Pérez, 2013 Tesis Veronica

8/16/2019 Pérez, 2013 Tesis Veronica

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALCENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD PIGMENTANTE DE HARINA DEJAMAICA (Hibiscus sabdariffa) EN PECES DE ORNATO (Carassius

auratus)

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DEDOCTORADO EN CIENCIAS

EN

DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

PRESENTA

M. en C. VERÓNICA PÉREZ ESCALANTE

DIRECTORES

Dra. ALMA ANGÉLICA DEL VILLAR MARTÍNEZDr. GABRIEL AGUIRRE GUZMÁN

Yautepec, Morelos, Septiembre 2013


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El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Biología Molecular del

Departamento de Biotecnología del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del

Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Alma Angélica Del Villar

Martínez y del Dr. Gabriel Aguirre Guzmán. Para la realización de los estudios se

contó con el apoyo económico (202136) de CONACyT. La investigación fue

realizada con el financiamiento otorgado por el proyecto Fomix-Morelos (93763).


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AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Politécnico Nacional que a través de ceprobi me permitió realizar mis

estudios de doctorado. A la Dra. Alma Angélica Del Villar por haberme permitido trabajar en su grupo enel Laboratorio de Biología Molecular. Por su dirección en el trabajo y confianzapara la realización del mismo.

Al Dr. Pablo Emilio Vanegas por sus observaciones y comentarios para elfortalecimiento del manuscrito.

Al Dr. Gabriel Aguirre Guzmán por su valiosa aportación en la revisión de la tesis ycomentarios que contribuyeron al mejoramiento del manuscrito. También por elrecibimiento en la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Autónomade Tamaulipas para la realización de la parte de histología.

A la Dra. Liliana Alamilla por su apoyo en el uso del equipo de secado poraspersión para la realización del trabajo.

A todos los integrantes del comité tutorial por sus observaciones y comentariosdurante la realización del trabajo.

A todos los miembros del área administrativa por el apoyo para la realización delos trámites durante el desarrollo de la tesis.

A todos mis compañeros y amigos del laboratorio por su apoyo en los diferentesmomentos durante mi estancia en este lugar de trabajo.

A todos mis compañeros y amigos de ceprobi y los que ya no están en ceprobipero que estuvieron en algún momento, que me alentaron para que culminara misestudios.

A mi familia que estuvo apoyándome en todo momento para que llegara aconcluir esta etapa de mi vida. En especial a mi papá, hermanos por suconfianza y apoyo. A mí cuñada Norma por la ayuda y apoyo que me habrindado. A mis sobrinos Beni, Marquitos, Sebas y Marlen que los quieromucho.

Gracias a todos…


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ÍNDICE DE CONTENIDO

ÍNDICE DE TABLAS…………………………………………………………….... xiii

NDICE DE FIGURAS…………………………………………………………….. xiv

RESUMEN………………………………………………………………… ............. xvi

ABSTRACT………………………………………………………………………… xviii

CAP TULO 1. EFECTO DE LA HARINA DE JAMAICA (Hibiscus

sabdar i f fa ) ADICIONADA A LA DIETA DEL PEZ DORADO (Carassius

auratus )……………………………………………………………………………. 1

1.1. Introducción……………………………………………… .………………….. 1

1.2. Marco teórico.……………………………………………………………….... 3

1.2.1. Cultivo de peces de ornato………………...…………………………... 3

1.2.2. Importancia del alimento en la acuacultura………………………….. 6

1.2.3. Aspectos generales de la pigmentación de los peces……………… 7

1.2.4. Uso de los pigmentos en la acuacultura……………...……………... 8

1.2.5. Uso de los pigmentos en los peces de ornato…………………… ..... 11

1.2.6. Hibiscus sabdariffa (jamaica)............................................................ 13

1.2.7. Propiedades de las antocianinas……...……………………………... 14

1.3. Justificación………………………………………………………………… .. 18

1.4. Objetivos................................................................................................... 19

1.4.1. Objetivo general………………………………………………………… 19

1.4.2. Objetivos específicos..……………………….………………………..... 19


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1.5. Materiales y Métodos……………………………………………………… ... 20

1.5.1. Material vegetal………………………………..………………………... 20

1.5.2. Extracción y cuantificación de antocianinas……………..………….. 20

1.5.3. Elaboración de dietas experimentales…………………….……….... 21

1.5.4. Cría experimental de los peces……………………………...………... 21

1.5.5. Parámetros biométricos evaluados………………………….………... 22

1.5.6. Análisis histológico……………………………………………..………. 23

1.5.6.1. Fijación de los tejidos…..…………………………………..……... 23

1.5.6.2. Deshidratación de los tejidos……………………………………. 23

1.5.6.3. Inclusión de los tejidos…………………………………………… 23

1.5.6.4. Corte de las muestras………...…………………………………. .. 23

1.5.6.5. Tinción histológica con hematoxilina y eosina…......…..……... 24

1.5.6.6. Análisis de las muestras en microscopio óptico..…………....... 24

1.5.7. Análisis estadístico……….……………………………………………. 24

1.6. Resultados y Discusión………………………………………...………… ... 26

1.6.1. Composición de la harina de jamaica………………………………... 26

1.6.2. Concentración de antocianinas………………………………………. 28

1.6.3. Efecto de las dietas experimentales…………………………………. 29

1.6.4. Análisis de la piel de los organismos alimentados con harina de

jamaica …………………………………………………………………………. 33

1.7. Conclusiones………………………………………………………………. ... 40

1.8. Referencias…………………………………………………………………... 41


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CAP TULO 2. OBTENCI N DE MICROENCAPSULADOS DE

ANTOCIANINAS DE JAMAICA (Hibiscus s abdar i f fa )……………………... 53

2.1. Introducción…………………………………………………………………... 53

2.2. Marco teórico………………………………………………………………..... 54

2.2.1. Generalidades de la microencapsulación………………………........ 54

2.2.2. Secado por aspersión…………………………………………………... 57

2.2.3. Etapas del secado por aspersión……………….……………….......... 58

2.2.4. Aplicaciones de la microencapsulación……………………………… 60

2.2.5. Maltodextrina como material pared………………………………….... 61

2.2.6. Tamaño y distribución de partícula………………………………….... 62

2.2.7. Caracterización morfológica y microestructural de los

microencapsulados…...…………………..……………………….………….. 63

2.2.8. Forma de las partículas…………………..…………………………….. 64

2.2.9. Microestructura de las partículas…………………………………….... 65

2.3. Justificación…………………………………………………………………… 66

2.4. Objetivos................................................................................................... 67

2.4.1 Objetivo general…………………………………………………………. 67

2.4.2. Objetivos específicos………………………………………………….... 67

2.5. Materiales y Métodos………………………………………………………... 68

2.5.1. Extracción y cuantificación de antocianinas de jamaica.…..…….... 68

2.5.2. Elaboración de microencapsulados………………………………….. 69

2.5.3. Determinación de sólidos totales…………………………………….. 69

2.5.4. Secado por aspersión…………………………………………………... 69


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2.5.5. Análisis de los microencapsulados por microscopia electrónica de

barrido (MEB)…………………………........…………………………………… 70

2.5.6. Distribución de tamaño de los microencapsulados……………….... 70

2.5.7. Eficiencia de microencapsulación…………………………………..... 70

2.6. Resultados y Discusión………………………………………………………. 72

2.6.1. Microencapsulación de antocianinas……………………………….... 72

2.6.2. Determinación de la humedad de los microencapsulados………... 72

2.6.3. Morfología de los microencapsulados…………….…………………... 73

2.7. Conclusiones……………………………………………………………….... 79

2.8. Referencias…………………………………………………………………... 80

CAPÍTULO 3. EFECTO DE LA DIETA ADICIONADA CON

ANTOCIANINAS MICROENCAPSULADAS EN PECES DE ORNATO

Carassius auratus ……………………………………….……………………..... 89

3.1. Introducción…………………………………………………………………... 89

3.2. Marco teórico.……………………………………………………………….... 90

3.2.1. Función y organización de los cromatóforos en la piel de los

peces......................................................................................................... 90

3.2.2. Función de los cromatóforos en la piel.………...………………….... 93

3.2.3. Características de los cromatóforos…………………………………. 94

3.2.4. Crecimiento de los organismos acuáticos………............................ 98

3.2.5. Alimentos microencapsulados......................................................... 99

3.3. Justificación………………………………………………………………...... 102


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3.4. Objetivos................................................................................................... 103

