent with more active sites, allowing separation of closely related compounds (Tebbett, 1991). This also results in better optical properties of

the stationary phase, which improves the results of densitometric analysis (Brunelle, Crawford, 2003).

Several attempts have been made to standardize procedures used for ink examination. A particularly interesting solution was described recently, in 2009, by Neumann and Margot (2009a, 2009b, 2009c). The researchers suggested introducing a calibration proce-dure for the obtained TLC profiles of the analysed inks in order to improve the reproducibility of analysis and therefore allow their comparison with chromatograms that would be developed at different times, possibly by different examiners. The calibration process is based on correlating the migration distances of ink constitu-ents to the migration distances of so-called dye ladder standards, i.e., methanolic solutions of three pure dyes: Acid Red 18 (CI 16255)/Basic Blue 26 (CI 44045)/Solvent Orange (CI 11270:1), eluted simultaneously to the samples. The elution distances of these three ladder dyes, along with the position of the base line and the solvent front on the chromatogram, constitute five anchoring points for creating a new coordinate system, constituting a kind of “calibration grid”. This grid is constructed over the TLC plate by two-dimen-sional linear interpolation using a new coordinate sys-tem, allowing assignment of new coordinates to the migration distances of ink components.

Since forensic document examiners are focused on screening the composition of inks and comparing developed chromatograms rather than on identifying the chemical composition of each band, Neumann and Margot (2009a) suggested a new method of chromato-gram visualisation that facilitates comparison of TLC results. This approach is based on digital acquisition of the absorption spectrum of an ink sample developed on a TLC plate, scanned at 31 different wavelengths ranging from 200 nm to 700 nm over the full elution distance (50 µm step). As a consequence, each track of the ink sample is represented in the form of a scan that includes information on the migration distance (mm), wavelengths (nm) and intensity of absorption (au).

A computerized system for the storage of record-ed ink profiles would allow objective comparisons of samples that had been examined at different times. Such improvements would contribute to reducing the numbers of errors occurring as a result of analysing ink evidence on different TLC plates. As has been proven, the main factors influencing the variability of the position of the dyes, leading to wrong conclusions, are not different solvent systems or (different) exam-iners performing the analysis, but the application of different TLC plates in the comparison of writing ma-terials (Neumann et al., 2011).



Table 2 Analysis of ink by means of planar chromatography (TLC and HPLC)

Type of ink Sample preparation Stationary phase Mobile phase ReferencesComposition Parts

Ballpoint pen ink Extraction with pyridine HPTLC Silica Gel Plates

Ethyl acetateEthanolWater1-butanolEthanolWater

703530501015

Houlgrave et al., 2011

Ballpoint pen ink Extraction with pyridine WhatmanLinear- K PreadsorbentPlates

Ethyl acetateEthanolWater1-butanolEthanolWater

703530501015

Roux et al., 1999

Ballpoint pen ink Extraction with absolute ethanol

HPTLC Silica Gel Plates (Merck)

1- butanol1-propanolWaterAcetic acid

10550.5

Causin et al., 2008

Ballpoint pen ink Extraction with ethanol/water 1:1 (v/v) mixture

HPTLC Silica Gel 60 Plates (Merck)

1-butanolEthanolWaterAcetic acid

6010200.5

Neuman, Margot, 2009a−c

Ballpoint pen ink (containing polar compounds)

Inkjet ink

Extraction with pyridine

Extraction with ethanol/water 1:1 (v/v) mixture

Whatman Silica Gel 60 Plates

Whatman Silica Gel 60 Plates

CyclohexaneChlorobenzeneAbsolute ethanolEthyl acetateAbsolute ethanolChlorobenzeneWaterAcetic acid 1- butanolButyric acetate

1021221032174110

Pagano et al., 2000

Inkjet and photocopier ink

Extraction with dimethylformamide and if necessary with concentrated sulphuric (VI) acid

Silica gel (unspecified)

Sequentially1) 100% chloroform(10 cm)2) Ethyl acetateIsopropanolWaterAcetic acid(7 cm)3) conc. sulphuric acid(2 cm)

3015101

Poon et al., 2005

Stamp ink Extraction with methanol HPTLC Silica Gel 60 (Merck)

Butyric acetate EthanolDistilled water

732

Raza, Saha, 2013

Inkjet ink Extraction with pyridine/water 4:3 (v/v) mixture

Silica Gel Plate/ UV254

Ethyl acetateAbsolute ethanolChlorobenzene

703530

Pagano et al., 2000



The attention of forensic examiners has not only been focused on ballpoint pen inks. In 1996, Gernandt and Urlaub (1996), who investigated gel pen inks for forensic applications, concluded that their composi-tion, which is based mainly on pigments, rules out the application of HPTLC as a potential tool for analysis of this kind of writing material. Currently, however, some gel inks increasingly frequently contain a com-bination of both pigments and dyes. These changes, introduced by the manufacturers into the production process, encouraged Wilson and his co-workers (Wil-son, LaPorte, Cantú, 2004) to attempt to separate the constituents of gel inks by means of HPTLC. In order to do so, a 3-solvent system consisting of ethyl ace-tate/ethanol/water 75:35:30 (v/v) was used. However, twenty out of twenty-nine examined samples were not separated, because their composition was based on pigments.

HPTLC was also employed in the examination of ink entries created with electric typewriters (Varsh-ney, Jettappa, Mehrotra, Baggi, 1995), inkjet printers (Pagano, Surrency, Cantu, 2000; Poon, Ho, Li, 2005) and stamp inks (Raza, Saha, 2013). In all cases, this technique only enabled initial examination of writing materials – allowing division of samples into groups according to dyes present in their composition. How-ever, none of the results enabled complete discrimi-nation between inks originating from various sources. TLC separation conditions are presented in Table 2.

Owing to the nature of the product (presence of dyes), the results of chromatographic separation of inks are in most cases visible to the naked eye. Nev-ertheless, different writing materials can give similar TLC chromatograms; therefore application of visual-ising techniques, allowing detection of components that are non-absorbing in the visible range, may reveal some additional identifying features. Despite the fact that observation of developed chromatograms under UV light or their densitometric analysis are still the methods of choice for many researchers, alternative detection techniques are increasingly being utilized.

In recent years, special consideration has been giv-en to luminescence and, more precisely, the possibility of observing the radiation emitted by the separated ink components through the application of cut-off filters that entirely block incident radiation. Houlgrave and co-workers (Houlgrave, LaPorte, Stephens, 2011) utilized ALS with appropriate filters to evaluate TLC profiles obtained for ballpoint pen inks. Responses of separated bands on chromatograms to particular wavelengths of electromagnetic radiation in this case provided additional characteristics that were not ap-parent with ambient light, resulting in more effective

discrimination between samples. It is therefore worth examining in more detail the effectiveness of oth-er visualisation methods for evaluating TLC results that make use of fluorescence or Raman spectroscopy (Cañamares, Reagan, Lombardi, Leona, 2014; Kocsis et al., 1999). Hyphenating HPTLC with MS is another interesting concept (Van Berkel, Ford, Deibel, 2005; Van Berkel, Sanchez, Quirke, 2002) that combines the high resolution of HPTLC with a more objective analysis of chromatograms by means of MS, allow-ing confirmation of unknown substances contained in each chromatographic band.

It appears that the discrimination power of TLC and HPTLC is not completely satisfactory. Moreover, an inconsistent spotting technique, defects in the surface of the stationary phase (Houlgrave, LaPorte, Stephens, 2011) or even varying conditions in the laboratory during analysis (e.g. temperature) may result in differ-ences in retardation factors (Rf), even when the same inks are compared. All of these factors that influence chromatographic separation, if uncontrolled, may lead to inaccurate conclusions being reached. Nonetheless, mainly because of low exploitation costs and relative-ly inexpensive equipment, HPTLC remains the most widely used method for the analysis of inks. Planar techniques, however, lack the sensitivity and resolu-tion levels that are achieved by more advanced tech-niques, and therefore HPTLC should rather be applied as a sort of screening test for ink differentiation before implementing more reliable methods (Tebbett, 1991).

3.2.2. High-Performance Liquid Chromatography, HPLC

One of the methods offering better resolving pow-er and allowing ready identification of non-coloured components of ink is high-performance liquid chro-matography (HPLC). This technique is particularly useful in the analysis of thermally fragile, non-volatile substances. It ensures lower detection limits and better separation of dyes than the previously described sepa-ration methods. Contrary to TLC, HPLC is capable of not only detecting components that are non-absorbing in the visible range, but also generating quantitative information on ink constituents with no need for ap-plying any additional visualisation steps (Zlotnick, Smith, 1999). In spite of these obvious advantages, HPLC tends to be overlooked in routine analysis, as it usually requires a larger ink sample, whose prepa-ration as well as the analysis procedure itself are far more complicated.

Lyter (1982) was one of the first researchers to suggest using HPLC for ink analysis. He successful-



ly discriminated between ballpoint pen inks, utilizing a normal-phase chromatographic system consisting of a column packed with silica gel and a solvent sys-tem of dichloroethane/ethanol/formamide (89:10:1). However, since that time, a reversed-phase system has played the crucial role in HPLC analysis of ballpoint pens. This modification was also initiated by Lyter (1982), who succeeded in distinguishing between ten ballpoint pen inks after failing to classify them with TLC. He used a UV/VIS detector to monitor the eluent at two different wavelengths: 254 nm and 546 nm. Ap-plication of dual-wavelength detection was intended to detect dyes that absorb in the visible range of the electromagnetic spectrum (546 nm), as well as colour-less resins (254 nm).

Simultaneous collection of data at various wave-lengths allows for better adjustment to the substances’ absorption maxima, thus improving the procedure of ink comparative analysis. In 1991 Tebbett (1991), and, slightly later, Kher’s group (Kher, Mulholland, Green, Reedy, 2006) modified Lyter’s method by replacing the conventional detector with a diode array detector (DAD). Application of DAD generates information over a wide range of wavelengths at the same time. As a consequence, there is no need to perform multi-ple analysis using single-wavelength detection, which would require a larger ink sample, leading to addition-al destruction of the evidence.

Tebbett (1991) also proposed a novel method of ink extraction prior to analysis, which utilized SFE with supercritical CO2 as an extracting solvent. The extraction rate was significantly increased, as super-critical fluid, which combines the properties of a gas and a liquid, dissolves ink components similarly to organic solvents, but with the diffusion rate of a gas.

The composition of gel pen inks differs from that of ballpoint pen inks, and therefore different analyt-ical techniques are required. Water-soluble gel inks are usually based on dyes with an ionic structure, which are not readily adsorbed on C18 or C8 columns, which employ silica gel modified with non-polar hy-drocarbon chains. The solution to this problem is IP-HPLC, which is a powerful method for separation of ionic compounds. Selection of a suitable ion-pairing reagent, forming a hydrophobic ion pair with the an-alyte, which can eventually be retained on an RP-sta-tionary phase column, is the key element of the whole IP-HPLC procedure.

In 2006, Liu et al. (2006) developed a method for the classification of gel inks. A preliminary solu-bility test allowed the 93 gel inks to be divided into a pigment-based and a dye-based group, the latter be-ing further examined with IP-HPLC. Among tested

ion-pairing reagents, the best results were obtained for TBABr, which provided complete separation and rel-atively short retention times of the dye components. As a result, the following mobile phase was selected: 40 mmol/l TBABr buffer solution (pH = 7) with aceto-nitrile as the organic modifier for IP-HPLC analysis in the ratio 40:60 (v/v). On the basis of the number and the retention times of dye components, 50 dye-based gel inks were classified into four groups.

IP-HPLC may also serve as an appropriate tool for the analysis of fountain pen inks, as their dye compo-nents usually contains sulfonic, carboxylic or phenol-ic groups. Wang’s group (Wang, Yu, Xie, Yao, Han, 2008) used this technique with TBABr as an ion-pair-ing agent to discriminate between 18 fountain pen inks. According to the number of both main and minor compounds, as well as the relative peaks intensities of each dye component, 12 black and 6 red inks were fully discriminated.

In 2009, an approach based on IP-HPLC was de-veloped by Yao et al. (2009) for differentiation of red ink entries of seals. Sixty-nine ink samples were sep-arated on a Luna C18 column (250 mm × 4.60 mm, 5 µm) with a mobile phase consisting of 20 mmol/l TBABr buffer solution (pH 7)/acetonitrile and a pro-grammable gradient of the buffer and acetonitrile go-ing from 45:55 (v/v) to 5:95 (v/v) in 12 minutes. An initial classification of inks into three groups was ob-tained according to the presence of peaks originating from colourants, monitored at 500 nm. A reference analysis of standard dye mixtures was performed in the same chromatographic conditions, and retention times, obtained for these standard samples, were com-pared with the results of seal ink examination, en-abling identification of the colourants in the red seal ink. Each class was further divided into sub-classes on the basis of additives present, which were detected by monitoring eluting solvent at 254 nm. Eventually, it was demonstrated that individual identification of ink entries cannot be achieved by the IP-HPLC approach. An examination based on dye components and addi-tives may only facilitate the initial classification of ink samples.

3.2.3. Gas Chromatography, GC

Forensic examination of inks that focuses on dis-criminating between materials on the basis of the col-ourant composition does not always yield expected re-sults. It is quite common that various writing materials contain the same mixtures of dyes or pigments; hence, a colourant-based comparison will not allow for suc-cessful discrimination between ink samples. In such



cases, examination of colourless ink components, i.e. solvents or additives, by means of gas chromatogra-phy may be the solution.

In 2004, Wilson et al. (Wilson, LaPorte, Cantú, 2004) applied GC/MS in order to expand information on gel pen inks composition, which had previously been characterized with TLC and optical techniques. Researchers examined fresh (1 hour), 1 week and 1 month old ink entries using an HP-5 fused silica capillary column. The presence of the most abun-dant glycerine peak (retention time of approximately 6 min) served as a criterion for initial classification of samples. Out of 15 gel inks, 10 contained glycerine, which was detectable not only in fresh entries but also in samples aged one month. After glycerine-based dif-ferentiation, peaks originating from other compounds, such as triethanoloamine, triethylene and pentaethyl-ene glycol, were used for further separation of sam-ples. GC was also applied by Wilson to compare the composition of gel and roller-ball inks. It was found that chromatographic peaks from hepta-, hexa- and pentaethylene glycol may be used to discriminate be-tween these two types of ink (gel and rollerball), as the presence of these solvents is characteristic of gel pen inks.

The mass spectrometer is definitely one of the most common type of detector that is coupled with GC, as it offers the possibility of compound identification on the basis of existing mass spectra databases. As has already been mentioned, forensic examinations tend to be focused on the comparison of samples rather than the identification of all components, and there-fore researchers do not limit their examinations to GC/MS, but also employ other detectors. Li’s group (Li, Xie, Guo, Fe, 2014), which carried out classification of 30 gel pen inks, coupled gas chromatography with FID. In this case, a DB-FFAP column was used to sep-arate volatile constituents of writing inks.

One of the main problems with the analysis of ink, which researchers are often faced with, is the very small amount of analyte available for examination. A typical sample with a diameter of 1 mm usually does not contain more than 100 ng of ink, whereas the matrix (e.g. paper) constitutes approximately 98% of the sampled material. Solvent extraction, which is a conventional method of preparing a sample for GC/MS analysis, involves additional dilution of the analyte and poses a high risk of sample contamina-tion. To avoid those possible disadvantages, Bügler, Buchner and Dallmayer (2008) proposed a method for chemical analysis of volatile components in ink di-rectly from paper, without sample preparation, thereby avoiding the possibility of introducing any impurities

into the analysed material. Thermal desorption com-bined with gas chromatography (TD-GC/MS) allows isolation of volatile compounds from the substrate with their simultaneous concentration, contributing to lowering detection limits. Choosing an optimal temperature (200°C) leads to effective desorption of solvents, additives and fragments of resins, and at the same time does not cause paper decomposition. Be-cause complete elimination of signals from the paper matrix is not possible, analysis of a blind sample is also performed. Subsequently, isolated compounds are transferred onto an HP-5MS column. The obtained chromatograms along with mass spectra enable classi-fication of ballpoint pen inks that are indistinguishable by methods of colourant analysis.

Another important aspect of GC/MS analysis, which tends to be overlooked, is the polar character of most of the volatiles found in inks, especially sol-vents such as 2-phenoxyethanol. As a result of strong adsorption of polar compounds on active sites on the stationary phase surface, undesired peak tailing may occur (Wilson, LaPorte, Cantú, 2004). In order to min-imise these distortions and obtain chromatograms with sharp, symmetrical peaks, controlling transfer lines and replacing damaged liners is recommended.

Finally, it is critical to understand that inks are composed of volatile components that will evaporate with ink aging. Therefore, old and fresh ink entries differ in terms of unstable compounds content, which is the main obstacle to a reliable comparison or iden-tification of writing materials using gas chromatogra-phy. Compounds that are present in newly executed entries, especially compounds undergoing rapid oxi-dation (benzyl alcohol) or solvents with a low boiling point (propylene glycol) may not be detectable in old samples. As a consequence, interpretation of GC data requires extreme caution and without a doubt cannot be the only source of information when carrying out comparative analyses of ink entries whose date of ex-ecution is unknown.

3.3. Spectroscopic techniques

Thin layer chromatography and other separation techniques are undoubtedly the most widely used methodologies to characterize ink formulations, main-ly because of the simple analytical procedures and minimal equipment requirements (TLC). However, in some cases, classical methods do not permit a satisfac-tory comparison, and then the application of additional instrumental techniques, providing complementary re-sults, is required. During the last ten years, researchers specializing in document examination have focused



mostly on spectroscopic techniques. Among these, mass spectroscopy has received the greatest attention (approximately 50% of the papers published between 2000 and 2014), whereas the remaining studies have focused on FTIR, Raman or UV-VIS spectroscopy (Calcerrada, García-Ruiz, 2015). Table 3 presents ar-ticles focused on the analysis of inks by spectroscopic techniques.

