Otoferlin: a multi‐C2 domain protein essential for hearing 

T. Pangršič1,*, E. Reisinger2,* & T. Moser1,3,4,#  

1InnerEarLab, Department of Otolaryngology and Collaborative Research Center 889, 

University Medical Center Göttingen, Göttingen, Germany  

2Molecular Biology of Cochlear Neurotransmission group, Dept. of Otolaryngology and 

Collaborative Research Center 889, University Medical Center Göttingen, Göttingen, 

Germany 

3Bernstein Center for Computational Neuroscience, University of Göttingen, Göttingen, 

Germany 

4Center for Molecular Physiology of the Brain, University of Göttingen, Göttingen, 

Germany 

*equal contribution 

#corresponding author  

Key words: hair cell, calcium, priming, fusion, synaptic vesicle, ferlins 

Correspondence: 

Tobias Moser 

InnerEarLab, Dept. of Otolaryngology and Collaborative Research Center 889, University 

of Göttingen Medical Center, 37099 Göttingen, Germany 

Tel.: 49‐551‐39‐8968  

Fax.: 49‐551‐3912950, tmoser@gwdg.de 

1

Abstract 

Sound is encoded at synapses between cochlear inner hair cells and the auditory nerve. 

These  synapses  are  anatomically  and  functionally  specialized  to  transmit  acoustic 

information with high  fidelity  likely over a  lifetime. The molecular mechanisms of hair 

cell  transmitter  release  have  recently  attracted  substantial  interest.  Here we  review 

progress toward understanding otoferlin, a multi‐C2 domain protein identified a decade 

ago by genetic analysis of human deafness. Otoferlin  functions  in hair cell exocytosis. 

Several otoferlin C2 domains bind to Ca2+, phospholipids, and proteins. Current research 

reveals  requirements  for  otoferlin  in  priming  and  fusion  of  synaptic  vesicles  during 

sound  encoding.  Understanding  the  molecular  mechanisms  through  which  otoferlin 

functions  also has  important  implications  for understanding disease mechanisms  that 

lead to deafness.  

 

Introduction 

The inner hair cells (IHCs) of the mammalian inner ear transduce mechanical stimuli into 

electrical  signals  and  transmit  them  to  auditory  neurons  via  ribbon‐type  synapses. 

Physiologically,  the  IHC  synapse  features  submillisecond precision and unprecedented 

high  rates  of  release  and  replenishment  of  vesicles.  Its morphological  feature  is  the 

synaptic ribbon, a nanoscale proteinaceous complex tethering a halo of synaptic vesicles 

close to the active zone (AZ; see Glossary). Except for the presence of the ribbon and the 

use  of  L‐type  Ca2+‐channels  for  stimulus‐secretion  coupling,  IHCs  were  thought  to 

employ  the  same  set  of  synaptic  proteins  as  glutamatergic  synapses  of  the  central 

2

nervous system (CNS; Box 1). However, already in 1999 immunohistochemistry and RT‐

PCR reported that synaptotagmin 1‐3, synaptophysin and synapsin are absent from this 

synapse  [1].  Subsequently,  physiological  and  immunohistochemical  studies  indicated 

that  it  also  lacks  complexins  [2,3]  and  seems  to operate without neuronal  soluble N‐

ethylmaleimide‐sensitive factor attachment receptor (SNARE) proteins [4]. Instead, IHCs 

use other proteins  such as  the C2‐domain protein otoferlin  for exocytosis. We expect 

that  future  studies will  further demonstrate  that  this  synapse does not use  the  same 

molecules thought to be mandatory for docking, priming and fusion of vesicles in brain 

synapses.  Such molecular  differences  allow  for  studies  of  disorders  of  the  auditory 

synapse  in  an  otherwise  unaffected  mouse  model  or  in  human  patients.  To  date, 

mutations  in  otoferlin,  the  L‐type  voltage‐dependent  Ca2+‐channel  CaV1.3  and  the 

vesicular  glutamate  transporter  3  (Vglut3)  have  been  identified  to  cause  human 

deafness  [5–7]  as  a  consequence  of  defective  synaptic  transmission  at  the  hair  cell 

synapse  [6,8–12].  These  hearing  disorders  can  therefore  be  referred  to  as 

“synaptopathies” [13–15].  

Otoferlin,  similarly  to  many  presynaptic  proteins  like  synaptotagmins  (Syts), 

Munc13s and Rab  interacting molecules (RIMs), contains several C2 domains (Fig. 1).  It 

belongs  to  the  family  of  ferlin  proteins,  which  includes  dysferlin  and  myoferlin  of 

vertebrate myocytes, Fer‐1 of sperm in invertebrates, and misfire in Drosophila. Ferlins 

have been generally  implicated  in membrane‐membrane fusion events (e.g.   [16]), but 

compared to other C2‐domain proteins  involved  in synaptic vesicle exocytosis, we have 

just begun to understand their precise functions.  

3

Otoferlin is required for synaptic transmission at the IHC ribbon synapse 

The analysis of otoferlin knockout mice gave first  insights  into the function of otoferlin 

[8].  Otoferlin‐deficient  IHCs  display  a  severe  reduction  in  Ca2+‐dependent  exocytosis 

with  normal  numbers  of  ribbon‐associated  and  docked  vesicles  [8]  (Fig.  2,  Box  2). 