3.4.1. Objetivo general………………………………………………………… 103

3.4.2. Objetivos específicos………………………………………………….. 103

3.5. Materiales y Métodos……………………………………………………….. 104

3.5.1. Dietas experimentales adicionadas con pigmentos

microencapsulados……………………………………………………………. 104

3.5.2. Cría experimental de los peces………………………………………. 104

3.5.3. Evaluación de los parámetros biométricos…………………………... 105

3.5.4. Análisis histológico…………………………………………………...... 105

3.5.5. Observación de las muestras en el microscopio óptico……………. 106

3.5.6. Análisis estadístico…………………………………………………….. 108

3.6. Resultados y Discusión……………………………………...……………… 109

3.6.1. Evaluación de las dietas experimentales……………………………. 109

3.6.2. Análisis estructural……………………………………………………... 115

3.6.3. Identificación de las células en la piel..……………………………… 117

3.6.4. Distribución de las células epidérmicas……………………………… 117

3.7. Conclusiones………………………………………………………………… 121

3.8. Referencias…………………………………………………………………... 122

Recapitulación………………………………………………………………......... 132

Anexos…………………………………………………………………………...... 134


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xiii

ÍNDICE DE TABLAS

CAPÍTULO 1

No. Pág

1.1 Lista de peces or namentales cultivados en México.……………..... 5

1.2 Paso para la tinción con hematoxilina y eosina para la

observación de células pigmentantes……………………………..... 25

1.3 Composición de la harina de jamaica (Hibiscus sabdariffa)............ 27

1.4 Efecto de la harina de jamaica en los parámetros biométricos en

Carassius auratus............................................................................ 31

CAPÍTULO 3

3.1 Pasos para teñir los cromatóforos con hematoxilina y eosina para la

observación de las células…………….……………………………....... 107

3.2 Efecto de las dietas adicionadas con microencapsulados de

jamaica (H. sabdariffa) en los parámetros biométricos de (C.

auratus)……........................................................................................ 111

3.3 Número de células epiteliales en la cabeza, dorso y aleta caudal

alimentados con antocianinas microencapsuladas………………….. 120


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xiv

ÌNDICE DE FIGURAS

No. CAPÍTULO 1 Pág.

1.1 Principales antocianinas distribuidas en la naturaleza y su

estructura general............................................................…………… 16

1.2 Tejido de la cabeza del control donde se ubican los cromatóforos... 34

1.3 Identificación de los iridóforos en tejido de los peces alimentados

con las dietas experimentales………………………………………….. 36

1.4 Número de cromatóforos por campo en diferentes partes del

cuerpo de Carassius auratus, alimentados con diferentes

concentraciones de antocianinas………………..………………….... 38

1.5 Cortes histológicos de los peces alimentados con las dietas

experimentales.................................................………………………. 39

CAPÍTULO 2

2.1 Formas de microencapsulación…………………………….…............. 56

2.2 Principio del funcionamiento del secado por aspersión……............. 59

2.3 Estructura externa de los microencapsulados….……………………. 74

2.4 Tamaño de los microencapsulados…………………………………… 77

2.5 Eficiencia de microencapsulación...................................................... 78


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xv

CAPÍTULO 3

3.1 Esquema de las principales estructuras de la piel de peces............. 92

3.2 Distribución de las células en la piel de los peces…….…………….. 96

3.3 Apariencia física de los peces alimentados con dietas adicionados

con microencapsulados de antocianinas……………..……………….. 114

3.4 Corte histológico de C. auratus...................................……................ 116

3.5 Cortes de las diferentes zonas del cuerpo de C. auratus…………… 118


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xvi

RESUMEN

En este estudio se evaluó el efecto de los pigmentos de la jamaica (Hibiscus

sabdariffa) sobre el crecimiento y la pigmentación de la piel en peces de ornato (C.

auratus). En una primera evaluación se analizó el efecto de la harina de jamaica

en la dieta de C. auratus. Posteriormente los pigmentos de la harina de jamaica se

microencapsularon para su protección contra los diversos factores ambientales,

éstos se adicionaron a la dieta de los peces, y se evaluó su efecto en los

parámetros biométricos y en la pigmentación. Los peces se alimentaron con dietas

adicionadas con la harina de brácteas de jamaica a diferentes concentraciones

(40, 80 y 160 mg de pigmento/kg alimento) y microencapsulados (150, 300 y 450

mg de pigmento/kg alimento). Los peces experimentales se evaluaron durante 8

semanas, se alimentaron tres veces al día a una proporción del 6% con relación al

peso. En ambos experimentos se evaluaron los parámetros biométricos: peso

final, tasa de crecimiento, consumo de alimento, tasa de conversión alimenticia y

supervivencia. Se evaluó la presencia de las células que almacenan los pigmentos

en la piel. Las dietas adicionadas con harina de jamaica no fueron rechazadas por

los peces y no se observó un efecto negativo en los parámetros biométricos, se

observó incremento en la tasa de crecimiento en los peces alimentados con las

dietas analizadas, así como también se observó la presencia de células que

podrían almacenar pigmentos, se logró identificar melanóforos e iridóforos

distribuidos en la piel. Se observó una mayor densidad de células que acumulan

pigmentos, en la cabeza seguida de la aleta caudal y el dorso. Los

microencapsulados se analizaron estructuralmente antes de ser adicionados a las

dietas; se observaron partículas de forma esférica y de superficie lisa, con un


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xvii

tamaño de 1.5-17 µm, algunas presentaron forma irregular con hendiduras en la

superficie, pero libres de grietas o rupturas, la eficiencia de encapsulación fue del

87% lo que sugiere que tanto el material pared como las condiciones del secado

fueron las adecuadas para la obtención de antocianinas microencapsuladas. Con

las dietas adicionadas con microencapsulados de 150 y 300 mg de pigmentos/kg

de alimento se mostró un incremento en el crecimiento y peso ganado comparado

con el control (P˂0.05). Con la concentración de 450 mg de pigmentos en la dieta,

el crecimiento y los parámetros biométricos no se vieron favorecidos. En los cortes

histológicos se observaron principalmente células epiteliales y mucosas en la

epidermis. No se lograron identificar células que acumulan pigmentos por lo que

se sugiere que los pigmentos microencapsulados no se asimilaron por el pez, pero

por otro lado se puede recomendar la dieta adicionada con microencapsulados a

ciertas concentraciones de pigmentos de jamaica para el crecimiento y la harina

de las brácteas de jamaica como aditivo también para incrementar el crecimiento y

la pigmentación de la piel de peces ornamentales.

Palabras clave: Carassius auratus, Hibiscus sabdariffa, pigmentos,

microencapsulados, crecimiento


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xviii

ABSTRACT

In this study, the effect of roselle (Hibiscus sabdariffa) pigments on growth

and skin pigmentation in ornamental fish (Carassius auratus) was evaluated in a

first evaluation the effect roselle calyx flour added to the C. auratus diet was

analyzed. Subsequently the flour pigments were microencapsulated for protection

against various environmental factors, they were added to the diet of fish, and

assessed effect on biometric parameters and pigmentation. The fish were fed with

diets added with roselle calyx flour at different concentrations (40, 80 and 160 mg

of pigment/kg feed) and microencapsulated (150, 300 and 450 mg of pigment/kg

feed). Experimental fish were evaluated for 8 weeks, were fed three times daily at

rate of 6% relative to the weight. In both experiments biometric parameters were

evaluated: final weight, growth rate, feed intake, feed conversion rate and survival.

The presence of the cells that store the pigments in the skin was evaluated. Diets

with added roselle flour were not rejected by the fish and no negative effect was

observed in the biometric parameters, increased growth rate, and the presence of

cells that could store pigments were also observed iridophores and melanophores

distributed on the skin were identified. A higher pigment-accumulating cell density

was observed in the head followed by the caudal fin and dorso.

Microencapsulated, were structurally analyzed before being added to the diet,

spherical particles with a smooth surface were observed, with a size from 1.5-17

µm, with some irregularly shaped on the surface, but free of cracks or ruptures,

encapsulation efficiency was 87% suggesting that both the wall material as the

drying conditions were appropriated for obtaining microencapsulated anthocyanins.

The diet added with 150 and 300 mg of microencapsulated pigments/kg feed,


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xix

showed an increased growth and weight gain compared to control (P˂0.05). With

450 mg of pigment concentration in the diet, growth and the biometric parameters

were not favored. In histological sections mainly epithelial and mucosal cells were

mainly observed in the epidermis. It was not possible to identify pigment

accumulating. Cells so suggested that microencapsulated pigments have not been

assimilated by the fish, but otherwise can recommend the diet supplemented with

microencapsulated roselle pigments for growth and roselle calyx flour as additive to

increase growth and pigmentation of ornamental fish.

Keywords: Carassius auratus, Hibiscus sabdariffa, pigments, microencapsules

growth.