UV/VIS spectroscopy, a relatively straightforward technique, was applied numerous times in the analy-sis of ballpoint pen inks in order to provide some in-sight about the dye composition and not necessarily to identify each of the ink components (Adam, Sherratt, Zholobenko, 2008; Brunelle, Crawford, 2003; Causin

et al., 2008; Senior, Hamed, Masoud, Shehata, 2012). However, the big disadvantage of UV-VIS is its de-structive character, as application of this method usu-ally requires extraction of the ink sample with appro-priate solvents. Due to this fact, novel, non-invasive analytical techniques − among them hyperspectral im-aging − are being introduced. Hyperspectral imaging (HSI) involves scanning the area of a questioned ink entry using the VIS/NIR range of the electromagnetic spectrum (400−1000 nm), performed in absorbance or reflectance mode (Nic Daeid, 2014; Payne et al., 2005; Reed, Savage, Edwards). Application of appro-priate algorithms (e.g. PCA), which make use of both spatial and spectral information, turns the HSI data

Table 3Spectroscopic techniques applied in the analysis of ink

Type of ink Sample preparation Technique Goal Results References

Ballpoint pen (10 blue inks)

Extraction with ethanol

UV- VIS,IR

Ink discrimination; comparative analysis supported with PCA

Division of inks into 8 and 7 groups based on UV-VIS and IR analysis, respectively

Senior et al., 2012

Ballpoint pen inks (21 black, 12 blue samples)

Extraction with ethanol UV- VIS

Ink discrimination; comparative analysis

Separation of black inks into 5 groups − discrimination power (DP) of 96% - and blue inks into 3 groups (DP: 79%)

Causin et al., 2008

Ballpoint pen (42 black, 49 blue inks) – MSP- DAD


Incomplete discrimination of samples; DP for both black and blue inks equalled 83%

Roux et al., 1999

Blue ballpoint pen (40 including 4 gel inks)

– MSP- DAD

Ink discrimination; comparative analysis based on LR approach

The best results (the lowest rate of false positive and false negative answers) were achieved for CIE- xyz and CIE- Lab colour systems

Martyna et al., 2013

Ballpoint pen (2 black and 1 red ink) – SR-FTIR

Discrimination and identification of inks

Method with superior sensitivity and resolution to techniques utilizing conventional sources of IR radiation

Wilkinson et al., 2002

Toner (807 black samples)

Transferring the toner onto aluminium foil by heating the printout

R-A IRClassification of inks; creating a spectral database

Spectral characteristics allowed classification of specimens into 98 groups; Discrimination of toner samples according to manufacturer was achieved

Merrill et al., 2003


Transferring the toner onto aluminium foil by heating the printout

R-A IR

Comparative analysis supported with multivariate discrimination techniques

Construction of LDA model resulted in discrimination of 95.81% toner samples

Egan et al., 2003


Transferring the toner onto glass or aluminium foil by heating the printout

R-A IR

Application of chemometric tools in comparative analysis of inks

15 groups were distinguished according to presence of characteristic absorption bands;Discrimination of 90.74% toner samples based on LDA

Udristioiu et al., 2009



Ballpoint pen ink (27 blue, 23 red, 9 black samples) and gel pen inks (10 blue, 9 black samples)

Evaporation of the solvent following the deposition of the ink sample on glass plate

µ-FTIR


95% of blue and black samples, as well as approximately 90% gel inks (depending on ink colour) were discriminated, based on vibrational spectra (IR and Raman). Further discrimination was obtained as a result of elemental analysis of inks (XRF)

Zięba-Palus, Kunicki, 2006

– Raman spectroscopy

Evaporation of the solvent following the deposition of the ink sample on glass plate

XRF

Ballpoint pen inks (12 blue, 21 black samples)

Extraction with ethanol FTIR


Characteristic absorption bands of colourless ink constituents formed the basis for discrimination of black (DP: 80–82%) and blue (DP: 95%) inks

Causin et al., 2008

Ballpoint pen inks (8 blue samples) – µ-ATR- IR

Application of chemometric tools in discrimination of inks

LDA and PCA, being complementary methods, allowed discrimination of 62.5% of ink samples. Strong matrix effects were registered.

Kher et al., 2006

Ballpoint pen inks (108 blue samples) – FTIR Identification of

inks

Two major groups of analysed inks were distinguished with regard to presence/absence of C=O bond in their structure. Further classification of samples resulted in obtaining 6 and 26 subgroups.

Wang et al., 2001

Ballpoint pen inks (9 black and 10 blue samples)

– HSI in VIS/NIR range


Visualisation of ink entries in VIS range resulted in DP of 0.96 and 0.94 for blue and black inks respectively;Discrimination of all ink samples was achieved through registration of hyperspectral images in NIR range followed by PCA

Payne et al., 2005

Gel pen inks (15 blue, 13 red, 14 black)

– HSI in range 400–1000 nm

Ink discrimination; comparison analysis

Analysis resulted in complete discrimination of red inks, 90% of blue and 40% of black inks

Reed et al., 2014

Gel pen inks (55 blue samples) – Raman

spectroscopy


36 pigment-based inks (identified previously with solubility tests) were classified into 5 groups (DP = 68%)

Mazzella, Buzzini, 2005

Black ballpoint pen inks – Raman

spectroscopy


Application of two different excitation wavelengths (514 nm, 782 nm) allowed more complete ink characterisation

Claybourn, Ansell, 2000

Ballpoint pen (26 blue and 26 black inks); liquid inks (63 blue, 60 black, 36 green, 48 red)

Application of an aqueous solution of poly-L-lysine and silver colloid on the ink’s surface

SERS Ink discrimination; comparative analysis

Discrimination power of the method varies between 28.2% (Raman spectroscopy) and 92.7% (SERS); DP depends on method of sample preparation and applied source of radiation

Anderman, 2001




Inkjet inks

Application of silver colloid and an aqueous solution of poly-L-lysine on the ink’s surface (also performed in reverse order).

SERS Ink discrimination; comparative analysis

Overwhelming effect of fluorescence was quenched through SERS. Sequence of solutions’ application during sample preparation did not influence analysis, although application of coloid solution prior to aggregating agent was less destructive of ink entries

Braz et al., 2014


Ballpoint pen (14 blue inks) – Raman

spectroscopy

Comparative analysis enhanced with chemometrics

PCA and HCA were used for data clustering and development of classification model (PLS-DA);the proposed model correctly classified 97% of ink samples

Souza Lins Borba et al. 2015

Ballpoint pen (10 blue and black inks) –

Raman spectroscopy,LIBS

Application of chemometric tools to ink classification

Combining Raman and LIBS data followed by application of chemometric methods (PCA, SIMCA, PLS-DA, SVM) worked better than independent analysis of data;SVM, requiring shorter calculation time, is recommended as a tool for initial data screening

Hoehse et al., 2012

Ballpoint pen (6), roller ball pen(6), gel pen (6) inks

Extraction with methanol ESI- MS


Complete discrimination of analysed inks based on visual comparison of MS spectra. Information on vehicles, dyes and pigments was obtained

Williams et al., 2009

Ballpoint pen inks (33 blue) – LDI- MS


Analysis in negative ion mode regarding unidentified peaks and their relative intensities permitted discrimination of 99.6% samples

Gallidabino et al., 2011

Gel pen inks (30 black) – LDI- MS

Application of statistical methods in ink discrimination

Objective comparison of MS spectra using methods based on Pearson correlation resulted in DP = 85%

Weyermann et al., 2011

Ballpoint pen inks (23 blue, 15 black, 12 red)

Removal of single paper fibre covered with ink

LDI-TOF-MSInk discrimination; comparison analysis

Dye-based comparison allowed separation of blue, black and red ink into 10, 5 and 3 groups, respectively

Matthews et al., 2011

Ballpoint pen (13 blue inks) – TOF-SIMS


Analysis in positive ion mode resulted in ink discrimination, including samples originating from the same producer

Coumbaros et al., 2009

Ballpoint pen (10 blue inks) – TOF-SIMS

Discrimination of inks supported with PCA

Successful discrimination of 41 out of 45 possible combinations, performed in positive ion mode

Denaman et al., 2010

201 black and 23 colour toners

Printouts were analysed with no previous preparation. Toner powder was formed into tablets (heated at 190-200°C for 15 minutes)

DART-MSIdentification and comparison of toners enhanced with CA and PCA

Dyes and other constituents were present in MS spectrum in the form of protonated compounds [M+H]+; varying fragments of analysed ink entries resulted in differences among peak intensities. MS spectral database was created

Jones et al., 2006

Ballpoint pen (13 black, 10 blue inks), gel pen (10 black), liquid inks (10 black)

– DESI-MSInk discrimination; comparative analysis

100% discrimination of inks based on 2D images of ink entries, showing spatial distribution of ions

Ifa et al., 2007



into two-dimensional images, which may reveal some subtle differences between analysed samples, and as a consequence enhance the comparison.

The colour of analysed objects can be estimated in a more objective and accurate way through microspec-trophotometry in the visible range coupled with a di-ode array detector (Martyna, Zadora, Stanimirova, Ramos, 2013; Roux, Novotny, Evans, Lennard, 1999). MSP-DAD combines the magnification capabilities of optical microscopy with photometric measurements and therefore enables colour assessment of very small samples, such as fragments of ink entries. What is even more important is that MSP ensures a reliable compar-ison, as it eliminates the subjectivity of human colour recognition. In 1999, Roux and co-workers investi-gated blue ballpoint pen inks by visual comparison of obtained MSP spectra. But this approach, based on spectral shape analysis, did not yield satisfactory re-sults in terms of distinguishing any of the ink colours. However, implementation of appropriate software, which converts the MSP spectra into coordinates de-fined by standardised colour systems, improves colour analysis. This approach was applied in 2013 by Mar-tyna et al. Researchers parameterised MSP spectra of 40 writing materials (36 ballpoint pen and 4 gel inks) registered in the visible range (380−800 nm) using three colour systems: CIE XYZ, CIE xyz, and CIE Lab. In order to evaluate the findings, LR models − a widely accepted measure of evidential value in forensic sci-ences − were developed (Zadora, Martyna, Ramos, Aitken, 2014). In comparison to visual assessment, the method of characterising MSP spectra using stan-dardised coordinates is undoubtedly a more efficient and objective way of comparing inks, and could also become the foundation for database creation. On the other hand, the discrimination power of MSP-DAD is not as high as that of TLC or HPLC, mainly because the sample is analysed without the step of prior sepa-ration of ink into its numerous components.

Whereas visible light spectroscopy is a tool for rapidly comparing the colour of samples, infrared spectroscopy provides extensive information about molecular structure and atom connectivity of ink com-ponents. In other words, with FTIR it is possible to compare not only colourants present in an ink formu-lation, but also colourless compounds such as resins or other organic additives. IR spectroscopy has been used for the analysis of various writing materials, from reg-ular ballpoint pen inks, to gel pen inks, stamp inks and toners (Brunelle, Crawford, 2003; Causin et al., 2008; Chen, Meng, Cheng, 2002; Dirwono et al., 2010; Egan, Morgan, Bartick, Merrill, Taylor, 2003; Kher, Mulhol-land, Green, Reedy, 2006; Merrill, Bartick, Taylor,

2003; Senior, Hamed, Masoud, Shehata, 2012; Udris-tioiu, Bunaciu, Aboul-Enein, Tanase, 2009; Wang, Yu, Zhang, Zhou, Xie, 2012; Wilkinson, Perry, Martin, McKinne, Cantu, 2002; Zięba-Palus, Kunicki, 2006). Sample preparation is relatively simple and usually does not require destruction of the analysed material (µ-ATR-IR), though it depends on applied IR mode (Brunelle, Crawford, 2003). Unfortunately, compared to other techniques, IR requires more sample materi-al (apart from µ-ATR mode). What is more, the inter-pretation of IR spectra is generally considered more difficult, due to the high number of ink components that absorb in the infrared range of the electromagnetic spectrum. For this reason, analysis once again does not focus on band assignment to a specific compound, but is based on comparing whole spectra, which can be thought of as a “fingerprint” of each ink sample (Cal-cerrada, García-Ruiz, 2015). This comparison is usu-ally supported with advanced chemometric techniques (Egan, Morgan, Bartick, Merrill, Taylor, 2003; Kher, Mulholland, Green, Reedy, 2006; Udristioiu, Bunaciu, Aboul-Enein, Tanase, 2009). Additionally, ink analy-sis by means of IR spectroscopy is also complicated by paper interference. Substrate constituents may con-tribute to strong absorption bands in spectra, and these bands cannot in all cases be eliminated by simple pa-per blank subtraction (Brunelle, Crawford, 2003). In cases where IR absorbance spectra are not conclusive and therefore discrimination between analysed sam-ples is impossible, application of another method that provides complementary information is required.

Without a doubt, Raman spectroscopy serves as such a complementary technique which has been em-ployed in the analysis of gel pen or roller-ball pen inks (Bell, Stewart, Ho, Craythorne, Speers, 2013; Braz, López-López, García-Ruiz, 2013; Claybourn, Ansell, 2000; Geiman, Leona, Lombardi, 2009; Mazzella, Buzzini, 2005) as well as ballpoint pen inks (An-derman, 2001; Claybourn, Ansell, 2000; Souza Lins Borba, Saldanha Honorato, Juan, 2015; Zięba-Palus, Kunicki, 2006). Raman spectra are usually less com-plex than those obtained as a result of IR examination, but this does not change the fact that discrimination is more effective when chemometric techniques for vi-sualising data are applied (Braz, López-López, Mon-talvo, García-Ruiz, 2014; Brunel, Crawford, 2003). It has been suggested that replacing commonly used PCA by soft independent modelling of class analogy (SIMCA) could enhance the analysis to an even great-er extent (Braz, López-López, Montalvo, García-Ruiz, 2014). Moreover, bands due to the paper substrate do not usually interfere with Raman scattering of ink components, and therefore the results are easier to in-



terpret (Bell, Stewart, Ho, Craythorne, James, 2013; Braz López-López, García-Ruiz 2013; Braz, López-López, Montalvo, García-Ruiz, 2014. On the other hand, Raman spectroscopy is a technique of relatively low sensitivity (compared to IR), as it provides a very weak signal, which might be additionally masked by sample fluorescence. Since fluorescence is much more intense, it usually dominates the spectra, masking the crucial information − Raman scatter (Brunelle, Craw-ford, 2003). However in this case, researchers also found an alternative solution − a remedy for the flu-orescence problem could be surface enhanced Raman spectroscopy (Braz, López-López, Montalvo, García-Ruiz, 2014; Geiman, Leona, Lombardi, 2009). It does not meet all expectations, as it is a quasi-destructive method which involves applying a layer of colloid solution on the surface of an ink entry. However, when conventional Raman spectroscopy fails, SERS usually gives satisfactory results.

Since forensic sciences aim to apply non-destruc-tive techniques of high discrimination abilities or ones leading only to minimal sample damage, various ionization methods coupled with mass spectroscopy have been employed in the analysis of ballpoint pen inks (Coumbaros, Kirkbride, Klass, Skinner, 2009; Denman, Skinner, Kirkbride, Kempson, 2010; Galli-dabino, Weyermann, Marquis, 2011; Ifa, Gumaelius, Eberlin, Manickea, Cooks, 2007; Ifa, Wiseman, Song, Cooks, 2007; Jones, Cody, McClelland, 2006; Weyer-mann, Marquis, Mazzella, Spengler 2007; Williams et al., 2009), roller-ball pen (Williams et al., 2009), gel pen inks (Jones, Cody, McClelland, 2006; Williams et al., 2009; Wu, Zhou, Yu, Liu, Xie, 2012) and other writing inks (Jones, Cody, McClelland, 2006; Lee, J., Lee, C., Lee, K., Lee, Y., 2008). Mass spectroscopy, being a rich source of knowledge on the composition of analysed material, provides molecular information not only on colourants, but also on vehicles, resins or surfactants contained in ink formulations.

Electrospray Ionization (ESI), a soft ionization technique, requires extraction of the ink entry with an appropriate solvent (e.g. methanol), as it produces charged electrospray droplets of the analyte through dispersion of the sample solution from a fine needle in an electrical field (Williams et al., 2009). However, damage to the document is minimal. Because of the high sensitivity of MS, the quantity of ink needed for analysis is much lower than the sample sizes required for HPTLC. Minimal fragmentation of the ions may pose some difficulties with structure identification, al-though ESI-MS still provides sufficient information to differentiate between inks on the basis of the dyes, pig-ments or vehicle components contained in these inks.

Unlike ESI-MS, LDI-MS is a non-destructive ana-lytical tool, as it allows examination directly from the paper surface, at the same time offering discrimina-tion power that is high enough to successfully distin-guish between ink samples (Gallidabino, Weyermann, Marquis, 2011; Matthews et al., 2011; Weyermann, Marquis, Mazzella, Spengler, 2007). Until recently, researchers concentrated mainly on the technique ap-plied in positive mode, and as a consequence restrict-ed themselves to detecting dyes present only in their basic forms (Weyermann, Marquis, Mazzella, Spen-gler, 2007). However, in 2010, Gallibadino employed LDI-MS in both positive and negative mode. That slight modification led to additional identification of anionic dyes and therefore allowed further discrimina-tion of ink samples, owing to a more complete charac-terisation of dye components.

A new group of mass spectrometry methods, in which ions are generated under atmospheric pressure (API) without sample preparation, is also worth men-tioning. Among these methods, DESI-MS is one of the most extensively used techniques in the forensic sciences. Because two-dimensional images including spatial and molecular information are obtainable, it has already been adopted for questioned documents examination.

Van Berkel developed an automated DESI-MS method in order to visualise compounds previously separated by TLC (Van Berkel, Ford, Deibel, 2005; Van Berkel, Sanchez, Quirke, 2002), and a few years later, this technique was applied to discriminate among ink entries directly from the paper substrate, without any prior sample preparation (Ifa, Gumaelius, Eberlin, Manickea, Cooks, 2007). However, the main prob-lem associated with DESI arises from optimization of desorbing solvent conditions. Selection of a solvent that is intended to isolate the ink from the substrate and introduce it to the spectrometer plays a key role in successful analysis. Inappropriate choice of the de-sorbing agent may result in spreading of the ink on the document surface, leading to a partial destruction of the evidence material (Morelato, Beavis, Kirkbride, Roux, 2013). If the spraying solvent is correctly se-lected, then the examination may be performed even multiple times, causing only minor distortions of the questioned ink entry.

