Erik Olsen, Jeppe Andreasen, Kim Sørensen, Mads Poulsen og

Stine Harbo KBT1-324a

P1: AROMASTOFFER

2

3

Abstract

Adulteration of nutritional products is a concern regarding the public safety, the eco-

nomic value of the product, hence the consumer receives value accordingly and further-

more from the viewpoint of a competitive business market. A growing consumer inter-

est in products of a natural origin is cause for concern regarding the economical profits

to be made by adulteration. With the change of direction of larger companies such as

Nestlé, Kellogg’s and Hersche, eliminating synthetic vanilla from their production in fa-

vor of natural, this causes the market of vanilla to be in rapid development. The follow-

ing paper will look to investigate the term “natural” and the requirements to obtain the

classification at different geographic locations. Various techniques available to distin-

guish products labelled incorrect, by fault or intent, will be investigated in the report ac-

cordingly. Additionally, samples of 3 store bought extracts, synthetic p-vanillin and

self-made extract derived from Madagascar vanilla beans will be investigated by the

methods of analysis: IR-Spectrophotometry and GC-MS, eventually diversities as well

as similarities of the samples will be commentated.

4

Forord

Rapporten er udarbejdet af gruppe KBT16-324a fra kemi- og bioteknologiingeniør,

AAU Esbjerg, i forbindelse med P1 projektet i 1 semester 2016.

Ud fra emnet aromastoffer, blev mere specifikt udvalgt emnet vanilje, derpå blev formu-

leret et initierende problem: ”Hvad er kravene for betegnelsen naturlig vanilje, og hvor-

dan reguleres dette? Samt hvordan forholder produktionen sig til, at forbrugerne i sti-

gende grad efterspørger et naturligt fremkommet produkt?” Det medførte problemformu-

leringen: "Kan man via analysemetoder uden referencestoffer autentificere vaniljeeks-

trakter?"

Målgruppen er andre evt. kemistuderende, andre med samme faglige kompetencer og

personer med interesse for problemstillingen.

Der er skrevet teori ud fra empiri og undersøgelse på området. Yderligere laboratorieun-

dersøgelser har givet et dybere indblik på emnet.

Projektet blev udarbejdet for at give medlemmerne af gruppen et større indblik på brug

af laboratorieudstyr til analyse. Samtidig bidrages til en udvikling af en større faglig vi-

den og anvendelse af metoder til styring, strukturering og brug af ressourcer indenfor

projektarbejde.

Personer som har bidraget med vejledning, hjælp og informationer til projektet: Jens

Muff, gruppevejleder, Torben Rosenørn, gruppekonsulent, Dorte Spangsmark, laborant,

Arvid Fromberg, vejleder DTU, Fødevarestyrelsen og FDA.

5

Indhold 0.0 Indledning ............................................................................................................................... 7

1.0 Lovgivningen .......................................................................................................................... 8

1.1 Den amerikanske kontra den europæiske lovgivning .......................................................... 8

1.1.1 Vanilje ekstrakt ............................................................................................................ 9

1.1.2 Lovgivningen ift. Vanillin ............................................................................................ 9

1.2 Sikkerhedsforanstaltninger ift. vanillin ............................................................................. 10

2.0 Produktion af vanilje/vanillin ................................................................................................ 12

2.1 Vanilje via v. planifolia & v. tahitis .................................................................................. 12

2.1.1 V. Planifolia ............................................................................................................... 12

2.1.2 V. Tahitis .................................................................................................................... 13

2.1.3 Produktion & bestøvning ........................................................................................... 13

2.2 Biokemiske processer ........................................................................................................ 15

2.2.1 Produktion via ferulasyre ........................................................................................... 15

2.2.2 Produktion via glukose ............................................................................................... 16

2.2.3 Produktion via eugenol ............................................................................................... 17

2.3 Syntetisk vanilje ................................................................................................................ 18

2.3.1 Syntese af vanillin via catechol & guaiacol ............................................................... 18

2.3.2 Fra lignin til Vanillin .................................................................................................. 21

3.0 Konklusion på problemanalyse ............................................................................................. 24

4.0 Problemformulering .............................................................................................................. 25

5.0 Autenticitet ............................................................................................................................ 25

5.1 Forfalskning af vaniljeprodukter ....................................................................................... 26

5.2 Kemiske og fysiske forskelle mellem syntetisk og naturlig vanilje .................................. 28

5.3 Autenticitering af vanilje ................................................................................................... 31

6.0 Analysemetoder ..................................................................................................................... 34

6.1 IR- Spektrofotometri ......................................................................................................... 34

6.2 Gaskromatografi ................................................................................................................ 37

6.3 Massespektrometri ............................................................................................................ 40

6.4 HPLC - High-performance liquid chromatography .......................................................... 42

6.5 Afgrænsning af analysemetoder ........................................................................................ 43

7.0 Eksperimentelt ....................................................................................................................... 44

7.1 Forsøgsbeskrivelse ............................................................................................................ 44

7.2 Forsøgsresultater ............................................................................................................... 47

7.2.1 FTIR Resultater .......................................................................................................... 47

7.2.2 GC-MS resultater ....................................................................................................... 51

6

8.0 Diskussion ............................................................................................................................. 58

9.0 Konklusion ............................................................................................................................ 61

Litteraturliste: .............................................................................................................................. 63

7

0.0 Indledning

Aroma er en relativ beskrivelse, der kan dække over både lugt- og smagsoplevelserne.

Dette skyldes, at de har meget med hinanden at gøre[1]. F.eks. kan tungen kun frembringe

fem forskellige smagsoplevelser. Smagsoplevelserne er salt, sødt, surt, bittert og umami.

Resten af aromaoplevelsen kommer fra lugtesansen. Det kan derfor være svært at skille

lugt og smag ad. Dette er også grunden til, at man som forkølet ikke kan smage noget. [1]

Menneskets aromaoplevelser er forskellige. Dette kan blandt andet udledes fra lugtesan-

sen, hvor nogle mennesker ikke kan lugte som andre eller har en anden opfattelse af lug-

ten. Dette skyldes, at vi har mange receptor-proteiner, som forskellige relaterede duftmo-

lekyler skal binde sig til, før vi kan lugte stoffet. [2] Hvis man ikke har receptorerne, der

passer til duften, vil man ikke kunne registrere stoffet. [3]

Stoffets struktur og vægt har indflydelse på aromaoplevelsen. I den sammenhæng skal

stoffet være relativt flygtigt, for at vi kan lugte stoffet.[3] Vanillin har et kogepunkt på

285 ºC, men fordamper stadig svagt ved stuetemperatur og kan registreres i recepto-

rerne.[3]

Vanilje er et af de største produkter indenfor aromastoffer. Generelt bliver vanilje brugt i

over 18.000 produkter på det globale marked, og i 2011 blev der produceret omkring

16.500 ton vanilje[4]. Der findes tre kategoriseringer af vanilje: naturlig vanilje, syntetisk

vanilje og naturidentisk vanilje. Hovedbestanddelen af vanilje består af stoffet vanillin.

Efterspørgslen på naturlig vanilje er steget voldsomt siden 2011. Dette kan udledes, fordi

der var en prisstigning fra ca. 20 US dollars/kg i 2011 til over 240 US dollars/kg i 2016,

uden at der skete nogle store ændringer i produktion[5]. En ringere kvalitet kan også haft

indflydelse på markedet.

Da naturlig vanilje kan være op til 10 gange dyrere end syntetisk vanilje, kan det forestil-

les, at der ville være god grund til at sælge et syntetisk produkt som et naturligt og derved

sælge et produkt dyrere. Da det før har været et problem, eller stadigt er det, giver det god

grund til, at undersøge hvilke metoder der er til at udføre kvalitetskontrol, for at sikre at

et produkt er legitimt.

Den generelle opfattelse af naturlig vanilje er, at det kommer fra vanilje planten, direkte

fra naturen. Dette er dog ikke den lovmæssige definition, som producenter benytter. I

stedet går de efter, hvad lovgivningen dikterer som naturlig vanilje. Lovgivningen sætter

nemlig reglerne for, hvornår et produkt kan kaldes naturligt. Der estimeres et stigende

forbrug af biovanillin. Dette rejser etiske spørgsmål mht. produktionen og forbrug. [6]

Dette skaber grundlag for at undersøge følgende:

"Hvad er kravene for betegnelsen naturlig vanilje, og hvordan reguleres dette? samt hvor-

dan forholder produktionen sig til, at forbrugerne i stigende grad efterspørger et naturligt

fremkommet produkt? ”

For at besvare dette vil vi først undersøge lovgivningen vedrørende betegnelsen naturlig

vanilje. Derudover vil vi undersøge de forskellige produktionsmetoder, der benyttes til

produktionen af vanilje. Derefter vil vi undersøge mulighederne i at autenticitere vanilje

via analysemetoder. Nogle af disse analysemetoder vil vi desuden selv benytte til at ud-

føre forsøg i vores egen autenticitering, for at undersøge mulighederne i autenticitering.

8

1.0 Lovgivningen

Det følgende afsnit omhandler lovgivningernes beskrivelse af naturlige aromastoffer og

syntetiske aromastoffer. Hvis et produkt betegnes naturlig, er det ikke ensbetydende med,

at produktet kommer fra naturen. Betegnelsen afhænger af hvilke regler produktet er om-

fattet af, hvilket afhænger af lokaliteten, da reglementet for definitionen af naturligt va-

nilje ikke er global.

1.1 Den amerikanske kontra den europæiske lovgivning Produktionen af fødevarer kan foregå på adskillige måder, grundet nutidens mange tek-

nologiske muligheder. Det har den udfordring, at ordet naturligt ikke bare referere til ét

facit men en mere kompleks størrelse. De forskellige verdensdele har således vedtaget

deres egen definition af, hvad en naturlig ingrediens er[7].

Den europæiske fødevareautoritet, EFSA, er hovedorganisationen indenfor forskningsba-

serede risikovurderinger mht. regulering og styring af fødevarer i EU. Organisationen

blev først oprettet i år 2002[8]. Derudover er der mindre enheder, som regulerer og styrer

fødevarer, der har etableret sig rundt i verden, eksempelvis fødevarestyrelsen i Danmark.

Der arbejdes på at samle alle enhederne, således at systemet vil have et universelt regu-

lerings- og styringssystem. Den europæiske definition på en naturlig fødevare, aroma

mm, som findes i Europa-Parlamentets og rådets forordning (EF) Nr. 1334/2008 af 16.

december 2008, lyder som følgende:

”Basismaterialet skal være vegetabilsk, animalsk eller mikrobiologisk. Produktionen skal

produceres via en traditionel proces af fødevaretilberedning”[7]

I produktionen af aromaen skal naturlig aroma foregå enten ved en traditionel proces, som

ifølge EU er en af de følgende[9], som ses på Figur 1:

Figur 1 - tabel over naturlige produktionsmetoder ift. EU:

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/DA/ALL/?uri=CELEX:32008R1334

http://eur-lex.europa.eu/legal-content/DA/ALL/?uri=CELEX:32008R1334

9

Råmaterialet skal således stamme fra vegetabilske, animalske eller mikrobiologiske kil-

der.