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1

CAPÍTULO 1

EFECTO DE LA HARINA DE JAMAICA (Hibiscus sabd ar if fa ) ADICIONADA A

LA DIETA DEL PEZ DORADO (Carassius auratus )

1.1. Introducción

La producción de peces de ornato es una actividad importante en la

comercialización, así como también uno de los pasatiempos más populares en el

mundo, siendo esta actividad relevante para el desarrollo económico de países no

desarrollados (Livengood y Chapman, 2007). Carassius auratus es uno de los

peces de ornato más populares y tienen un alto valor en el mercado. La forma del

cuerpo, aletas, tamaño y pigmentación del mismo, son criterios importantes que

determinan el precio en el comercio de los organismos. Para lograr una mejor

aceptación así como el precio de los peces y, debido a que estos organismos

obtienen sus pigmentos a partir de lo que consumen, éstos deben ser alimentados

con dietas con pigmentos hasta lograr un color rojo o anaranjado (Paripatanamont

y col., 1999; Gouveia y Rema, 2005).

La pigmentación de los peces dorados se ha logrado a través de la dieta

suplementada con pigmentos sintéticos como de zeaxantina, luteína o astaxantina

y se han observado que mejoran la pigmentación de la piel del organismo. Sin

embargo, estudios recientes se han enfocado en usar compuestos naturales como

una alternativa a los pigmentos sintéticos, debido a que existe la preocupación de

que los pigmentos sintéticos puedan tener efectos adversos en el metabolismo del

organismo además de los altos costos de los mismos (Gomes y col., 2002).


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2

Una dieta rica en pigmentos de diversas fuentes naturales puede mejorar la

pigmentación de la piel del organismo (Meyers, 2000). Para ello se han utilizado

algunas plantas que contienen carotenoides como las algas Arthrospira maxima,

Chlorella vulgaris Haemotococcus pluvialis y Xanthophyllomyces dendrorhous

(Gouveia y col., 2003; Gouveia y Rema, 2005; Xu y col., 2006), y plantas como

Medicago sativa (Yanar y col., 2008). Se ha demostrado que los carotenoides

además de pigmentar la piel, también tienen una función como nutrientes y son

vitales para el crecimiento y la reproducción en organismos acuáticos (Miki, 1991).

Sin embargo, Bjerkeng y col. (2000) comentan que la eficiencia de pigmentación

de los peces está influenciada por el tipo de pigmento, fuente del mismo,

concentración, longitud de cadena del pigmento e ingredientes que posee la dieta

y de otros factores como tamaño del pez, edad, tiempo de alimentación,

composición de la dieta, madurez sexual, factores genéticos y ambientales

(Torrisen, 1985; Paripatanamont y col., 1999; Xu y col., 2006).

Existen otras fuentes naturales de pigmento, además de los carotenoides

que pueden ser una alternativa para la pigmentación de los peces. Las

antocianinas, son moléculas responsables de la coloración roja, violeta y azul de

algunos tejidos específicos de las plantas (Prior y Wu, 2006). Esta propiedad de

pigmentación y su baja toxicidad ha abierto la posibilidad de usarlos como

colorantes naturales en los alimentos (Hirunpanich y col., 2005). En la acuacultura

existen pocas investigaciones de las antocianinas relacionadas con su capacidad

pigmentante en los organismos acuáticos, es por ello que este punto es relevante

en la presente investigación.


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3

En este experimento se utilizó como fuente de pigmentos la jamaica ( H.

sabdariffa), la cual pertenece a la familia de las malváceas y se cultiva en regiones

tropicales. Esta planta posee compuestos fenólicos como las antocianinas, que le

dan el color rojo a las brácteas, los cuales se emplean como aromatizante en

salsas, jaleas, mermeladas, bebidas y como colorante en los alimentos (Ju y

Howard, 2003). Garzón. (2008) señala que en México, la producción de jamaica se

concentra en quince estados dentro de los cuales destacan: Guerrero (60%),

Oaxaca (21%), Nayarit y Michoacán (4%). Por lo que la jamaica es sugerida para

utilizarse como una alternativa de pigmentos naturales para diversos propósitos en

la acuacultura.

1.2 Marco teórico

1.2.1 Cultivo de peces de ornato

En términos generales, los peces ornamentales se describen como

organismos acuáticos almacenados en un acuario, como un pasatiempo o

distracción para el público. Los peces más cultivados para el comercio son los

organismos de agua dulce (Livengood y Chapman, 2007). En Estados Unidos

(EU), Florida es el estado que más peces ornamentales produce representando el

95% de la producción. Los productores de peces de ornato cultivan 800

variedades de organismos de agua dulce, con una producción en el 2003 de 47

millones de dólares (Hill y Yanong., 2006). En general, la industria ornamental

genera aproximadamente ingresos que van desde 175 a 247 millones de dólares

al año aproximadamente, solamente en EU (FAO, 2006; Hill y Yanong, 2006).

Otros países que propagan tradicionalmente peces de ornato son China,


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4

Indonesia, Japón, Malasia, Singapur y Tailandia; recientemente el cultivo de peces

ornamentales se ha extendido a otras regiones como Bélgica, España, Holanda,

Israel, y la República Checa (Livengood y Chapman, 2007).

En cuanto a la generación de recursos económicos, se estima que la

importación al mayoreo en los distintos países es de aproximadamente 900

millones de dólares y al menudeo es de aproximadamente 300 millones de dólares

con una tasa de crecimiento del 14% anual desde 1985, estimándose un valor de

15 mil millones al año (Panné-Huidobro y Luchini, 2008).

En México, la acuacultura se inició en la década de los 70's desde ahí se ha

convertido en una actividad económica y de beneficio social (FAO, 1999). En este

país el estado que más se ha dedicado al cultivo de peces de ornato es Morelos,

ya que se coloca en primer lugar a nivel nacional al tener, 290 unidades de

producción de peces ornamentales, con una producción de aproximadamente 20

millones de peces y una derrama económica de 58 millones de pesos. Cabe

destacar que esta actividad genera alrededor de 1,700 empleos, mismos que

podrían duplicarse, si se impulsa mejores líneas de exportación y rendimientos de

mercado. Anualmente 20 variedades de peces de ornato producidos en México se

exportan a Los Ángeles, California, E.U. La Tabla 1.1 muestra los principales

peces de ornato que se cultivan en México.


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Tabla 1.1. Especies de peces ornamentales cultivados en México (FAO, 2003)

Nombre científico Nombre común

Astronotus ocellatus Oscar

Brachydanio albolineatus Pez rosa

B. rerio Pez cebra

Carassius auratus Carpa dorada

Cichlasoma severum Disco severum

Cyprinus carpio Carpa koi

Hyphessobrycon spp. TetraLebistes reticulatus Guppy

Mollienesia velífera Molinesia

M. latipinna

M. sphenops

Rasbora spp. Rasbora

Trichogaster leeri Gurami perla

T. trichopterus Gurami azul

T. cosby Gurami mosaico

T. microlepis Gurami luz de luna

Puntius spp. Barbos

Pterophyllum scalare Escalario

Xiphophorus helleri Pez espada

X. maculatus Platy

X. variatus Platy variatus


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1.2.2 Importancia del alimento en la acuacultura

Es fundamental una nutrición adecuada en los animales para mantener un

buen sistema de producción, económicamente sustentable así como organismos

saludables y productos de alta calidad. En el cultivo de los peces, la nutrición es

importante porque debe cubrir todas las necesidades del organismo, y es una

actividad que representa del 40 al 50% de los costos de producción. Las dietas de

los peces han ido cambiando con los años, y se han desarrollado nuevos

alimentos que promueven el crecimiento, además de mejorar la salud de los

organismos (Francis-Floyd, 2002).

En México, la industria de alimentos balanceados para acuacultura ha

incrementado hasta un 150% en los últimos años, lo cual contribuye con 65

millones de dólares, este incremento ha sido proporcional a la producción de

peces ya que cada año aumenta de un 10 a un 14% (FAO, 2006) por lo que el

consumo de alimentos se ha triplicado. Las principales industrias fabricantes de

alimentos son: Aceitera de Junta, Agribrands Purina, Forrajes El Barro, Malta

Clayton, Piasa, Rangen, Silver Cup, Super-Zeigler, y Zenzone. Agribrands Purina

es la que tiene el dominio del mercado (60%). El principal reto que tienen estos

fabricantes de alimentos es aumentar el volumen de producción así como mejorar

el precio de venta (http://www.panoramaacuicola.com/articulos_y_entrevistas.html)

Los alimentos para peces se encuentran disponibles en dos formatos según

su contenido de humedad: en forma de gránulos secos (humedad


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7

fáciles de almacenar, transportar y distribuir. Estos se elaboran en forma de copos

u hojuelas y tienen la ventaja de ser suaves, pequeños, mejor estabilidad en agua

y mayor digestibilidad, por lo mismo son usados ampliamente en peces de ornato

(Castelló, 2000; Francis-Floyd, 2002). Los alimentos semi-húmedos requieren de

un tratamiento adicional antes de ser suministrado, este se mezcla con alimentos

secos para que absorban parte de la humedad o bien ser secados para mejorar el

tiempo de almacenamiento. Esta segunda forma de presentación es la preferida

por algunas especies ya que puede tener mejor palatabilidad y digestibilidad,

proporcionando mejores resultados (FAO, 1999).