Therefore,  it was concluded that otoferlin  is essential for a  late step of exocytosis (e.g. 

vesicle priming and/or fusion [8]). Subsequently, otoferlin was shown to be required for 

synaptic exocytosis of  immature outer hair cells and type I vestibular hair cells [17,18]. 

The  function  of  the  vestibular  system  was  partially  impaired  when  assessed  by 

vestibular  evoked  potentials  [18],  while  no  gross  vestibular  deficit  was  detected  in 

behavioral assays [8]. This  is  in  line with the  less severe exocytosis phenotype found  in 

otoferlin‐deficient vestibular hair cells [18].  

  In contrast to otoferlin deletion, abrogation of similar CNS synaptic proteins like 

Munc13‐1 or Syt1  is  lethal. The disruption of the priming  factor Munc13‐1  leads to an 

almost complete block of evoked and spontaneous transmitter release at most neuronal 

synapses  [19,20].  Similarly,  deletion  of  the  Ca2+‐sensor  protein  Syt1  abolishes  the 

synchronous  component of evoked  response  [21], while  the effects on  asynchronous 

and spontaneous transmitter release vary among preparations  [21–25]. How does this 

compare  to  the  observed  effects  in  IHCs  lacking  otoferlin?  These  cells  show  no 

detectable  synchronous  exocytosis  [8,9]  but  slowly  release  transmitter  regardless  of 

stimulation [9]. Similarly to Syt, otoferlin is mainly found on synaptic vesicles but also on 

the plasma membrane [8,9] (Fig. 2b).  

 

4

Current hypotheses of otoferlin function in exocytosis 

The  observed  association  between  otoferlin  and  synaptic  vesicles,  the  structural  and 

biochemical similarities with Syt1, and  the  impairment of exocytosis despite abundant 

vesicles  at  the  AZ,  led  to  the  hypothesis  that  otoferlin  functions  as  a  Syt1‐like  Ca2+‐

sensor for fusion  in  IHCs [8]. A subsequent  investigation of an Otof missense mutation 

indicated a role for otoferlin in vesicle replenishment and suggested priming as another 

site of action [9].  

 

Otoferlin: a Ca2+‐sensor for synaptic vesicle fusion? 

The direct  interaction of otoferlin with  the neuronal SNAREs, Syntaxin 1 and SNAP25, 

[8,26,27] supported the hypothesis that otoferlin may act as a Syt1‐like Ca2+‐sensor for 

fusion. A reconstituted SNARE‐mediated membrane fusion assay showed that, similar to 

Syt1,  individual  C2  domains  of  otoferlin  (except  C2A)  and  also  otoferlin  fragments 

containing 3 consecutive C2 domains could stimulate SNARE‐mediated  liposome fusion 

in a Ca2+‐dependent manner [27]. An interaction of otoferlin and neuronal SNAREs in the 

organ of Corti was  indicated [8] and the presence of SNAREs  in hair cells was reported 

based  on  immunostaining  and Western  blotting  (e.g.  [1,3]). However,  a  recent  study 

cast  doubt  on  the  physiological  relevance  of  these  interactions  by  indicating  that 

neuronal SNAREs are not required for exocytosis  in  IHCs [4]. Obviously, otoferlin could 

still  interact  with  as  yet  unidentified  SNAREs  or  SNARE‐like  proteins  mediating 

exocytosis in IHCs.  

5

Ca2+‐  and  phospholipid  binding  by  several  of  the C2  domains  [8,26,27]  further 

supports  the  Ca2+‐sensor  hypothesis,  though,  the  biochemical  properties  of  these  C2 

domains  are  still  under  debate.  Predicting  Ca2+‐  and  phospholipid  binding  sites  is 

challenging as otoferlin and non‐ferlin C2 domains  share only  low  sequence  similarity 

(e.g. 31% amino acid identity between PKCα C2 and otoferlin C2D is one of the highest). 

Further, except for the C2A domain, providing the first crystal structure of an otoferlin C2 

domain [28] (Fig. 1), purification of otoferlin C2 domains expressed  in E. coli  is difficult. 

In  some  studies,  protein  aggregates were  dissolved  under  denaturing  conditions  and 

proper  protein  folding  after  re‐naturation  was  not  ascertained  [8,26].  Moreover, 

uncertainty about the extent of the C2 domains led to the design of different constructs 

for  expression  [9,26,27],  possibly  affecting  the  results  of  binding  assays.  In  a  recent 

comprehensive  study  on  recombinant  otoferlin  C2  domains,  the  binding  of  Ca2+ was 

indicated for all C2 domains with the exception of C2A [27]. This is consistent with other 

results  on  C2A  [28],  C2D  [8],  and  C2F  domains  [26], while  a  lack  of  Ca2+‐binding was 

reported for C2F in another study [9]. Similarly, phospholipid binding has been indicated 

for all otoferlin C2 domains in [27], but not for C2A in [28] and C2F in [9]. Future studies 

solving the structure of the otoferlin C2 domains will ultimately reveal their borders and 

help resolve controversy about Ca2+‐ and phospholipid binding sites.  

