Patologia hpv

+

Patologia Infecção HPV

Hugo SousaBScH Microbiology

MSc OncologyPhD Biomedical Sciences

MD Student_________________________________________Serviço Virologia – Lab Biologia Molecular

Grupo Oncologia MolecularIPO Porto FG EPE

+Características Gerais

+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)

Vírus com distribuição ubíqua Independentemente do género, idade, etnia ou localização

geográfica

Vírus epitelio-mucosotrópico Infecta células epiteliais e mucosas

Características Gerais


Descritos quase 200 tipos de HPV



Família Papillomaviridae

Estrutura icosaédrica ( 55nm)



Vírus de DNA cadeia dupla Genoma com 8000pb positivo

2 genes estruturais (L1 e L2)

7 ou 8 genes precoces (E1 a E8)


+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Características Gerais

GENE FUNCTION

E1 DNA-dependent ATPase, ATP dependent helicasE;Allow unwinding of the viral genome and act as an elongation factor for DNA replication.

E2 Responsible for recognition and binding of origin of replication. Exists in two forms: full length (transcriptional transactivator) and truncated (transcriptional repressor). The ratio of these found in the heterotrimeric complex formed before complexing with E1 regulates transcription of viral genome.

E3 ????

E4 Late Expression: C terminal binds intermediate filament, allowing release of virus-like particles. Also involved in transformation of host cell by deregulation of host cell mitogenic signalling pathway.

E5 Obstruction of growth suppression mechanisms: e.g EGF receptor; activation of mitogenic signalling pathways via transcription factors: c-Jun and c-Fos (important in ubiquitin pathway degradation of p53 complex by E6). Inactivation of p21 (p53 induced expression halts cell cycle until DNA is proof-read for mutations).

E6 Transformation of host cell by binding p53 tumour suppressor protein.

E7 Transforming protein, binds to pRB/p107.

E8 ?????


Baixo-Risco: HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89

Alto-Risco HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59 Provável Alto-risco: HPV26, 53, 66, 68, 73 e 82

Risco Indeterminado

HPV30, 32, 34, 62, 67, 69, 71, 74, 83, 84, 85, 87, 90 e 91



HPV-associated diseases HPV types

Skin warts 1,2,3,4,7,10,26,27,28,29,41,48,57,60,63,65,75,76,77,78

Epidermodysplasia verruciformis benign lesions 3,5,8,9,12,14,15,17,19,20,21,22,23,24,25,36,47,49,50

Epidermodysplasia verruciformis squamous cell carcinoma5,8,14,17,20,47

Periungual squamous cell carcinoma 16,34,35

Laryngeal papillomas 6,11

Oral focal epithelial hyperplasia 13,32

Squamous cell carcinoma (tonsil) 16,33

Anogenital warts 6,11,40,42,43,44,54,55,74

Low-grade anogenital intraepithelial neoplasia 6,11,16,18,30,31,33,34,35,39,40,45,51,52,56,57,58,59,61,64,66,67,68,70,71,72,73,74

High-grade anogenital intraepithelial neoplasia 16,18,31,33,34,35,39,45,51,52,56,58,59,68

Squamous cell carcinoma (cervix mostly) 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68

Adenocarcinoma (cervix mostly) 16,18


Baixo-Risco: HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89 Provocam aparecimento de papilomas/verrugas…



Alto-Risco HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59 Desenvolvimento de lesões baixo/alto grau e cancro



Yearly Incidence Counts of HPV-Associated Cancers in the United States, 2003–2007

+Infecção

+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Infecção

Infecção Basal

Activação Replicação viral E1, E2, E4, E5

Amplificação Carga viral 10 1000 cópias/célula

Maturação vírus 1-3 semanas

Desenvolvimento de lesão Semanas Meses

+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Infecção

+ Mecanismo de Carcinogénese


Major Events

Escape à Resposta Imunológica

Integração DNA viral no DNA do hospedeiro

Imortalização celular

Instabilidade genómica

Mecanismo de Carcinogénese

+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Mecanismo de Carcinogénese


Integração Viral

DNA Episomal: expressão de E2 regula a expressão de E6 e E7

DNA integrado: perda de E2 permite expressão desregulada de E6 e E7

Promove Inibição replicação viral Instabilidade genética

Confere vantagem selectiva para a proliferação de células

Ocorre na maioria dos casos de HSIL

Podem co-existir formas episomais com integradas

Mecanismo de Carcinogénese

+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Mecanismo de Carcinogénese – E6