1.2.3 Aspectos generales de la pigmentación de los peces

La determinación del color en la piel de los peces es un proceso complejo

que involucra una serie de factores celulares, fisiológicos y genéticos. Algunos de

estos factores producen un fenotipo de color estable mientras que otros están

influenciados por el ambiente, el cual puede producir cambios en el fenotipo

(Colihueque, 2010).

Los factores celulares en la pigmentación involucran la existencia de células

especializadas llamados cromatóforos, las cuales pueden almacenar pigmentos

específicos. Existen al menos cinco tipos de cromatóforos en los peces:

eritróforos, iridóforos, leucóforos, melanóforos, y xantóforos. Este tipo de células

pueden almacenar pigmentos específicos de color amarillo, anaranjado o rojo

(carotenoides), azul, dorado, iridiscente o plateado (guanidina), blanco (gránulos

de guanina), negro o café (melanina). Algunos de estos cromatóforos pueden

absorber luz, como es el caso eritróforos, melanóforos, xantóforos, mientras que


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8

otros pueden reflejar luz como ocurre con los iridóforos y leucóforos generando

colores iridiscentes debido a sus variaciones en la organización estructural de sus

organelos cristalinos basados en la estructura de purina (Fujii, 2000).

1.2.4 Uso de los pigmentos en la acuacultura

En la naturaleza existen muchos pigmentos presentes en las plantas; como

por ejemplo, antocianinas, carotenoides, clorofilas y porfirinas los cuales tienen un

papel importante en las células vegetales protegiéndolas de la fotoxidación

(Palozza y Krinsky, 1992). Los carotenoides son pigmentos que se encuentran

ampliamente distribuidos en la naturaleza y están presentes en muchas algas,

animales, microorganismos y plantas (Britton, 1993). Debido a que los peces no

pueden sintetizar sus propios pigmentos, estos los adquieren de forma natural en

su dieta, es por ello que la acuacultura ha buscado fuentes alternativas de

pigmentos para adicionarlos a los alimentos (Meyers y Latscha, 1990; Torrisen,

1985). Se ha observado que la coloración mejora al incluir fuentes naturales de

astaxantina extraídos de algas (Phaffia rhodozyma) (Moretti y col., 2006),

crustáceos como el camarón (Pleisonika sp.), y levaduras (Haemotococus

pluvialis) (Bowen, 2002), comparados con la astaxantina sintética.

El salmón (Salmon salar ) es uno de los peces con el que más se han hecho

esfuerzos para pigmentar su carne debido a que el color rosa de la misma es muy

apreciado por los consumidores en el mercado (Leclerco y col., 2010). Buttle y col.

(2001) evaluaron la eficiencia de deposición de dos carotenoides en la piel del

salmón reportando que se deposita mejor la cantaxantina que la astaxantina,


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9

debido a que cada carotenoide difiere en su distribución en los isómeros y debido

a que la absorción o utilización de los pigmentos difiere entre especies.

Los carotenoides proporcionan el color depositándose en la piel o carne de

los peces y algunos como el β-caroteno actúa como fuente de vitamina A. Amar y

col. (2001) determinaron que los pigmentos participan en el mecanismo de

defensa de Oncorhynchus mykiss (trucha arcoíris). Se reportó que la astaxantina,

β-caroteno, y cantaxantina incrementan los factores humorales, complemento

(componentes de la respuesta inmunitaria), actividad de la lisozima, así como los

factores celulares como la fagocitosis y la citotoxicidad no específica.

La astaxantina sintética de forma no esterificada (Carophyll pink) y

esterificada (NatuRose) ha sido empleada en dietas para pargo australiano

(Pagrus auratus) para determinar su efecto en aumentar la pigmentación en piel.

Se reporta que ambos pigmentos de astaxantina incrementan significativamente el

contenido de carotenoides en la piel, sin diferencias entre los dos pigmentos. Lo

contrario sucede en otros peces como el salmón y trucha arcoíris que solo utilizan

astaxantina esterificada o no esterificada (Booth y col., 2004; Doolan y col., 2008).

Kalinowiski y col. (2007) adicionaron harina de camarón como fuente de

astaxantina esterificada evaluando el tiempo de alimentación adecuado para que

P. auratus adulto pudiera adquirir la coloración rosa-rojo. Se observó que el tiempo

de alimentación y concentración de astaxantina esterificada incrementa la

pigmentación del tegumento del pez y la coloración se mantiene estable después

del tratamiento.

Se determinó el efecto de dietas suplementadas con astaxantina en el

camarón blanco Litopenaeus vannemei juvenil, observando que estos organismos


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10

mejoran su crecimiento, supervivencia y resistencia a ser cultivados bajo

concentraciones de salinidad al contar con este componente en sus dietas (Flores

y col., 2007).

Estos estudios demuestran que la utilización de pigmentos difiere entre

especies y que los carotenoides tienen funciones en los peces tales como:

pigmentar la piel y la carne, servir como antioxidante, favorecer el metabolismo

reproductivo y disminuir los efectos del estrés (Buttle y col., 2001; Wang y col.,

2006).

Investigaciones con otros peces han demostrado que los carotenoides

dietarios juegan un papel importante en la reproducción y la respiración. Con

varias pruebas alimenticias han mostrado que el suplemento con carotenoides en

la dieta también mejora la eficiencia alimenticia, acelera la tasa de crecimiento y

mejora la sobrevivencia larvaria (Meyers, 2000).

Miki. (1991) en su estudio demuestra que la astaxantina tiene fuerte actividad

inhibidora de peroxidación lipídica mediada por formas activas de oxígeno,

también Palozza y Krinsky. (1992) han documentado el papel de la astaxantina

como un antioxidante eficiente. Por lo que sugieren que los carotenoides son

importantes en la protección de los lípidos de las membranas contra la

peroxidación (Miki, 1991).

Durante el crecimiento los salmónidos absorben los carotenoides y los

depositan en el músculo en forma de astaxantina y cantaxantina. Durante la

maduración sexual, el pigmento es movilizado y transferido a la piel en machos y a

los huevos en las hembras. Los estudios más avanzados sobre el metabolismo de


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los pigmentos se han realizado en salmón y se ha observando que la astaxantina

es absorbida, metabolizada, transportada a los tejidos y órgano blanco de los

salmónidos. El carotenoide es reducido a zeaxantina y metabolizado como

vitamina A. la absorción ocurre en el intestino donde el carotenoide es convertido

a vitamina A en la pared intestinal. La astaxantina es transportada en la sangre por

lipoproteínas siendo el hígado el mayor órgano metabólico.

1.2.5 Uso de los pigmentos en los peces de ornato

Algunas características importantes para la calidad en peces de ornato

enviados a mercado son el tamaño, forma y coloración de los mismos. Por lo que

se han realizado esfuerzos para obtener peces con mayor pigmentación en la piel.

En C. auratus se ha evaluado el efecto de la astaxantina en la pigmentación de la

piel, tratando de obtener la dosis adecuada de pigmento (25, 50, 75 y 100mg de

astaxantina) para la coloración así como la estabilidad del color (Paripatanamont y

col., 1999). Los resultados mostraron que 36-37 mg de astaxantina/kg de alimento

es la dosis que permite adquirir y mantener el color después del tratamiento y

observaron que a mayor concentración de pigmentos la distribución de

cromatóforos en la piel se incrementa (Paripatanamont y col., 1999).

Gouveia y Rema (2005) evaluaron el efecto de la astaxantina extraída de

Chorella vulgaris y astaxantina sintética, a concentraciones de 45, 80 y 120 mg de

pigmento y a diferentes temperaturas sobre C. auratus. Demostrando que la mejor

pigmentación fue con astaxantina de C. vulgaris y que la temperatura es uno de

los factores ambientales que influye en la pigmentación logrando una mejor

pigmentación a temperaturas de 26 a 30ºC.