The Ca2+‐sensor hypothesis has also been addressed in a study expressing Syt1 in 

otoferlin‐deficient mouse  IHCs  [29]. Despite  high  viral  transduction  rates  and  proper 

Syt1  targeting  to  synaptic  vesicles,  hearing  and  IHC  exocytosis  (Box  2)  could  not  be 

restored  [29].  Further,  otoferlin  expressed  in  Syt1‐deficient  neuroendocrine  cells  and 

6

hippocampal  neurons  failed  to  restore  synchronous  exocytosis.  In  the  latter,  a  small 

increase  in  asynchronous  response was  found, which may  be  related  to  the  slightly 

larger  miniature  excitatory  postsynaptic  potentials  (EPSCs),  potentially  reflecting  a 

subtle  increase  in  the number of postsynaptic AMPA  receptors.  Together,  the  results 

argued against a simple  functional equivalence of  these structurally and biochemically 

related proteins. However, potential pitfalls need to be considered. First, otoferlin may 

not  have  been  sufficiently  targeted  to  the  presynaptic  terminals  of  hippocampal 

neurons. Second, the fusion with eGFP might have impaired its function. Third, failure of 

cross‐rescue may  have  resulted  from  a  lack  of  the  relevant  interaction  partners  of 

otoferlin and Syt1 in the respective cells.  

Perhaps the strongest argument for the Ca2+‐sensor hypothesis comes from the 

observation that otoferlin‐knockout IHCs never show synchronous exocytosis, not even 

after a  long period of exocytic arrest such as  long hyperpolarization  [8,9]. Specifically, 

neither  short  Ca2+‐influx  typically  used  to  discharge  the  readily  releasable  pool  of 

vesicles (RRP; Fig. 2a, Box 2) nor Ca2+‐uncaging (Fig. 2c) elicited fast exocytic responses, 

although small but significant exocytosis could be documented by capacitance changes 

during  long depolarizations of  IHCs and by postsynaptic recordings  in the absence and 

presence  of  IHC  stimulation.  Therefore,  although  otoferlin  is  critical  for  vesicle 

replenishment (see below), impaired vesicle replenishment is unlikely to account for the 

complete  lack of RRP exocytosis  in otoferlin‐deficient  IHCs.  Instead,  together with  the 

above‐mentioned  evidence,  this  finding  supports  a  role  of  otoferlin  in  vesicle  fusion. 

Future studies combining mutagenesis directed towards Ca2+‐binding sites in otoferlin C2 

7

domains ‐ ideally sparing vesicle replenishment ‐ together with flash photolysis of caged 

Ca2+  (to  probe  for  changes  in  the  intrinsic  Ca2+‐dependence  of  fusion,  Box  2) will  be 

required to ultimately test the Ca2+‐sensor of fusion hypothesis for otoferlin.  

 

Otoferlin: a priming factor enabling fast vesicle replenishment? 

A function of otoferlin in IHC synaptic vesicle priming was uncovered when analyzing the 

deaf pachanga mouse mutant [9] that carries a missense mutation in the C2F domain of 

otoferlin elicited by random mutagenesis  [30]. Mutant  IHCs displayed normal synaptic 

Ca2+‐influx and exocytosis of the RRP (Fig. 2a), a small but fast exocytic response to Ca2+‐

uncaging  (Fig.  2c)  and  an  unaltered  intrinsic  Ca2+‐dependence  of  exocytosis  [9], 

supporting the view that this mutation does not impair the mechanism of Ca2+‐triggered 

fusion.  However,  a marked  reduction  of  sustained  exocytosis  (Fig.  2a)  and  a  slowed 

recovery of the RRP from depletion  indicated an  impaired vesicle replenishment of the 

release  sites.  This,  together with  an  unchanged  anatomical  estimate  of  the  synaptic 

vesicle complement, and normal endocytic membrane retrieval, suggested that otoferlin 

is  involved  in  vesicle  priming  [9].  However,  as  these  authors  noted,  a  function  of 

otoferlin  in  clearing  exocytic material  from  the  release  site  towards  the  perisynaptic 

sites of endocytosis [31] could not be excluded. Indeed, a role in coupling exocytosis to 

endocytosis  has  been  suggested  for  of  Syt1  [32–34]  and,  hence,  potentially,  another 

interesting parallel between otoferlin and Syt1 might exist. Vesicle replenishment in hair 

cells  is Ca2+‐dependent  [35–39] and  it  is  tempting  to  speculate  that otoferlin  is a  key 

effector of this process.  

8

The  finding of normal RRP exocytosis  in vitro  (Fig. 2a, Fig. 3a)  seemed hard  to 

reconcile with the profound hearing impairment in pachanga mice in vivo [9]. However, 

in vivo recordings from single auditory nerve fibers and brainstem neurons showed that 

lowering stimulus rates improved spiking at sound onset in pachanga mice [9] (Fig. 3b). 