Den amerikanske version af definitionen på en naturlig aroma, som findes ved FDA’s

CFR - Code of Federal Regulations Title 21, er:

”En essentiel olie, oleoharpiks, essens eller ekstraktiv, protein hydrolysat, destillat eller

hvilket som helst produkt, som er blevet ristet, opvarmet eller via enzymproces, som in-

deholder aromastoffer udvundet fra krydderi, frugt, frugtjuice, grøntsager, grøntsags-

juice, gær, planter, bark, knopper, rødder, blade eller lignende plante materiale, kød, fisk

og skaldyr, fjerkræ, æg, mejeriprodukter eller fermenteret produkter, hvoraf deres pri-

mære funktion er at give aroma frem for ernæring.” [10]

Naturlig aroma er et materiale som er godkendt af ”Food and Drug Adminstration”, FDA,

hvilket er et produkt, som er naturligt fra starten af processen.

Forskellen i de to definitioner ses i, at den amerikanske lovgivning betegner et produkt

som naturligt, hvis råmaterialet findes i naturen. Modsat er EU-reglementet, som ikke

definerer råmaterialet som et stof, der nødvendigvis kommer fra naturen. EU-reglementet

ligger derimod vægt på at processen er en naturlig proces. Debatten ligger således i, hvad

der er en traditionel proces, og i det hele taget hvad fødevarer er. [11]

I Asien er den overordnede lovgivning delt op i forskellige områder. Blandt andet Mel-

lemøsten, hvor lovgivningen hovedsageligt er påvirket af Koranen, men også en moderne

regulering for indehold mm. i fødevarer er blevet etableret. Saudi Standard 951/1997 de-

finerer naturlige aromaer, som aromaer udvundet fra vegetabilske eller animalske kil-

der.[12]

1.1.1 Vanilje ekstrakt

Naturlig vanilje ekstrakt er i USA defineret, som værende en ekstrahering af vaniljebøn-

ner i en vandig opløsning med ethanol. FDA’s defintion på vanilje ekstrakt er, at der

som minimum pr. 100 ml ekstrakt skal indeholde 35% alkohol w/v% for 10 g vanilje-

bønner, som maks. må indeholde 25 % fugt. For syntetisk vanilje skal det minimum in-

deholde 0,75 g vanillin pr. 100 ml for at det må benævnes som et ekstrakt.[13]

Dog må den godt indeholde en ekstra ingrediens ud af 5 mulige, de mulige er: glycerin,

propylen glykol, sukker, dextrose og majssirup.[10]

Lige meget om det er syntetisk eller naturlig vanilje, ser det ikke ud til at det gør en for-

skel i lovgivningen, bortset fra hvordan man deklarere produktet.

Der er ingen oplyste informationer omkring lovgivningen indenfor EU. Der er dog lov-

givning mht. produktionen.

1.1.2 Lovgivningen ift. Vanillin

EU-reglementet samt den amerikanske lovgivning betegner naturligt vanillin, som væ-

rende ekstraheret direkte fra bønnen. Ved adskillelsen af de forskellige komponenter i

vanilje, vil den destillerede vanillin ift. EU-reglementet og den amerikanske lovgivning

betegnes som ”naturligt vanilje aroma”.[7]

Vanillin kan som tidligere beskrevet blive udvundet fra mange forskellige kilder. Hvis

vanillin udvindes fra ferulasyre, som er en carboxylsyre udvundet fra eksempelvis risklid,

og der anvendes en naturlig proces, betegnes produktet både ift. lovgivningen i EU og

10

USA som ”naturlig aroma”. Men hvis vanillin er blevet produceret via en anden kilde for

eksempel guaiacol, som udvindes fra petrokemikaliske forbindelser, vil det være godtaget

ift. EU-reglementet at betegne det færdige produkt som ”naturlig”, hvis processen er en

biokemisk. Derimod vil et produkt fermenteret fra samme kilde, betegnes som ”kunstigt”

eller ”syntetisk” ift. den amerikanske lovgivning.[7]

Hvis vanillin er udvundet fra lignin, som er et restprodukt fra papirproduktionen, siger

EU-lovgivningen og den amerikanske lovgivning, at det færdige produkt ikke må beteg-

nes som naturligt, men går under kategorien ”syntetisk aroma”, da de nuværende proces-

ser forløber ved en ikke traditionel metode. [7]

En anden kilde til at opnå en sammenlignelig oplevelse af vaniljearomaen er ud fra ethyl

vanillin, som ikke findes naturligt i naturen, men kan fremstilles syntetisk i laboratoriet.

Det færdige produkt betegnes ift. EU-reglementet som ”vanilje smag”, der antyder, at

produktet er syntetisk. På den front er den amerikanske lovgivning mere streng, idet de

vil angive det færdige produkt udvundet fra ethyl vanillin som værende ”kunstig vanilje

aroma.” [7]

Ift. de oplyste informationer, kan det udledes, at EU-lovgivning tillader, at flere produkter

betegnes som naturligt udvundet. Dvs., at EU-lovgivningen ikke specificerer betegnelsen

naturligt i samme grad som den amerikanske lovgivning gør. Definitionen er langt mere

bredt ud, såsom ”naturligt aromastof”. Rent logisk skal man være påpasselig med at kon-

kluderer, hvor naturligt et produkt er. Et af de helt store problemer er, at der ingen fælles

lovgivning i verdenen er inden for aromastoffer, hvilket komplicerer det overordnet bil-

lede af hvad der er naturligt og hvad der ikke er. [7]

1.2 Sikkerhedsforanstaltninger ift. vanillin Undersøgelser viser, at vanillin er skadelig overfor fisk og andre dyr, som lever i vand.

Dog er vanillin ikke klassificeret som skadelig for miljøet, da vanillin er biologisk ned-

brydeligt, dvs. det via organismer i naturen gradvist bliver nedbrudt. Dertil skal nævnes,

at processen bioakkumulation, hvor skadelige kemiske stoffer optaget af en mindre orga-

nisme akkumuleres videre til en større organisme i det næste led, som følge af at den

mindre organisme indtages som føde for en større organisme, ikke forløber pga. den bio-

logiske nedbrydningseffekt af vanillin.[14] Konklusionen er draget ud fra octanol-vand

fordelingskoefficienten Ko/v. Værdien fortæller, hvor meget et stof er opløst i det upolære

stof octanol i forhold til det polære stof vand. Biokemisk set oplyser Ko/v-værdien blandt

andet om i hvor høj grad, et skadeligt stof optages i det upolære fedtvæv.[15] Idet værdien

af log(Ko/v) af vanillin kun er på 1,21, som ses på Figur 2, der oplyser om grænsen ift. en

skadelig virkning på organismer ligger på værdier af log(Ko/v) over 4,5. Derudover skaber

Figur 3 et overblik over de førnævnte risici ved vanillin på miljøet.[14]

Figur 2 - vanillins miljøpåvirkninger

http://www.cefic.org/Documents/IndustrySupport/RHODIA%20GPS%20Safety%20Summary.pdf

http://www.cefic.org/Documents/IndustrySupport/RHODIA%20GPS%20Safety%20Summary.pdf

11

Ift. mennesker er det påvist, at vanillin er øjeirriterende som ses ved H-sætningerne på

Figur 3. Helbredsmæssigt frarådes det, at en person spiser over 75 gram rent vanillin, da

det vil have en skadelig virkning på personen. Det daglige indtag anbefales ikke at over-

stige 10 mg pr. kg.[16] Ved produktionen af vanillin frigives kun en meget lille mængde

vanillin. Inhalering af vanillinstøv har vist, at have en skadelig virkning for erhvervsar-

bejderne specielt i form af øjenirritation. [14]

Figur 3 - H- og P-sætninger for vanillin: http://kemibrug.dk/KBA/CAS/105039/?show_KBA=1&portaldesign=1

Lovgivningerne omhandlende, hvad naturlig og syntetisk vanilje må benævnes som, er

således forskellige alt efter verdensdelen. Den amerikanske lovgivning, FDA, betragter

nogle produkter som syntetiske for eksempel udvundet fra guaiacol, mens produktet kan

betegnes som naturlig, hvis processen er naturlig, indenfor den europæiske lovgivning,

EFSA. De kemiske processer, det kræver at fremstille vanillin, er således forskellige.

Hvad der gør, at den europæiske lovgivning tillader visse produkter som naturlige, vil de

kemiske processer redegøre for. Dvs. hvad der sker kemisk set fra råmaterialet udvindes,

til det færdigfremstillede produkt vanilje/vanillin er blevet produceret.

http://kemibrug.dk/KBA/CAS/105039/?show_KBA=1&portaldesign=1

12

2.0 Produktion af vanilje/vanillin

Der distanceres mellem vanilje afledt af dens naturlig forekomst, planter af orkide fami-

lien, samt vanillin udvundet ved biokemiske processer og vanillin produceret via syntese

ved klassificeringer omtalt i foregående afsnit. Det følgende afsnit vil have til formål at

belyse processer relevant for industri såvel som forbrugere.

2.1 Vanilje via v. planifolia & v. tahitis Vanilje er verdenskendt og et af de mest eftertragtede aromastoffer i verden[17]. Den

naturlige vanilje stammer fra orkidéfamilien i vaniljeslægten med 106 forskellige ar-

ter.[18] Det er dog kun tre af disse der bruges industrielt: V. planifolia, V. tahitensis og

V. pompona. V. pompona bruges hovedsaligt til parfumer og tobaksproduktion grundet

den ringere kvalitet af produktet.[19]

2.1.1 V. Planifolia

V. planifolia stammer fra Mexico og blev sidenhen fragtet til Europa i 1807, derfra blev

planten spredt til bl.a. Fransk Reunion omkring 1821, hvor den tog navn efter datidens

geografiske benævnelse, Bourbon[20]. Deraf betegnes vanilje udledt fra V. planifolia

som bourbon vanilje. Grundet en mangel på en naturlig bestøver af planten i form af

kolibrier og melipona bier, udviklede man her en manuel proces, hvorved man kunne

bestøve orkideens blomst. Den metode anvendes til dags dato globalt, grundet en højere

succesrate. Metoden omtalt vil blive gennemgået i afsnit 2.1.3. V. planifolia er den mest

anvendte i produktionen af naturlig vanilje, se Figur 4. Det skyldes bl.a. dens højere ind-

hold af vanillin end andre orkidéer i Vanilla familien.[20]

Figur 4. Global produktion af vaniljebønner: https://vanilla.symrise.com/sites/default/files/C2_SYM-

RISE_1170X660_1.jpg

https://vanilla.symrise.com/sites/default/files/C2_SYMRISE_1170X660_1.jpghttps://vanilla.symrise.com/sites/default/files/C2_SYMRISE_1170X660_1.jpg

13

2.1.2 V. Tahitis

V. Tahitis er en krydsning af V. Planifolia og V. Odorata og den dyrkes i Tahiti & Papua

ny Guinea, førstnævnte er tidligere kaldet fransk Polynesien. Deraf ynder den det alment

brugte navn polynesisk vanilje. Da denne vanilje produceres i et væsentligt mindre om-

fang, som vist på Figur 4, er prisen for produktet højere end for vanilje udvundet af arten

V. Planifolia.[18] Der antydes en forskel i aromaen af de to varianter[21], hvilket bekræf-

tes af studier, der påviser et indhold af anissyre og piperonal, der ikke er til stede ved

analyse af vanilje afledt af V. Planifolia, samt en mængde af p-hydroxybenzosyre, som

er 20 gange højere.[20]

2.1.3 Produktion & bestøvning

Produktionen af vaniljestænger er en lang proces. Selve planten vokser som en slyng-

plante, og den gror i 4 år før den er moden. Hver blomst, som planten udvikler, skal

bestøves manuelt, og den blomstrer på mindre end én dag. De gror i klynger af 8-10 styk,

og hver enkelt plante kan producere op til 1000 blomster. Det er dog kun en brøkdel af

disse, der bliver færdigudviklet.[20] Bestøvningen af blomsten forgår ved, at man sepa-

rerer gynandrium fra labellum med f.eks. en tandstik. Rostellum membranen vippes op,

så dens underside får kontakt med pollen fra anther. Der masseres med et let tryk sammen,

og bestøvningen er overstået. Figur 5 giver en beskrivelse af orkidéens dele.