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Se realizaron estudios del efecto de los carotenoides en la pigmentación de

la piel de peces payaso ( Amphiprion ocellaris) en donde se probaron tres tipos de

pigmentos (astaxantina, β-caroteno y cantaxantina) adicionados a la dieta a

concentraciones de 20, 50 y 100 ppm, revelando que la dosis de pigmento no

cambia el brillo, coloración o tonalidad del organismo, pero que el tipo de pigmento

si altera el tono siendo la astaxantina quien incrementó el tono de color rojo.

También se observó que, si este pigmento es eliminado de la dieta, el tono no se

reduce, pero si la saturación del mismo (Yasir y Qin, 2010).

En Hyphessobrycon callistus o pez tetra, se evaluó el uso de astaxantina, β-

caroteno y una mezcla de éstos en la sobrevivencia, crecimiento, pigmentación y

capacidad antioxidante. Se demostró que al incrementar la concentración de

pigmentos, se ve favorecida la coloración en el cuerpo del pez, además este

organismo convierte el β-caroteno a astaxantina para almacenarlo y depositarlo en

la piel y al incrementar la concentración de pigmentos, la coloración en el cuerpo

también es mayor. Además, se ha observado que este tipo de carotenoide tiene

capacidad antioxidante disminuyendo la actividad de las enzimas endógenas

como la superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, alanina transaminasa,

aspartato transaminasa, lo que protege al hígado de los radicales libres (Wang y

col., 2006).

Grether y col. (2008) han observado que los carotenoides también tienen un

efecto en la fecundación y descendencia en Poecilia reticulata (guppies), ya que

estos peces depositan los pigmentos en los huevos favoreciendo la eclosión en un

90%.


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Además de usar pigmentos sintéticos y naturales provenientes de algas y

levaduras, también se han evaluado carotenoides de plantas como Capsicum

annum que contiene capsantina, luteína, zeaxantina y β-criptoxantina. Estos se

han probado en peces de ornato (Zacco platypus) para incrementar la

pigmentación en piel, demostrando que la concentración de capsantina y

zeaxantina incrementa significativamente la pigmentación (Choong-Ryul y col.,

2010).

1.2.6 Hibiscus sabdariffa (jamaica)

Hibiscus sabdariffa es una planta que pertenece a la familia Malvaceae, ésta

se originó en Malasia y es cultivada principalmente en regiones tropicales y

subtropicales (Appell, 2003). En México se le conoce como jamaica y fue

introducido por los españoles durante la colonización (SAGARPA-ASERCA, 1999).

Los principales países productores de la jamaica son China, India y Sudán

entre otros en donde México ocupa el séptimo lugar de esta lista. Su producción

se concentra en 15 estados: Campeche, Colima, Guerrero, Jalisco, Nayarit,

Michoacán, Morelos, Oaxaca, Puebla, Quintana Roo, Sinaloa, Tabasco,

Tamaulipas, Veracruz y Yucatán (INEGI, 2005; Garzón, 2008).

Los cálices deshidratados de la jamaica son apreciados comercialmente

porque a partir de estos pueden obtenerse extractos concentrados de color rojo

con aplicación en la industria alimentaria y farmacéutica. Los compuestos

responsables de esta coloración roja son las antocianinas éstas pertenecen al

grupo de los flavonoides (Galicia-Flores y col., 2008). Además, los cálices de la

jamaica contiene diversos compuestos como: ácido cítrico, acido esteárico, ácido


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málico, ácido protocatecuico, ácido ascórbico, alcaloides, anisaldehído,

antocianinas, cera, galactosa, mucopolisacáridos, pectina, polisacáridos,

quercetina, β-caroteno y β-citosterol (Duke, 2002; Hirupanich y col., 2005).

En algunas regiones, a los extractos de esta planta se les han atribuido

diversas propiedades medicinales con acción astringente, efectos coleréticos,

digestivo, diuréticos, emoliente, reducción de la presión arterial y niveles de

colesterol, y sedativa (Tsai y col., 2002; Duke y col., 2003). También se les ha

señalado con efectos contra la hipertensión (Haji y Tarkhani, 1999; Odigie y col.,

2003), e inflamación (Dafallah y Al-Mustafa, 1996). Chia-Wen y col. (2007)

demostraron que los extractos de H. sabdariffa tienen actividad antioxidante y

antitumoral, así como capacidad para inhibir la oxidación de los lípidos de baja

densidad (LDL) la cual reduce la arterioesclerosis, e inhibe la proliferación de la

células del músculo liso, induciendo la apoptosis.

1.2.7 Propiedades de las antocianinas

Las antocianinas son compuestos solubles en agua, siendo identificadas por

dos tipos de estos compuestos (cianidinas y delfinidinas) (Pouget y col., 1990).

Las antocianinas pertenecen al grupo de los flavonoides y son hidrosolubles,

poseen un peso molecular de 400 a 1200, presentan carga positiva en su

estructura y son moléculas que proporcionan color (azul, morado y rojo). La

mayoría de las antocianinas están glucosiladas en la posición 3´ del anillo C, o en

la posición 5´ y 7´ del anillo A (Prior y Wu, 2006).


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La arabinosa, galactosa, glucosa, ramnosa y xilosa son los azúcares que

están unidos a las antocianidinas como di o tri sacáridos; existiendo

aproximadamente 17 antocianinas, pero solo seis de éstas están ampliamente

distribuidas en la naturaleza y se muestran en la figura 1.1. La antocianinas

pueden presentar también acilaciones como compuestos aromáticos o ácidos

alifáticos, por lo que la estructura de éstas varía dependiendo de su glucosilación

o acilación (Prior y Wu., 2006).

En fase acuosa, las antocianinas pueden presentar diversas formas

moleculares como: base hemiacetal, base quinoidal, catión flavilio, y chalcona, su

color relativo depende del pH (Cooke y col., 2005). Las antocianinas permanecen

estables cuando se encuentra en la forma de catión flavilio y con pH diferentes

posee variaciones en el color rojo (pH 2), incoloro (pH 5) y azul púrpura (pH 7-8).

La estabilidad de las antocianinas puede verse afectada por el pH, oxígeno y

las condiciones de almacenamiento (Kalt y col., 2000). Además de mejorar el color

en los alimentos, las antocianinas pueden prevenir la auto-oxidación de lípidos de

la pared así como la peroxidación de lípidos en sistemas biológicos (Narayan y

col., 1999).

Las antocianinas están relacionadas en muchas actividades biológicas que

impactan de manera positiva en la salud de los humanos (reducción de varias

enfermedades coronarias y cáncer, además de favorecer la actividad

neuroprotectora) (Wrolstad, 2004; Cooke y col., 2005). Las antocianinas más

importantes en las brácteas de jamaica son la delfinidina-3-sambubiósido y

cianidina-3-sambubiósido (Gradinaru y col., 2003; Hou y col., 2005).


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Figura 1.1 Principales antocianinas distribuidas en la naturaleza y su estructura

general (Prior y Wu, 2006).

Antocianinas R1 R2 R3 Espectro luz/visible (color)

Pelargonidina (Pg) H H OH 494 (anaranjado)

Cianidina (Cy) OH H OH 506 (rojo-violeta)

Delfinidina (Dp) OH OH OH 508 (violeta-azul)

Feonidina (Pn) OCH3 H OH 506 (anaranjado-rojo)

Petunidina (Pt) OCH3 OH OH 508 (azul-rojo)

Malvidina (Mv) OCH3 OCH3 OCH3 510 (azul-rojo)

c


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En la planta, las antocianinas poseen diferentes funciones como la atracción

de polinizadores, para la dispersión de semillas y la protección contra los rayos

UV. El color está dado por el número y la posición de los grupos hidroxilo y

metoxilo en la molécula, el incremento de grupos hidroxilo producen tonalidades

hacia el color azul mientras que incrementos de grupos metoxilo producen

coloración roja (Garzón, 2008).


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1.3 Justificación

En la acuacultura, el color de la piel de los peces de ornato es muy

importante ya que es un indicador de la calidad del pez y puede afectar su

aceptación en el comercio además de su precio. Por ello es que para mejorar el

color de la piel y músculo en algunos peces se han usado pigmentos sintéticos

que usualmente son agregados a la dieta comercial.

Se ha reportado que la adición de los pigmentos en el alimento incrementa

los costos de producción del alimento así como la misma operación del sector

acuacultura. Por ello es que se buscan alternativas disponibles y de bajo costo

que sustituyan a los pigmentos sintéticos. La jamaica puede ser considerada como

un pigmento alternativo para la pigmentación de peces de ornato dado que se ha

observado que posee pigmentos que pueden favorecer la pigmentación de los

peces. Sin embargo su potencial pigmentante requiere ser evaluado para

determinar su aplicación y beneficios en los peces dorados.