DART-MS appears to be less destructive to evi-dence, as it samples the analysed material using ion-ized gases (helium or nitrogen; Jones, Cody, McClel-land, 2006). DART generates data-rich spectra, which are more informative compared to those obtained us-ing ESI, which, in turn, results in higher confidence in compounds identification.



LA-ICP-TOF-MS, which enables elemental analy-sis of writing ink, is another technique that may deliv-er valuable information. A group of Polish researchers (Szynkowska, Czerski, Paryjczak, Parczewski, 2009) successfully used this method to discriminate between laser printer toners. Effective discrimination and iden-tification of toner producers was achieved after con-sidering the isotope ratios. Application of chemom-etric methods (PCA, CA) additionally enhanced the analysis.

However, it should be emphasized that even an extremely detailed analysis, proving that the chemi-cal composition of compared inks is identical, is not equivalent to stating that analysed entries have been created with the same writing instrument. Mass-pro-duction processes result in the production of writing instruments containing inks of the same properties. What is more, it is currently quite common for ink producing companies to supply different manufactur-ers of writing instruments. Therefore, concluding that ink entries have actually been created with a particu-lar (individual) writing instrument remains one of the most challenging requests facing forensic examiners.

4. statistical methods used in the interpretation of ink evidence

Ink evidence is not delivered for forensic examina-tion as frequently as biological traces or fingerprints. This has not, however, discouraged researchers from developing new techniques and improving already existing ones, allowing for even more effective dis-crimination between ink of closely related formulas. These advancements relate both to the analytical pro-cedures themselves, as in the case of implementing a calibration process in TLC using so-called dye lad-der standards (Neumann, Margot, 2009), and to meth-ods of more objective sample comparison, utilizing algorithms based on various measures of similarity − Euclidean distance (Berger, 2009; Neumann, Margot, 2009a, 2009b, 2009c; Neumann, Ramotowski, Genes-say, 2011), Pearson correlation (Neumann, Margot, 2009a, 2009b, 2009c; Neumann, Ramotowski, Genes-say, 2011; Weyermann et al., 2012; Weyermann, Mar-quis, Mazzella, Spengler, 2007), and artificial neural networks (Neumann, Margot, 2009a, 2009b, 2009c; Neumann, Ramotowski, Genessay, 2011). However, the crucial stage of forensic examination, namely the evaluation of the evidential value of physicochemical data, is still being given insufficient attention.

In the forensic sciences, there are two main ap-proaches to the validation of results: the so-called clas-

sical approach employing significance tests (such as Student’s t-test for univariate data) and methods based on Bayes’ theorem (Aitken, 2006). However, the main disadvantage of significance tests is that they do not allow inclusion – in a single computation – of infor-mation regarding the rarity of a given physicochemi-cal value in the general population and between-object variability. Moreover, this approach violates the prin-ciple of the presumption of innocence (when propos-ing the null hypothesis) and is associated with a sub-jective choice of significance level. Therefore, it is un-surprising that the interest of researchers is nowadays directed towards methods adopting the likelihood ratio (LR) approach, which enables inclusion of all this in-formation in one calculation run.

4.1. Likelihood ratio

The likelihood ratio theory of hypothesis testing is based on estimating the ratio of conditional probabili-ties, according to the following equation:

LR =Pr(E│H1 ) ,Pr(E│H2 )

where E represents the evidence (usually physico-chemical data measured for the evidence), whereas H1 and H2 are two competing hypotheses (it is assumed that H1 and H2 are equivalent to the propositions of the prosecution and defence, respectively).

For evidence in the form of continuous data, prob-abilities Pr(·) in the LR equation are replaced with probability density functions f(·).

The likelihood ratio can take values between zero and infinity and is interpreted as follows: values of LR above 1 support H1, while values of LR below 1 pro-vide support for H2. Additionally, the higher (lower) the value of the LR, the stronger the support for H1 (H2) (Zadora, 2014). Hence, the LR approach provides not only qualitative information (which of the prop-ositions, H1 or H2, is supported by the evidence), but also quantitative information, being a measure of the strength of the support for one of the hypotheses.

In the process of comparing writing inks, Pr(X = x|H1) signifies the probability that the observed simi-larity of physicochemical data between the questioned ink sample and reference material occurred because both of the samples actually originated from the same source (the so-called prosecution hypothesis, H1). Pr(X = x|H2) refers to the probability that the ques-tioned specimen does not originate from the same source as the reference sample (the so-called defence hypothesis, H2). It is extremely important to properly



define the source of the ink specimen when formulat-ing the hypothesis. As has been pointed out by Neu-mann and Margot (2009a), in the case of comparative analysis, the source should be understood as a specific writing instrument, since any other definition will not be informative enough, from the point of view of the judicature, to answer relevant questions. For example, the fact that both of the samples (evidence and refer-ence material) are characterised by the same chemical composition does not carry any information about the probability of finding this particular ink formulation in writing instruments.

It should also be emphasized that even in cases where the evidence and reference material originate from the same source (e.g. stamps created with the same (rubber) stamp), the probability Pr(X = x|H1), and thus the value of the numerator in the LR formula, will not always equal one. Researchers always have to bear in mind that ink deposited on paper is constant-ly exposed to various environmental factors that may induce aging processes, leading to degradation of ink. As a consequence, lack of a complete match between the questioned and reference sample will be the result of ongoing changes in the physicochemical properties of the evidence − the questioned ink entry.

In order to estimate Pr(X = x|H2), i.e., the proba-bility that the similarity between compared samples is accidental, it is necessary to have an appropriate data-base, allowing determination of between-object vari-ability (Neumann, Margot, 2009a). These ink librar-ies, containing reference samples, should be created locally, as, for example, a database designed for Polish market purposes will probably not representatively re-flect American or Asian ink populations, etc.

It is also worth recalling that statistical computa-tions, just like the results of any analytical process, are riddled with errors that may result, for instance, from a lack of accepted standard procedures developed for estimating the frequency of occurrence of examined writing inks or for evaluating the influence of the pre-viously mentioned environmental factors on a ques-tioned sample.

Therefore, the reliability of constructed statisti-cal models has to be controlled (validated). This is usually performed using a so-called validation set, which includes samples of known origin. These sam-ples are used to simulate a hypothetical forensic case and subsequently to generate LR values on the basis of the analytical results. Since the source of the sam-ples submitted for examination is known, it is possible to check which of the propositions (H1 whether H2) should be supported by the physicochemical data. In other words, the performance of the constructed LR

model can be verified. The most common measures for evaluating decisions in forensic science are rates of false positive (LR > 1 when H2 is correct) and false negative (LR < 1 when H1 is correct) answers. Howev-er, as it has been emphasized (Ramos, Gonzalez-Ro-driguez, Zadora, Aitken, 2013), measuring the rates of incorrect answers, as well as application of Tippett plots, are both insufficient approaches for assessing the model’s performance. With Tippett plots, a straightfor-ward visualisation of rates of misleading evidence is obtained, although no information on the strength of this support for the incorrect hypothesis is delivered. Contrary to these methods, construction of empirical cross entropy (ECE) plots, a tool recommended by researchers (Martyna et al., 2013; Martyna, Zadora, Stanimirova, Ramos, 2014; Ramos, Gonzalez-Rodri-guez, Zadora, Aitken, 2013; Ramos, Zadora, 2011) provides information of both a qualitative and quan-titative nature. ECE is a method based on a system of penalising incorrect LR values. The stronger the sup-port for the wrong hypothesis, the greater the penalty assigned to the model’s response. The most desired models are those strongly supporting the correct prop-osition (LR >> 1 when H1 is correct, and LR << 1 when H2 is correct). In the case of supporting the incorrect proposition ( i.e., LR < 1 when H1 is correct, and LR > 1 when H2 is correct), the obtained LR values should stay around 1, giving very weak support.

Regarding the examination of writing inks, evalu-ation of LR models has been performed using Tippett plots (Neumann, Margot, 2009a) or empirical cross entropy (Martyna et al., 2013). In the latter case, ECE plots were used by Martyna’s group to assess the per-formance of LR models, which were developed for MSP-DAD data obtained for forty blue pen inks with-in: CIE-XYZ, CIE-xyz, and CIE-Lab colour determina-tion systems.

Multivariate chemometric techniques such as PCA (Adam, Sherratt, Zholobenko, 2008; Kher, Mulholland, Green, Reedy, 2006; Thanasoulias, Parisis, Evmiridis, 2003; Weyermann et al., 2012), LDA (Senior, Hamed, Masoud, Shehata, 2012) or CA (Weyermann et al., 2012) have been employed in order to classify writing inks. Although effective in simple classification tasks, these methods do not take into account between-ob-ject variability or the rarity (frequency of occurrence) of the determined physicochemical property for the questioned ink sample within a relevant population. Therefore, the LR approach has also been suggested as a potential tool for solving classification problems. Neumann and Margot (2009b) successfully used the LR method to classify ballpoint pen inks, highlighting once again that defining the source of the questioned



ink sample when proposing the LR hypothesis is an extremely important issue affecting the interpretation process. In this particular case, the origin of the sam-ple should be understood as a specific brand or model of writing instrument.

Estimation of evidence values becomes even more complex when the material submitted for analysis yields information including multivariate datasets of highly correlated variables. Since in this case, uni-variate LR models cannot be easily proposed (Zado-ra, 2009), current research is focused on combining chemometric methods (allowing for a reduction in datasets’ dimensionality) with the LR approach. Al-though this methodology has not been applied in the analysis of questioned documents, it has been imple-mented in other forensic spheres, showing satisfying results. A fusion of LR with PCA (Martyna, Zadora, Stanimirova, Ramos, 2014) has been successfully ap-plied in the examination of wine samples. In another case, discrete wavelength transform (DWT) allowed compression of spectral data of automotive paints and polymeric car parts (Martyna, Michalska, Zadora, 2015), and in yet another case, the geographical origin of olive oils was determined using a combination of LDA with LR (Własiuk, Martyna, Zadora, 2015).

All the above mentioned examples considered LR computation methods at so-called source level. How-ever, the person ordering the expert report might be more interested in assessing the evidential value at the activity level, i.e., obtaining information on the sus-pect’s action that may have led to the creation of this particular evidence material (Zadora, Martyna, Ra-mos, Aitken, 2014). And once again, evaluation of the evidence at the activity level may be performed using the LR approach.

When examining writing inks, consideration of the following hypotheses may be more significant from the perspective of fact finders (police, prosecutor or judge): H1 − the person whose fingerprints were found on the writing instrument (ballpoint pen) had created the questioned entry, H2 − the person whose finger-prints were found on the writing instrument (ballpoint pen) had not created the questioned entry.

Obviously, even advanced analysis of evidence (questioned ink entry) and reference material (ink originating from the secured ballpoint pen), followed by a comparison of the obtained physicochemical data will, not provide the answer to this particular question. Even determination of a so-called match between both samples – i.e. proving that two inks are chemically identical – under no circumstances enables us to state that the questioned entry was created with a particular writing instrument, unless it can be proved that the de-

termined ink formulation is associated with that, and only that, specific pen. However, examination of the evidence at the activity level would still require taking into account other possible events, such as the proba-bility of exchanging ballpoint pens refills.

Finally, it should be underlined that the value of the evidence at the source level is not equivalent to its value considered at the activity level. For instance, extremely unique inks with DNA taggants constitute exquisitely valuable evidence at a source level. At the same time, these inks are not inseparably linked with the owner and, as a consequence, could always fall into the wrong hands and serve as a tool for commit-ting a crime.

5. conclusions

A combination of non-invasive preliminary optical examinations and HPTLC is still the most common recommendation made by many forensic scientists when asked about the best technique for ink analysis (Brunelle, Crawford, 2003; Calcerrada, García-Ruiz, 2015; LaPorte, Stephens, 2012). However, like most developed techniques, this approach is not a univer-sal analytical tool. TLC fails when inks submitted for examination are composed of similar dye constitu-ents, and – what is worse – it requires extraction of the ink from the substrate. The remaining separation techniques (HPLC, GC) along with a wide range of spectroscopic methods (IR, Raman spectroscopy, MS) provide additional information on the chemical com-position of writing inks. These methods require min-imal sample preparation and therefore allow semi- or even non-destructive analysis. Until recently, howev-er, poor equipment accessibility, high costs of analysis and complex procedures resulted in limited applica-tion of spectroscopic methods in routine examinations. Nonetheless, it appears that these factors increasingly rarely constitute a real obstacle. Articles published in recent years have revealed that spectroscopic tech-niques have become the most popular choice among forensic researchers.

In reality, each of the suggested techniques, as long as it is properly applied, provides some useful information and a combination of methods usually results in more reliable conclusions. Undoubtedly, awareness of factors influencing written entries (aging processes), and of the given technique’s limitations are another important aspect of each analytical procedure. Therefore, discrimination (identification) of volatile constituents of ink, which gradually evaporate as an entry ages, should under no circumstances constitute



the only source of information when solving compar-ison or identification problems. Dye-based analysis should also be performed with caution. The possibil-ity of dye photodegradation has to be considered in qualitative and especially quantitative interpretation of obtained data. In the case of an inconsistencies be-tween chemical profiles of compared writing materi-als, underestimation of aging mechanisms may result in drawing incorrect, false negative conclusions.

The substrate of the document bearing the ink en-try, due to the presence of various additives such as fillers or optical brighteners, makes the interpretation process even more difficult. FTIR analysis of inks that are easily absorbed by paper – which is performed di-rectly on the substrate – usually poses some difficul-ties because of interference from the paper, whereas strong sample fluorescence results in challenges when attempting to characterise ink with Raman spectrosco-py. That, however, does not mean that the above men-tioned techniques are excluded from the set of poten-tial analytical tools used in ink examination. Various modifications, such as SERS, which is introduced in order to quench an overwhelming fluorescence effect (Braz, López-López, Montalvo, García Ruiz, 2014; Geiman, Leona, Lombardi, 2009), allow occurring difficulties to be overcome in most cases.

It should be also emphasized, that the influence of external factors on written entries cannot be underes-timated during the interpretation process, irrespective of the applied analytical method. A perfect piece of ev-idence does not exist in the real world; therefore eval-uation of its value, for example, through calculation of the LR, is an essential step in every forensic proce-dure. The LR approach takes into account – in a sin-gle-computation run – aspects relating to the similarity of compared samples, and between- and within-object variability, as well as the rarity (frequency) of the de-termined physicochemical properties in the general population. This method of estimating the evidential value of findings undoubtedly provides more valua-ble information than the currently applied approach, which is restricted to confirming or excluding consist-ency between chemical profiles of analysed materials (Neumann, Ramotowski, Genessay, 2011). This (cur-rently applied) approach is even more complicated due to a lack of transparent rules of decision-making concerning distinguishing between genuine differenc-es among ink profiles and (explainable) differences that might stem, for example, from the degrading ef-fects of environmental factors. Current research in the field of questioned document examination, instead of developing new analytical methods, should rather fo-cus on validation of already existing techniques, and,

even more importantly, on introducing standard proce-dures enabling the interpretation of results in terms of their reliability.

references

1. Aitken, C. G. G. (2006). Statistics in forensic science. Part II. An aid to the evaluation of evidence. Problems of Forensic Sciences, 65, 68−81.

2. Adam, C. D. (2008). In situ luminescence spectroscopy with multivariate analysis for the discrimination of black ballpoint pen ink-lines on paper. Forensic Science Inter-national, 182, 27–34.

3. Adam, C. D., Sherratt, S. L., Zholobenko, V. L. (2008). Classification and individualisation of black ballpoint pen inks using principal component analysis of UV-vis absorption spectra. Forensic Science International, 174, 16–25.

4. Andermann, T. (2001). Raman spectroscopy of ink on paper. Problems of Forensic Sciences, 46, 335–344.

5. Bell, S. E. J., Stewart, S. P., Ho, Y. C., Craythorne, B. W., James, S. S. (2013). Comparison of the discriminating power of Raman and surface-enhanced Raman spectros-copy with established techniques for the examination of liquid and gel inks. Journal of Raman Spectroscopy, 44, 509–517.

6. Berger, C. E. H. (2009). Inference of identity of source using univariate and bivariate methods. Science and Jus-tice, 49, 265–271.

7. Braz, A., López-López, M., García-Ruiz, C. (2013). Ra-man spectroscopy for forensic analysis of inks in ques-tioned documents. Forensic Science International, 232, 206–212.

8. Braz, A., López-López, M., Montalvo, G., García Ruiz C. (2014). Forensic discrimination of inkjet-printed lines by Raman spectroscopy and surface-enhanced Raman spectroscopy. Australian Journal of Forensic Sciences, DOI: 10.1080/00450618.2014.982179.

9. Brunelle, R. L., Crawford, K. R. (2003). Advances in the forensic analysis and dating of writing ink. Springfield: Charles C. Thomas.

10. Bügler, J. H., Buchner, H., Dallmayer, A. (2005). Age determination of ballpoint pen ink by thermal desorption and Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Journal of Forensic Sciences, 53, 982−988.

11. Bügler, J. H., Buchner, H., Dallmayer, A. (2008). Char-acterization of ballpoint pen inks by thermal desorption and Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Journal of Forensic Sciences, 50, 1209−1214.

12. Calcerrada, M., García-Ruiz, C. (2015). Analysis of questioned documents: A review. Analytica Chimica Acta, 853, 143−166.

13. Cañamares, M. V., Reagan, D. A., Lombardi, J. R., Leo-na, M. (2014). TLC-SERS of mauve, the first synthetic dye. Journal of Raman Spectroscopy, 45, 1147–1152.



14. Causin, V., Casamassima, R., Marega, C., Maida, P., Schiavone, S., Marigo, A., Villari, A. (2008). The dis-crimination potential of ultraviolet-visible spectropho-tometry thin layer chromatography, and Fourier trans-form infrared spectroscopy for the forensic analysis of black and blue ballpoint inks. Journal of Forensic Sci-ences, 53, 1468−1475.