Figur 5 Beskrivelse af V. planifolia blomsten: http://bioweb.uwlax.edu/bio203/s2009/ruud_kirs/images/Va-

nilla%20parts%202%20--%20B.%20Navez%20--%20Wikipedia.png

Ovary er den del der bliver til vaniljebønnen, og den gror efterfølgende i 6 måneder før

den bliver høstklar. Efter høst gennemgår den grønne bønne en forarbejdningsproces, der

varierer alt efter regionen, hvor de forarbejdes. Figur 6 illustrerer de forskellige processer,

der forløber. Den overordnede proces forløber sig over yderligere 6 måneder fra høst til

pakning. Denne tidskrævende modning af bønnen, den manuelle bestøvningsmetode, så-

vel risikofyldt plantevækst og forarbejdningsproces mht. plantesygdomme og uønsket

bakteriel vækst[22], bevirker til at skabe et produkt med høje omkostninger.

http://bioweb.uwlax.edu/bio203/s2009/ruud_kirs/images/Vanilla%20parts%202%20--%20B.%20Navez%20--%20Wikipedia.pnghttp://bioweb.uwlax.edu/bio203/s2009/ruud_kirs/images/Vanilla%20parts%202%20--%20B.%20Navez%20--%20Wikipedia.png

14

Figur 6 Forarbejdsningsproces af høstede vaniljebønner: Elke A. AUTHENTICITY OF VANILLA AND VANILLA

EXTRACTS : Part 1: Comprehensive survey of the literature. Jt Res Cent. 1993, s. 23

Under denne fermenterings og tørringsproces opnår vaniljebønner sin karakteristiske

mørke farve, og vanillinglucosid spaltes til vanillin samt afarter af denne bl.a. p-hydro-

xybenzaldehyd, vanillinsyre, p-hydroxybenzosyre, samt glukose.[20] Den eksakte biolo-

giske proces er endnu ikke belyst.[22] Naturlige vaniljearomaer er en kompleks blanding

af mere end 400 aromakomponenter.[23] Det er de ekstra komponenter, som ikke findes

i syntetisk vanilje, som differentierer de to produkter og giver naturlig vanilje en ekstra

sensoriske oplevelse.

15

2.2 Biokemiske processer Vanillin kan produceres via biokemiske fremstillingsprocesser, der forløber ved fermen-

tering, mikrobiologiske processer, tørring, filtrering mm.[9]. Dette bevirker, at produkter

udvundet ved disse procedurer kan opfylde kriterierne af EU og US regulativer for at

navngive disse som værende naturlige, såfremt de opfylder de resterende kriterier. Af

disse metoder anvendes hyppigst en enzymkatalyseret fermenteringsproces. Da biokemi-

ske processer er yderst komplekse i deres opbygning, vil disse kun beskrives kursorisk

grundet den mindre relevans i forhold til projektets formål.

2.2.1 Produktion via ferulasyre

Ferulasyre, er en carboxylsyre, der bl.a. findes i cellevæggen i hvede, majs, sukkerroe-

granulat og ris. Her findes stoffet i fri såvel som i bunden tilstand til andre cellevægsmo-

lekyler via en esterbinding. Denne bindingstype kan brydes i basisk opløsning ved en

temperatur i intervallet 85-100°c.[24] Denne forarbejdningsproces bevirker dog, at det

ifølge EU regulativer ikke ville kunne accepteres som naturlig, da processen ikke opfylder

kravet omhandlende traditionel forarbejdningsproces af fødevare. Dog opfylder denne

proces de US krav, der omhandler brugen af ordet naturligt i forhold til produktet. I stedet

for en basisk opløsning anvendes enzymet feruloyl esterase, der kan isoleres fra svampe,

gær eller bakterier.[24] Den primære forekomst af ferulasyre, der anvendes til produktion

af naturligt vanillin fås som et biprodukt af produktionen af risklid olie, hvor ferulasyren

adskilles fra riskliden via en enzymatisk behandling, der bevirker at det endelig produkt

betegnes som værende naturligt vanillin, globalt set, grundet anvendelsen af en anerkendt

fremstillingsproces samt råmaterialet.

Producenten Solvay, tidligere kaldet Rhodia, har udviklet en biokemisk proces til udvin-

ding af vanillin ud fra ferulasyre udvundet fra sukkerroe granulat, der gennemgår en fer-

menterings proces med vanillinsyre som intermedieært produkt. Denne proces forløber

med to forskellige stammer af svampe.[11] (Figur 7) Denne fabrikation via mikroorga-

nismer opfylder regulativerne for fremstilling af naturligt vanillin i både EU og US.

Figur 7 - ferulasyre → vanillinsyre → vanillin: Paterson, D., 2010. Vanilla: natural or not? Chemistry Eduction in

New Zealand, s. 4.

Den ovenstående proces beskriver en af mange mulige veje til hvordan, vanillin kan frem-

stilles ud fra ferulasyre. Disse foregår på mange måder, der bl.a. omfatter reduktion, hy-

drering eller decarboxylering af ferulasyren, som værende de bedst anvendelige.[25]

16

2.2.2 Produktion via glukose

Det schweiziske firma Evolva i samarbejde med det amerikansk baserede firma Interna-

tional flavors & fragrances inc. har siden 2014 markedsført vanillin udledt af glukose

(Figur 8). En proces der betegnes som værende naturlig under både EU og US regulativer,

da både udgangsstof samt forarbejdningsproces opfylder kriterierne til denne anerken-

delse. Processen forløber via en fermenteringsproces, der foregår i en lukket fermente-

ringstank. Gærceller fra 2 forskellige stammer tilføres 4 gener, hvorpå der dannes enzy-

mer, der gør det muligt at omdanne glukose til det ønskede produkt, vanillin.[26] Disse

gener oprinder fra så forskellige kilder som bakterier, svampe, planter og mennesker. Ved

en yderligere tilførsel af et plantegen, har man succesfuldt opnået en længerevarende sen-

sorisk effekt svarende til den, som opnås ved brug af vanilje fra vaniljeorkideen og som

endnu ikke er replikeret i andre fabriksproducerede former af syntetisk vanilje.[27]

Figur 8 - glukose→vanillin: https://encrypted-tbn1.gstatic.com/im-

ages?q=tbn:ANd9GcSoNvYTA3cK5lxUyDRoJ3igCJS6_aGcuha_Lq7fCU8iiv0cMbkC & http://www.sigmaal-

drich.com/content/dam/sigma-aldrich/structure7/129/mfcd00006942.eps/_jcr_content/renditions/mfcd00006942-

medium.png

https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSoNvYTA3cK5lxUyDRoJ3igCJS6_aGcuha_Lq7fCU8iiv0cMbkChttps://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSoNvYTA3cK5lxUyDRoJ3igCJS6_aGcuha_Lq7fCU8iiv0cMbkChttp://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/structure7/129/mfcd00006942.eps/_jcr_content/renditions/mfcd00006942-medium.pnghttp://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/structure7/129/mfcd00006942.eps/_jcr_content/renditions/mfcd00006942-medium.pnghttp://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/structure7/129/mfcd00006942.eps/_jcr_content/renditions/mfcd00006942-medium.png

17

2.2.3 Produktion via eugenol

Vanillin udledt via stoffet eugenol, der bl.a. findes i olie fra nelliker, blev fra 1870’erne

anvendt som en mulig form for syntese. Den gamle produktionsform blev sidenhen

skrinlagt i slutningen af 1920’erne og vil derfor ikke blive gennemgået yderligere grun-

det en manglende nutidsrelevans.[28]

Den aktive proces med eugenol som udgangsstof, hvor vanillin udvindes herfra opfylder

kravene for en klassificering som værende naturlig i både EU og USA (Figur 9). Denne

proces begår sig på, at mikroorganismer via en oxidativ nedbrydningsproces omdanner

eugenol til coniferylalkohol. Et produkt der også indgår i processen for fremstilling af

vanillin ud fra udgangsstoffet lignin, og efterfølgende til coniferylaldehyd for til sidst at

danne ferulasyre, der danner vanillin ved en procedure, der blev beskrevet i afsnit 2.2.1,

der omhandler produktionen via ferulasyre. En virksomhed, der anvender denne fermen-

teringsteknologi, er den fransk baserede aromastofproducent Mane.[24]

Figur 9 - eugenol → vanillin http://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/standards/vanillin/lit/jr_15.png & http://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/standards/Eugenol/lit/jr_113.png

http://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/standards/vanillin/lit/jr_15.pnghttp://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/standards/Eugenol/lit/jr_113.png

18

2.3 Syntetisk vanilje Vanillin, der anses som værende det mest signifikante aromastof i vanilje, kan udvindes

via syntese af forskellige udgangsstoffer som tæller lignin, et biprodukt af papirproduk-

tion eller catechol og guaiacol, petrokemiske molekyler udvundet af olie-gasindustrien.

Disse materialer gennemgår processer, der ifølge EU og USA’s regulativer ikke opfylder

kriterierne for at kalde produkterne naturlige.

2.3.1 Syntese af vanillin via catechol & guaiacol

Syntesemodellen via guaiacol beskriver den petrokemiske fremgangsmetode til fremstil-

ling af syntetisk vanillin startende med råmaterialerne benzen og propylen. Der findes

flere processer der kan lede til det endelige produkt[29][2]. Endvidere eksistere der flere

processer til at opnå de intermedieære produkter beskrevet i følgende passage. Afsnittet

vil omhandle den primært anvendte metode, der samtidig anses som værende den førende

indenfor industrien mht. omkostninger af råvare, energiforbrug og bæredygtighed. Denne

proces står nu for 85 % af produktionen af det, der betegnes som syntetisk vanillin[17].