Moody and Laimonis, 2010

+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Mecanismo de Carcinogénese – E7

Moody and Laimonis, 2010

+

CANCRO COLO DO ÚTERO

+Cancro do Colo do Útero

+Cancro do Colo do ÚteroDistribuição Mundial


4ª neoplasia na mulher

Neoplasia urogenital

Alta taxas: Incidência 16 / 100 000 Mortalidade 6 / 100 000

Em Portugal


1842 – A culpa era da profissão…

1901 – A culpa era da religião…

60s – A culpa era da circuncisão…

70s – A culpa era dos Herpes…

Etiologia


1980’s – Associação com HPV

Infecção por HPV é um factor necessário mas não suficiente odds ratio: 60 (95% C.I. 49-73

Etiologia

Prof. Harald Zur Hausen (Nobel da Medicina 2008)

+Cancro do Colo do ÚteroPatologia

Desenvolvimento de Lesões Precursoras que podem evoluir para Cancro

Infecção Ca Colo Útero6 meses 3 anos 6 anos 10 anos


Colo Útero Normal Normal

His

tolo

gia

Cito

logi

a


CIN 1

His

tolo

gia

Cito

logi

a


CIN 2

His

tolo

gia

Cito

logi

a


CIN 3

His

tolo

gia

Cito

logi

a


Carcinoma In Situ

His

tolo

gia

Cito

logi

a


Carcinoma Invasor

His

tolo

gia

Cito

logi

a


Carcinoma Invasor

+

Métodos de Diagnóstico

+Diagnóstico Infecção HPVMétodos

Métodos Indirectos Colposcopia Teste Papanicolau… Serologia….

Métodos Directos Polimerase Chain Reaction (PCR) Restriction Fragment Lenght Position (RFLP) Reverse Transcriptase – PCR (RT- PCR) Real-Time PCR Sequenciação Captura Híbrida Southern Blot Hibridização em tiras CHIPS

Amplificação

Hibridização

+Diagnóstico Infecção HPVMétodos

+Diagnóstico Indirecto


Teste do Papanicolau Detecta células com alterações

Colposcopia, Papanicolau…


Teste do Papanicolau Detecta células com alterações

Colposcopia, Papanicolau…

Alterações celulares

Normal

+Técnicas Amplificação


Amplificação de um fragmento de DNA especifico;

Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir

obter milhões de cópias do fragmento pretendido;

Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de

DNA de sequência conhecida;

PCR Assays

Região Alvo

5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’

3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’


Small portion of genome targeted Allows testing of samples with poor quality DNA Small changes in virus (variants or integration) may give false

negative results

Consensus assays Generally target L1 region Type(s) determined by type specific hybridization, restriction

digestion or sequencing

Type specific assays Generally target E6/E7 region

PCR Assays

+Técnicas AmplificaçãoPCR Assays


Fig. 1. Outline of the HPV-DNA genome, presented in a linear form. The position of the early (E), late (L) genes and the untranslated region (UTR) is indicated, as well as the positions of the four most widely used primer sets CPI/II (Tieben et al., 1993), MY09/11 (Hildesheim et al., 1994), GP5+/6+ (Jacobs et al., 1997), SPF10 (Kleter et al., 1998) and Roche Amplicor HPV assay with their respective amplimer sizes (the precise location of the primers, used in the Roche assay is unknown). The 291 bp fragment used for formal classification of HPV genotypes (Chan et al., 1995; de Villiers et al., 2004) is shown in the L1 region.

PCR Assays


Primers MY09: 5´- CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC – 3´ MY11: 5`-GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG- 3

São primers degenerados e usam nucleótidos modificados: M = A ou C R = A ou G W = A ou T Y = C ou T

Fragmento de 449pb

PCR Assays


RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais);

Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela actividade diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência específica)

Presença de polimorfismo Perda ou ganho de local de restrição Variação no tamanho de fragmentos de DNA.