15. Chen, H. S., Meng, H. H., Cheng, K. C. (2002). A survey of methods used for the identification and characteriza-tion of inks. Forensic Science Journal, 1, 1–14.

16. Ciepliński, M., Świętonowska, A. (2008). Możliwość podwyższenia białości papieru za pomocą dodatku roz-jaśniacza optycznego i barwnika niuansującego. Prace Instytutu Elektrotechniki, Łódź, 237, 201−215.

17. Claybourn, M., Ansell, M. (2000). Using Raman Spec-troscopy to solve crime: inks, questioned documents and fraud. Science and Justice, 40, 261−271.

18. Coumbaros, J., Kirkbride, K. P., Klass, G., Skinner, W. (2009). Application of time of flight secondary ion mass spectrometry to the in situ analysis of ballpoint pen inks on paper. Forensic Science International, 193, 42–46.

19. Denman, J. A., Skinner, W. M., Kirkbride, K. P., Kemp-son, I. M. (2010). Organic and inorganic discrimination of ballpoint pen inks by ToF-SIMS and multivariate sta-tistics. Applied Surface Science, 256, 2155–2163.

20. Dirwono, W., Park, J. S., Agustin-Camacho, M. R., Kim, J., Park, H. M., Lee, Y., Lee, K. B. (2010). Application of micro-attenuated total reflectance FTIR spectroscopy in the forensic study of questioned documents involving red seal inks. Forensic Science International, 199, 6–8.

21. Egan, W. J., Morgan, S. L., Bartick, E. G., Merrill, R. A., Taylor, H. J. (2003). Forensic discrimination of photo-copy and printer toners II. Discriminant analysis applied to infrared reflection-absorption spectroscopy. Analytical Bioanalytical Chemistry, 376, 1279–1285.

22. Gallidabino, M., Weyermann, C., Marquis, R. (2011). Differentiation of blue ballpoint pen inks by positive and negative mode LDI-MS. Forensic Science International, 204, 169–178.

23. Geiman, I., Leona, M., Lombardi, J. R. (2009). Appli-cation of Raman spectroscopy and surface-enhanced Raman scattering to the analysis of synthetic dyes found in ballpoint pen inks. Journal of Forensic Sciences, 54, 947–949.

24. Gernandt, M. N., Urlaub, J. J. (1996). An introduction to the gel pen. Journal of Forensic Sciences, 41, 503−504.

25. Hoehse, M., Paul, A., Gornushkin, I., Panne, U. (2012). Multivariate classification of pigments and inks using combined Raman spectroscopy and LIBS. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 402, 1443−1450.

26. Houlgrave, S., LaPorte, G. M., Stephens, J. C. (2011). The use of filtered light for the evaluation of writing inks analyzed using Thin Layer Chromatography. Journal of Forensic Sciences, 56, 778−783.

27. Ifa, D. R., Gumaelius, L. M., Eberlin, L. S., Manickea, N. E., Cooks, R. G. (2007). Forensic analysis of inks by imaging desorption electrospray ionization (DESI) mass spectrometry. Analyst, 132, 461–467.

28. Ifa, D. R., Wiseman, J. M., Song, Q., Cooks, R. G. (2007). Development of capabilities for imaging mass spectrometry under ambient conditions with desorption electrospray ionization (DESI). International Journal of Mass Spectrometry, 259, 8–15.

29. Jones, R. W., Cody, R. B., McClelland, J. F. (2006). Dif-ferentiating writing inks using direct analysis in real time mass spectrometry. Journal of Forensic Sciences, 51, 915–918.

30. Kher, A., Mulholland, M., Green, E., Reedy, B. (2006). Forensic classification of ballpoint pen inks using high performance liquid chromatography and infrared spec-troscopy with principal components analysis and line-ar discriminant analysis. Vibrational Spectroscopy, 40, 270–277.

31. Kocsis, L., Horvath, E., Kristof, J., Frost, R. L., Redey, A., Mink, J. (1999). Effect of the preparation conditions on the surface-enhanced Raman-spectrometric identifica-tion of thin-layer-chromatographic spots. Journal of Chromatography A, 845, 197–202.

32. LaPorte, G. M., Stephens, J. C. (2013). analysis tech-niques used for the forensic examination of writing and printing inks. (In) L. Kobilinsky (ed.), Forensic chem-istry handbook (pp. 225−250). Hoboken: John Wiley & Sons.

33. Lee, J., Lee, C., Lee, K., Lee, Y. (2008). TOF-SIMS study of red sealing-inks on paper and its forensic applications. Applied Surface Science, 255, 1523–1526.

34. Li, B., Xie, P., Guo, Y. M., Fei, Q. (2014). GC Analysis of black gel pen ink stored under different conditions. Jour-nal of Forensic Sciences, 59, 543−549.

35. Liu, Y. Z., Yiu, J., Xie, M., Liu, Y., Han, J., Jing, T. T. (2006). Classification and dating of black gel pen ink by ion-pairing high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1135, 57–64.

36. Lyter, A .H. (1982). Examination of ballpoint pen ink by high pressure liquid chromatography. Journal of Foren-sic Science, 27, 154.

37. Martyna, A., Lucy, D., Zadora, G., Trzcińska, B. M., Ramos, D., Parczewski, A. (2013). The evidential value of microspectrophotometry measurements made for pen inks. Analytical Methods, 5, 6788−6795.

38. Martyna, A., Michalska, A., Zadora, G. (2015). Interpre-tation of FTIR spectra of polymers and Raman spectra of car paints by means of likelihood ratio approach sup-ported by wavelet transform for reducing data dimen-sionality. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 407, 3357–3376.

39. Martyna, A., Zadora, G., Stanimirova, I., Ramos, D. (2014). Wine authenticity verification as a forensic prob-lem: An application of likelihood ratio test to label verifi-cation. Food Chemistry, 150, 287–295.



40. Matthews, B., Walker, G. S., Kobusa, H., Pigou, P., Bird, C., Smith, G. (2011). The analysis of dyes in ball-point pen inks on single paper fibres using laser desorp-tion ionisation time of flight mass spectrometry (LDI-TOF-MS). Forensic Science International, 209, e26–e30.

41. Mazzella, W. D., Buzzini, P. (2005). Raman spectroscopy of blue gel pen inks. Forensic Science International, 152, 241–247.

42. Merrill, R., Bartick, E., Taylor, J. H. (2003). Forensic discrimination of photocopy and printer toners I. The development of an infrared spectral library. Analytical Bioanalytical Chemistry, 376, 1272–1278.

43. Morelato, M., Beavis, A., Kirkbride, P., Roux, C. (2013). Forensic applications of desorption electrospray ionisa-tion mass spectrometry (DESI-MS). Forensic Science International, 226, 10–21.

44. Neumann, C., Margot, P. (2010). Considerations on the ASTM standards 1789–04 and 1422–05 on the forensic examination of ink. Journal of Forensic Sciences, 55, 1304–1310.

45. Neumann, C., Margot, P. (2009a). New perspectives in the use of ink evidence in forensic science: part I. De-velopment of a quality assurance process for forensic ink analysis by HPTLC. Forensic Science International, 185, 29–37.

46. Neumann, C., Margot, P. (2009b). New perspectives in the use of ink evidence in forensic science, part II. De-velopment and testing of mathematical algorithms for the automatic comparison of ink samples analysed by HPTLC. Forensic Science International, 185, 38–50.

47. Neumann, C., Margot, P. (2009c). New perspectives in the use of ink evidence in forensic science, part III. Op-erational applications and evaluation. Forensic Science International, 192, 29–42.

48. Neumann, C., Ramotowski, R., Genessay, T. (2011). Forensic examination of ink by high-performance thin layer chromatography. The United States Secret Service Digital Ink Library. Journal of Chromatography A, 1218, 2793–2811.

49. Pagano, L. W., Surrency, M. J., Cantu, A. A. (2000). Inks: Forensic analysis by Thin Layer (Planar) Chromatogra-phy. Washington: US Secret Service.

50. Payne, G., Wallace, C., Reedy, B., Lennard, C., Schuler, R., Exline, D., Roux, C. (2005). Visible and near-infrared chemical imaging methods for the analysis of selected forensic samples. Talanta, 67, 334–344.

51. Poon, N. L., Ho, S. S .H., Li, C. K. (2005). Differentia-tion of coloured inks of inkjet printer cartridges by thin layer chromatography. Science and Justice, 45, 187–194.

52. Ramos, D., Gonzalez-Rodriguez, J., Zadora, G., Ait-ken, C. (2013). Information-theoretical assessment of the performance of Likelihood Ratio computation methods. Journal of Forensic Sciences, 58, 1503−1518.

53. Ramos, D., Zadora, G. (2011). Information-theoretical feature selection using data obtained by Scanning Elec-tron Microscopy coupled with and Energy Dispersive X-ray spectrometer for the classification of glass traces. Analytica Chimica Acta, 705, 207–217.

54. Raza, A., Saha, B. (2013). Application of Raman spec-troscopy in forensic investigation of questioned docu-ments involving stamp inks. Science and Justice, 53, 332–338.

55. Reed, G., Savage, K., Edwards, D., Nic Daeid, N. (2014). Hyperspectral imaging of gel pen inks: an emerging tool in document analysis. Science and Justice, 54, 71–80.

56. Roux, C., Novotny, M., Evans, I., Lennard, C. (1999). A study to investigate the evidential value of blue and black ballpoint pen inks in Australia. Forensic Science International, 101, 167–176.

57. Senior, S., Hamed, E., Masoud, M., Shehata, E. (2012). Characterization and dating of blue ballpoint pen inks using principal component analysis of UV-vis absorption spectra IR spectroscopy and HPTLC. Journal of Foren-sic Sciences, 57, 1087–1093.

58. Siegel, J., Allison, J., Mohr, D., Dunn, J. (2005). The use of laser desorption/ionization mass spectrometry in the analysis of inks in questioned documents. Talanta, 67, 425–429.

59. Souza Lins Borba, F., Saldanha Honorato R. I., Juan, A. (2015). Use of Raman spectroscopy and chemometrics to distinguish blue ballpoint pen inks. Forensic Science International, 249, 73–82.

60. Tebbett, I. R. (1991). Chromatographic analysis of inks for forensic science applications. Forensic Science Re-view, 2, 71−82.

61. Thanasoulias, N. C., Parisis, N. A., Evmiridis, N. P. (2003). Multivariate chemometrics for the forensic dis-crimination of blue ball-point pen inks based on their Vis spectra. Forensic Science International, 138, 75–84.

62. Udristioiu, E. G., Bunaciu, A. A., Aboul-Enein, H. Y., Ta-nase, I. G. (2009). Infrared spectrometry in discriminant analysis of laser printer and photocopy toner on ques-tioned documents. Instrumental Science and Technology, 37, 230–240.

63. Urlaub, J. J., Gernandt, M. N. (1996). An introduction to the gel pen. Journal of Forensic Sciences, 41, 503−504.

64. Van Berkel, G. J., Ford, M. J., Deibel, M. A. (2005). Thin-layer chromatography and mass spectrometry cou-pled using desorption electrospray ionization. Analytical Chemistry, 77, 1207–1215.

65. Van Berkel, G. J., Sanchez, A. D., Quirke, J. M. E. (2002). Thin-layer chromatography and electrospray mass spec-trometry coupled using a surface sampling probe. Analyt-ical Chemistry, 74, 6216–6223.

66. Varshney, K. M., Jettappa, T., Mehrotra, V. K., Bag-gi, T. R. (1995). Ink analysis from typed script of electronic typewriters by high performance thin layer chromatography. Forensic Science International, 72, 107−115.



67. Wang, J., Luo, G., Sun, S., Wang, Z., Wang, Y. (2001). Systematic analysis of bulk blue ballpoint pen ink by FTIR spectrometry. Journal of Forensic Sciences, 46, 1093−1097.

68. Wang, X. F., Yu, J., Xie, M. X., Yao, Y. T., Han, J. (2008). Identification and dating of the fountain pen ink entries on documents by ion-pairing high-performance liquid chromatography. Forensic Science International, 180, 43–49.

69. Wang, X. F., Yu, J., Zhang, A. L., Zhou, D. W., Xie, M. X. (2012). Nondestructive identification for red ink entries of seals by Raman and Fourier transform infrared spec-trometry. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 97, 986–994.

70. Weyermann, C. (2005). Mass Spectrometric investiga-tion of the aging processes of ballpoint ink for the ex-amination of questioned document. (Website) http://geb.uni-giessen.de/geb/volltexte/2006/3044/.

71. Weyermann, C., Bucher, L., Majcherczyk, P., Mazzel-la, W., Roux, C., Esseiva, P. (2012). Statistical discrimi-nation of black gel pen inks analysed by laser desorption/ionization mass spectrometry. Forensic Science Interna-tional, 217, 127–133.

72. Weyermann, C., Marquis, R., Mazzella, W., Speng-ler, B. (2007). Differentiation of blue ballpoint pen inks by laser desorption ionization mass spectrometry and high-performance thin-layer chromatography. Journal of Forensic Sciences, 52, 216–220.

73. Wilk, D. (red.). (2013). Kryminalistyka: przewodnik. To-ruń: Towarzystwo Naukowe Organizacji i Kierownictwa. Stowarzyszenie Wyższej Użyteczności „Dom Organiza-tora”.

74. Wilkinson, T., Perry, D. L., Martin, M. C., McKinney, W. R., Cantu, A. A. (2002). Use of synchrotron reflec-tance infrared spectromicroscopy as a rapid direct, non-destructive method for the study of inks on paper. Ap-plied Spectroscopy, 56, 800–802.

75. Williams, M., Moody, C., Arceneaux, L., Rinke, C., White, K., Sigman, M. E. (2009). Analysis of black writ-ing ink by electrospray ionization mass spectrometry. Forensic Science International, 191, 97–103.

76. Wilson, J. D., LaPorte, G. M., Cantú, A. A. (2004). Dif-ferentiation of black gel inks using optical and chemical techniques. Journal of Forensic Sciences, 49, 364–370.

77. Własiuk, P., Martyna, A., Zadora, G. (2015). A likelihood ratio model for the determination of the geographical or-igin of olive oil. Analytica Chimica Acta, 853, 187−199.

78. Wu, Y., Zhou, C. X., Yu, J., Liu, H. L., Xie, M. X. (2012). Differentiation and dating of gel pen ink entries on pa-per by laser desorption ionization- and quadruple-time of flight mass spectrometry. Dyes and Pigments, 94, 525–532.

79. Yao, Y. T., Song, J., Yu J., Wang, X. F., Hou, F., Zhang, A. L., Liu, Y., Han, J., Xie, M. X. (2009). Differ-entiation and dating of red ink entries of seals on docu-ments by HPLC and GC/MS. Journal of Separation Sci-ence, 32, 2919–2927.

80. Zadora, G. (2006). The role of statistical methods in as-sessing the evidential value of physico-chemical data. Problems of Forensic Sciences, 65, 91−103.

81. Zadora, G., Martyna, A., Ramos, D., Aitken, C. (2014). Statistical analysis in forensic science: evidential value of multivariate physicochemical data. Chichester: John Wiley & Sons.

82. Zięba-Palus, J., Kunicki, M. (2006). Application of the micro-FTIR spectroscopy, Raman spectroscopy and XRF method examination of inks. Forensic Science In-ternational, 158, 164–172.

83. Zlotnick, J., Smith, F. (1999). Chromatographic and elec-trophoretic approaches in ink analysis. Journal of Chro-matography B: Biomedical Sciences and Applications, 733, 265–272.

corresponding authorDr hab. Grzegorz ZadoraInstytut Ekspertyz Sądowychul. Westerplatte 9PL 31-033 Krakówe-mal: [email protected]


wykaz skrótów i akronimów

Skrót/akronim Nazwa polska Nazwa angielskaALS Alternatywne źródło światła Alternative Light SourceAPI Jonizacja pod ciśnieniem atmosferycznym Atmospheric Pressure IonizationATR Osłabione całkowite wewnętrzne odbicie Attenauted Total ReflectionCA Analiza skupień Cluster AnalysisCI Numer CI, indywidualne oznaczenie substancji barwiących

figurujących w Międzynarodowym Indeksie BarwColour Index

DAD Detektor z matrycą diodową Diode Array DetectorDART Bezpośrednia analiza w czasie rzeczywistym Direct Analysis in Real TimeDB-FFAP Faza stacjonarna − zmodyfikowany glikol polietylenowy

kwasu tereftalowegoNitroterephtalic-acid-modified polyethylene glycol stationary phase

DESI Desorpcyjna jonizacja przez elektrorozpylanie Desorption Electrospray IonizationDMSO Dimetylosulfotlenek Dimethyl sulfoxideDP Moc dyskryminacyjna Discrimination PowerECE Empiryczna entropia krzyżowa Empirical Cross EntropyESI Jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym Electrospray IonizationFID Detektor płomieniowo-jonizacyjny Flame Ionization DetectorFTIR Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera Fourier Transform Infrared SpectroscopyGC Chromatografia gazowa Gas ChromatographyHP-5 Faza stacjonarna metylofenylosiloksany z pięcioprocentowym

udziałem grup fenolowych(5%-phenyl)-methylpolysiloxane stationary phase

HPLC Wysokosprawna chromatografia cieczowa High-Performance Liquid ChromatographyHPTLC Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa High-Performance Thin Layer ChromatographyHSI Obrazowanie hiperspektralne Hyperspectral ImagingIP-HPLC Wysokosprawna chromatografia par jonowych Ion-Pair High-Performance Liquid

ChromatographyIR Spektroskopia w podczerwieni Infrared SpectroscopyIRL Luminescencja w podczerwieni Infrared LuminescenceIRR Reflektancja w podczerwieni Infrared ReflectanceLA-ICP-MS Spektrometria mas z jonizacją w plazmie sprzężonej

indukcyjnie z analizatorem kwadrupolowym i przystawką do odparowania laserowego

Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry

LDA Liniowa analiza dyskryminacyjna Linear Discriminant AnalysisLDI Jonizacja przez desorpcję laserową Laser Desorption IonizationLIBS Spektroskopia emisyjna wzbudzana

laseremLaser Induced Breakdown Spectroscopy

LOD Granica wykrywalności Limit of DetectionLR Iloraz wiarygodności Likelihood ratioMK Materiał kryjący –MS Spektrometria mas Mass Spectrometry

analiza fizykochemiczna materiałów kryjących oraz metody interpretacji wyników badań − przegląd literatury