It  was  then  hypothesized  that,  in  vivo,  with  given  evoked  and  spontaneous  vesicle 

release  the  impaired  vesicle  replenishment  does  not  support  the maintenance  of  a 

sufficient  standing  RRP  (i.e.  the  AZ  is  chronically  depleted  of  primed,  release‐ready 

vesicles  or  perhaps  of  reusable  synaptic  machinery;  Fig.  3c).  Longer  interstimulus 

intervals partially restore a standing RRP (Fig. 3a), enabling some as yet limited neuronal 

spiking upon presentation of sounds.  In contrast, during  in vitro experiments, cells are 

kept at hyperpolarized potentials in‐between stimuli, so that “spontaneous” transmitter 

release  is  blocked  (see  [40]).  As  a  consequence,  even  the  reduced  rate  of  vesicle 

replenishment can establish a normal‐sized RRP for exocytosis in IHCs of pachanga mice 

upon  stimulation  at  the  low  rates  of  repetition  (0.01‐0.03  Hz)  used  in  [9].  Figure  3 

illustrates  this  hypothesis  with  the  product  of  standing  RRP  and  release  probability 

defining the transmitter release (Fig. 3a) and ensuing spike rate (Fig. 3b).  

Why  might  cochlear  IHCs  require  otoferlin  as  a  special  priming  factor?  The 

answer may be related to the demands of synaptic encoding of sound, where each spiral 

ganglion neuron (SGN) can spike at hundreds of Hz during ongoing acoustic stimulation. 

Different from a bipolar cell of the retina or a vestibular ganglion neuron, each SGN  is 

driven by a  single  IHC AZ  [41],  reviewed  in  [42]). Moreover, SGNs  seem  to only  spike 

once for each presynaptic release event [43]. Therefore, in response to ongoing acoustic 

9

stimulation, the SGN spike rate is probably limited by the rate of vesicle replenishment 

to  the AZ. Assuming  an  adapted  spike  rate  of  200 Hz,  and  one  or more  vesicles  per 

release event, the vesicle replenishment rate must be 200 Hz and  likely greater.  If the 

average release event involves four [44] or seven [40] vesicles, then a replenishment of 

at least 800‐1400 vesicle‐quanta would be required per second per AZ. IHCs in vitro can 

sustain exocytic rates of 700 synaptic vesicles per second per AZ for at  least 100 ms of 

strong  stimulation  [9]. Assuming  approximately 10  release  sites per AZ,  this  indicates 

that  each  ‘RRP  slot’  can  be  replenished  70  times  per  second.  These  rates  surpass 

estimates in other synapses that lack otoferlin. For example, the IHC vesicle supply rate 

exceeds  that  of  rat  bipolar  cells  by  approximately  an  order  of  magnitude,  despite 

comparable synaptic structure and only slightly different RRP size (70 vesicles/s/AZ or 7 

vesicles/s/RRP slot [45]). On the other hand, vestibular hair cells express otoferlin too, 

but show  lower  replenishment  rates, which are  less strongly affected by disruption of 

otoferlin [18].  

The search for  interaction partners of otoferlin  is an active topic of research. In 

addition  to  the  above mentioned  SNAREs,  the unconventional Myosin VI  [46,47],  the 

small G‐protein Rab8b [48], Ergic2 [49] and the CaV1.3 channel [26] were described to 

interact with otoferlin. However, three of the studies  [47–49] used a yeast‐two‐hybrid 

bait covering half of the C2D domain (amino acids 904 to 1025 while C2D extends from 

962 to 1095), which might reveal unspecific protein interactions due to misfolding of the 

incomplete domain. Further  functional  studies  to demonstrate  the  relevance of  these 

protein interactions would therefore be desirable.  

10

How  can  the  priming  and  Ca2+‐sensing  functions  (Fig.  3c,  d)  be  selectively 

affected  by  different  mutations  of  the  otoferlin  gene?  We  consider  two  possible 

scenarios. While no significant biochemical difference between the mutant and the wild 

type  C2F  domain  has  been  described  so  far  [9],  the  pachanga mutation might  alter 

binding  site(s)  for  interaction(s)  involved  in  priming  but  leave  the molecular  events 

leading to fusion intact. Alternatively, priming and fusion may require different amounts 

of proteins. For example, 30% of the normal levels of otoferlin, as detected in pachanga 

IHCs, might suffice  for  intact  fusion but not  for proper priming. On  the other hand,  in 

the  complete  absence of otoferlin,  fusion events might be  so  rare  that priming  is no 

longer the rate‐limiting step, although it, too, is affected by the lack of otoferlin (see Fig. 

3c). However,  the dependence of priming and  fusion on otoferlin  levels has yet  to be 

established.  It  is  likely  that  the  pachanga mutation  renders  the  protein  product  less 

stable, consequently only very little protein is detected by immunofluorescence (Fig. 2b). 

Interestingly,  cross‐breeding  of  pachanga  with  knockout  mice  resulted  in  a  further 

reduction of otoferlin protein levels in IHCs, leading to even less sustained exocytosis [9]. 