Tidligere har der bl.a. været anvendt en metode, der foregik ved dichlorering af benzen

med sidenhen substitution af disse grupper med hydroxygrupper med henblik på dannelse

af det intermedieære stof, catechol, der er forgænger til guaiacol. Denne proces er dog

ikke længere anvendt, da den nærmere beskrevne proces har vist sig mere energibespa-

rende, chlorfri og mindre affaldsproducerende[30]. Til den relevante proces bringes rå-

materialerne til reaktion under dannelse af det intermedieære produkt cumen, der under

Hocks processen, som omhandler dannelsen af phenol og acetone udfra benzen og pro-

pylen, hvoraf kun phenol anvendes i den videre fremstilling. Denne proces foregår ved

en alkylation, hvor propylen reagerer med phosphorsyre under dannelse af den sekundært

placerede intermedieære carboncat-ion, der efterfølgende binder med carbon i benzenrin-

gen. Da carbon nu er bundet til hydrogen og carbocationen midlertidig vil den negativt

ladet phosphorsyre-ion reagere med benzenringens fritstående hydrogen, og katalysato-

ren reetableres (Figur 10). Derpå gennemgår cumen en radikal oxidationsproces, der

fremtvinger en kombination af syre-base reaktioner og dannelse af carbocationer, der ikke

vil blive uddybet nærmere grundet manglende relevans (Figur 11).

Figur 10 - benzen + propylen → cumen: http://www.essentialchemicalindustry.org/images/stories/420_Phe-

nol/Unit42%20Phenol230810-3.jpg

Figur 11- cumen → phenol + acetone https://www.cliffsnotes.com/assets/22896.jpg

http://www.essentialchemicalindustry.org/images/stories/420_Phenol/Unit42%20Phenol230810-3.jpghttp://www.essentialchemicalindustry.org/images/stories/420_Phenol/Unit42%20Phenol230810-3.jpghttps://www.cliffsnotes.com/assets/22896.jpg

19

Phenol reagerer herefter med hydrogenperoxid katalyseret i en sur opløsning af phosphor-

syre under substitution af et hydrogenatom med en hydroxygruppe til phenol ved dannel-

sen af catechol, der er den ortho placerede isomer af benzendiol og samtidig den domine-

rende af de dannede ortho-para isomere (Figur 12). Som katalysator for processen anven-

des der metalliske salte. [31]

Catechol monomethyleres med dimethylsulfat, via en variation af Reimer-Tiemann pro-

cessen under dannelse af en etherforbindelse imellem phenolgruppen og methylgruppen.

Processen katalyseres i en basisk opløsning. Catechol reagere med basen under dannelse

af vand, og der dannes en negativ ladning omkring oxygen. Denne binder med en af de

to methylgrupper fra dimethylsulfat. Dette bevirker samtidig, at bindingsforholdet imel-

lem carbon og oxygen i dette stof elimineres. Der dannes derpå guaiacol (Figur 13) samt

det negativt ladede CH3SO4-, der dernæst kan reagere med H2O og reetablerer basen og

danne det stabile CH3SO3OH. Processen forløber med et overskud af catechol for at

undgå en yderligere methylering af guaiacol. [2]

Figur 13 - catechol + dimethylsulfat → guaiacol: http://www.prepchem.com/wp-content/uploads/2015/12/Prepara-

tion-of-guaiacol.png

Guaiacol reagerer med glyoxylsyre, et biprodukt fra syntese af glyoxal fra acetaldehyd i

en elektrofil substitutionsreaktion, og der dannes herpå 4-hydroxy-3-mythoxymandel

syre (vanillinmandel syre). Processen forløber i en fortyndet alkalisk opløsning med ka-

lium ved 20 °C[2]. Processen forløber med et overskud af guaiacol for at forhindre at

vanililinmandelsyre substitueres yderligere. Da glyoxylradikalet hovedsageligt vil pla-

cere sig para til hydroxygruppen grundet guaiacols rummelige struktur viser dette sig en

fordelagtig proces mht. udladelse af yderligere rearrangering af sidegrupper i retning mod

det ønskede endelige produkt. (Figur 14)[29]

Figur 14 - guaiacol + glyoxyl syre → vanillinmandelsyre: Common Fragrance and Flavor Materials: Preparation, Properties and Use - Surburg, H. & Panten, J. - Wiley & sons, 2006

Figur 12 - phenol + hydrogenperoxid → benzendiol: Catalytic Oxidations with Hydrogen Peroxide as Oxidant - Strukul, G. - Springer, 2013.

http://www.prepchem.com/wp-content/uploads/2015/12/Preparation-of-guaiacol.pnghttp://www.prepchem.com/wp-content/uploads/2015/12/Preparation-of-guaiacol.png

20

Derpå oxideres 4-hydroxy-3-mythoxymandelsyre af dioxygen, med Cu(II) som katalysa-

tor, til phenylglyoxylsyre i temperaturintervallet 80-130 °C(Figur 15)[32].

Efterfølgende decarboxylerer phenylglyoxylsyre spontant til vanillin ved at afgive car-

bondioxid (Figur 16). Denne reaktion muliggøres af stoffets evne til at danne intramole-

kylære hydrogenbindinger og derved omlejrer sine elektroner, hvorpå det fraspalter car-

bondioxid. Efterfølgende neutraliseres produktet, der herefter isoleres via vakuumdestil-

lation.

Figur 16 - phenylglyoxylsyre → vanillin: Common Fragrance and Flavor Materials: Preparation, Properties and Use - Surburg, H. & Panten, J. - Wiley & sons, 2006

En videre oprensning af råproduktet finder sted. Dette forekommer ved, at det krystalliske

produkt opløses i en vandig opløsning af ethanol, der tilføres energi i form af varme. For

sidenhen at rekrystallisere ved afkøling. Denne rensningsproces anvendes til, at der op-

nås et produkt svarende til en ønsket standard.

Figur 15 - vanillinmandel syre → phenylglyoxylsyre: Kirk-Othmer Food and Feed Technology, Volume 1 - - Wiley & sons, 2007

21

2.3.2 Fra lignin til Vanillin

2.3.2.1 Introduktion til Vanillin fra Lignin

Lignin er et komplekst polymer, som stammer fra planter og træer. [33]Det står for ca. 30

procent af træers celleopbygning. Lignin spiller en stor rolle mht. stabiliteten i cellevæg-

gen, pga. dets egenskab til at sammenkoble cellulosen og hemicellulosen (træs hovedpo-

lymere) og dermed skabe stivheden i træet.[34]

Lignin består primært af tre forskellige phenolpropenol monomerer (Figur 17.1,2 og 3).

Monomererne danner ligninpolymeren ved at lave ether bindinger ved alkoholerne og

kovalente C-C bindinger. Fordelingen af de tre monomere i lignin afhænger af hvilken

plante- eller træsort, der kigges på. Græsarter indeholder alle 3 monomerer (Figur 17.1,2

og 3), mens løvfældende træer indeholder primært monomerende coniferyl- og sinapyl-

alkohol (Figur 17.3). Nåletræer indeholder primært kun monomeren coniferylalkohol (Fi-

gur 17.2). [35],

Figur 17 1. Kumarylalkohol, 2. coniferylalkohol og 3. sinapylalkohol

Første gang man opdagede, at vanillin kunne fremstilles ud fra lignin, var ved et tilfælde,

hvor man kunne dufte vanilje fra et restprodukt fra en papirproduktion. Det blev senere

bekræftet af forskere fra USA (Howard, McGill universitet m.fl.), at det var muligt. Dette

var en stor forretningsmulighed, da prisen på vanilje var relativ høj, og man stod med et

restprodukt, som kunne syntetiseres om til vanillin. [33]

Der blev efterfølgende forsket i hvilke syntese metoder, der ville give det største udbytte

af vanillin fra lignin. Den første fabriksproduktion af vanillin fra lignin startede i USA i

1936 og året efter i Canada. Produktionen og forskningen viste dog, at træsorter fra bl.a.

nåletræsfamilen egnede sig bedst til vanillinproduktionen pga. dets ligninmonomere.

Træsorten indeholder primært kun ligninmonomeren coniferylalkohol. Derfor begyndte

vanillinproducenterne at importere træ fra længere distancer til papirproduktion med det

formål at optimere deres vanillin produktion. [33]

2.3.2.2 Ekstrahering af lignin fra sulfit spildevand

Hovedbestanddelen i papir stammer fra et af træs fibre, cellulose. Det udvindes fra træet,

ved at adskille det fra lignin og hemicellulosen. Denne proces foregår ved, at koge træ-

granulat sammen med kemikalier [33][36]. Der findes flere processer, hvorved lignin og

hemicellulosen kan separeres. Den væske som hemicellulosen og ligninet er i, er et rest-

produkt fra papirproduktionen. Der vil i følgende afsnit kigges kun kort på ekstrahering

af lignin fra ’’brown liquor” (restproduktet fra en sulfit pulpingproces), og syntesen af

monomeren coniferylalkohols til vanillin.

For at kunne omdanne lignin til vanillin, skal lignin ekstraheres fra spildevandet, restpro-

duktet fra papirproduktionen. Her findes flere metoder til at ekstrahere lignin afhængig af

22

pulpingprocessen, som er afhængig af hvilke pulpingprocesser, der benyttes til at lave

cellulosen. Der kigges på en sulfitproces.[36] Der bliver brugt en sulfidsyre, som går ind

og laver en substitution med alkoholen og danner sulfoneret lignin (Figur 18). For at iso-

lere lignin anvendes flere forskellige filtreringsmetoder såsom ultrafiltrering.[36] Der vil

ikke kigges yderligere på filtreringsmetoder i rapporten.

2.3.2.3 Produktionen af vanillin fra lignin

Når lignin er ekstraheret fra væsken, ender man ud med et sulfoneret ligninfragment.

Fragmentet vil afhænge af hvilken træsort, der er anvent i papirprocessen, da

monomerene er variernde mht. træsorten.[33] For at optimere processen mest muligt

anvendes der træ fra nåletræsfamilien, da indholdet af monomeren coniferylalkohol er

størst der. coniferylalkohol er den monomer, som primært kan syntetiseres til vanillin. I

processen hvor ligninpolymeren bliver sulfoneret, vil der i opgaven udelukket tages ud-

gangspunkt i monomeren coniferylalkohol. [33]

Første skridt i processen er coniferylalkoholen, som reagerer med svovlsyrling og laver

en addition. Hydrogen atomet fra syren danner en elektronparbinding med elektronerne

fra dobbeltbindingen fra coniferylalkoholen og danner en C-H binding, hvilket gør, at der

dannes en carbocation på det andet carbon atom. [37] Carbocationen vil sidde på carbo-

natomet nærmest phenol ringen ifl. Markovnikovs regel, pga. carbon atomet der sidder

tættest på phenylgruppen danner den mest stabile carbocation. (additionsgruppen vil ligge

sig ved det mest substitueret carbon atom). Svovlsyrlinganionen danner nu en elektron-

parbinding med carbon atomet hvor carbocationen sidder (Figur 19).