Analiza fizykochemiczna materiałów kryjących oraz metody interpretacji wyników badań − przegląd literatury 267


MSP Mikrospektrofotometria MicrospectrophotometryNIR Promieniowanie elektromagnetyczne z zakresu bliskiej

podczerwieniNear Infrared (radiation)

PCA Analiza głównych składowych Principal Component AnalysisPLS-DA Dyskryminacyjny wariant metody częściowych

najmniejszych kwadratówPartial Least Squares Discriminant Analysis

R-A IR Refleksyjno-absorpcyjna spektroskopia w podczerwieni Reflection-Absorption Infrared SpectroscopySERS Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana Surface-Enhanced Raman SpectroscopySFE Ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym Supercritical Fluid ExtractionSIMCA Metoda niezależnego modelowania i analogii klas Soft Independent Modelling by Class AnalogySIMS Spektrometria mas jonów wtórnych Secondary Ion Mass SpectrometrySR-FTIR Synchrotronowa mikrospektroskopia w podczerwieni

z transformacją FourieraSynchrotron Radiation-based FTIR

SVM Maszyny wektorów wspierających Support Vector MachineTBABr Bromek tetrabutyloamoniowy Tetra-n-butylammonium bromideTD Desorpcja termiczna Thermal DesorptionTOF-MS Spektrometria mas jonów wtórnych z analizatorem czasu

przelotuTime-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

THF Tetrahydrofuran TetrahydrofuranTLC Chromatografia cienkowarstwowa Thin Layer ChromatographyUV Promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie

ultrafioletowymUltraviolet (radiation)

VIS Promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie widzialnym Visible (radiation)XRF Rentgenowska analiza fluorescencyjna X-ray fluorescence analysis

1. wstęp

Dokumenty to nieodłączne elementy należące do naszego otoczenia. Towarzyszą nam od początku życia aż po jego kres, przyjmując wielorakie formy − począw-szy od listów, pamiętników czy dowodów tożsamości, a skończywszy na receptach lekarskich, umowach ubez-pieczeniowych i testamentach. Postępująca cyfryzacja pociągnęła za sobą znaczne zmiany w sposobie wymiany informacji, przez co posługiwanie się klasycznymi for-mami dokumentów nie jest tak powszechne, jak jeszcze kilkanaście lat temu. Wciąż jednak w wielu przypadkach dokonywanie transakcji czy podpisywanie umów obywa się w konwencjonalny sposób, co z kolei wiąże się z za-stosowaniem odpowiedniego materiału kryjącego.

Materiały kryjące stanowią mieszaninę szeregu składników odpowiadających za nadanie im odpowied-niej barwy, płynności i szybkości schnięcia, a także wie-lu innych właściwości, zależnych od rodzaju narzędzia pisarskiego, w którym będą one stosowane. Wieczne pióra korzystają z atramentów bazujących na rozpusz-czalnikach wodnych. Szybkoschnące pasty długopisowe stanowią mieszaninę barwników i rozpuszczalników or-ganicznych odpowiedzialnych za ich oleistą konsysten-cję. Z kolei pióra kulkowe coraz częściej wypełniane są tuszami żelowymi, które, w przeciwieństwie do poprzed-

ników, składają się z pigmentów zdyspergowanych w no-śnikach wodnych. Wszystkie natomiast, bez względu na rodzaj instrumentu, w którym są stosowane, mogą służyć jako narzędzie do popełnienia przestępstwa.

Przestępstwa przeciwko dokumentom obejmują dwie główne formy: przerobienie (dokonanie zmian w orygi-nalnym dokumencie) oraz podrobienie (wykonanie całe-go dokumentu według pewnego wzoru; Wilk, 2013).

Wśród problemów spotykanych podczas analizy ma-teriałów kryjących prowadzonych na potrzeby eksperty-zy sądowej należy wymienić:1. identyfikację materiałów kryjących;2. analizę porównawczą materiałów kryjących;3. oszacowanie czasu lub chronologii sporządzania za-

kwestionowanych zapisów.Próba identyfikacji ma na celu określenie źródła

danej próbki materiału pisarskiego pochodzącego z ba-danego dokumentu. Przez owe źródło rozumie się markę, model, wytwórcę lub rok produkcji materiału, którego użyto do sporządzenia analizowanego zapisu. Badanie przeprowadza się poprzez porównanie próbki dowodo-wej ze zbiorem materiałów pisarskich znajdujących się w bibliotekach danych. Analiza porównawcza polega na-tomiast na porównaniu właściwości fizykochemicznych materiałów kryjących użytych do sporządzenia zapisów na jednym bądź kilku dokumentach. Znacznie rzadziej



analiza porównawcza może prowadzić do dopasowania próbki materiału kryjącego do konkretnego narzędzia pi-sarskiego, np. długopisu czy pieczątki.

Próbę rozwiązania powyższych problemów przepro-wadza się, stosując dwuetapową procedurę. Wstępne oględziny dokumentu przeprowadza się z wykorzysta-niem różnego rodzaju metod optycznych, wśród których należy wymienić obserwację zapisów w promieniowa-niu z zakresu UV, VIS lub IR. Metody te nie zawsze są jednak wystarczającymi środkami do rozwiązania pytań napotykanych podczas analizy dokumentów. Dlatego też kolejnym etapem są szczegółowe badania materia-łów kryjących, obejmujące zarówno metody niszczące materiał dowodowy, jak i te nienaruszające dokumentu, a więc preferowane pośród nauk sądowych.

Warto podkreślić, że badania te mają raczej charakter przesiewowy. Nie chodzi więc o rozpoznanie wszystkich składników materiału kryjącego, a jedynie o porówna-nie uzyskanych, w wyniku przeprowadzonych badań, danych fizykochemicznych dla materiału dowodowego i porównawczego. Neumann, Ramotowski i Genessay (2011) wskazują również na problem, jaki stanowi brak bezpośredniego związku między materiałem kryjącym i producentem narzędzia pisarskiego. Skład materiału pisarskiego nie jest unikatowy, ponieważ wielu wytwór-ców zaopatruje się u tych samych producentów materia-łów pisarskich lub zmienia owych producentów podczas produkcji konkretnego modelu narzędzia pisarskiego. Ma to ogromny wpływ na proces badawczy i stanowi wyzwanie podczas szacowania wartości dowodowej otrzymanych danych fizykochemicznych. Co więcej, skład chemiczny zapisu nie jest stały w czasie, ulega on zmianom pod wpływem różnych czynników zewnętrz-nych (warunki środowiskowe).

Celem pracy jest przedstawienie charakterystyki me-tod stosowanych w analizach fizykochemicznych mate-riałów kryjących, a także sposobów interpretacji danych uzyskanych w wyniku przeprowadzonych badań. Niniej-sza praca stanowi pierwszy człon dwuczęściowego prze-glądu literaturowego, który obejmować będzie również problem datowania zapisów oraz określania chronologii nanoszenia krzyżujących się linii (część II). Opracowa-nie nie zawiera wyczerpującego przeglądu wykorzy-stywanych technik, a jedynie gromadzi najistotniejsze, z punktu widzenia autorów, publikacje, ze szczególnym uwzględnieniem pozycji opracowanych w ciągu ostat-nich lat.

2. Skład materiałów kryjących

Pomimo ogromnej różnorodności materiałów kry-jących obecnych na rynku (pasty długopisowe, tusze drukarskie, tusze stosowane w pieczątkach) ich skład, w którym dominują substancje organiczne, jest bardzo

zbliżony. Złożone są one głównie z środka barwiącego (barwnika lub pigmentu) umieszczonego w odpowied-nim nośniku (rozpuszczalnik, żywica) i zawierają szereg substancji dodatkowych decydujących o właściwościach materiału pisarskiego. W tabeli 1 zebrano najważniejsze składniki, które wchodzą w skład materiałów kryjących.

Oprócz powyższych substancji w materiałach kryją-cych występuje wiele innych komponentów, które do-bierane są zazwyczaj w taki sposób, aby zapewnić mu odpowiednie właściwości wymagane ze względu na rodzaj narzędzia, w którym będzie wykorzystywany. LaPorte i Stephens (2013) podkreślają, iż znaczenie tych substancji, pomimo ich zazwyczaj niewielkiej zawarto-ści, nie powinno być lekceważone, ponieważ to właśnie ich kombinacja może pozwolić na rozróżnienie dwóch próbek o zbliżonym składzie.

3. metody stosowane podczas analizy identyfikacyjnej i porównawczej

3.1. Badania wstępne

Przed przystąpieniem do analizy chemicznej mate-riałów kryjących przeprowadza się szereg badań wstęp-nych. Są to metody o nieniszczącym charakterze, które nie wymagają usunięcia fragmentu zapisu z podłoża, nie ingerują więc w materiał dowodowy. Można je wykonać stosunkowo szybko, bez angażowania często kosztow-nych i skomplikowanych metod analizy instrumentalnej, a interpretacja otrzymanych wyników nie stwarza więk-szych problemów. Badania wstępne zazwyczaj obejmują:

1. badania wizualne, w tym z wykorzystaniem mi-kroskopu (właściwości fizyczne zapisu) mające na celu określenie rodzaju materiału kryjącego, wstępną ocenę jego koloru oraz ujawnienie znaków szczególnych zapi-su w postaci uszkodzeń (Brunelle, Crawford, 2003);

2. badania wykorzystujące różne źródła światła, w tym IRR oraz IRL oraz obserwację zapisów poddanych działaniu promieniowania UV w zakresie krótko- i dłu-gofalowym oraz VIS (właściwości optyczne; Brunelle, Crawford, 2003; Houlgrave, LaPorte, Stephens, 2011; LaPorte, Stephens, 2013; Wilson, LaPorte, Cantú, 2004).

Badania wstępne często pozwalają stwierdzić, że porównywane zapisy zostały wykonane przy zastoso-waniu różnych materiałów kryjących. Jeżeli jednak ana-lizowane zapisy są nierozróżnialne za pomocą metod optycznych, wcale nie musi to oznaczać, że zostały one wykonane tymi samymi materiałami. W takim wypadku zawsze staje się konieczne przeprowadzenie analiz che-micznych, ponieważ bardzo powszechnym zjawiskiem jest wykazywanie tych samych właściwości fizycznych i optycznych przez materiały pisarskie o różnym składzie (LaPorte, Stephens, 2013). Otrzymane dane dotyczące właściwości fizycznych i optycznych badanego zapisu



w połączeniu z informacjami uzyskanymi po przeprowa-dzeniu analizy chemicznej pozwalają więc na utworzenie bardziej kompletnej charakterystyki materiału pisarskie-go.

3.2. Metody chromatograficzne

Zastosowanie niszczących technik analitycznych wy-maga najczęściej usunięcia fragmentu zapisu z podłoża, a następnie ekstrakcji materiału pisarskiego odpowiedni-mi rozpuszczalnikami. Brunelle i Crawford (2003) wy-mieniają podstawowe kryteria, którymi powinien kiero-wać się badacz pobierający próbkę zapisu. Pobór próbki powienien:1. w jak najmniejszym stopniu naruszać materiał dowo-

dowy;2. zapewnić możliwie maksymalne stężenie materiału

kryjącego przy stałej wielkości pobieranego fragmen-tu dokumentu;

3. być wolnym od zanieczyszczeń (w szczególności spo-wodowanych obecnością materiału kryjącego z dru-giej strony dokumentu).Ów pobór coraz częściej sprowadza się do wykorzy-

stania specjalnych dziurkaczy lub strzykawek ze stalo-wymi igłami o niewielkich średnicach, umożliwiającymi pobieranie próbek w postaci krążków o tych samych wy-miarach.

Rodzaj użytego materiału zazwyczaj narzucać będzie wybór rozpuszczalnika stosowanego do ekstrakcji. Na-leży jednak pamiętać, że w wypadku przeprowadzania analiz porównawczych, niezwykle istotne jest przepro-wadzanie ekstrakcji w tych samych warunkach. Wyko-rzystywane rozpuszczalniki i ich objętości, czas ekstrak-cji, temperatura, a nawet intensywność mieszania próbki powinny pozostawać niezmienne (Brunelle, Crawford, 2003).

Pasty długopisowe oraz inne materiały pisarskie ba-zujące na rozpuszczalnikach organicznych są najczęściej ekstrahowane w temperaturze pokojowej z wykorzysta-niem: pirydyny (Brunelle, Crawford, 2003; Causin i in., 2008; LaPorte, Stephens, 2013; Wilson, LaPorte, Cantú, 2004), metanolu, acetonitrylu (LaPorte, Stephens, 2013) lub absolutnego etanolu (Causin i in., 2008). Neumann i Margot (2010) zwracają natomiast uwagę, iż ekstrak-cja za pomocą mieszaniny C2H5OH/H2O 1:1 (v/v) prze-prowadzona w temperaturze 100°C nie wpływa na skład materiału pisarskiego i co istotniejsze, wymaga znacznie krótszego czasu niż przeprowadzana w temperaturze po-kojowej.

W celu ekstrakcji materiałów kryjących, których skład bazuje na rozpuszczalnikach wodnych, najczęściej wykorzystuje się mieszaninę etanolu i wody w stosunku objętościowym 1:1 (Brunelle, Crawford, 2003; LaPorte, Stephens, 2013; Wilson, LaPorte, Cantú, 2004). W przy-padku, gdy zapis pozostaje odporny na działanie wodnej

mieszaniny rozpuszczalników, zastosowanie znajduje pirydyna lub DMSO (Brunelle i Crawford, 2003). Now-sze źródła (LaPorte, Stephens, 2013) proponują użycie mieszaniny THF/H2O 4:1 (v/v) jako skutecznego ekstra-henta zarówno dla past długopisowych, jak i materiałów kryjących w płynnej formie.

Ważnym elementem jest również ekstrakcja tak zwa-nej ślepej próby, czyli w tym wypadku czystego frag-mentu podłoża (bez naniesionego materiału pisarskiego) w celu określenia efektów matrycowych. Papier może bowiem zawierać różnego rodzaju dodatki, między in-nymi fluorescencyjne rozjaśniacze optyczne (Ciepliński, Świętonowska, 2008), które mogą prowadzić do błędnej interpretacji wyników, w szczególności, gdy jako metodę detekcji stosuje się techniki optyczne.

3.2.1. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HPTLC)

Począwszy od 1950 roku, kiedy to odnotowano wzrost produkcji materiałów pisarskich bazujących na barwnikach organicznych, do analizy dokumentów za-częto wykorzystywać techniki chromatograficzne, wśród których w owym czasie prym wiodła chromatografia bibułowa. Badacze szybko jednak zdali sobie sprawę z niewystarczającej rozdzielczości powyższej metody i wraz z rozwojem technik separacyjnych cienkie war-stwy żelu krzemionkowego, celulozy oraz innych mate-riałów, stopniowo zastępowały bibułę wykorzystywaną jako fazę stacjonarną. Obecnie, HPTLC jest wciąż jedną z najczęściej stosowanych metod w analizach porów-nawczych i identyfikacyjnych materiałów pisarskich.

Analiza past długopisowych z wykorzystaniem TLC przeprowadzana była przez wielu naukowców. W 1972 roku Brunelle zaproponował dwie mieszaniny rozpuszczalników: octan etylu/etanol/woda 70:35:30 (v/v) oraz 1-butanol/etanol/woda 20:10:15 (v/v), które od tej pory stosowane były jako eluenty. Płytki chroma-tograficzne wykorzystywane w analizie materiałów pi-sarskich są najczęściej pokryte żelem krzemionkowym bez dodatku związków fluorescencyjnych, takich jak siarczek cyn ku(II), których obecność mogłaby maskować ewentualne właściwości fluorescencyjne niektórych składników materiałów kryjących. Warunki rozdzielania materiałów kryjących za pomocą TLC, zaproponowane przez różne grupy badawcze, zostały zebrane w tabeli 2.

Pośród wielu udoskonaleń zaproponowanych w celu polepszenia rozdzielania chromatograficznego, najwięk-sze znaczenie miało wprowadzenie wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC), a więc pły-tek o warstwie adsorpcyjnej o grubości 200 µm i mniej-szej średnicy ziaren niż w przypadku konwencjonalnych płytek. Skutkuje to bardziej równomiernym rozmiesz-czeniem warstwy adsorbentu na płytce i większą ilością centrów aktywnych, przez co możliwe jest rozdzielenie



związków o zbliżonym charakterze (Tebbett, 1991). Po-nadto bardziej jednolita powierzchnia płytki poprawia jej właściwości optyczne, dzięki czemu analiza densytome-tryczna daje lepsze wyniki (Brunelle, Crawford, 2003).

Jednym z ciekawszych rozwiązań zaproponowanych stosunkowo niedawno, bo w 2009 roku przez Neuman-na i Margot (2009a, 2009b, 2009c), było wprowadzenie procesu kalibracji otrzymanych profili chemicznych pró-bek materiałów pisarskich w celu zapewnienia możliwo-ści ich porównywania z wynikami otrzymanymi w przy-szłości dla innych próbek. Proces kalibracji polegał na powiązaniu pomiarów otrzymanych dla analizowanych past długopisowych z wynikami uzyskanymi dla tak zwanych dye ladder standards, czyli roztworami trzech czystych barwników: Acid Red 18 (CI 16255)/Basic Blue 26 (CI 44045)/Solvent Orange (CI 11270:1) w metanolu. Poszczególne barwniki, na rozwiniętym już chromato-gramie, wraz z linią startową i czołem fazy ruchomej, stanowiły punkty zaczepienia dla utworzenia nowego układu współrzędnych będącego swego rodzaju „siatką kalibracyjną”. Owa siatka była następnie wykorzystana do korekty odległości przebytych przez poszczególne substancje poprzez dwuwymiarową interpolację między tradycyjnym układem metrycznym a nowym układem współrzędnych.