Genotipagem

5’ – (…) ACTGA (…) – 3’

3’ – (…) TGACT (…) – 5’

+Técnicas AmplificaçãoGenotipagem


Baixo-Risco

HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89

Alto-Risco

HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 5

Provável Alto-risco

HPV26, 53, 66, 68, 73 e 82

Risco Indeterminado

HPV30, 32, 34, 62, 67, 69, 71, 74, 83, 84, 85, 87, 90 e 91

+Técnicas de Hibridização


Alvo – DNA ou RNA

Utilização de sondas específicas

Possibilidade de diferenciação entre subtipos de vírus

Técnicas Captura Híbrida Hibridização em tiras Southern Blotting CHIPS


Principio da técnicaHibridização de Ácidos NucleicosAmplificação sinal por QuimioluminescênciaMétodo semiquantitativo

MétodoHibridização amostras positivas com sondas específicasComplexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplacaReacção com anticorpo secundário conjudado com FAAdição de reagente e detecção por quimioluminescência

Captura Híbrida

+Técnicas de HibridizaçãoCaptura Híbrida

45 minutesat 65ºC

60 minutesat 65ºC

60 minutesagitação

30 minutes

15 minutes

+Técnicas de HibridizaçãoSouthern Blot

+Técnicas de HibridizaçãoHibridização em Tiras

+Técnicas de HibridizaçãoCHIPs

Tubos ou lâminas com sondas específicas para cada subtipo;

Tipagem de vírus: HPV, HCV, HIV


56

18

16

66

+

Casos Clínicos

+Caso Clínico #1

História Clínica 37 anos Sexo feminino Divorciada 2 filhos Bom estado geral

Queixas principais Escorrências esbranquiçadas Dor durante acto sexual

Exame ginecológico Colo uterino com zona

vermelha peri-orificial extensa

+Caso Clínico #1

História Clínica 37 anos Sexo feminino Divorciada 2 filhos Bom estado geral

Queixas principais Escorrências esbranquiçadas Dor durante acto sexual

Exame ginecológico Colo uterino com zona

vermelha peri-orificial extensa

Diagnósticos Diferenciais Candidíase Herpes Genital Lesão/Cancro do Colo do

Útero

Suspeitas Vírus do Papiloma Humano Candida Albicans Herpes simplex 1/2

+Caso Clínico #1

Citologia Células atípicas Lesão baixo grau

Raspagens Colo do Útero HPV Alto-Risco Positivo Herpes Simplex 2 Positivo

Biópsia Colo do Útero CIN 2

Cito

logi

aH

isto

logi

a

+Caso Clínico #2

História Clínica 8 anos Sexo masculino

Sinais e Sintomas Voz ciciada Rouquidão Odinofagia (dor à

deglutição) “Respiração rude”

+Caso Clínico #2

Diagnósticos Diferenciais Asma Infecção respiratória Cancro da Laringe Papilomatose Laríngea

Suspeitas Respiratory Syncicial Virus Cytomegalovirus Influenza virus Human Papillomavirus

História Clínica 8 anos Sexo masculino

Sinais e Sintomas Voz ciciada Rouquidão Odinofagia (dor à

deglutição) “Respiração rude”

+Caso Clínico #2

Sangue – Biologia Molecular DNA CMV neg DNA RSV neg RNA InfA, B, C neg DNA HPV neg

Biópsia Lesao

papilomatosa/verrucosa HPV positivo

Diagnóstico:Papilomatose laríngea

Human Papillomavirus (HPV)

+

Prevenção

Como se pode prevenir?

Castidade!?!?!?

Abstinência sexual !?!?!?

Monogamia !?!?!?


Uso de PreservativoÉ a medida mais eficaz para prevenir DST e travar a sua disseminação, mas não confere protecção absoluta para a infecção por HPV…

Exames ginecológicos regulares

Precauções com parceiros e comportamentos de risco


Teste do Papanicolau... Rastreioo Detecta células com alterações

30

2/3 anosCitologia

Citologia + HPV

< 3

0 a

nos

18 21 30

3/3 anos

AnualInício actividade

sexual

3

0 a

nos

3 anos


Vacinas profiláticas oferecem grandes promessas no futuro…

Merck® (Gardasil™)Vacina tetravalente (HPV6, 11, 16 e 18)

Glaxo SmithKline® (Cervarix™)Vacina bivalente (16 e 18)


Vacinas profiláticas em Portugal

•Vacina integrada no Programa Nacional de Vacinação

(Despacho n.º 8378/2008, de 20 de Março)

Merck® (Gardasil™)

Vacina tetravalente (HPV6, 11, 16 e 18)

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Hugo SousaBScH Microbiology

MSc OncologyPhD Biomedical Sciences

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Grupo Oncologia MolecularIPO Porto FG EPE

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