Figur 19 Addition af coniferylalkohol med Svovlsyrling

Under papirpulping og separationsprocessen, som ikke vil nævnes nærmere i rapporten,

forekommer en oxidationsreaktion, og den primære alkohol oxideres til et aldehyd.[33]

(Figur 20)

Figur 18 Sulfoneret lignin: https://en.wikipedia.org/wiki/Lignosulfonates

https://en.wikipedia.org/wiki/Lignosulfonates

23

Figur 20 Oxidation af coniferylalkohol til aldehyd

Det sulfoneret coniferylaldehyd bliver nu sorteret fra vha. forskellige metoder såsom ul-

trafiltrering, som der ikke vil nævnes yderligere i rapporten.

Efter det sulfoneret coniferylaldehyd er blevet isoleret, fortsætter processen ved at sub-

stituere sulfonsyren med en hydroxygruppe i en basisk opløsning. Processen vil forløbe

som en Sn2 substitutionsproces. Substitutionen forløber ved, at hydroxygruppen, som er

nukleofil og går ind og danner en binding til carbonatomet med dets ledige elektronpar.

Dette gør at carbonatomet både har en C-OH - og en C-SO3H binding (Overgangs stadie).

Da hydroxygruppen er en mere stabil forladende gruppe, vil sulfonsyren fraskydes. C-

OH bindingen bliver dannet og sulfonsyrens elektronparbinding med C-SO3H bindingen

brydes. (Figur 21)

Figur 21 SN2 substitution med hydroxid

Næste skridt i syntesen hen imod vanillin sker der en omvendt carbonyl kondensation. Pi

bindingen på aldehydet til oxygenet brydes, og der dannes en intern hydrogenbinding

mellem aldehydet og alkoholen. Der skabes en carbocation på alkoholens carbonatom, da

hydrogenatomet danner binding med aldehydet. Carbocationen danner nu en Pi binding

24

til næste carbonatom. Ethenol fraspaltes nu fra den dannede aldehydgruppe. Det fraspal-

tede ethenol vil efterfølgende befinde sig på dens resonansform ethanal, da ethenol er et

ustabilt stof. (Figur 22)

Figur 22 - Omvendt carbonyl kondensation

Efter endt carbonyl kondensation er produktet vanillin. Vanillins renhedsgrad afhænger

af isolationsmetoderne, samt en udrensning til sidst, som ikke nævnes yderligere i rap-

porten.

I syntesen var der taget udgangspunkt i sulfidpulping, en metode som kun står for om-

kring 10 procent af det samlede papirproduktionsmarked,[38] men det var ud fra sulfid

pulping, man opdagede den første syntesevej. [39]

3.0 Konklusion på problemanalyse

Ud fra de relevante lovgivninger på området, der omhandler defineringen af hhv. natur-

lig, naturidentisk og syntetisk kan det konkluderes, at disse er afhængige af lokaliteten

for hvor aromastoffet forhandles. Hvad angår EU lovgivningen betegnes et naturligt

aromastof, som et produkt behandlet ved en traditionel forarbejdningsproces, uden at

der tages hensyn til udgangsstoffets forekomst. Den amerikanske lovgivning forholder

sig til bl.a. ophavet af udgangsstoffet skal være naturligt, dvs. udgangsstoffet skal kunne

identificeres som værende af naturlig forekomst i naturen ifl. FDA’s regulativer. For at

imødekomme en stigende efterspørgsel af produkter, der antager produktbeskrivelsen

naturlig, benyttes udviklingen af teknologiske metoder, hvorpå produktet kan fabrike-

res, så det imødekommer regulativerne for at opnå en klassificering som værende natur-

lig. Dette praktiseres med henblik på finansiel gevinst ved anvendelsen af billigere, bæ-

redygtigere og lettere tilgængelige udgangsstoffer. I afsnit 2.2 beskrives flere forskellige

måder at tilvejekomme et naturligt klassificeret produkt, og der forskes yderligere i me-

toder for at effektivisere med henblik på at få større udbytteprocent i metoder anvendt i

industrien.

25

4.0 Problemformulering

De forskellige produktionsmuligheder, de varierende lovgivninger og markedstendenser,

gør det interessant at undersøge nærmere de kemiske og fysiske forskelle på syntetisk og

naturlig vanilje, samt hvilke analysemetoder, der kan anvendes til en autentifisering af

vanilje. Grundet de nævnte markedstendenser, lovgivninger og produktionsmuligheder,

er det interessant at undersøge følgende problemformuleringen:

"Kan man via analysemetoder uden referencestoffer autentificere vaniljeekstrakter?"

5.0 Autenticitet

Vaniljes stigende popularitet har resulteret i, at flere firmaer heriblandt Hersheys, Kel-

logg’s og Nestlé er begyndt at erstatte syntetisk vanilje med naturlig vanilje i deres føde-

vareproduktion. Syntetisk vaniljes produktionspris er en brøkdel af det naturlige. Prisfor-

skellen på de to varianter af vanilje kan føre til, at producenterne af naturlig vanilje til-

sætter billige additiver til deres produkt og dermed opnår en større profit. [17]

Kvalitetskontrol af vaniljen er derfor en nødvendighed for at sikre kvaliteten overfor for-

brugerne, men samtidig også for at skabe lige markedsføringsvilkår for producenterne. I

Danmark står Fødevarestyrelsen for kvalitetskontrol af diverse fødevarer. De sikrer kva-

liteten af produkterne ved bl.a. at tjekke om varedeklarationerne stemmer overens med

indholdet. Det er især vaniljen, som er produceret og solgt i årene 2000-2005 og årene fra

2015-2016, der er interessante, da det var i de år, hvor det ville give mest mening, øko-

nomisk set, at bedrage med produktet, grundet den øgede markedsværdi for vanilje. På

Figur 23 ses priserne i USD for et kg naturlig Bourbon vanilje. [40][41][42][43]

Figur 23 Markedsværdier for priserne på naturlig vanilje

26

5.1 Forfalskning af vaniljeprodukter Forfalskning af fødevarer har eksisteret i mange år. Det kan ske med mange varer. Siden

år 1980 har krydderier været det andet mest udsatte produkt, som kan ses på Figur 24.

[44]

Figur 24 - reporteret snyd af madtyper: https://fas.org/sgp/crs/misc/R43358.pdf , side 21

Man har fundet tilfælde af svindel med vanilje helt tilbage fra år 1895. Dengang var kva-

liteten af vanilje problemet, og derfor havde prisen været for høj i forhold til kvaliteten af

produktet. Metoderne til at analysere vanilje var begrænsede, og det var derfor svært at

sige, om der var tilføjet noget til produktet.[45]

Der kan snydes med vanilje på flere forskellige måder. En måde, til at snyde med vanilje,

er når der er oplyst et falsk oprindelsesland. Vanilje fra Madagaskar er f.eks. kendt for at

være af høj kvalitet, hvilket resulterer i et produkt, som er nemmere at sælge. En anden

metode, der kan snydes med vanilje, er når der er oplyst fejlagtigt indhold. Den mest

brugte metode er at tilsætte noget, som ikke burde være i produktet, eller fortynde det

givne produkt, således at kvaliteten falder. Hvordan det fordeles kan ses på Figur 25. [44]

Figur 25 - andel af metoderne anvendt til forfalskning: https://fas.org/sgp/crs/misc/R43358.pdf , side 24

Mht. vaniljebønner er den mest udbredte metode til at snyde, at den brugte vaniljebønne,

efter at være ekstraheret for vanillin bliver væddet i en væske, som indeholder syntetisk

vanilje. Derefter kan vaniljebønnerne sælges som nye, og den samme vaniljebønne bliver

https://fas.org/sgp/crs/misc/R43358.pdfhttps://fas.org/sgp/crs/misc/R43358.pdf

27

derfor i realiteten solgt som naturlig vanilje to gange. Det er også sket, at vaniljebønnerne

er blevet dyppet i en væske med syntetisk vanilje for at danne de krystaller, som normalt

viser, at bønnen er af god kvalitet. Derved bliver der skabt en illusion af en bedre kvalitet,

selvom bønnen muligvis er af ringere kvalitet.[46] Når det gælder naturligt vanilje, som

pulver eller ekstrakt, er det mest almindeligt, at der bliver tilsat syntetisk vanilje til det

naturlige produkt. Dette har blandt andet været et problem med naturlig vanilje solgt i

Mexico. Et stort problem i Mexico er fejlagtigt deklareret vaniljeekstrakt, som er blandet

med ekstrakt fra tongabønnen og solgt som naturlig.[47] Vaniljeprodukter, der er blevet

blandet med ekstrakt fra tongabønnen, var så stort et problem at der i 2009 blev udsendt

en advarsel på FDA’s (US Food and Drug Administration) hjemmeside. Der bliver ud-

meldt, at efter flere sager med coumarin i vanilje, har FDA 13 forskellige firmaer/selska-

ber under opsyn mht. forfalskede produkter.[48] Coumarin er bevist, at være både kræft-

fremkaldende og giftigt for leveren. [49] EFSA anbefaler dertil, at indtaget af coumarin

må højest være 0-0,1 mg pr. kg. kropsvægt. Mængden af coumarin i fødevare ift. EU

reglementet er der en begrænsning på, men det er tilladt at anvende coumarin[50]. Ift. den

amerikanske lovgivning FDA er det ikke tilladt at anvende coumarin,[51] hvilket gør at

det ikke er lovligt i USA.

Der bliver også tilføjet færdigbrugte vaniljebønner til f.eks. vaniljesukker. Da vaniljebøn-

nerne er brugte, indeholder de ikke mere aroma, men ved at tilsætte knuste vaniljebønner,

skabes der en illusion af et produkt med naturligt vanilje i, selvom det ikke altid er tilfæl-

det [46]. Denne metode ses ikke som en strafbar måde at snyde med vanilje, da man ikke

tilsætter noget ulovligt til det givne produkt.

Fødevaresvindel har således tre definitioner:

1. Erstatning: Når der bliver byttet ud på, tilføjet eller fortyndet i et produkt. Dette med-

fører normalt i at varedeklarationen ikke længere passer til det solgte produkt, i form af

hvilket land produktet originalt stammer fra, og hvilken proces som det givne produkt

har gennemgået. Et eksempel på dette er, når der bliver tilføjet vand og citronsyre til

juice, for at få en større mængde produkt at sælge.

2. Addition: Når der bliver tilføjet en ikke autentisk ingrediens til et produkt, for at

skjule produktets kvalitet. Et eksempel på dette er, når der bliver tilføjet et tilsætnings-

stof til at give den røde farve til paprika.