Ponieważ specjaliści w dziedzinie badań dokumen-tów są bardziej zainteresowani porównywaniem roz-winiętych płytek chromatograficznych aniżeli identy-fikowaniem poszczególnych pasm, Neumann i Margot (2009a) zaproponowali również nowy sposób wizuali-zacji chromatogramu, ułatwiający porównywanie wyni-ków. Polegał on na cyfrowej rejestracji widma absorpcyj-nego przy 31 różnych długościach fali promieniowania w zakresie od 200 do 700 nm na całej drodze elucji (co 50 µm), w wyniku czego każda próbka przedstawiona była na wykresie uwzględniającym odległości przebyte przez dane substancje (mm), długości fali promieniowa-nia (nm) oraz intensywności absorpcji (au).

Skomputeryzowany system przechowywania tak otrzymanych profili chemicznych umożliwi porównywa-nie próbek, których analiza nie została przeprowadzona równolegle, to znaczy na jednej płytce chromatogra-ficznej. Zmiany zaproponowane przez tychże badaczy pozwoliłyby na minimalizację błędów wynikających z analizy próbek na różnych płytkach. Jak bowiem do-wiedziono, to nie różne eluenty czy osoby przeprowa-dzające analizę, a stosowanie różnych płytek chroma-tograficznych jest głównym czynnikiem powodującym powstawanie błędów podczas analizy porównawczej (Neumann i in., 2011).

Uwaga badaczy nie skupiała się jedynie na pastach długopisowych. Analizując w 1996 roku tusze długopi-sów żelowych na potrzeby wymiaru sprawiedliwości, Gernandt i Urlaub (1996) stwierdzili, że ich skład opie-rający się głównie na pigmentach, wyklucza stosowanie

do ich rozdzielenia techniki HPTLC. Obecnie jednak co-raz częściej można spotkać tusze żelowe, które bazują na barwnikach. Zmiany te zachęciły Wilsona i współpra-cowników (Wilson, LaPorte, Cantú, 2004) do podjęcia próby rozdzielenia składników tego rodzaju materiałów techniką HPTLC. W tym celu zastosowano spotykaną najczęściej w analizie materiałów kryjących fazę rucho-mą: octan etylu/etanol/woda 75:35:30 (v/v). Analizie poddano 29 próbek, spośród których aż 20 nie uległo rozdzieleniu, a więc bazowało na pigmentach.

HPTLC wykorzystano również do analiz zapisów wykonanych za pomocą elektrycznych maszyn do pi-sania (Varshney, Jettappa, Mehrotra, Baggi, 1995), dru-karek atramentowych (Pagano, Surrency, Cantu, 2000; Poon, Ho, Li, 2005) czy tuszy pieczątkowych (Raza, Saha, 2013). We wszystkich przypadkach technika ta umożliwiła jedynie podział materiałów pisarskich na grupy w oparciu o występujące w nich barwniki, nie dała natomiast stuprocentowego rozróżnienia produktów po-chodzących z różnych źródeł. W tabeli 2 zamieszczono szczegóły dotyczące warunków rozdzielania chromato-graficznego.

Dzięki obecności barwników w materiałach pisar-skich wynik rozdzielania chromatograficznego jest za-zwyczaj widoczny gołym okiem, jednak wiele materia-łów daje podobne chromatogramy pomimo odmiennego składu. Jest więc jasne, że koniecznym etapem staje się zastosowanie odpowiednich metod w celu wizualizacji składników nieabsorbujących światło z zakresu widzial-nego. Pomimo że większość specjalistów stosuje w tym celu promieniowanie UV czy densytometrię (głównie do analizy ilościowej), coraz częściej sięga się po alterna-tywne metody detekcyjne.

W ostatnich latach szczególną uwagę poświęcono luminescencji i możliwości obserwowania jedynie pro-mieniowania emitowanego przez dany składnik dzięki zastosowaniu odpowiednich filtrów wycinających pro-mieniowanie padające. ALS, umożliwiające naświetla-nie płytki chromatograficznej promieniowaniem o róż-nych długościach fali, zostało wykorzystane przez Houl-grave’a i współpracowników (Houlgrave, LaPorte, Ste-phens, 2011) do obserwacji pasm chromatograficznych otrzymanych w wyniku analizy past długopisowych w celu otrzymania ich dokładniejszej charakterystyki. Warto więc skupić się również na innych metodach do-starczających nowych możliwości identyfikacyjnych, wykorzystując do obserwacji rozwiniętego już chroma-togramu spektroskopię fluorescencyjną czy ramanowską (Cañamares, Reagan, Lombardi, Leona, 2014; Kocsis i in., 1999). Sprzężenie HPTLC ze spektrometrią mas jest także interesującą alternatywą (Van Berkel, Ford, Deibel, 2005; Van Berkel, Sanchez, Quirke, 2002) ze względu na dobre możliwości separacyjne HPTLC oraz obiektyw-ną analizę danych na podstawie widm masowych pasm



chromatograficznych poprzez identyfikację lub określe-nie liczby substancji zawartych w tym paśmie.

Jak mogłoby się wydawać, możliwości dyskrymina-cyjne zarówno techniki TLC, jak i HPTLC, nie są cał-kowicie satysfakcjonujące. Co więcej, różnice w warto-ściach Rf dla tych samych związków obecnych w tych samych materiałach pisarskich mogą wynikać z błędów w nanoszeniu próbki na płytkę lub mechanicznych de-fektów fazy stacjonarnej (Houlgrave, LaPorte, Stephens, 2011), jak również zmiennych warunków panujących w laboratorium w trakcie wykonywanej analizy (m.in. temperatury), a mających niezaprzeczalny wpływ na otrzymywany chromatogram. Prowadzić to może do błędnych wniosków podczas analizy porównawczej. Niemniej jednak ze względu na niskie koszty eksplo-atacyjne oraz niewielkie wymagania dotyczące aparatu-ry, wciąż są to metody, po które specjaliści z dziedziny analizy dokumentów sięgają najczęściej. Technikom tym brakuje jednak czułości i rozdzielczości, charaktery-stycznych dla bardziej zaawansowanych metod separa-cyjnych, dlatego też TLC powinna być stosowana jako swego rodzaju badanie przesiewowe, przeprowadzane przed przystąpieniem do bardziej zaawansowanej anali-zy (Tebbett, 1991).

3.2.2. Wysokosprawna chromatografia cieczowa (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)

Jedną z metod zapewniającą lepsze rozdzielenie i identyfikację składników materiałów pisarskich jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). Sku-teczna w analizie związków nietrwałych termicznie, a także substancji nielotnych, zapewnia niższe granice wykrywalności oraz lepsze rozdzielenie substancji obec-nych w materiach pisarskich aniżeli omawiane wcześniej techniki separacyjne. W przeciwieństwie do chroma-tografii cienkowarstwowej, HPLC umożliwia wykry-wanie bezbarwnych związków, a także ich ilościowe oznaczanie bez konieczności stosowania dodatkowych procesów wizualizacji (Zlotnick, Smith, 1999). Pomimo tych ewidentnych zalet, technika ta jest jednak często pomijana podczas przeprowadzania rutynowych analiz, ponieważ wymaga wykorzystania większej ilości próbki niż w przypadku TLC, a jej przygotowanie i sam proces analizy bywa bardziej skomplikowany.

Lyter (1982), jako jeden z pierwszych badaczy, za-proponował zastosowanie HPLC do analizy past długo-pisowych. Wykorzystując kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym oraz fazę ruchomą złożoną z dichlo-roetanu/etanolu/formamidu w stosunku 89:10:1 (v/v), a więc stosując normalny układ faz, skutecznie rozróżnił badane pasty długopisowe. Jednak to układ faz odwró-conych odgrywa główną rolę w analizie chromatogra-ficznej past długopisowych. Pionierem tego typu analiz ponownie okazał się Lyter (1982), który w 1982 roku

dokonał skutecznego rozróżnienia dziesięciu past długo-pisowych po nieudanej próbie ich klasyfikacji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Eluent monitorowa-ny był za pomocą detektora UV/VIS z wykorzystaniem promieniowania o długości fali 254 nm oraz 546 nm. Zastosowanie dwóch długości fal promieniowania elek-tromagnetycznego miało umożliwić wykrycie zarówno barwników absorbujących w zakresie światła widzialne-go (546 nm), jak i żywic (254 nm).

Jednoczesna rejestracja chromatogramów dla kilku dowolnie wybranych długości fali promieniowania elek-tromagnetycznego dawała jednak znacznie lepsze rezul-taty w analizach porównawczych materiałów kryjących. W 1991 roku Tebbett (1991), a także nieco później Kher i współpracownicy (Kher, Mulholland, Green, Reedy, 2006) zmodyfikowali metodę Lytera, wykorzystując w swoich badaniach detektor z matrycą diodową (Dio-de Array Detector, DAD). Jego zastosowanie dostarcza znacznie więcej informacji dotyczących składu analizo-wanego materiału aniżeli w przypadku detektora wyko-rzystującego jedną długość fali. Nie ma więc potrzeby przeprowadzania kilku analiz, które wymagałyby użycia większej liczby próbek, a więc dodatkowego niszczenia materiału dowodowego.

Tebbett (1991) zaproponował również innowacyjne wówczas podejście jeśli chodzi o pobór próbki materiału kryjącego, ponieważ zastosował SFE − rolę ekstrahenta pełnił CO2. Gęstość płynu sprawiła, że substancje roz-puszczały się w nim jak w cieczy, natomiast jego współ-czynnik dyfuzji (zbliżony do wartości odpowiadającej gazom) pozwalał na szybsze przenoszenie masy, przez co proces ekstrakcji przebiegał bardzo efektywnie.

Tusze wykorzystywane w długopisach żelowych różnią się od omawianych powyżej past długopisowych, przez co wymagają innej metody analitycznej. Rozpusz-czalne w wodzie tusze żelowe bazują na barwnikach o budowie jonowej, nie są więc adsorbowane na kolum-nach typu C18 czy C8, które wykorzystują krzemionkę modyfikowaną niepolarnymi łańcuchami węglowodoro-wymi. Dlatego też ważną rolę w analizie tuszy żelowych odgrywa IP-HPLC. Kluczowym elementem IP-HPLC jest dobór odpowiedniego odczynnika do tworzenia par jonowych, który poprzez wiązanie się z polarnymi ana-litami umożliwia ich zatrzymywanie na kolumnach typu RP.

W 2006 roku Liu i in. (2006) poddali analizie 93 tusze żelowe, z których na podstawie testów rozpuszczalności wyodrębniono grupę bazującą na barwnikach, poddaną następnie analizie IP-HPLC w celu ich dalszej klasyfi-kacji. Badacze analizowali wiele odczynników do two-rzenia par jonowych, spośród których najodpowiedniej-szym − umożliwiającym całkowite rozdzielanie barw-ników i zapewniającym krótkie czasy retencji − okazał się TBABr. Ostatecznie więc faza ruchoma składała się z 40 mmol/l roztworu TBABr (pH = 7) oraz acetonitrylu



pełniącego rolę modyfikatora organicznego w stosunku objętościowym 40:60. Umożliwiło to podział 50 tuszy żelowych na cztery grupy według kryterium klasyfika-cyjnego, którym była obecność pików o danych czasach retencji, odpowiadających poszczególnym barwnikom.

Chromatografia par jonowych stanowi również od-powiednie narzędzie do analizy atramentów, ponieważ bazują one na barwnikach zawierających polarne grupy sulfonowe, karboksylowe czy fenolowe. Grupa Wanga (Wang, Yu, Xie, Yao, Han, 2008), wykorzystując TBABr jako odczynnik do tworzenia par jonowych, dokonała pełnego rozróżnienia 18 atramentów (12 czarnych oraz 6 czerwonych), przyjmując za kryterium klasyfikacyjne ilość pików pochodzących zarówno od głównych barw-ników, jak i występujących w mniejszych ilościach oraz porównując ich względne intensywności.

W 2009 roku chromatografia par jonowych została wykorzystana przez Yao i współpracowników (2009) do analizy czerwonych tuszy pieczątkowych. Grupę 69 pró-bek poddano rozdzieleniu chromatograficznemu na ko-lumnie Luna C18 (250 mm × 4.60 mm, 5 µm) za pomocą fazy mobilnej 20 mmol/l TBABr (pH 7)/acetonitryl prze-prowadzonemu w trybie gradientowym, przechodząc w czasie 12 minut z warunków 45:55 (v/v) do 5:95 (v/v). Na podstawie pików obserwowanych przy długości fali promieniowania elektromagnetycznego wynoszącej 500 nm, a więc pochodzących od substancji barwiących, dokonano klasyfikacji tuszy na 3 grupy. Przeprowadzając w tych samych warunkach chromatograficznych analizę roztworów standardowych i porównując ich czasy reten-cji z wynikami otrzymanymi dla analizowanych tuszy pieczątkowych, zidentyfikowano substancje barwiące, które najczęściej występowały w czerwonych tuszach pieczątkowych. W celu dalszej klasyfikacji na podstawie zawartości substancji dodatkowych, eluent monitoro-wano z wykorzystaniem promieniowania UV (254 m). Ostatecznie okazało się, że podział analizowanych ma-teriałów kryjących ze względu na występujące w nich barwniki i substancje dodatkowe może w znacznym stopniu pomóc w ich klasyfikacji, jednak nie pozwala na stuprocentowe rozróżnienie tuszy pieczątkowych pocho-dzących z różnych źródeł.

3.2.3. Chromatografia gazowa (Gas Chromatography, GC)

Istniejące metody analityczne pozwalające na roz-różnienie materiałów kryjących na podstawie zawartych w nich substancji barwiących nie zawsze dają zadowa-lające rezultaty. Bardzo często bowiem zdarza się, że w różnych materiałach występują te same barwniki czy pigmenty, a więc analiza bazująca jedynie na porówny-waniu tych związków nie pozwala na ich skuteczne roz-różnienie. W takim wypadku rozwiązanie stanowić może analiza składników bezbarwnych, a więc rozpuszczalni-

ków lub substancji dodatkowych, za pomocą chromato-grafii gazowej.

W 2004 roku Wilson i współpracownicy (Wilson, LaPorte, Cantú, 2004) postanowili zastosować tech-nikę GC/MS, aby wzbogacić informacje zdobyte na drodze badań optycznych i chromatografii cienkowar-stwowej, dotyczących składu tuszy żelowych. W tym celu wykorzystano kolumnę kapilarną pokrytą fazą sta-cjonarną HP-5, a rozdzieleniu poddano zarówno świeże zapisy (jednogodzinne), jak i takie, które sporządzono przed tygodniem oraz miesiącem. Podczas analizy otrzy-manych chromatogramów pierwszym kryterium klasyfi-kacyjnym, które brano pod uwagę, była obecność piku pochodzącego od gliceryny (czas retencji wynosił około 6 min). Dziesięć spośród piętnastu analizowanych tuszy żelowych zawierało w swoim składzie ten rozpuszczal-nik, którego zawartość była wykrywalna do sześciu mie-sięcy od sporządzenia zapisu. Dalsza klasyfikacja opie-rała się na pikach pochodzących od innych substancji, takich jak glikol tri- i pentaetylenowy oraz trietanolo-aminy. Technika chromatografii gazowej została również wykorzystana przez Wilsona do analizy porównawczej tuszy długopisów żelowych i piór kulkowych. Wykaza-no, że obecność glikolu hepta-, heksa- oraz pentaetyleno-wgo jest charakterystyczna dla długopisów żelowych, co może stanowić podstawę do ich identyfikacji.

Spektrometr mas, ze względu na istniejące biblioteki widm masowych i możliwość identyfikacji związków, jest jednym z częściej stosowanych detektorów w chromato-grafii gazowej. Ponieważ, jak wcześniej wspominano, identyfikacja wszystkich związków obecnych w materia-łach kryjących nie jest priorytetem w analizach przepro-wadzanych na potrzeby ekspertyz kryminalistycznych, badacze nie opierają się wyłącznie na technice GC/MS, ale korzystają również z innych detektorów. I tak, Li (Li, Xie, Guo, Fe, 2014) przeprowadził klasyfikację trzydzie-stu tuszy długopisów żelowych, wykorzystując detektor FID. Lotne składniki poddano rozdzieleniu na kolumnie kapilarnej pokrytej fazą stacjonarną typu DB-FFAP.

Jednym z najważniejszych problemów spotykanych podczas analizy materiałów kryjących jest bardzo mała ilość materiału przeznaczonego do badań. Fragment pa-pieru o średnicy 1 mm zawiera zazwyczaj nie więcej niż 100 ng materiału pisarskiego, natomiast matryca stano-wi około 98% pobranego materiału. Klasyczny sposób przygotowania próbki do analizy GC/MS, polegający na ekstrakcji zapisu z podłoża, wiąże się z dodatkowym roz-cieńczeniem próbki i dużym ryzykiem jej zanieczyszcze-nia. W 2008 roku Bügler, Buchner i Dallmayer (2008) za-proponowali metodę, która umożliwiła przeprowadzenie analizy bez konieczności wcześniejszego przygotowania próbki, minimalizując tym samym ryzyko jej kontamina-cji. Desorpcja termiczna w połączeniu z chromatografem gazowym (TD-GC/MS), bo o niej mowa, pozwala na za-tężenie próbki, co przyczynia się do obniżenia granicy



wykrywalności (ang. limit of detection, LOD) metody i niewątpliwie skraca czas analizy. Wybór optymalnej temperatury (200°C) z jednej strony umożliwił desorp-cję rozpuszczalników, dodatków oraz fragmentów ży-wic (monomerów i polimerów), z drugiej natomiast nie doprowadził do rozkładu papieru. Całkowita eliminacja efektów matrycowych nie jest jednak możliwa, dlatego konieczna była analiza tak zwanej ślepej próby podło-ża. Uwolnione w ten sposób lotne związki rozdzielano następnie na kolumnie HP-5MS, a otrzymane chromato-gramy wraz z widmami masowymi pozwoliły na klasyfi-kację past długopisowych, nierozróżnialnych metodami skupiającymi się na analizie substancji barwiących.