Human missense mutations  in  OTOF,  including  the mutations  that  confer  enhanced 

temperature‐sensitivity  to  otoferlin  (see  below),  might  also  act  by  destabilizing  the 

protein. Research on mouse models  and  in  vitro biochemical  studies of otoferlin  and 

exocytosis  at  the  IHC  synapse  will  help  to  understand  clinical  findings  described  in 

patients with mutations in otoferlin. 

 

 

11

Potential molecular mechanisms involving otoferlin  

Compared  to  the putative Ca2+‐sensor of  fusion  (Syt1) and  the putative priming  factor 

(Munc13‐1)  acting  at  conventional  synapses,  little  is  known  about  the  structure  and 

function of otoferlin. Moreover, direct comparison  is hampered by the unconventional 

exocytic machinery found  in hair cells. Nevertheless, we provide some speculations on 

potential  molecular  mechanisms  of  otoferlin  function:  Considering  vesicle 

replenishment  and  fusion,  possible  molecular  mechanisms  include  (i)  tethering  of 

opposing membranes, potentially  involving otoferlin oligomerization,  (ii) promotion of 

the assembly of trans‐SNARE complexes, (iii) Ca2+‐dependent approximation of vesicular 

and  plasma membranes,  (iv)  interaction with  other  proteins mediating Ca2+‐triggered 

fusion,  and  (v)  interaction with  endocytic  proteins  to  facilitate  the  clearance  of  the 

release  site.  Otoferlin's  potential  involvement  in  tethering  synaptic  vesicles  to  the 

plasma membrane  is an attractive hypothesis for  its function  in vesicle replenishment. 

Indeed,  vesicles  at  IHC  synapses  are  tethered  to  the  synaptic  ribbon  and/or  to  the 

plasma  membrane  (e.g.  [50]),  but  the  molecular  identity  of  the  tethers  remains 

unknown. Ca2+‐dependent phospholipid binding has been indicated for several otoferlin 

C2  domains  [26,27].  Therefore,  it  seems  conceivable  that  otoferlin  inserts  into  the 

cytosolic  leaflet  of  the  plasma membrane,  acting  as  a  cone  or wedge  that  promotes 

membrane  bending  and  brings  the  opposing membranes  in  closer  apposition,  as  has 

been suggested for Munc13 C2B [51] and Syt C2 domains [52,53]; reviewed in [54–57]). 

Alternatively,  in analogy to predictions for Syt1, otoferlin might act to stabilize the yet 

unidentified SNARE complex (as reported using  liposome fusion assays [27]) or help to 

12

reduce electrical  repulsion between  the opposing membranes by way of  the positive 

charges  of  bound  Ca2+‐ions.  Finally,  the  coiled‐coil  domain  of  otoferlin might  form  a 

superhelix either with itself or with other proteins, and the “zippering‐together” of the 

helices could help to overcome the energy barrier for fusion of the two membranes. 

 

Human mutations and clinical findings  

Pathogenic mutations in OTOF underlie the nonsyndromic autosomal recessive deafness 

DFNB9  [5]  and  together  with  the  non‐pathogenic  mutations  [58–65]  provide  some 

indication for which protein domains are  important for otoferlin function (Fig. 4). Non‐

pathogenic  sequence  variants  are mostly  found  in  the  C2A  domain  or  in  the  linker 

regions  between  C2  domains.  So  far, more  than  60  pathogenic mutations  have  been 

reported. Among those are 15 pathogenic missense mutations of which 10 are found in 

C2 domains C‐F (Fig. 4, see also [63]). In addition to disabling the function of the protein 

at  the  synapse, missense mutations might  lead  to  enhanced  protein  degradation,  as 

reported for the deaf5 [47,66] and pachanga [9] mutations in mice.  

The hearing impairment varies among subjects with different mutations in OTOF. 

In most patients, auditory brainstem responses are absent or highly abnormal despite 

the presence of otoacoustic emissions and/or cochlear microphonics  [60–62,64,65,67] 

as also found in auditory neuropathy [68]. Together with the results of animal research 

this indicates impaired SGN activation by IHC transmitter release (synaptopathy) despite 

intact  mechanoelectrical  transduction  and  cochlear  amplification  [67].  Otoacoustic 

emissions can also disappear [60], presumably due to subsequent loss of outer hair cells.  

13

Most  pathogenic  OTOF mutations  lead  to  profound  prelingual  deafness.  The 

predominant one,  the so‐called “Spanish mutation”  (Q829X), causes a premature stop 

codon  and  was  found  in  8%  of  the  congenital  non‐syndromic  deaf  population  with 

autosomal recessive inheritance of Spanish descent [58,63]. Missense mutations (Fig. 4) 

produce heterogeneous phenotypes. Some cause profound prelingual deafness, as do 

premature stop codons or frameshift‐inducing deletions or  insertions [63]. Others,  like 

the L1011P mutation [69], leave residual high‐frequency hearing, which suggests partial 

functionality of the mutated protein.  