3. Bortskaffelse: Dette er når der bliver fjernet ingredienser fra det originale produkt

uden at køberen ved det. Et eksempel på dette er, når honning bliver filtreret for at

fjerne pollen fra bikuben, så honningen bliver svær at spore tilbage til sit oprindelses

sted.[44]

Syntetisk vanilje består af meget få komponenter heri primært vanillin. Naturlig vanilje

består af over 400 forskellige komponenter. Det betyder, at naturlig vanilje har flere

egenskaber f.eks., at kunne dreje planpolariseret lys pga. nogle af stofferne har et kiralt

center f.eks. limonen. På den måde kan forfalskning af naturlig vanilje blandt andet

identificeres. Forfalskning er et problem og foregår på forskellige måder f.eks. at dekla-

rerer, at vaniljebønnen er fra et falskt oprindelsesland. Problemet løses ved at anvende

en række analysemetoder alt efter hvilken type forfalskning, der ønskes undersøgt.

28

5.2 Kemiske og fysiske forskelle mellem syntetisk og naturlig vanilje For at kunne redegøre for en kvalitetskontrol af produkter som indeholder vanilje, under-

søges kemiske og fysiske forskelle på naturligt og syntetisk vanilje. Dertil må en bag-

grundsviden for syntetisk kontra naturlig vanilje opnås, for at forstå hvordan produktet

vil agere i en kemisk analyse.

Aromastofferne i vanilje består af mere end 400 forskellige komponenter[19]. Indtil vi-

dere er der identificeret mere end 400 forskellige komponenter, men der sikkert er flere

ikke-identificerede stoffer i vanilje. 1/3 af vanilje aroma består af vanillin, mens de reste-

rende 2/3 udgøres af andre stoffer såsom benzen, limonen, kanelsyre og benzenalko-

hol[18]. Vanillin udgør derfor det største aromatiske bidrag til vanilje.

Garvesyre, polyphenoler, frie aminosyrer og harpikslignende konsistens er andre ikke-

flygtige stoffer, som udgør den væsentligste andel af den karakteristiske vanilje aroma.

Resin påvirker det færdige produkt i den forstand, at aromaen vil bibeholdes i længere

tid. Flygtige stoffer, der er stoffer med et lavt damptryk som er med til at udgøre den

samlede oplevelse af vanilje er for eksempel syrer, acetaler, ethere, alkoholer, heterocy-

cliske forbindelser, carbonhydrider, ester og forbindelser med carbonylgrupper i.[52]

Det er kun 26 af de 400 forskellige komponenter som indgår i vanilje, som optræder i en

mængde på mere end 1 mg/kg. Informationen er bemærkelsesværdig, fordi der egentligt

kun er 26 molekyler som har en reel betydning for den samlede oplevelse af vaniljearo-

maen. Dvs. syntetisk vanilje er lettere at få til at dufte som naturlig vanilje, grundet va-

nillins koncentration i naturligt vanilje, da den væsentligste del af naturlig vanilje ikke

omfatter de ca. 400 forskellige komponenter pga. den meget lille mængde, de resterende

ca. 374 molekyler optræder i.[19]

Vanillin har molekylformlen C8H8O3 og følgende strukturformel, som Figur 26 viser:

Figur 26 - Strukturformlen for vanillin: http://www.chemikinternational.com/pdf/2010/10_2010/che-

mik_2010_10_631_640.pdf

Vanillin har det systematiske navn 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyd[53]. Ud fra struk-

turformlen ses at stoffet består af de hydrofile grupper: hydroxy-, aldehyd og ether, da

der er en intern ladningsforskydning i bindingen mellem to af atomerne carbon-oxygen

eller hydrogen-oxygen, samt en benzenring, som er en hydrofob gruppe, da den indehol-

der carbon-hydrogen bindinger. Hydrogenbindinger kan kun forekomme mellem et af de

elektronegative atomer: oxygen, nitrogen eller fluor, som har et ledigt elektronpar og et

hydrogenatom som er bundet til et oxygen, nitrogen eller et halogen. Dvs. etheren og

aldehydet i vanillin vil ikke danne en hydrogenbinding til en anden ether eller aldehyd i

et andet vanillinmolekyle, men vil kunne danne hydrogenbindinger til hydroxygruppen.

Pga. af vinklen mellem oxygenatomer i ethergruppen og hydroxygrupen, kan de to grup-

per danne en hydrogenbinding internt i molekylet mellem hinanden, som Figur 27 viser.

29

Figur 27 - Intra og intermolekylære hydrogenbindinger i vanillin: http://www.flavours.asia/uplo-

ads/7/9/8/9/7989988/vanilla-chemistry-link.pdf side 5

Det resulterer i, at hydroxygruppen ikke kan danne hydrogenbindinger til et andet mole-

kyle, da hydrogenatomet allerede er optaget. Effekten af de interne hydrogenbindinger i

molekylet ses i, at vanillin har et smeltepunkt i intervallet på 80-83,5 ºC. Når vanillin

opløses i vand vil der være mindre mulighed for at danne hydrogenbindinger, hvilket

resultere i, at vanillin er tungt opløseligt. Vanillins opløselighed i vand på 9,0 g/L[14]

stemmer derfor overens med molekylstrukturen, idet et stof betragtes letopløseligt i vand,

hvis 20 g/L kan opløses i vand[54]. Derimod kan vanillin opløses i upolære opløsnings-

midler såsom benzen, men let opløselig i det polære stof ethanol.

Tabel 1 giver en oversigt over fysiske og kemiske egenskaber af vanillin.

Tabel 1, tabel over fysiske/kemiske egenskaber for vanillin: http://www.chemikinternatio-nal.com/pdf/2010/10_2010/chemik_2010_10_631_640.pdf

Egenskab Værdi

Smeltepunkt 80-83,5 ºC

Kogepunkt 285 ºC

Vandopløseligt 9,0 g/L ved 25 oC

Damptryk 0,0029 hPa ved 25 oC

Syntetisk vanilje består hovedsageligt af vanillin eller ethyl vanillin. Ethyl vanillin beteg-

nes syntetisk, da det ikke er naturligt forekommende i naturen, da det kun kan fremstilles

i laboratoriet. Ethyl vanillin har en tre gange mere intens aroma end vanillin.

Uanset hvilken proces man anvender, vil molekylet være vanillin. Strukturen af vanillin

udvundet fra eugenol, lignin eller fra vaniljebønnen kan man se forskel på, hvis man ud-

fører et eksperiment med planpolariseret lys. Det viser sig, at naturlig vanilje er optisk

aktiv på baggrund af de andre tilstedeværende stoffer i vanilje, mens vanillin ikke er [55].

Optisk aktivitet opstår, når et molekyle har isomerformer, dvs. molekylet har samme mo-

lekylformel men forskellige strukturformler. Det kan forekomme ved kirale centre, der er

et atom, som er bundet til 4 forskellige substituenter. Netop af denne grund har vanillin

og ethyl vanillin ikke kirale centre. Ved det kirale center kan planpolariseret lys drejes i

hver sin retning, hvoraf molekylet betegnes at have aktive former. For eksempel har mo-

lekylet limonen, som findes i naturligt vanilje, et kiralt center som er angivet med en rød

prik på Figur 28:

http://www.flavours.asia/uploads/7/9/8/9/7989988/vanilla-chemistry-link.pdfhttp://www.flavours.asia/uploads/7/9/8/9/7989988/vanilla-chemistry-link.pdfhttp://www.chemikinternational.com/pdf/2010/10_2010/chemik_2010_10_631_640.pdfhttp://www.chemikinternational.com/pdf/2010/10_2010/chemik_2010_10_631_640.pdf

30

Figur 28 - a) L form af limonen b) D-former af limonen: http://www.chemikinternational.com/pdf/2010/10_2010/che-

mik_2010_10_631_640.pdf

De forskellige former, det kirale center medfører, er dextrorotorisk form (+) og levoro-

torisk form (-), som ofte resulterer i, at stoffet har to forskellige dufte. Da molekyler i

naturlig vanilje kan dreje planpolariseret lys, mens syntetisk ikke har denne egenskab,

kan det udnyttes i form af at efterprøve den kemiske analysemetode polarimetri. I pola-

rimetri sendes en monokromatisk lysstråle gennem en polarisator, hvor planpolariseret

lys kun kan passere, hvorefter strålen går gennem det undersøgende stof og til sidst regi-

streres i en analysator. [56]

Ud fra den kemiske viden omkring naturlig vaniljes kontra syntetisk vaniljes kemiske og

fysiske egenskaber kan teorien anvendes i praksis forstand ift. en kvalitetskontrol af pro-

dukter. Gyldigheden af en kvalitetskontrol afhænger af mængden af snyderi ift. at angive

syntetisk vanilje som værende naturligt vanilje.

31

5.3 Autenticitering af vanilje Kriterierne, der kræves opfyldt for at bekræfte autenticiteten af vaniljeprodukter, er fast-

sat af IOFI (International Organization of the Flavor Industry), der har adopteret den fran-

ske lovgivning på området DGCCRF (Directorate General for Competition, Consumption

and Fraud Repression), og den amerikanske standard for identitet af vanilje, der kræver

at produktet er afledt fra V. Planifolia eller/og V. Tahitis samt specifikke krav for eks-

trakter afledt af disse som omtalt i afsnit 1.1.1.

Der ses på forholdene imellem 4 stoffer, der specifikt kendetegner naturlig vanilje. Va-

nillin (Vanillin), p-hydroxybenzaldehyd (p-HBAld), p-hydroxybenzosyre (p-HB acid) og

vanillinsyre (Vanillic acid)[57]. En tilstedeværelse af stoffet ethylvanillin vil generere

mistanke om forfalskning af et produkt angivet som værende naturlig, da dette som nævnt

tidligere i rapporten ikke findes i naturen, men kun kan frembringes kemisk. Dette gøre

sig også gældende for tilstedeværelsen af coumarin, da dette stof heller ikke normalt vil

være at forefinde i produkter af denne art. Undersøgelser har dog vist fravigelser fra denne

opfattelse, da man har kunnet konstatere en tilstedeværelse i henstillede prøver af ældre

dato[58]. Figur 29 angiver forholdene for hvilke stofmængder, der findes acceptable for

produkter med benævnelsen naturlig, og Figur 30 viser stoffernes strukturer.

Figur 29. DGCCRF retningslinjer for autenticitet af vanilje: Handbook of Vanilla Science and Technology, Havkin-

Frenke, D Belanger, FC, 2010

Figur 30. Strukturer af de 4 aromatiske stoffer for hvilke ratioer beregnes: Handbook of Vanilla Science and Techno-

logy, Havkin-Frenke, D Belanger, FC, 2010

Der er dog fundet uregelmæssigheder i forholdene mellem vanillin/p-hydroxybenzalde-

hyd og vanillinsyre/p-benzaldehyd for vanilje af indisk herkomst.[57] Der kan ved at stu-

dere vanillinindholdet, der for V. Planifolia er højere end V. Tahitis, skabes en antagelse

32

af fra hvilken planteart, produktet er afledt. Der kan også ved observation af tilstedevæ-

relsen af anissyre, anisaldehyd og heliotropin [59], fastslås V. Tahitis som værende for-

gænger til produkter indeholdende disse stoffer, da de ikke forekommer i vanilje afledt af

V. Planifolia der dog indeholder stoffet 5-methylfurfural[60]. Afvigelser fra disse kan

være medvirkende til at skabe grobund for mistanke om forfalskning.