Bardzo ważnym aspektem analizy materiałów kryją-cych techniką chromatografii gazowej, o którym nie za-wsze wspomina się w literaturze, jest polarny charakter analitów, w szczególności rozpuszczalników, takich jak 2-fenoksyetanol. Związki o takim charakterze wykazu-ją tzw. ogonowanie, które wynika z ich silnej adsorpcji na centrach aktywnych (Wilson, LaPorte, Cantú, 2004). Wskazane jest więc kontrolowanie linii transferowej oraz stosowanie dezaktywowanych wkładek szklanych (linera) w celu uzyskiwania ostrych pików o symetrycz-nym kształcie.

Należy również zdawać sobie sprawę, że świeże i sta-re zapisy znacznie różnią się pod względem zawartości lotnych związków organicznych. Stanowi to główną przeszkodę w stosowaniu techniki GC podczas analiz porównawczych, czy identyfikacyjnych. Związki obec-ne w niedawno naniesionych materiałach kryjących, szczególnie te o niskich temperaturach wrzenia (glikol propylenowy) lub łatwo ulegające utlenieniu (alkohol benzylowy), zazwyczaj nie będą wykrywalne w star-szych zapisach. Analiza materiałów kryjących z wyko-rzystaniem chromatografii gazowej wymaga więc szcze-gólnej ostrożności i z całą pewnością nie może stanowić głównego źródła informacji podczas przeprowadzania analiz porównawczych zapisów o nieznanym czasie spo-rządzenia.

3.3. Metody spektroskopowe

Techniki separacyjne, z chromatografią cienkowar-stwową na czele, wciąż stanowią najczęściej stosowane narzędzie do analizy materiałów kryjących, co najpew-niej wynika z prostego przebiegu analizy i niewielkich wymagań co do aparatury. Zdarza się jednak, że aby osiągnąć pożądane rezultaty, należy zastosować dodat-kowe kryterium porównawcze, które zostanie uzyska-ne dzięki innym technikom instrumentalnym. W ciągu ostatnich dziesięciu lat uwaga badaczy specjalizujących się w analizie dokumentów skierowana była głównie ku technikom spektroskopowym. Największy wzrost zain-teresowania odnotowała spektrometria mas (dotyczyła jej blisko połowa artykułów opublikowanych w latach

2000−2014), podczas gdy pozostałe publikacje odnosiły się do spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fo-uriera (FTIR), spektroskopii Ramana czy UV-VIS (Cal-cerrada, García-Ruiz, 2015). W tabeli 3 zebrano przy-kłady metod spektroskopowych stosowanych w analizie materiałów kryjących.

Spektroskopia UV/VIS, wykorzystywana najczęściej w badaniach past długopisowych (Adam, Sherratt, Zho-lobenko, 2008; Brunelle, Crawford, 2003; Causin i in., 2008; Senior, Hamed, Masoud, Shehata, 2012) jest sto-sunkowo prostą techniką pozwalającą na porównywanie próbek na podstawie zawartych w nich barwników, bez ich jednoznacznej identyfikacji. Jest to metoda o niszczą-cym charakterze, ponieważ zazwyczaj wymaga ekstrakcji materiałów kryjących odpowiednim rozpuszczalnikiem. Dlatego też coraz częściej zastępowana jest ona techni-kami nieinwazyjnymi, czego przykładem jest rejestrowa-nie obrazów spektralnych. Metoda ta polega na skanowa-niu powierzchni zapisu, najczęściej w zakresie VIS/NIR (400−1000 nm), w wyniku czego wyznaczane są widma absorbancji lub reflektancji (Nic Daeid, 2014; Payne i in., 2005; Reed, Savage, Edwards). Dzięki zastosowaniu od-powiednich algorytmów (na przykład PCA) możliwe jest utworzenie dwuwymiarowych obrazów pozwalających wykryć subtelne różnice między właściwościami spek-tralnymi poszczególnych materiałów kryjących.

Dokładne i obiektywne porównywanie koloru ana-lizowanych próbek możliwe jest dzięki mikrospektro-fotometrii w zakresie światła widzialnego, wykorzy-stującej detektor z matrycą diodową (Martyna, Zadora, Stanimirova, Ramos, 2013; Roux, Novotny, Evans, Len-nard, 1999). MSP-DAD stanowi połączenie mikroskopii optycznej z pomiarami fotometrycznymi. Umożliwia ona porównywanie kolorów nawet bardzo niewielkich próbek, takich jak fragment zapisu na analizowanym dokumencie, niezależnie od sposobu postrzegania barw przez badacza. W 1999 roku Roux i współpracownicy porównywali pasty długopisowe, zestawiając otrzyma-ne widma, a następnie lokalizując na nich odpowiednie pasma. Wizualne porównywanie ogólnego kształtu widm nie prowadziło jednak do zadowalających rezultatów. Zastosowanie odpowiedniego oprogramowania kompu-terowego umożliwiłoby natomiast precyzyjny pomiar koloru dzięki przypisaniu mu konkretnej wartości liczbo-wej, umieszczając go w odpowiedniej przestrzeni barw. Podejście to wykorzystano w 2013 roku przez A. Marty-nę i in. Badacze, korzystając z trzech przestrzeni barw: CIE XYZ, CIE xyz, CIE Lab, porównywali 40 materiałów kryjących (36 past długopisowych oraz 4 tusze żelowe) analizowanych techniką mikrospektrofotometrii w za-kresie światła widzialnego (380−800 nm), a do interpre-tacji danych zastosowali modele statystyczne oparte na teorii LR testowania hipotez (Zadora, Martyna, Ramos, Aitken, 2014). Opis widm za pomocą znormalizowanych współrzędnych z pewnością usprawnił analizę porów-



nawczą, a także mógłby stanowić podstawę do utworze-nia baz danych. Technika ta nie charakteryzuje się jednak tak dużymi możliwościami dyskryminacyjnymi, jak TLC lub HPLC, głównie z tego powodu, iż analizie poddawa-na jest cała mieszanina, jaką stanowi materiał kryjący, bez uprzedniego rozdzielenia na poszczególne składniki.

Podczas gdy spektroskopia w zakresie światła wi-dzialnego pozwala na ocenę koloru próbki, spektroskopia w podczerwieni jest źródłem informacji na temat cech strukturalnych związków obecnych w materiałach kryją-cych. Umożliwia więc rozróżnianie materiałów również na podstawie zawartych w nich substancji bezbarwnych, między innymi żywic czy dodatków organicznych.

Spektroskopia IR była wykorzystywana do anali-zy różnego rodzaju materiałów pisarskich, począwszy od zwykłych past długopisowych po tusze żelowe, pie-czątkowe czy tonery drukarek laserowych (Brunelle, Crawford, 2003; Causin i in., 2008; Chen, Meng, Cheng, 2002; Dirwono i in., 2010; Egan, Morgan, Bartick, Mer-rill, Taylor, 2003; Kher, Mulholland, Green, Reedy, 2006; Merrill, Bartick, Taylor, 2003; Senior, Hamed, Masoud, Shehata, 2012; Udristioiu, Bunaciu, Aboul-Enein, Tana-se, 2009; Wang, Yu, Zhang, Zhou, Xie, 2012; Wilkin-son, Perry, Martin, McKinne, Cantu, 2002; Zięba-Palus, Kunicki, 2006). Przygotowanie próbki jest stosunkowo proste i zazwyczaj nie wymaga zniszczenia materiału do-wodowego (µ-ATR-IR), choć zależy to od wariantu za-stosowanej metody (Brunelle, Crawford, 2003). Niestety w porównaniu z innymi technikami, IR wymaga użycia większej ilości próbki, a otrzymywane widma są znacz-nie bardziej skomplikowane z powodu obecności w ma-teriałach kryjących dużej liczby związków absorbujących promieniowanie z zakresu podczerwieni. Po raz kolejny więc, analiza nie polega na identyfikacji poszczególnych związków, lecz na porównywaniu otrzymanych widm absorpcyjnych (Calcerrada, García-Ruiz, 2015), co coraz częściej jest dokonywane z wykorzystaniem odpowied-nich metod chemometrycznych (Egan, Morgan, Bartick, Merrill, Taylor, 2003; Kher, Mulholland, Green, Reedy, 2006; Udristioiu, Bunaciu, Aboul-Enein, Tanase, 2009). Analizę za pomocą spektroskopii IR dodatkowo kom-plikuje ogromny wpływ papieru, którego składniki dają zazwyczaj intensywne pasma absorpcyjne, co nie zawsze jest skutecznie niwelowane poprzez odejmowanie widm ślepej próby (Brunelle, Crawford, 2003). W przypadku, gdy otrzymane tą drogą rezultaty nie są jednoznaczne, konieczne jest zastosowanie innej techniki pozwalającej na uzyskanie dodatkowych informacji, na podstawie któ-rych możliwe będzie rozróżnienie materiałów kryjących.

Rolę takiej komplementarnej metody pełni spektro-skopia Ramana, która znajduje zastosowanie w analizie tuszy długopisów żelowych i piór kulkowych (Bell, Ste-wart, Ho, Craythorne, Speers, 2013; Braz, López-López, García-Ruiz, 2013; Claybourn, Ansell, 2000; Geiman, Leona, Lombardi, 2009; Mazzella, Buzzini, 2005) oraz

past długopisowych (Anderman, 2001; Claybourn, An-sell, 2000; Souza Lins Borba, Saldanha Honorato, Juan, 2015; Zięba-Palus, Kunicki, 2006). Co prawda liczba pasm obserwowanych na widmach ramanowskich jest znacznie mniejsza niż w przypadku widm IR, nie zmie-nia to jednak faktu, że wizualizacja danych znacznie ułatwia ich interpretację (Braz, López-López, Montalvo, García-Ruiz, 2014; Brunel, Crawford, 2003), a zastąpie-nie powszechnie stosowanego PCA przez techniki mo-delowania indywidualnych grup (np. SIMCA) mogło-by dodatkowo usprawnić analizę (Braz, López-López, Montalvo, García-Ruiz, 2014). Co więcej, podłoże nie odgrywa w tym wypadku tak znaczącej roli (Bell, Stew-art, Ho, Craythorne, James, 2013; Braz López-López, García-Ruiz 2013; Braz, López-López, Montalvo, Gar-cía-Ruiz, 2014), przez co wyniki analizy są łatwiejsze w interpretacji. Z drugiej strony, spektroskopia w pod-czerwieni charakteryzuje się większą czułością, a sygnał nie jest zakłócany przez fluorescencję próbki, która czę-sto maskuje mało intensywne pasma ramanowskie (Bru-nelle, Crawford, 2003). Jednak i w tym wypadku badacze zaproponowali alternatywne rozwiązanie − remedium na problem fluorescencji było zastosowanie powierzch-niowo wzmocnionej spektroskopii Ramana (Braz, Ló - pez-López, Montalvo, García-Ruiz, 2014; Geiman, Le-ona, Lombardi, 2009). Co prawda, jest to metoda qu-asi-destrukcyjna, ponieważ wiąże się z naniesieniem na powierzchnię zapisu warstwy koloidu, jednak tam, gdzie zawodzi konwencjonalna spektroskopia ramanowska, SERS daje zazwyczaj dobre rezultaty.

W związku z tym, iż nauki sądowe dążą do korzysta-nia z nieniszczących (lub prowadzących do uszkodzenia dowodu tylko w niewielkim stopniu) metod o dużych możliwościach dyskryminacyjnych, w celu analizy past długopisowych (Coumbaros, Kirkbride, Klass, Skinner, 2009; Denman, Skinner, Kirkbride, Kempson, 2010; Gal-lidabino, Weyermann, Marquis, 2011; Ifa, Gumaelius, Eberlin, Manickea, Cooks, 2007; Ifa, Wiseman, Song, Cooks, 2007; Jones, Cody, McClelland, 2006; Wey-ermann, Marquis, Mazzella, Spengler 2007; Williams i in., 2009), tuszy piór kulkowych (Williams i in., 2009), długopisów żelowych (Jones, Cody, McClelland, 2006; Williams i in., 2009; Wu, Zhou, Yu, Liu, Xie, 2012) oraz innych narzędzi pisarskich (Jones, Cody, McClelland, 2006; Lee, J., Lee, C., Lee, K., Lee, Y., 2008) stosowano do tej pory różne warianty jonizacji próbki w połącze-niu ze spektrometrią mas. Technika MS stanowi bogate źródło informacji na temat składu badanego materiału kryjącego, umożliwiając wykrycie nie tylko środków barwiących, ale także nośników, żywic czy surfaktantów.

Tak zwana miękka metoda jonizacji, uzyskiwana poprzez rozpylanie w polu elektrycznym (Electrospray Ionization, ESI) wymaga zastosowania próbki w postaci roztworu, co wiąże się z koniecznością ekstrakcji mate-riałów kryjących na przykład metanolem (Williams i in.,



2009). Ze względu na wyjątkową czułość spektrometru mas, wymagana ilość próbki jest jednak znacznie mniej-sza niż w przypadku HPTLC, przez co zniszczenie ma-teriału dowodowego następuje w minimalnym stopniu. Niewielka fragmentacja cząsteczek utrudnia określenie ich struktury, wystarcza jednak do rozróżnienia materia-łów pisarskich na podstawie zawartych w nich barwni-ków, pigmentów czy nośników.

LDI-MS, pozwalająca na analizę materiałów kryją-cych bezpośrednio z powierzchni papieru, również do-starcza niezbędnych informacji do rozróżnienia bada-nych zapisów (Gallidabino, Weyermann, Marquis, 2011; Matthews i in., 2011; Weyermann, Marquis, Mazzella, Spengler, 2007). Do niedawna, technika ta stosowana w trybie jonów dodatnich, umożliwiała wykrycie jedynie zasadowych substancji barwiących (Weyermann, Mar-quis, Mazzella, Spengler, 2007). Jednak w 2010 roku Gallibadino, wykorzystując LDI-MS w trybie jonów dodatnich i ujemnych, doprowadził do identyfikacji barwników kwasowych obok substancji zasadowych, zwiększając tym samym moc dyskryminacyjną metody i prowadząc do pełniejszej charakterystyki składu barw-nikowego.

Warto również wspomnieć o najnowszych sposobach jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym (API) wyko-rzystywanych w spektrometrii mas i adaptowanych na potrzeby analizy dokumentów. Analiza i obrazowanie powierzchni różnych materiałów możliwa jest dzięki za-stosowaniu DESI-MS.

Van Berkel wykorzystał i zautomatyzował DESI-MS w celu wizualizacji związków rozdzielonych za pomocą TLC (Van Berkel, Ford, Deibel, 2005; Van Berkel, San-chez, Quirke, 2002). Technika ta była również stosowana do bezpośredniej analizy zapisów (Ifa, Gumaelius, Eber-lin, Manickea, Cooks, 2007). Trudności pojawiające się przy tym sposobie jonizacji wynikają głównie z doboru rozpuszczalnika, którego rozpylony strumień kierowany na powierzchnię papieru ma za zadanie wyizolować frag-ment zapisu i wprowadzić go do spektrometru. Zastoso-wanie nieodpowiedniego rozpuszczalnika może bowiem powodować rozmywanie się materiałów kryjących na powierzchni dokumentu, prowadząc tym samym do jego częściowego zniszczenia (Morelato, Beavis, Kirkbride, Roux, 2013). Prawidłowy dobór substancji desorbują-cej umożliwia natomiast wielokrotne przeprowadzanie analizy powodujące jedynie niewielkie zniekształcenie zapisu.

DART-MS w mniejszym stopniu narusza materiał dowodowy, gdyż w celu dozowania próbki wykorzystu-je jedynie strumień zjonizowanego gazu (helu lub azotu; Jones, Cody, McClelland, 2006). Otrzymane widma MS są bogatsze aniżeli uzyskane metodą ESI-MS, dzięki cze-mu możliwa jest identyfikacja większej liczby związków.

Niezwykle cennych informacji dostarczyć może rów-nież zastosowanie techniki LA-ICP-TOF-MS pozwala-

jącej na analizę składu pierwiastkowego materiałów pi-sarskich. Grupa polskich badaczy (Szynkowska, Czerski, Paryjczak, Parczewski, 2009) wykorzystała tę metodę do rozróżnienia analizy tonerów stosowanych w drukarkach laserowych. Uwzględnienie stosunków izotopowych pierwiastków oraz zastosowanie metod chemometrycz-nych (PCA, CA) pozwoliło na skuteczne rozróżnienie oraz identyfikację producentów badanych próbek.

Należy jednak podkreślić, iż nawet tak szczegółowa analiza, mogąca potwierdzić tożsamość składu porów-nywanych materiałów kryjących, nie może równać się stwierdzeniu, że ten sam środek pisarski został użyty do sporządzenia obu zapisów. Produkcja większości na-rzędzi pisarskich odbywa się obecnie na masową skalę, a wielu wytwórców zaopatruje się u tych samych dostaw-ców materiałów kryjących. Dlatego też stwierdzenie, czy oba zapisy sporządzone tym samym tuszem w rzeczywi-stości zostały wykonane za pomocą konkretnego narzę-dzia pisarskiego, do tej pory stanowi największe wyzwa-nie dla specjalistów z dziedziny badania dokumentów.

4. metody statystyczne stosowane w interpretacji wyników analiz materiałów kryjących na potrzeby wymiaru sprawiedliwości

Materiał dowodowy w postaci materiałów kryją-cych nie jest równie powszechny, co ślady biologiczne czy odciski palców. Nie zniechęca to jednak badaczy do opracowywania nowych i udoskonalania istniejących już metod analitycznych, pozwalających na coraz to sku-teczniejsze rozróżnianie materiałów pisarskich nawet o bardzo zbliżonym składzie. Udoskonalenia te dotyczą zarówno samego procesu analitycznego, na przykład po-przez wprowadzenie kalibracji wykorzystującej tzw. dye ladder standards (Neumann, Margot, 2009), jak i sposo-bów bardziej obiektywnego porównywania próbek dzięki zastosowaniu odpowiednich algorytmów wykorzystują-cych różne miary podobieństwa − odległość euklidesową (Berger, 2009; Neumann, Margot, 2009a, 2009b, 2009c; Neumann, Ramotowski, Genessay, 2011), korelację Pe-arsona (Neumann, Margot, 2009a, 2009b, 2009c; Neu-mann, Ramotowski, Genessay, 2011; Weyermann i in., 2012; Weyermann, Marquis, Mazzella, Spengler, 2007), sztuczne sieci neuronowe (Neumann, Margot, 2009a, 2009b, 2009c; Neumann, Ramotowski, Genessay, 2011). Wciąż jednak niewiele uwagi poświęca się kluczowemu elementowi analizy prowadzonej na potrzeby wymiaru sprawiedliwości, a mianowicie ocenie wartości dowodo-wej danych fizykochemicznych.