For  some  hearing‐impaired  individuals,  their  phenotypes  are  exacerbated  at 

elevated body temperature. In these cases, an in‐frame deletion or missense mutations 

in OTOF  have  been  identified  and  proposed  to mediate  the  temperature‐dependent 

hearing  loss.  To  date,  four  such  point mutations  have  been  described  which  affect 

different  sites  of  the  protein  (violet  in  Fig.  4),  indicating  a  general mechanism  like 

protein  destabilization  and  subsequent  degradation  leading  to  a  reduction  in  protein 

levels.  Interestingly, when  afebrile  the  individuals with  the  I515T,  the G541S  and  the 

E1804del mutations have  almost normal hearing  thresholds  in pure  tone  audiograms 

albeit with  impaired speech recognition particularly  in background noise [62,65,70].  In 

contrast,  at  38.1°C  they  are  profoundly  deaf  for  low  frequencies,  severely  hearing 

impaired  for high  frequencies, and  they  reported  tinnitus. Case  studies  such as  these 

have provided launch pads for the investigation of specific neurobiological mechanisms 

of hearing and deafness in the past decade. 

 

14

Concluding remarks and future directions 

Interdisciplinary studies over the past decade have characterized otoferlin as a hair cell 

specific protein essential for synaptic sound encoding. Following the discovery of OTOF 

as a deafness gene, its expression, clinical genotype‐phenotype relationship, subcellular 

localization, protein biochemistry and structure, functional role in synaptic transmission, 

and  disease mechanism(s)  have  been  addressed. Otoferlin  has  become  an  important 

bait  for  fishing other members of  the unconventional hair cell  release machinery, but 

this search has just begun to yield results.  

Recent  studies  have  revealed  the  crystal  structure  of  its  C2A  domain  and 

demonstrated Ca2+‐ and phospholipid binding of several other C2 domains. However, the 

precise  topology  of  Ca2+‐binding  to  the  structure  of  full‐length  otoferlin  and  the 

functional consequences are not clear  (see Box 3).  In vitro work  in knockout mice and 

point mutants has played a major role in unraveling the function(s) of otoferlin. So far, it 

has helped to pinpoint the function of otoferlin to hair cell exocytosis. Hypothetical roles 

in Ca2+‐dependent vesicle priming and vesicle fusion are not mutually exclusive and will 

guide  future morphological  and  physiological  analyses. Mouse models with missense 

mutations  in otoferlin will  likely provide  insights  into disease mechanisms of moderate 

hearing phenotypes, including temperature‐sensitive hearing impairment. The defective 

vesicle replenishment in IHCs of pachanga mice, which is possibly related to the reduced 

levels of otoferlin protein, could well be a common denominator of weaker otoferlin‐

related human hearing  impairments. Establishing efficient gene  transfer  into  IHCs will 

15

enable  detailed  structure‐function  analysis  in  the  otoferlin  knockout  background  and 

also lay the foundation for future gene replacement therapy.  

 

 

Acknowledgment 

We would  like  to  thank M. Rutherford, C. Dean, R.  Jahn and S. Hallermann  for critical 

reading of the manuscript. We thank Linda Hsu for preparing the artwork. This work was 

supported  by  a  grant  from  the Deutsche  Forschungsgemeinschaft  (DFG)  through  the 

Collaborative Research Center 889 “Cellular Mechanisms of Sensory Processing” (to T. M. 

and E. R.). 

 

 

 

 

 

 

16

 

Figure 1: Structure and function of various C2‐domain proteins 

Schematic diagrams of the protein structure of a selection of ferlins (dysferlin, myoferlin 

and  otoferlin)  and  other  C2‐domain  proteins  involved  in  synaptic  exocytosis 

(synaptotagmin, Munc13,  RIM;  for  reviews  see  [55,71,72]),  along with  their  putative 

functions,  are  illustrated.  Among  the  C2‐domain  proteins,  ferlins  possess  the  highest 

number of C2 domains known (up to seven). In addition, they contain a DysF and/or Fer 

domain  (60‐70  residue  conserved  motif),  both  specific  for  this  family  of  proteins. 

Proteins  involved  in membrane  fusion events are often membrane anchored proteins 

and contain either an amphiphatic α‐helix, which  forms a  superhelix with α‐helices of 

interaction partners (as the SNARE motif in the SNARE complex), or domains which bind 

to phospholipid membranes in a Ca2+‐dependent manner. Otoferlin contains both types 

of domains: in addition to six C2 domains known for Ca2+‐ and phospholipid binding (ie. 

C2A‐F),  a  coiled‐coil  domain  (CC)  is  present  in  one  region  otherwise  predicted  to  be 

unstructured.  This  CC  domain might work  in  a  similar manner  as  the  SNARE motif, 

although  the other players  forming a  superhelix  like  in  the SNARE  complex  still await 

17

identification. In otoferlin, myoferlin and dysferlin, a seventh C2 domain  is predicted to 

fold  between  the  C2D  and  the  C2E  domains  (ie.  C2de  [73]).  However,  the  sequence 

similarity between  these  ferlin C2de domains and any other C2 domain  is much  lower 

than  the  similarity amongst other  ferlin C2 domains. The  tertiary  structure of  the C2A 

domain  (PDB  ID: 3L9B, upper  right;  reproduced, with permission,  from  [28])  is shown. 

