PCR

Técnicas de Biología molecular

amplificación de la secuenciacomprendida entre los dos cebadores

ciclos de amplificacióndesnaturalizaciónreasociación polimerización

Karry Mullis 1985Premio Nobel 1993

Componentes del sistema

1. Oligonucleótidossecuencia que flanquean el fragmento a amplificar

actúan como cebadorestamaño de 20-24 nucleótidosdiseño: 3’-OH bien apareadoposibilidad de mutagénesis dirigida

Componentes del sistema

2. TampónTris pH 8,4, importancia de la concentración de MgCl2. Afecta a: incorporación de dNTP, actividad polimerasa y Tm cebador-molde

A 0,5 mMB 0,8 mMC 1,5 mMD 2 mM E 2,5 mMF 3 mM

Efecto de la concentración de MgCl2en la PCR

Componentes del sistema

3. PolimerasasDirección de polimerización 5’-3’. Necesita 3’-OH. Copian molde. Usan dNTP

Taq Thermus aquaticus 40 + - -Vent Thermococcus litoralis 400 - + -Pfu Pyrococcus furiosus 120 - + -Tth Thermus thermophilus 20 + - +

DNA polimerasa a) b) c) d) e)

a) origen b) vida media (min) a 95ºC c) exo 5’ d) exo 3’ e) transcriptasa inversa

Componentes del sistema

4. dNTPs

dATP, dGTP, dGTP, dTTP a 100-200mMPueden utilizarse marcados con 32P, quimiolumisiscentes o fluorescentespara que el producto del PCR se use como sonda.

5. Molde

DNA cualquier secuenciaRNA usando polimerasas con actividad de trascriptasa inversa (RT-PCR)

Protocolo general

Ciclo desnaturalización reasociación polimerización

1º ciclo 5’/94ºC 2’/50ºC 3’/72ºC2º-34º ciclo 1’/94ºC 2’/50ºC 3’/72ºC último ciclo 1’/94ºC 2’/50ºC 10’/72ºC

Aplicaciones de la PCR

Diagnosis de enfermedadesEstablecimiento de la huella genética

Aislamiento de genesSecuenciaciónMutagénesis

Amplificación de RNA: RT-PCR (trascriptasa inversa)Amplificación de secuencias adyacentes: PCR inversa

PCR en tiempo real