HPLC anvendes rutinemæssigt til analyse af produkter indeholdende vanilje[61]. Meto-

den anvendes til at identificere signifikante stoffer og mængder ved anskuelse af deres

rententionstider og deres kvantitative indhold i forhold til hinanden. En prøve, der skal

analyseres, klargøres ved, at der for bønner kreeres en ekstraktion, og ved analyse af en

ekstrakt laves en fortynding.[61]

Til analyse af produkter indeholdende vanilje anvendes metoder omtalt i afsnit 6. Om-

vendt fase er brugbar til adskillelse af phenoler, phenolsyre, aldehyder og lignende upo-

lære stoffer. Der anbefales brug af C8 eller C18 stationær fase, hvoraf den primær an-

vendte er C18 løsningen. Som mobil fase anvendes kombinationer af vand, methanol og

acetonnitril opløsning i isokratisk eller gradient-eluering med sur pH. Der anvendes en

UV- eller DAD-detektor til at registrer dataene[61]. Et eksempel på parametre til en

HPLC analyse af vanilje kan ses på Figur 31.

Figur 31. Eksempel på parametre for en HPLC analyse af vanilje: Handbook of Vanilla Science and Technology,

Havkin-Frenke, D Belanger, FC, 2010

Der er udført ekstensive studier på området, der omhandler effektivisering af HPLC ana-

lyser. Disse er udført med varianter i form af forholdene og deltagerne i den mobile fase.

Der har været anvendt forskellige typer af kolonner som stationær fase og observationer

ved forskellige bølgelængder. Der er bl.a. opnået en gennemløbstid på ned til 2 min ved

anvendelse af C18 kolonne, en mobil fase bestående af vand og methanol i forholdene

2/3 og observation ved 231 nm[57]. Effektivisering breder sig også til udførelse med an-

dre analysemetoder med henblik på, at kunne differentiere produkters autenticitet ud fra

andre parametre.[57] En alternativ analysemetode af vanilje med henblik på at skelne

forskellen mellem syntetisk vanilje og naturlig vanilje, kan laves med henblik på isotoper

af carbon. Et massespektroskopi giver et spektrum over et molekyles masse og dets frag-

menteringioners masse. Da massen af et molekyle afhænger af den atomare sammensæt-

ningen, vil massespektret angive flere forskellige masser for det samme stof pga. isotoper.

Carbons isotop 13C står gennemsnitligt for ca. 1.1 procent af alle carbonisotoper og vil

derfor gøre sig bemærket i massespektret. [62] Processen for molekylets dannelse kan

spille en faktor for fordelingen.

13C-fordelingen for en plante afhænger af plantetypen grundet forskellige fotosynteser.

Der vil ikke gåes i dybden med fotosynteserne grundet, at deres biologiske proces ikke

33

har markant relevans for projektet, undtagen forekomsten af carbon 13 isotoper.[63] Fo-

tosynteser mht. 13C er C3 (korn, sukkerroer og træer m.fl.), C4 (Sukkerrør og majs

m.fl.) og CAM (V. planifolia, V. tahitis). Forskellige processer i fotosyntesen, gør at

fordelingen af isotopen varierer fra det gennemsnitlige. V. planifolia, lignin, eugenol og

ferulasyre stammer alle fra en fotosyntetiskproces, og varierer derfor fra de forventede

1,1 procent 13C. Da de førnævnte udgangsstoffer stammer fra forskellige fotosynteser,

vil de dermed have forskellige procentvise 13C indhold.

Ifl. kilderne [18][20] angives værdierne af 13C for de forskellige fotosynteser ud fra

formlen.

Det resulterer i, at C3 fotosyntesen ligger mellem -30‰ og -24‰, C4 fotosyntesen lig-

ger mellem -16‰ og -10‰ og CAM fotosyntesen ligger mellem -10‰ og -30‰. [64]

Vha. massespektroskopi kan der måles på forskellene af isotopsammensætningen. Da

lignin kommer fra træer og guaiacol fra fossile plantematerialer, som stammer fra en C3

fotosyntese sammenlignet med V. planifolia og V. tahitis som stammer fra CAM synte-

sen, vil der kunne ses en forskel på massespektret. Figur 32 viser et plot af δ 13C fra va-

nillin fra både de syntetiske kilder samt naturlige.

Figur 28 Carbon 13 isotopmåling af vanillin

Metoderne beskrevet er med til at sikre forbrugere imod forfalskninger og skabe en lige

konkurrence iblandt producenterne. Da vaniljeindustrien estimeres til en værdi af 650

millioner US dollars[65] er der substantiel økonomisk gevinst ved forfalskning og anden

form for snyd.

34

6.0 Analysemetoder

For at identificere, at der er begået fødevaresvindel, anvendes som omtalt en række ana-

lysemetoder. Den teoretiske baggrund, der ligger til grund for autentificering, vil gen-

nemgås i følgende kapitel. Dertil hører en gennemgang af opbygningen af analyseappa-

raterne og tolkning af fremkomne spektre blandt andet.

6.1 IR- Spektrofotometri IR-Spektrofotometri står for infrarød spektroskopi, da spektroskopimetoden bygger dens

hovedfundament på baggrund af infrarødlys, hvilket ligger på en bølgelængde mellem

700nm og 10.000.000nm. En omregning fra bølgelængde til bølgetal kan fortages ved:

𝑥 𝑐𝑚−1 =1,0 · 107

𝑦 𝑛𝑚

Metoden benyttes primært til, at undersøge og karakterisere forskellige stoffer, renheds-

bestemmelser og funktionelle grupper samt kvalitative undersøgelser af opløsninger [66].

Der måles på absorbering af infrarødstråling. Et molekyles evne til at absorbere afhænger

af dets struktur. Under et absorptionsspektrum af et ukendt stof, vil stoffets funktionelle

grupper, ligge i den høje ende af spektret (1500 cm-1 til 5000 cm-1), mens det såkaldte

fingeraftryks område vil ligge i den lave ende (1500 cm-1 til 500 cm-1). Fingeraftryks om-

rådet har specifikke absorptioner afhængig af molekylernes opbygning.[66]

Der sker en absorption af IR-lys, idet atomer er i stand til at blive exciteret og elektronerne

springer bane. Infrarødlys giver dog ikke nok energi til, at en elektron kan excitere til et

andet energiniveau, men lyset absorberes i molekylernes bindinger. Dvs. atomernes

svingninger (vibrationer) i molekylerne kan absorbere infrarødlys. [66]

Vibrationer i molekyler beskrives hovedsageligt af svingningsfrekvenserne inddelt i to

grupper strækningssvingninger (Figur 33) og bøjningssvingninger (Figur 33). Med stræk-

ningssvingninger menes, at bindingslængden varierer, mens bøjningssvingning varierer

vinklen mellem bindingerne. Der kræves mest energi til at ændre bindingslængden sam-

menlignet med bindingsvinklen, hvilket resulterer i, at strækningssvingningerne frem-

kommer ved højere bølgetal end bøjningsvinklerne. [66]

Figur 33 Bevægelighed i molekylernes bindinger: https://en.wikipedia.org/wiki/Carbon_dioxide#/media/File:Co2_vi-

brations.svg

Dvs. stoffernes evne til at absorbere infrarødstråling afhænger af stoffets evne til at vi-

brere. Intensiteten af absorptionen er derfor proportional med ændringen af momentet i

molekylet. Ændringen af momentet i et molekyle forekommer mere i molekyler med et

35

dipolmoment. Et dipolmoment er en forskydning af elektroner over tid i et molekyle, som

skaber større bevægelighed. [66][62] Dette gør, at stoffer som har en kraftig dipol såsom

alkoholer og syrer vil lave en stærk absorption.

Et IR-absorptionsspektrum giver derved et billede af et stofs absorption af det infrarøde

lys. Det giver et billede af bl.a. de forskellige funktionelle grupper, men samtidig gives

billede af gruppefrekvenser.[66] Ingen forskellige stoffer vil give det helt samme absorp-

tionsspektrum, da stoffets svingningsfrekvens afhænger af både molekylets struktur, vi-

brationsfrekvens og stoffets masse. Derfor vil ingen spektre være helt ens. Hvis det ikke

kan afgøres ud fra bølgetallene over 1500 cm-1, kan der kigges på fingeraftryksområdet.

For at kunne tolke et IR-spektrum skal et kendskab til de forskellige gruppers absorpti-

onsområder etableres. Der vil ikke kunne laves en helt præcis tabel for absorption af funk-

tionelle grupper, da alle molekyler vil have forskellige vibrationsfrekvenser, men en tabel

vil kunne give et overblik over gruppernes absorptionsområder. (Figur 34)

For at koble teorien fra foregående afsnit og strukturer på vanillin molekylet (Figur 35)

og kunne undersøge, hvorvidt IR er en egnet metode til at analysere forskellen på synte-

tisk vanillin og naturligt vanillin, vil der analyseres på vanillins funktionelle grupper i

dets IR-spektrum, som var et resultat af et eksperiment, der kommes ind på i afsnit 7.0

(Figur 35).

Det første, der ligges mærke til på IR-spektret, er det brede bånd ved 3500 - 3000 cm-1. I

teorien blev grupper med en stærk dipol beskrevet som absorptionsstærke grupper, mens

Figur 34 En tabel over funktionelle gruppers absorptions områder: http://lmfk.dk/kemiforlaget/spektro-skopi/data/tabelsamling-jan-2004.pdf

Figur 35 Vanillins infrarøde absorptionsspektrum - FTIR apparat

36

grupper, hvor strækningslængden ændres, vil ligge i den høje ende af spektret. Alkohol-

gruppen i vanillin er en gruppe med en stærk dipol gruppe. Den er derfor stærkabsorbe-

rende i bølgetallene 3500 - 3000 cm-1, hvilket passer godt med spektret. Vanillin indehol-

der også en aldehydgruppe, som også er en gruppe med en stærk dipol. Den vil ifølge

tabellen absorbere stærkt omkring 1730 cm-1, hvilket også stemmer overens med spektret.

Vanillin indeholder også en ethergruppe som også er en gruppe med en stærk dipol, som

vil have en stærk absorption mellem 1290-1000 cm-1.

Da vanillin er et aromatisk stof, som indeholder en aromatisk ring vil der ske karakteri-

stiske absorptioner for C−⃛C strækninger. De ligger ifølge tabellen omkring 1600-1575 cm-1 og 1500-1450 cm-1. Da der er så mange absorptioner mellem 1500 cm-1og nedefter,

skabes en vis usikkerhed ved manuel aflæsning af spektret, men karakteristiske grupper

med stærke dipoler kan dog aflæses. En fordel er derfor at sammenligne spektrene elek-

tronisk via en database og få en procentvis sammenligning ud for at bekræfte, at det ana-

lyserede stof er vanillin.