Para este estudio se eligió el pez dorado porque es uno de los peces más

populares en el comercio y también es de los más usados como modelo de

estudio para la evaluación de diversos tipos de pigmento, principalmente los

carotenoides por lo que es interesante estudiar el efecto de los pigmentos de

jamaica en la pigmentación de la piel y en los parámetros biométricos de los

mismos.


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1.4 Objetivos

1.4.1 Objetivo general

Evaluar el efecto de los pigmentos de la harina de jamaica de Hibiscus sabdariffa

sobre la pigmentación y los parámetros biométricos del pez dorado (Carassius

auratus).

1.4.2 Objetivos específicos

Conocer la composición fisicoquímica de la harina de la jamaica

Identificar la concentración de antocianinas totales en el cáliz de la jamaica

Evaluar el efecto de las dietas adicionadas con harina sobre los parámetros

biométricos, como respuesta a diferentes concentraciones de pigmento

utilizadas.

Evaluar el efecto de las dietas experimentales sobre la pigmentación de C.

auratus en relación a la acumulación en las células de la piel del pez.


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1.5 Materiales y Métodos

1.5.1 Material vegetal

La jamaica (Hibiscus sabdariffa, línea R5-4N) fue donada por el Ingeniero

Quintín Obispo González. Esta planta fue cultivada en el campo experimental del

Colegio Superior Agropecuario del Estado de Guerrero (CSAEGRO), Iguala

Guerrero, México. El cáliz seco se molió en un procesador de alimento (Sunbeam,

motor de 220 watts), por 3 min a temperatura ambiente. La harina fue almacenada

a 4ºC en recipientes herméticos y opacos para evitar la degradación de los

pigmentos. La harina se analizó fisicoquímicamente conforme a los siguientes

parámetros: humedad (NOM-116-SSA1-1994), extracto graso (NMX-F-615-

NORMEX-2004), proteína (NMX-F-608-NORMEX-2002), cenizas (NMX-F-607-

NORMEX-2002), fibra cruda (NMX-F.613-NORMEX-2003).

1.5.2 Extracción y cuantificación de antocianinas

A 8 g de la harina de jamaica se le adicionaron 100 mL de etanol acidificado

con ácido clorhídrico al 0.1% (v/v) (Zhao y col., 2008); la suspensión se mantuvo

en agitación orbital (200 rpm) por 24 h en oscuridad, finalmente el extracto se

separó de la harina mediante un filtrado con papel Watman No. 42.

Las antocianinas se cuantificaron mediante espectrofotometría (510-550 nm)

(Longo y col., 2005). El contenido total de las antocianinas (CTA), expresado en

mg de cianidin 3-glucósido equivalentes por 100 g de muestra seca (Zhao y col.,

2008), se calculó de acuerdo a la siguiente ecuación:


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Donde AB es la absorbancia, e es el coeficiente de extinción molar de cianidin 3-

glucósido (26900); L es la longitud de la celda (1 cm); MW es el peso molecular de

antocianinas con respecto a la cianidina (449.2); D es el factor de dilución; V es el

volumen final (mL) y G es el peso seco en mg.

1.5.3 Elaboración de dietas experimentales

Se utilizó dieta comercial en polvo para tilapia (Agribrands, PURINA S.A de

C.V, México), compuesta de 45% de proteína, 10% de grasa y 4.5% de fibra

cruda. A la dieta comercial se le adicionó almidón de papa (1%) previamente

solubilizado en agua destilada y precalentado a 60ºC (Francis-Floyd, 2002) como

aglutinante. Posteriormente se le adicionó el pigmento a diferentes

concentraciones (40, 80, 160 mg de antocianina/kg de alimento). La dieta control

se elaboró de la misma forma sin adicionarle antocianinas.

La mezcla se peletizó en un molino de alimentos (Sunbeam, 220 watts motor,

Kitchen Aid, Canadá) a fin de obtener pelets de 2 mm de diámetro, los cuales se

secaron en horno a 60ºC por 24 h. Los pelets se almacenaron en obscuridad con

recipientes herméticos y opacos a 4ºC (Royes y Chapman, 2003) para su posterior

uso.

1.5.4 Cría experimental de los peces

Se emplearon alevines de pez japonés (C. auratus) de 8 semanas de edad y

con un peso de 6.3 - 7.4 g, los organismos se aclimataron a las condiciones del


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laboratorio a una temperatura de 25 ± 2ºC, y un nivel de oxígeno disuelto de 7

ppm, alimentándolos con la dieta control durante una semana.

El bioensayo se realizó utilizando peceras de vidrio de 20L con 10 peces por

pecera, los cuales fueron distribuidos homogéneamente. Cada pecera se

consideró como una repetición y cada dieta experimental un tratamiento con tres

repeticiones. Los peces se alimentaron tres veces al día (09:00; 13:00 y 18:00 h)

en una proporción de 6% de peso corporal durante 8 semanas, la cantidad de

alimento se ajustó cada semana (Kalinowski y col., 2007).

El bioensayo se llevó a cabo bajo un fotoperiodo de 12/12 h, con agua libre

de cloro y peceras equipadas con un filtro para extraer los sedimentos. Además se

sifoneó el agua de las peceras una vez por semana reponiendo 1/3 del volumen

total del agua de la pecera y se cambió totalmente el agua cada ocho días (Yanar

y col., 2008). Durante el bioensayo se monitorearon diariamente los siguientes

parámetros: oxígeno disuelto (6-7 ppm), pH (7.3 - 7.5) y temperatura (25 ± 2ºC).

1.5.5 Parámetros biométricos evaluados

Durante el bioensayo se analizaron los siguientes parámetros biométricos:

peso corporal inicial y final, tasa de crecimiento [(peso final (g)-peso inicial

(g))/(peso inicial) * 100]; tasa de crecimiento específico [(Ln peso final (g)-Ln peso

inicial (g)/no. días)*100], el consumo de alimento [consumo de alimento (g) por los

peces durante el período de 8 semanas]; aumento de peso, tasa de conversión del

alimento [consumo de alimento (g)/ganancia de peso (g)] y la tasa de

supervivencia [(peces vivos al final/peces vivos al inicio)*100] (Gouveia y col,

2003; Kalinowski y col., 2007).


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1.5.6 Análisis histológico

1.5.6.1 Fijación de los tejidos

Al final del bioensayo se sacrificaron al azar tres peces por tratamiento, se

removieron 0.5 cm2 de la cabeza, dorso y aleta caudal. Los tejidos obtenidos se

sumergieron en formalina amortiguada al 10%: 100 mL de formalina al 37%, 900

mL de agua destilada, 4 g de fosfato de sodio dihidrogenado monohidratado

(NaH2PO4 H2O), y 6.5 g de fosfato disódico anhídrido (Na2HPO4) por 24 h con la

finalidad de preservar los tejidos (Luna, 1992).

1.5.6.2 Deshidratación de los tejidos

Se inició con una serie gradual de soluciones de alcohol etílico como agente

deshidratante. Las muestras se sumergieron en etanol al 70%, seguida de una

solución al 80%, 2 cambios con alcohol al 96% y 3 cambios de etanol absoluto

todos se incubaron por 60 min. Una vez deshidratada la muestra, se pasó a una

solución de cloroformo concentrado por 60 min para aclarar el tejido (Luna, 1992).

1.5.6.3 Inclusión de los tejidos

La inclusión se realizó infiltrando parafina líquida a 60ºC dentro de un

histocasette con el tejido, se mantuvo por 24 h en parafina y posteriormente se

sacó el histocasette y se guardó a -20ºC para su solidificación (Luna, 1992).

1.5.6.4 Corte de las muestras

Se realizaron 3 cortes histológicos de un área específica de la muestra a 10

mµ de espesor en el micrótomo (LEICA, RM2125, China). Los cortes se colocaron


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en un baño de flotación a una temperatura de 38ºC, con la finalidad de que la

muestra incluida se extienda en el agua y no forme pliegues, la muestra se

recuperó del agua con una laminilla, los cortes se fijaron a 60ºC (Luna, 1992).

1.5.6.5 Tinción histológica con hematoxilina y eosina

La tinción de los cortes se realizó con Hematoxilina de Harris y eosina

amarillenta, cuyo procedimiento se describe en la Tabla 1.2 (Luna, 1992).

Una vez teñidas las muestras, se dejaron en xileno mientras se realizó el

proceso de montaje, la muestra se cubrió con bálsamo de canadá, se colocó un

cubreobjetos para fijar la muestra, evitando que se formaran burbujas, y se dejó

secar a 50ºC (Luna, 1992).