The crystal structure of otoferlin C2A shows a similar folding as the Munc‐13 C2B domain, 

but has a shorter top loop [28]. Abbreviations: DUF, domain of unknown function; DysF, 

dysferlin  domain;  Fer,  Ferlin‐specific  motif;  MHD,  Munc13  homology  domain;  PDZ, 

postsynaptic  density‐95/Discs  large/Zona  occludens‐1  domain;  ;;  TM,  transmembrane 

domain. 

 

 

Figure 2: Exocytosis and otoferlin expression  in  IHCs of wild‐type mice and otoferlin 

mutant mice 

The  schematic  diagrams  (insets  to  parts  a  and  c)  depict  an  IHC.    Between  5  and  20 

ribbon‐type  active  zones  are  typically  seen,  although  only  3  are  depicted  here.  

18

Exocytosis was evoked by depolarizations of varying duration (in the case of part a) or by 

flash photolysis of caged Ca2+ (part b, for a fast and global elevation of cytosolic [Ca2+]) 

measured as membrane capacitance increase (∆Cm).  

a) Two components of ∆Cm in response to depolarization of IHCs in wild‐type mice (black 

line):  readily‐releasable  pool  (RRP;  gray  line)  and  the  sustained  component  (black 

dashed  line). While RRP exocytosis  is preserved, the sustained component of release  is 

strongly  reduced  in  IHCs  of  pachanga  mice  (C2F  missense  mutants,  green  line).  In 

otoferlin  knockout  (KO)  mice,  exocytosis  is  almost  absent  (violet)  [9].  b) 

Immunofluorescence  of  otoferlin  (otof:  green)  and  vesicular  glutamate  transporter  3 

(Vglut3: violet) expressed in IHCs of wild‐type (top), pachanga (middle) and otoferlin KO 

mice (bottom). Pachanga  IHCs show  lower expression  levels of otoferlin than the wild‐

type animals [9]. In the wild‐type IHCs the immunofluorescence signal for otoferlin and 

Vglut3  largely  overlap, while  otoferlin  shows  a  stronger  staining  than  Vglut3  on  the 

plasma membrane.   Scale bar: 5 µm. c) Upon Ca2+‐uncaging, a  large pool of vesicles  is 

released within a few ms in wild‐type IHCs (black). In IHCs of pachanga mice (green line), 

this  fast  component  is  strongly  reduced  (arrow);  however,  its  time  constant  is 

comparable to the fast component of the wild‐type response [9]. The strong reduction 

in amplitude is currently not understood. It might reflect a reduction in the total number 

of  synaptic vesicles or experimental conditions  that do not allow  sufficient priming  in 

the mutant IHCs. In otoferlin‐KO mice, only some residual slow release can be observed 

(violet) [9]. Adapted, with permission, from [9]. 

 

19

 

Figure 3: Proposed roles of otoferlin in IHC vesicle priming and fusion. 

a) Schematic drawing of the rate of exocytosis upon depolarization in IHCs of wild‐type 

(black) and pachanga  (green) mice roughly to scale  (assuming a vesicle capacitance of 

45 attofarad [74]): the rate of sustained release is strongly reduced in mutant IHCs [9].  

b) The spike rate of auditory nerve fibers and bushy cells over time (post‐stimulus time 

histogram) upon presentation of suprathreshold acoustic stimuli (gray bar) in wild‐type 

and pachanga mice [9]. The poor sound encoding in pachanga mice was proposed to be 

due to slowed vesicle replenishment, which was supported by  in vitro data (a) and the 

finding  that decreasing  the  rate of stimulus  repetition  (10 versus 0.5 Hz: green versus 

violet  trace)  improved  sound  encoding  in  mutant  mice.  In  vitro,  the  mutant  IHCs 

20

sufficiently  replenished  the RRP of vesicles because  synaptic  release was  inhibited  for 

several  seconds between  consecutive  stimuli. The  rate of  spiking of auditory  fibers  is 

driven  by  the  rate  of  transmitter  release  from  IHCs.  In  order  to  illustrate  the 

replenishment hypothesis we  relate spike  rate  to  the  rate of  transmitter  release  from 

IHCs  that  is  determined  by  the  size  of  the  standing  RRP  and  the  probability  of 

neurotransmitter release (Pr). For simplicity, we neglected the effects of refractoriness 

and  large  bin‐width  that  lead  to  underestimation  of  the  actual  rate  of  release.  The 

standing RRP differs between the resting (Rest) and stimulated (Stim) conditions, but is 

always much smaller at the AZ of the mutant IHCs. c) Schematic en‐face view of the AZ 

with  synaptic  vesicles and Ca2+‐nanodomains  in wild‐type, pachanga and otoferlin‐KO 

IHCs  in vivo. Normal numbers of docked vesicles were  reported  in both mutants. The 

pachanga mutation spares  fusion but  impairs  the priming of synaptic vesicles  [9]. The 

loss of otoferlin  in KO mice severely affects fusion and probably priming [8,9]. Because 

fusion  events  are  extremely  rare  in  otoferlin‐KO  IHCs,  enough  time  is  available  for 

vesicles  to reach  fusion competence despite defective priming. d) Schematic model of 

the proposed role of otoferlin in vesicle priming and fusion; Ca2+ is critical for both steps. 