W naukach sądowych dominują dwa rodzaje inter-pretacji wyników ekspertyzy: podejście klasyczne opar-te na testach istotności (na przykład test t-Studenta dla danych jednowymiarowych) oraz metody bazujące na teorii Bayesa (Aitken, 2006). Testy istotności nie umoż-



liwiają jednak uwzględnienia, w jednym podejściu obli-czeniowym, częstości występowania danej cechy w po-pulacji generalnej i zmienności międzyobiektowej. Co więcej, naruszają one zasadę domniemania niewinności (przy formułowaniu hipotezy zerowej) oraz wiążą się z subiektywnym wyborem poziomu istotności. Nic więc dziwnego, że uwaga badaczy coraz częściej skierowana jest ku metodom polegającym na obliczaniu ilorazu wia-rygodności (ang. likelihood ratio, LR), które umożliwiają uwzględnienie powyższych informacji w jednym toku obliczeniowym.

4.1. Iloraz wiarygodności

Oszacowanie ilorazu wiarygodności polega na obli-czeniu ilorazu prawdopodobieństw warunkowych, zgod-nie z poniższym wyrażeniem:

LR =Pr(E│H1 ) ,Pr(E│H2 )

gdzie E − dowód, informacja o materiale dowodowym najczęściej w postaci danych fizykochemicznych uzy-skanych w wyniku badań, natomiast H1 oraz H2 to dwie przeciwstawne hipotezy (przyjmuje się, że H1 odpowiada hipotezie oskarżenia, a H2 hipotezie obrony).

Natomiast w przypadku analizy danych fizykoche-micznych typu ciągłego, prawdopodobieństwo Pr(·) w wyrażeniu na LR jest zastępowane przez funkcję gę-stości prawdopodobieństwa f(·).

Iloraz wiarygodności może przyjmować wartości od zera do nieskończoności i jest interpretowany w następu-jący sposób: gdy wartość LR jest większa od 1, to dowód wspiera hipotezę H1, a gdy jego wartość jest mniejsza od 1, to wspiera hipotezę H2. Dodatkowo im większa (mniejsza) od 1 wartość LR, tym mocniejsza wsparcie dla hipotezy H1 (H2) (Zadora, 2014). Iloraz wiarygodności dostarcza więc nie tylko informacji jakościowych (któ-rą z hipotez wspiera obserwowana wartość), ale również ilościowych, stanowiąc miarę wsparcia danej hipotezy.

W przypadku analizy porównawczej materiałów kryjących, Pr(X = x|H1) oznaczać będzie prawdopodo-bieństwo, że zaobserwowane podobieństwo danych fizy-kochemicznych oznaczone dla próbki dowodowej i po-równawczej powstało w przypadku, gdy pochodzą one z tego samego źródła (tzw. hipoteza prokuratury, H1), a Pr(X = x|H2) prawdopodobieństwo w przypadku, gdy próbki pochodzą z różnych źródeł (tzw. hipoteza obrony, H2). Niezwykle ważne jest odpowiednie zdefiniowanie owego źródła podczas formułowania hipotezy. Jak pod-kreślają Neumann i Margot (2009a), w przypadku ana-lizy porównawczej źródło powinno być rozumiane jako konkretny środek pisarski, ponieważ każda inna defini-cja nie będzie niosła ze sobą wystarczająco użytecznych, z punktu widzenia wymiaru sprawiedliwości, informacji. Fakt, że obie próbki (dowodowa i porównawcza) charak-

teryzują się tym samym składem, nie informuje o praw-dopodobieństwie znalezienia owego materiału kryjącego w narzędziach pisarskich.

Należy również podkreślić, że nawet w przypadku, gdy próbka porównawcza i dowodowa materiału kryją-cego pochodzić będą z tego samego źródła (na przykład odbitki wykonane zostaną tą samą pieczątką), wartość Pr(X = x|H1), a zatem licznik w wyrażeniu na iloraz wia-rygodności, nie zawsze będzie równy jedności. Wynikać to będzie z możliwych procesów degradacji próbki do-wodowej, zachodzących pod wpływem działania czynni-ków środowiskowych zazwyczaj nieznanych badaczom, które powodować będą zmiany w właściwości fizykoche-micznych materiału kryjącego, a więc będą skutkować brakiem całkowitej zgodności z próbką porównawczą.

Konieczny wymóg do oszacowania Pr(X = x|H2), czyli prawdopodobieństwa, że zaobserwowane podo-bieństwo między różnymi próbkami jest przypadkowe, stanowi dysponowanie odpowiednią bazą danych pozwa-lającą na określenie zmienności międzyobiektowej (Neu-mann, Margot, 2009a). Owe bazy próbek referencyjnych powinny być tworzone lokalnie, ponieważ zrozumiałe jest, że biblioteka materiałów pisarskich utworzona dla potrzeb polskiego rynku prawdopodobnie nie będzie re-prezentatywna dla populacji materiałów występujących na rynkach amerykańskich czy azjatyckich.

Należy również zdawać sobie sprawę, że obliczenia statystyczne, podobnie jak wyniki analiz instrumental-nych, obarczone są pewnymi błędami, które w tym wy-padku wynikać mogą między innymi z braku standardo-wych metod służących szacowaniu powszechności wy-stępowania analizowanych materiałów kryjących oraz wspominanego już wpływu czynników środowiskowych na próbkę dowodową.

Konieczne jest więc kontrolowanie rzetelności opra-cowanego modelu statystycznego, co przeprowadza się na tzw. zbiorze walidacyjnym, w skład którego wchodzą próbki o znanym źródle. Są one wykorzystywane do prze-prowadzenia symulacji hipotetycznych analiz i wygene-rowania na ich podstawie zbioru wartości LR. Ponieważ pochodzenie owych próbek znane jest badaczowi, może on stwierdzić, dla których z hipotetycznych analiz praw-dziwa jest hipoteza H1 lub H2. Na podstawie uzyskanych wyników możliwa jest zatem ocena poprawności funk-cjonowania opracowanego modelu LR. Jednym ze spo-sobów takiej oceny jest szacowanie odsetku odpowiedzi fałszywie pozytywnych (LR > 1 dla prawdziwej H2) oraz fałszywie negatywnych (LR < 1 dla prawdziwej H1). Jak podkreślono (Ramos, Gonzalez-Rodriguez, Zadora, Ait-ken, 2013), jest to jednak niewystarczające podejście, podobnie zresztą jak stosowanie wykresów Tipetta, któ-re co prawda dostarczają informacji o liczbie błędnych wskazań, ale w żaden sposób nie mierzą siły tego fałszywego wsparcia. Obu tych informacji, o charakterze można by rzec zarówno jakościowym jak i ilościowym,



dostarcza rekomendowana przez badaczy (Martyna i in., 2013; Martyna, Zadora, Stanimirova, Ramos, 2014; Ra-mos, Gonzalez-Rodriguez, Zadora, Aitken, 2013; Ra-mos, Zadora, 2011) konstrukcja wykresów empirycznej entropii krzyżowej (ang. Empirical Cross Entropy, ECE). Podstawą tej metody jest przypisywanie kar błędnym od-powiedziom modeli LR. Im bardziej wartość LR wspiera błędną hipotezę, tym większą karą jest obarczona. Naj-lepsze modele to takie, które silnie wspierają prawidłowe hipotezy (LR >> 1, gdy H1 jest poprawna i LR << 1, gdy H2 jest poprawna) oraz nie wspierają nieprawidłowych (tzn. LR < 1, gdy H1 jest poprawna i LR > 1, gdy H2 jest poprawna).

W przypadku analizy materiałów kryjących korzysta-no do tej pory z wykresów Tippetta (Neumann, Margot, 2009a) lub wykresów entropii krzyżowej (Martyna i in., 2013). W drugim przypadku, zespół Martyny posłużył się wykresami ECE w ocenie modeli LR, które zostały opra-cowane dla widm absorpcyjnych sparametryzowanych w oparciu o trzy modele przestrzeni barw: CIE-XYZ, CIE-xyz, CIE-Lab, a uzyskanych uprzednio w wyniku analizy MSP-DAD czterdziestu niebieskich materiałów kryjących.

Dotychczas w przypadku problemu identyfikacyjne-go w celu klasyfikacji materiałów pisarskich najczęściej stosowano wielowymiarowe metody chemometryczne, m.in. PCA (Adam, Sherratt, Zholobenko, 2008; Kher, Mulholland, Green, Reedy, 2006; Thanasoulias, Parisis, Evmiridis, 2003; Weyermann i in., 2012), LDA (Senior, Hamed, Masoud, Shehata, 2012) czy CA (Weyermann i in., 2012). Metody te nie uwzględniają jednak informa-cji o zmienności międzyobiektowej czy częstości wystę-powania danej cechy w populacji. Dlatego też, w celu rozwiązania problemu klasyfikacyjnego, zaproponowano zastosowanie ilorazu wiarygodności. Neumann i Margot (2009b) wykorzystali to podejście w celu klasyfikacji past długopisowych, zwracając równocześnie uwagę na konieczność zdefiniowania w tym wypadku źródła mate-riału kryjącego jako konkretnej marki/modelu.

Bardzo często jednak badacze mają do czynienia z materiałem dowodowym, który opisywany jest przez wiele zależnych od siebie zmiennych. W takiej sytuacji niemożliwe jest szacowanie wartości dowodowej za po-mocą jednowymiarowego modelu LR (Zadora, 2009). Obecnie opracowywane są więc metody polegające na połączeniu metod chemometrycznych (umożliwiających redukcję liczby zmiennych) z ilorazem wiarygodności. Rozwiązanie tego typu jeszcze nie znalazło zastosowa-nia w analizie środków kryjących. Badacze skutecznie wykorzystali je jednak do analizy próbek win, łącząc LR z PCA (Martyna, Zadora, Stanimirova, Ramos, 2014), korzystając z dyskretnej transformaty falkowej (ang. Discrete Wavelength Transform, DWT) podczas spek-troskopowej analizy farb i polimerowych części samo-chodowych (Martyna, Michalska, Zadora, 2015), a także

stosując kombinację LDA z LR w celu określenia pocho-dzenia geograficznego oliwy z oliwek (Własiuk, Marty-na, Zadora, 2015).

Wszystkie powyższe przypadki dotyczyły oceny war-tości dowodowej na tzw. poziomie źródła. Zleceniodaw-cę ekspertyzy interesować może jednak nie tyle pocho-dzenie danego materiału dowodowego, co stwierdzenie, jakie zdarzenie (aktywność podejrzanego) mogła dopro-wadzić do jego powstania, czyli ocena wartości dowo-dowej na tzw. poziomie aktywności (Zadora, Martyna, Ramos, Aitken, 2014). Również w tym przypadku ocenę wartości dowodowej można przeprowadzić z wykorzy-staniem podejścia opartego na ilorazie wiarygodności.

W przypadku analizy materiałów kryjących, dla or-ganów wymiaru sprawiedliwości istotniejsze może być rozważenie przykładowych hipotez: H1 − osoba, której odciski palców zabezpieczono na narzędziu pisarskim (długopisie) sporządziła kwestionowany zapis, H2 − oso-ba, której odciski palców zabezpieczono na narzędziu pisarskim (długopisie) nie sporządziła kwestionowanego zapisu.

W takim wypadku analiza podobieństwa cech fi-zykochemicznych materiału kryjącego pochodzącego z zabezpieczonego długopisu i materiału, którym wyko-nano kwestionowany zapis, nie pozwala na udzielenie odpowiedzi na tak postawione pytanie. Nawet w przy-padku stwierdzenia zgodności właściwości obu próbek, należałoby udowodnić, iż jest on stosowany wyłącznie w danym długopisie, na którym zabezpieczono odciski wiążące go z podejrzanym. Analizując dowody na po-ziomie aktywności, konieczne jest uwzględnienie innych zdarzeń, między innymi prawdopodobieństwa wymiany wkładu w długopisie.

Należy więc podkreślić, iż siła dowodu na poziomie „źródła” nie jest równoważna sile dowodu na poziomie „aktywności”. Przykładowo, tak zwane tusze DNA, ze względu na swoją unikatowość, stanowią niezwykle cen-ny materiał dowodowy rozpatrywany na poziomie źró-dła. Nie są one jednak nierozerwalnie związane z właści-cielem, przez co mogą zostać wykorzystane przez osoby niepożądane.

5. Podsumowanie

Próbując odpowiedzieć na pytanie, która metoda jest obecnie najlepszym wyborem podczas analizy materia-łów kryjących, wielu specjalistów (Brunelle, Crawford, 2003; Calcerrada, García-Ruiz, 2015; LaPorte, Stephens, 2012) wskazuje na połączenie wstępnych badań optycz-nych z HPTLC. Jak większość opracowanych technik, nie jest to jednak uniwersalne narzędzie analityczne. TLC zawodzi, gdy porównywane materiały charaktery-zują się bardzo zbliżonym składem barwnikowym, a co gorsze, wiąże się z koniecznością ekstrakcji zapisu. Po-



zostałe techniki separacyjne (HPLC, GC) oraz szereg metod spektroskopowych (IR, spektroskopia Ramana, MS) pozwalają uzyskać dodatkowe informacje na te-mat materiałów kryjących, bardzo często nie powodując uszkodzenia materiału dowodowego. Do tej pory ich zastosowanie było jednak ograniczone ze względu na mniejszą dostępność aparatury, wyższe koszty analizy czy skomplikowany przebieg. Niemniej jednak czynniki te coraz rzadziej stanowią realną przeszkodę i w ostat-nich latach to właśnie techniki spektroskopowe cieszyły się największą popularnością pośród badaczy, o czym świadczy tematyka publikowanych artykułów.

W rzeczywistości każda z zaproponowanych tech-nik, pod warunkiem umiejętnego stosowania, dostarcza cennych informacji, a połączenie odpowiednich metod zapewnić może bardziej wiarygodne rezultaty. Niewąt-pliwie jednak świadomość czynników wpływających na sporządzone zapisy (procesy starzenia), a także wła-snych ograniczeń danej metody, jest niezwykle ważnym elementem każdych badań. I tak identyfikacja substancji lotnych obecnych w materiałach kryjących, stopniowo odparowujących z powierzchni zapisu, w żadnym wy-padku nie może stanowić jedynego źródła informacji podczas rozwiązywania problemów porównawczych czy identyfikacyjnych. Analiza barwników również po-winna być prowadzona z wyjątkową dozą ostrożności. Jakościowa, a w szczególności ilościowa interpretacja otrzymanych wyników, musi uwzględniać możliwość fotodegradacji tychże substancji. W przypadku niezgod-nych profili chemicznych porównywanych materiałów kryjących zlekceważenie takiej ewentualności prowadzić może do błędnych, fałszywie negatywnych wniosków.

Podłoże, na które naniesiony został zapis, ze wzglę-du na obecność rozjaśniaczy optycznych czy wypeł-niaczy, także może utrudniać interpretację sygnałów analitycznych. Analiza materiałów kryjących silnie ab-sorbowanych przez papier techniką FTIR często spoty-ka się z takimi trudnościami z powodu wielu sygnałów pochodzących z podłoża, natomiast silna fluorescencja próbki bardzo często uniemożliwia analizę za pomocą spektroskopii Ramana. Nie zawsze jednak oznacza to, że wymienione czynniki wykluczają stosowanie powyż-szych metod. Występujące komplikacje często mogą być skutecznie eliminowane poprzez wprowadzanie pew-nych modyfikacji danej techniki instrumentalnej, tak jak w wypadku stosowania techniki SERS w celu pozbycia się przeszkadzającej fluorescencji (Braz, López-López, Montalvo, García Ruiz., 2014; Geiman, Leona, Lombar-di, 2009).

Należy również podkreślić, że bez względu na rodzaj zastosowanej metody badawczej, wpływ szeregu czynni-ków na zakwestionowane zapisy nie może być bagateli-zowany podczas interpretacji wyników. W rzeczywistym świecie nie istnieje bowiem idealny materiał dowodowy. Konieczne wydaje się więc szacowanie jego wartości, na

przykład poprzez wyznaczanie ilorazu wiarygodności. Pozwala on na uwzględnienie w jednym podejściu obli-czeniowym informacji o podobieństwie próbek, zmien-ności wewnątrz- i międzyobiektowej oraz częstości występowania danej cechy w populacji generalnej. Taki sposób oceny wartości dowodowej dostarcza więc bar-dziej użytecznych informacji z punktu widzenia wymia-ru sprawiedliwości niż w przypadku obecnie stosowane-go podejścia, które ograniczone jest do stwierdzenia lub wykluczenia zgodności między profilami chemicznymi analizowanych próbek (Neumann, Ramotowski, Genes-say, 2011). Podejście takie jest dodatkowo komplikowa-ne przez brak transparentnych reguł pozwalających na rozgraniczenie rzeczywistych różnic w składzie materia-łów kryjących od tych wytłumaczalnych, wynikających na przykład z działania czynników środowiskowych. Bardziej zasadne wydaje się więc ukierunkowanie dal-szych badań nie tyle na tworzenie nowych metod ana-litycznych, co na walidację już istniejących technik, a w szczególności na interpretację uzyskiwanych wyni-ków pod kątem ich wiarygodności.

Physicochemical analysis of inks and methods of evidence ... analysis of inks and methods of...

Documents

Transcript of Physicochemical analysis of inks and methods of evidence ... analysis of inks and methods of...