1.5.6.6 Análisis de las muestras en el microscopio óptico

Las muestras se observaron en el microscopio óptico (NIKON eclipse, 80i,

Japón) a diferentes objetivos 20, 40 y 100X. Siendo fotografiados los tejidos con

una cámara de video integrada al microscopio (Data Image, ds 33, Japón). Se

adquirieron 30 campos por tejido para el análisis de imágenes para definir tamaño,

forma y color de las células pigmentadas (Hirata y col., 2003). Se cuantificaron

manualmente los cromatóforos de 30 campos capturados.

1.5.7 Análisis estadístico

Para el análisis de los datos se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de

una vía con una comparación de medias aplicando Tukey con un nivel de

significancia de P˂0.05. El paquete estadístico que se utilizó fue Sigma plot

versión 11.0.


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Tabla 1.2. Paso para la tinción con hematoxilina y eosina para la observación

de células pigmentantes.

Compuesto de tinción de tinción ti Tiempo

Xileno I 3 min

Xileno II 3 min

Etanol xileno 3 min

Etanol absoluto I 3 minEtanol al 90% 3 min

Agua destilada 3 min

Hematoxilina de Harris 10 min

Agua destilada 3 min

Alcohol ácido Tres rápidas sumergidas

Agua destilada Lavar abundantemente

Eosina 20 s a 1 min

Etanol al 96% 2 min

Etanol absoluto II 2 min

Etanol absoluto III 2 min

Xileno III 5 min


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1.6 Resultados y Discusión

1.6.1 Composición de la harina de jamaica

Para este trabajo fue importante conocer la composición proximal del cáliz de

la jamaica ya que se reporta que cambia con respecto a otras variedades

estudiadas por diferentes autores. Además de que es necesario saber qué

componentes se adicionaron a la dieta junto con los pigmentos, dentro de los

componentes del cáliz, se trata de una muestra con un contenido apreciable de

proteína, cenizas y fibra (Tabla 1.3). Se reporta que el componente mayoritario de

los cálices es la fibra dietética. Para esta variedad de planta, el contenido de fibra

fue de 10.02 ± 0.48 g/100 g de peso seco, contra otra variedad de jamaica que

reportan Sáyago-Ayerdi y col. (2007) que contiene 33.9 g/100 g, esta variación se

justifica debido a que son variedades diferentes y además son cultivadas bajo

diferentes condiciones ambientales que influyen en su composición (Babalola y

col., 2001).

Se determinó el contenido de ceniza, en la jamaica se encontró un contenido

de 7.36 ± 0.21 g/100g de peso seco. Babalola y col. (2001) señalan que el

contenido de la ceniza está constituido principalmente de calcio, magnesio,

potasio y zinc. Los valores referenciados en cuanto al contenido de cenizas son

más homogéneos. El potasio y calcio parecen ser los principales componentes

minerales, aunque la jamaica también es fuente interesante de hierro y magnesio

desde el punto de vista nutricional (Babalola y col., 2001). Además, los cálices

presentan en su composición vitaminas tales como tiamina, niacina y

principalmente vitamina C (Morton, 1987).


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Tabla 1.3. Composición de la harina de jamaica (H. sabdariffa)

Determinaciones g/100 g

Humedad % 10.64 ± 0.22

Grasas (g) 0.293 ± 0.0028

Proteína (g) 9.44 ± 0.79

Cenizas (g) 7.36 ± 0.21

Fibra cruda (g) 10.02 ± 0.48

Carbohidratos (g) 72.0

Azúcares reductores % 13.2 ± 0.13

Sodio (mg/kg)

Antocianinas (mg/g)

˂3.0

3.55±0.35


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Se sugiere que los micronutrientes de la jamaica podrían tener un efecto

benéfico en la salud de los peces, ya que se reporta que una deficiencia de estos

elementos en la dieta cotidiana de los peces se asocia a diversas enfermedades,

por ejemplo la presencia de cataratas en los ojos de los salmones específicamente

(Waagbo y col., 2003).

En cuanto al contenido de humedad de la harina, éste fue de 10.64 ± 0.22

g/100 g (Tabla 1.3). Algunos autores reportan que la humedad debe ser menor al

12% del cáliz deshidratado, debido a que los valores elevados de humedad

podrían repercutir en la estabilidad del color, el cual es afectado por la absorción

de agua que incrementa las velocidades de reacción así como el desarrollo de olor

(Gradinaru y col., 2003).

Otros componentes importantes del cáliz de la jamaica son la proteína,

observándose un contenido de 9.44 ± 0.79 g/100 g de muestra seca, grasas 0.293

± 0.0028 g/100 g, y la presencia de las antocianinas (Tabla 1.3). Los pigmentos

proporcionan el color rojo, los cuales está demostrado que tienen capacidad

antioxidante en humanos (Babalola y col., 2001).

1.6.2 Concentración de antocianinas

La concentración de antocianinas en la jamaica fue de 3.55 ± 0.35 mg/g la

cual es mayor en comparación con otras fuentes de pigmentos reportados como

Aristotelia chilensis (Maqui) que reportan una concentración de 2.119 ± 0.6 mg/g

en peso seco (Escribano-Bailón y col., 2006). En maíz morado chino se reporta

una concentración de 3.045 ± 1.63 mg/g de antocianinas totales en las semillas


48/158

29

secas (Zhao y col., 2008). El contenido de los pigmentos tiene relación con la

metodología que se use para la extracción (Salinas-Moreno y col., 2003), se ha

encontrado que al utilizar metanol acidificado al 1% como solvente de extracción,

la cantidad de pigmentos extraídos aumenta considerablemente. Sin embargo, el

metanol es tóxico, los pigmentos de jamaica se extraen utilizando agua como

disolvente u otros solventes que no sean tóxicos. Para este trabajo se utilizó el

etanol acidificado ya que es un solvente que extrae eficientemente los pigmentos

más que el agua, además no es tóxico y se evapora fácilmente, por lo que se optó

por utilizar este solvente para la extracción de los pigmentos ya que puede ser

utilizado para la elaboración de las dietas debido a que es menos tóxico que otros

solventes (Galicia-Flores y col, 2008).

1.6.3 Efecto de las dietas experimentales

La acuacultura es un sector que se ha dedicado al cultivo de peces y

camarones y es una de las actividades de mayor importancia económica debido a

la alta demanda de sus productos en el mercado. Este sector invierte recursos

económicos para mejorar las dietas usadas en la alimentación de los organismos

bajo cultivo.

Estas mejoras favorecen el nivel nutricional de las dietas, eficientando el

crecimiento, reproducción y otras funciones fisiológicas. Además de la mejora en

el sentido nutricional de las dietas, la acuacultura también tiene el interés de

elaborar dietas con otros aditivos para incrementar la pigmentación de la carne de

los salmones y la piel de peces ornamentales, los pigmentos más utilizados son

los de color rojo o amarillo, principalmente la astaxantina sintética, o de algunas


49/158

30

fuentes naturales de algas, cianobacterias o plantas (Maltby y col., 2003). Para

algunos peces de ornato ya se han usado fuentes de pigmentos naturales,

principalmente carotenoides que son extraídos de algunas algas, levaduras y

plantas, para incrementar la pigmentación en C. auratus (Paripatanamont y col.,

1999; Gouveia y col., 2003; Gouveia y Rema, 2005).

Los organismos mostraron un comportamiento activo de alimentación a lo

largo del bioensayo, acercándose a la dieta y consumiéndola en cuanto la

detectaban sin dejar residuos de ellas entre 5-8 min después de ser

proporcionada. Los organismos de cada réplica (dieta experimental o control)

consumieron de 40 a 47 g aproximadamente de las respectivas dietas por

semana, observándose una diferencia significativa entre los tratamientos y el

control (Tabla 1.4).

En cuanto a los parámetros biométricos evaluados en este estudio con C.

auratus se encontró que al aumentar la dosis de antocianinas en la dieta, la tasa

de crecimiento y peso ganado se incrementan, con diferencias significativas con

relación al control (Tabla 1.4).

En un estudio realizado con pigmentos de alfalfa, se observó que al

incrementar la dosis de pigmento, la tasa de crecimiento y el peso ganado

disminuye, atribuyéndose a que alguno de los componentes de la planta son

utilizados pobremente por el pez o que actúan como un antinutriente en la dieta

(Yanar y col., 2008). Con este estudio se demuestra que los pigmentos de la

jamaica pueden ser usados en C. auratus para su crecimiento, siendo este el

primer reporte sobre la aplicación de la jamaica como fuente de pigmentos

naturales en C. auratus.


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31

Tabla 1.4. Efecto de la harina de jamaica (H. sabdariffa) en los parámetros biométricos en C. auratus.