IR-spektrofotoskopi benyttes i dette projekt til undersøgelse af naturligt og syntetisk va-

nilje kvalitativt, da spektret ikke vil kunne give en præcis beskrivelse af, hvad stoffet

indeholder pga. de mange komponenter i naturlig vanilje. Spektrene for henholdsvis na-

turligt og syntetisk kan dog holdes op mod hinanden og undersøges. Et spektrum af na-

turlig vanilje vil give et meget absorberende spektrum, grundet dets mange forskellige

molekyler og komponenternes forskellige vibrationsfrekvenser, da naturlig vanilje kun

indeholder omkring 2 % vanillin. Forskellen på de to spektre vil derfor være absorbe-

ringsmængden.

37

6.2 Gaskromatografi Princippet i gaskromatografi er, at en stofblanding bringes på gasform, tilføres og trans-

porteres igennem en kolonne. Da de enkelte stoffer besidder forskellige kogepunkter og

polaritet, vil de derved føres igennem kolonnen med forskellige hastigheder via en mobil

fase bestående af en bæregas, der fører fragmenterne gennem en stationær fase, hvis po-

laritet afhænger af prøven. Tiden, der forløber for stoffet at passere igennem kolonnen til

detektoren, kaldes rententionstiden og videregives til et datasystem. Detektoren registre-

rer yderligere stofmængden ved gennemløb af kolonnen bl.a. ved at måle den termiske

ledningsevne af gassen, der forlader kolonnen. Datasystemet viser resultatet i et kroma-

tografi med rententionstiden horisontalt og stofmængden vertikalt. I Figur 36 er illustreret

instrumenterne, der indgår i analysemetoden og enkelte af disses funktion og vigtighed

vil blive gennemgået kursorisk.

Gaskromatografi kan anvendes kvalitativt til at bestemme indholdet af en prøve under

forudsætning af, at man har en formodning af indholdet af denne samt givet, at man har

rene referenceprøver af formodede stoffer at krydstjekke med. Disse gennemløber pro-

cessen efter samme princip som prøven. Herefter kan rententionstider sammenlignes og

prøvens indhold identificeres.[67]

Gaskromatografianalyse kan også anvendes kvantitativt, da arealet under toppene, be-

skrevet ved rententionstiderne for de adskilte stoffer, agerer som mål for indholdets

mængde af det givne stof i prøven. Dette bestemmes ligeledes ved gennemløb af kendte

stofprøver, disse med kendte koncentrationer. Der kan derpå beregnes areal af disse toppe

under forudsætning af, at de analyserede prøver indeholder de samme volumen. Ved ud-

arbejdning af en standardkurve ud fra prøverne af de kendte stofmængdekoncentrationer,

kan der udføres lineær regression.[68]

Den mobile fase beskriver bæregassen, der fører fragmenterne af det medie, man ønsker

analyseret gennem kolonnen. De inerte gasser, helium eller dinitrogen er alment an-

vendt.[69] Dog anvendes nogle steder hydrogen som substitut for helium. Dette frarådes

dog på baggrund af brandfare[67]. En gas af høj renhedsgrad er påkrævet, da eventuelle

urenheder i form af oxygen eller vand kan angribe væsken i den stationære fase og be-

skadige den samt generere uhensigtsmæssige målinger af detektoren. Figur 37 og 38 viser

den mobile fases gennemstrømning af kolonnen i en hhv. pakket og åben.

Figur 36- Instrumenter anvendt ved gas chromatografi: https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c6/Gas_chromatograph-vector.svg/800px-Gas_chromatograph-vector.svg.png

38

Figur 38 - Pakket kolonne: Harold M. McNair, J.M.M., 1998. Basic Gas Chromtography, Wiley.

Den stationære fase består af en væske, der enten er af polær eller upolær karakter alt

efter opløselighed af stoffet, der ønskes analyseret. En effektiv stationær fase ønskes at

interagere med den prøve, der ønskes analyseret. Da ”like solvents like” anvendes derfor

en polær stationær fase til en polær prøve og omvendt en upolær stationær fase til en

upolær prøve. Forskellene ses illustreret på Figur 39, hvor et pesticid undersøges i en

upolær (SE-30) og en polær (OV-210). Det fremgår af figuren, at det polære pesticid

analyseres med fordel af den polære OV-210 kolonne. Der kan anvendes flere typer af

væske som stationær fase. Kravene til disse er et lavt damptryk, termisk stabilitet og lav

viskositet.

Figur 37. Åben kolonne: Harold M. McNair, J.M.M., 1998. Basic Gas Chromtography, Wiley.

Figur 39- Polært pesticide analyseret i hhv. SE-30 (uploær) & OV-210 (polær) kolonne: Harold M. McNair, J.M.M., 1998. Basic Gas Chromtography, Wiley.

39

Kolonnen er en tynd cylinderformet medie, der fabrikeres i flere varianter alt efter anven-

delighed. De laves bl.a. som pakkede kolonner (Figur 40, b) i rustfri stål, kobber eller

glas, der pakkes med et inert fast materiale, diatoméjord, som belægges med den statio-

nære fase. Disse er forholdsvis lette at fremstille[67] og foretrækkes ved større prøver.

Der fabrikeres desuden åbne kolonner (Figur 40, a) udført med en polyamid overflade,

hvor indersiden er belagt med kvartsglas, som består af 95 % SiO2, og et tyndt lag statio-

nær fase. Disse er typisk fysisk længere end de pakkede kolonner og øger dermed mulig-

heden for adskillelsen af fragmenterne af en stofprøve. Der findes flere undergrupper af

disse, der dog ikke vil omtales yderligere.

Figur 40 - (a) åben kolonne, (b) pakket kolonne: http://archive.cnx.org/resour-

ces/b99ee1873ddcf932fa3110fe5b75650083d10824/Picture%204.png

For at få et optimalt udbytte af analysemetoden kan gaskromatografi anvendes i processer

med massespektroskopi for at danne et bedre billede af komponenterne i den undersø-

gende prøve uden benyttelse af referencestoffer.

40

6.3 Massespektrometri Massespektrometri er en analysemetode med forskellige anvendelsesmetoder. Den kan

anvendes til at undersøge større komplekse stoffer, men også blandinger som består af

flere komponenter. Massespektrometri kan undersøge stoffer ved mængder helt ned til

10-9g [62]. En analyse af en blanding af flere komponenter starter ved en separering af

komponenterne kromatografisk evt. gaskromatografi, derefter bruges en ionkilde, som

ioniserer det bestemte stof, hvorefter det ledes til en masseanalysator. I masseanalysato-

ren adskilles de forskellige ioner med et eller flere magnetiske kraftfelter. Ved at variere

styrken af kraftfeltet, slippes ioner med forskellig masse igennem, hvorefter de bliver

registreret af en detektor. Massespektrometri giver specielle individuelle spektre, grundet

molekylers vægt og nedbrydningsmønstre. [62]

Analysemetoden afbilder et massespektrum med masse pr. ladningsenhed ud af den vand-

rette akse og intensiteten, procentvis tilstedeværelse af ionerne, ud af den lodrette akse.

Dvs. højden af toppene er proportional med antallet af ioner med massen, men også sta-

biliteten af fragmentioner. [62] Den mest intense top i spektret kaldes basetoppen, hvor-

efter de resterende toppes intensitet er givet ved en procentdel af basetoppen. Nedbryd-

ningsmønstret ses ud af den vandrette akse, hvor molarmassen er proportionalt faldene

med fragmenteringen af molekylet [62]. Methylchlorid (Figur 41) indeholder atomet

chlor. Chlors gennemsnitlige molarmasse er 35,453 g/mol, da massen er et gennemsnit af

isotoperne, da 35Cl står for 76 % og 37Cl står for 24 % i naturen, vil der derfor på spektret

ved et stof indeholdende Cl være en mindre top ved siden af basetoppen (52 m/z, figur

45)[62][70].

Som beskrevet i tidligere afsnit separerer gaskromatografien komponenterne fra hinan-

den, hvorefter de sendes videre til massespektroskopi. Første skridt mod et massespek-

trum, sker ved at stoffet bliver ioniserede. Et givent stof indføres i ionkilden, som har et

tryk på ca. 10-8 bar samt en temperatur på 200-300 0C. Trykket har den funktion at for-

hindre sammenstød af molekyler, mens temperaturen får stoffet til at fordampe og gør

fragmenteringen betydeligt nemmere. I ionkilden bliver det fordampede stof angrebet af

elektroner, og stoffet vil afgive en elektron og danne en positiv ion. Dvs. radikalerne har

ingen uparret elektronpar længere, så interne reaktioner mellem fragmentioner sker ikke.

[62]

Feks. methylchlorid

𝑀 + 𝑒− → 𝑀+• + 2𝑒−

𝐶𝐻3𝐶𝑙 + 𝑒− → 𝐶𝐻3𝐶𝑙

+• + 2𝑒− 𝑚 𝑚 𝑧⁄ 50

𝐶𝐻3𝐶𝑙+• → 𝐶𝐻2𝐶𝑙

+ + 𝐻 • 𝑚 𝑧⁄ 49

𝐶𝐻3𝐶𝑙+• → 𝐶𝐻3

+ + 𝐶𝑙 • 𝑚 𝑧⁄ 15

𝐶𝐻3+ 𝑜𝑔 𝐶𝐻2𝐶𝑙

+ 𝑘𝑎𝑛 𝑓𝑟𝑎𝑔𝑚𝑒𝑛𝑡𝑒𝑟𝑒𝑠 𝑦𝑑𝑒𝑟𝑙𝑖𝑔𝑒𝑟𝑒

41

Figur 41 - Methanchlorid: MS http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?ID=C74873&Mask=200

Som tidligere nævnt er intensiteten proportional med antallet af ionerne. Fragmenterede

ioners antal afhænger af, hvor stabil ionen er. Dvs. jo mere stabil en ion, der bliver dannet,

jo længere tid tager den om at blive fragmenteret igen. Hvis der kigges på fragmenterin-

gen af methylchlorid, som ses i nedbrydningsligningerne, bliver methylcationen dannet.

𝐶𝐻3+ fragmenterer videre til 𝐶𝐻2

2+ og videre til C4+. Da 𝐶𝐻3+ er mere stabil end 𝐶𝐻2

2+

resulterer det i, at der vil være et større antal af 𝐶𝐻3+ tilstede og vil dermed give en højere

top i massespektret. [62]

Efter molekylet bliver fragmenteret, bli-

ver de dannede ioner accelereret vha. en

ionaccelerator. Ionacceleratoren accele-

rer ionerne ved, at de positive ioner sø-

ger mod en negativ kilde. De bliver der-

efter afbøjet i et magnetfelt (se Figur

42), hvor ionens afbøjningsradius er af-

hængende af ionens ladning (z) og

masse (m) samt magnetfeltets styrke (B)

og acceleratorspændingen (U)[62].

𝑚

𝑧=

𝑟2 · 𝐵2

2𝑈

Da ladningen i det fleste spektre er 1 C, vil ionerne kun afhænge af massen. Det er en

fordel at holde radius konstant mht. størrelse og effekten af udstyret. De fleste apparater

holdes acceleratorspændingen også konstant, mens det kun er magnetfeltets styrke som

justeres. Magnetfeltets styrke er derfor proportional med størrelsen på ionerne i anden

potens