Misma letra en la misma fila no hay diferencia significativa (P˂0.05)

Concentración de pigmentos/kg de alimento (mg/kg)Parámetros Control 40 80 160Peso inicial (g) 7.43 ± 0.14 7.36 ± 0.22 6.33 ± 0.42 7.43 ± 0.23

Peso final (g) 16.73 ± 0.52 19.66 ± 0.60 17.41 ± 2.03 19.58 ± 2.07

Crecimiento (%) 124.63 ± 5.01b 167.15 ± 12.4 9a 163.16 ± 15.91a 176.26 ± 21.92a

Tasa especifica decrecimiento

1.26 ± 0.34b 1.534 ± 0.72a 1.50 ± 0.124a 1.56 ± 0.129ab

Alimento consumido (g) 42.08 ± 2.14ab 47.11±1.64a 40.70 ± 3.12b 44.84 ± 2.55a

Peso ganado (g) 11.70 ± 0.26b 14.08 ± 1.25a 11.69 ± 1.25b 13.38 ± 0.65a

Tasa de conversiónalimenticia

3.70 ± 0.11b 3.34 ± 0.03a 3.04 ± 0.20a 3.35 ± 0.04a

Supervivencia (%) 90.00 ± 0 96.6 ± 5.10 96.6 ± 5.10 96.6 ± 5.10

31


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32

En un estudio realizado con Colisa lalia se demostró que al utilizar

antocianinas y betalainas sintéticas en la dieta no presentaron un efecto

significativo en la pigmentación de la piel ni en el crecimiento comparado con el

control (Barón y col., 2008).

Durante el bioensayo se monitoreó la calidad de agua para evitar que los

peces sufrieran algún tipo de estrés. Ya que se reporta que puede afectar el

proceso del crecimiento, el organismo dedica energía para la formación de

estructuras y tejidos, este puede estar afectado por los diferentes factores

ambientales por ello es importante monitorear y mantener la calidad del agua.

(Barker y Scheibling, 2008).

En cuanto a la tasa de conversión alimenticia de los peces, no se observó

diferencia significativa entre los tratamientos, pero al comparar esos resultados

con el control se observaron diferencias, ya que al aumentar la dosis la eficiencia

disminuye (Tabla 1.4). Caso contrario a lo que se reportan con el uso de la alfalfa,

la tasa de conversión es más alta cuando la dosis de pigmentos también aumenta

(Yanar y col., 2008). Se reporta que entre más bajo sea este valor, el organismo

es capaz de convertir su alimento en biomasa. Con C. lalia al experimentar con

dietas adicionadas con antocianinas y betalainas reportaron que no se observa un

efecto significativo en la coloración de la piel en comparación con los

carotenoides, pero si en el crecimiento, además de que los pigmentos utilizados

no fueron de fuentes naturales (Barón y col., 2008).


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33

Con C. auratus las diferencias externas de color no fueron muy aparentes,

sin embargo con el análisis histológico se observó una agregación de células

donde se almacenan los pigmentos. La literatura reporta que la pigmentación de la

piel de los peces está influenciada por el tipo de pigmento suplementado en la

dieta y otros factores como: fuente, concentración y estructura del pigmento en la

dieta (Paripatananont y col., 1999; Gouveia y col., 2003); además de la edad y

tamaño del pez (Torrisen, 1985) así como de los factores ambientales.

1.6.4 Análisis de la piel de los organismos alimentados con harina de jamaica

En los cortes histológicos se logró identificar un tipo de cromatóforos de

acuerdo a su morfología se encontraron melanóforos e iridóforos (Fig 1.2). Los

melanóforos son un tipo de cromatóforos que acumulan pigmentos de color oscuro

o negro, y se pueden encontrar formando gránulos de pigmentos dispersos o

agregados en el citoplasma, los gránulos dispersos se caracterizan por tener

proyecciones citoplasmáticas que salen del centro de la célula y se entrelazan con

fibras de tejido conectivo (Kaleta, 2009), los melanóforos son el principal tipo de

células que se identificaron en todo el cuerpo del pez, siendo más abundantes en

el área de la cabeza, esté tipo de células se identificaron primeramente en la

muestra control (Fig. 1.2).

En la figura 1.2 se muestra al grupo control, donde se observa la presencia

de los melanóforos distribuidos en cabeza, dorso y aleta caudal este tipo de

células se identificó de acuerdo a lo reportado en la literatura por su tamaño que

va de los 10-100 µm, a su forma oval y presencia de color oscuro.


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34

Figura 1.2. Tejido de la cabeza del control donde se ubican los cromatóforos.

Melanóforos

20 µm


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35

Otro tipo de células identificado de acuerdo a su forma y tamaño fueron los

iridóforos (Fig.1.3); se reporta en la literatura que estas células son filamentosas y

su principal característica es que reflejan la luz y por lo tanto hacen que se tornen

de diferentes tonalidades iridiscentes, la figura 1.3 muestra el tejido de peces

alimentados con pigmentos 160 mg/kg de alimento en esta figura se observa la

presencia de los iridóforos en la cabeza, dorso y aleta caudal del pez.

En los tratamientos se identificaron estas mismas estructuras con algunas

diferencias entre ellos con lo cual se pudiera sugerir que tanto la presencia y

distribución de los melanóforos en la piel fueron debidas a la adición de pigmentos

en la dieta.

La pigmentación de los peces puede deberse a la combinación entre

iridóforos y melanóforos detectados (Fig. 1.2 y 1.3), la cual se reportada como una

cooperación entre estas células que proporcionan la coloración de la piel en los

peces (Hirata y col., 2003; Kaleta, 2009). Por otro lado se reporta que los gránulos

de melanina agregados en los melanóforos hacen que los iridóforos se descubran,

y por lo tanto dispersan y reflejan la luz sobre los xantóforos filtrando la luz

creando diferentes tonos en la piel (Hirata y col., 2003).

Después de haber identificado las células se realizó la cuantificación de

éstas en las partes del cuerpo de los peces, se observó una mayor distribución en

el área caudal seguida de la cabeza y dorso (Fig.1.4).


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36

Figura 1.3. Identificación de los iridóforos en tejido de los peces alimentados con

las dietas experimentales (160 mg/kg de alimento). Muestra de tejido con luz

polarizada, a) tejido de la cabeza; b) dorso; c) cola. Muestras observadas a 20x.

(b)

(a) (b)

(c)


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37

En la figura 1.5 se muestran los cortes histológicos donde se observa la

distribución de las células de cada tratamiento, en todos se encontraron

melanóforos e iridóforos donde la diferencia se logra observar en la distribución de

las células en los diferentes tejidos analizados (cabeza, dorso y aleta caudal). De

acuerdo con estos resultados y con lo reportado por Xu y col. (2006) la distribución

de los pigmentos en el cuerpo de C. auratus no se encuentra de manera

homogénea. Con los resultados obtenidos en la presente investigación se observa

que la distribución y cantidad de los cromatóforos está relacionada con la

localización en el cuerpo y la edad del espécimen, tal como lo sugiere Xu y col.

(2006). En la figura 1.5 se muestran todos los cortes histológicos donde se

observa la distribución de las células de cada tratamiento, en todos se encontraron

melanóforos e iridóforos donde la diferencia fue en la distribución (Fig. 1.5)


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38

Figura 1.4. Número de cromatóforos por campo en diferentes partes del cuerpo deCarassius auratus, alimentados con las diferentes concentraciones deantocianinas. Misma letra no hay diferencia significativa P˂0.05

DIETAS

sin pigmento (40 mg) (80 mg) (160 mg)

Núm

erodecélulas/área

0

50

100

150

200

250

cabeza

dorso

aleta

0 40 80 160

Antocianinas mg/kg de alimento


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39

Figura 1.5. Cortes histológicos de los peces alimentados con las dietas experimentales. Se hace una comparación

de la distribución entre los tratamientos y el control. C: cabeza, D: dorso y A: aleta caudal.

D

A

C

0 mg 40 mg 80 mg 160 mg

39


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40

1.7 Conclusiones

El uso de las antocianinas como aditivo en la dieta de los peces es una

alternativa para fortalecer el crecimiento en peces de ornato.

C. auratus utilizó eficientemente la jamaica como fuente de pigmentos.

Los resultados del presente estudio indican que C. auratus utilizó

eficientemente la jamaica como fuente de pigmentos y que la adición de

antocianinas como fuente natural de pigmentos no afectó negativamente los

parámetros.

Se observó la presencia de células que pudieran estar acumulando los

pigmentos.

Se observó una mayor densidad de los melanóforos en aleta caudal en los

peces alimentados con pigmentos de mayor concentración comparación

con control y con las concentraciones de pigmento menores.


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Pérez, 2013 Tesis Veronica

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