 

 

21

 

Figure 4: Single amino acid mutations in OTOF 

Protein domain structure of otoferlin with pathogenic missense mutations and in‐frame 

deletions (top), and sequence variants (bottom), according to [58–65,69,70,75,76]. The 

numbers are based on the amino acid sequence of human otoferlin.  C2 domains (C2A‐F) 

are depicted according to analysis  in silico [77] or the crystal structure [28]. A seventh 

putative  C2  domain  is  also  depicted  [73]  (see  Fig  1  for  details).).  Five  potentially 

pathogenic  mutations  that  occurred  in  the  heterozygous  state  in  hearing  impaired 

patients ‐ and for which the mutation in the second allele has not been identified ‐ are 

labeled by §. The P490Q* mutation was found in cis with I515T [59]. Mutations in violet 

have  been  associated with  cases  of  temperature‐sensitive  hearing  loss  [62,64,65,70]. 

Abbreviations: CC, coiled‐coil domain; FerB, Ferlin‐specific motif  ; TM,  transmembrane 

domain. 

 

Glossary: 

Active zone (AZ): the site of the presynaptic plasma membrane where neurotransmitter 

is released opposite to the postsynaptic density.  

 

22

C2 domains: β‐sandwich domains consisting of a pair of four‐stranded β‐sheets (see Fig. 

1). They are found in protein kinase C, phospholipases, and in many presynaptic proteins 

like  synaptotagmins,  Munc‐13s,  and  RIMs.  C2  domains  generally  bind  Ca2+  and 

phospholipids  and/or  interact with other proteins. They  are  involved  in  a plethora of 

cellular  functions  (i.e. exocytosis,  regulation of GTPase  activity, modification of  lipids, 

protein  phosphorylation  etc).  In  C2  domains  within  non‐ferlin  proteins  (such  as 

Synaptotagmins, Munc13s etc.), Ca2+ is coordinated by three to five negatively‐charged 

aspartate  residues  located  at  specific  positions  in  top  loops  1  and  3.  Phospholipid 

binding occurs either simultaneously with that of Ca2+ to the top loops or independently 

of Ca2+ to the β‐groove (reviewed in [78]). 

 

Pathogenic mutations: mutations  in  the  genomic DNA  that  grossly  affect  the  length, 

stability or function of the encoded protein. Deletions or insertions of nucleotides in the 

coding sequence that  lead to a shift  in the reading  frame are always considered to be 

pathogenic. The same is true for point mutations leading to premature stop codons and 

therefore  to  truncated,  mostly  nonfunctional  proteins,  which  are  termed  nonsense 

mutations. Mutations  that  interfere with  the  splice donor or acceptor  site  in  the pre‐

mRNA are also mostly pathogenic. The exchange of one amino acid by another might be 

deleterious for the protein function or stability, in which case those are called “missense 

mutations”,  or  they  do  not  impair  the  protein  and  are  therefore  termed  “sequence 

variants”. 

 

23

Profound hearing  loss: a very severe form of hearing  impairment (hearing  loss greater 

than 90 decibels). Patients with  such hearing  impairment usually do not benefit  from 

hearing aids, but can be aided by cochlear implantation if the auditory pathway is intact.  

 

Readily‐releasable pool of vesicles (RRP):   population of vesicles that can  immediately 

fuse upon  increase  in  intracellular [Ca2+] without any further preparatory step. In most 

synapses these vesicles appear to be morphologically docked.  

 

Ribbon  synapse:  a  specialized  type  of  synapse, where  the AZ  contains  a  presynaptic 

electron‐dense  body,  the  ribbon,  which  is  composed  of  ribeye  and  other  scaffold 

proteins.  Ribbon  synapses  are  found  in  vertebrate  hair  cells,  synaptic  terminals  of 

photoreceptors,  bipolar  cells,  pineal  glands  and  electroreceptors.    Structurally  similar 

synapses,  known  as  T‐bar  synapses,  exist  in Drosophila,  however,  such  synapses  lack 

ribeye. 

24

Box 1: Comparison of the excitatory CNS synapse and the IHC ribbon synapse 

The conventional neuronal synapse and the IHC ribbon synapse differ in their molecular 

anatomy and physiology  (Figure  I). While the AZs of neurons reside  in the presynaptic 

terminal  remote  from  the  soma,  the AZs of  IHCs are part of  the epithelial  soma. AZs 

commonly contain a mesh of scaffold proteins, termed the cytomatrix of the active zone 

(CAZ),  that  tether  vesicles  and  position  Ca2+‐channels  at  the  sites  of  vesicle  fusion 

(reviewed in [79–81]). Some scaffold proteins are conserved between CNS synapses and 

IHC  ribbon synapses. However,  the CNS AZs are usually small, and on average zero  to 

two vesicles are released by a brief stimulus (an action potential). Knowledge on several 

proteins  involved  in vesicle maturation, docking, priming and release  is quite detailed. 

The  large  IHC AZ  is equipped with a specialized molecular anatomy, which enables the 

release of dozens to hundreds of vesicles per second  in response to graded  (receptor) 

potentials. Most  prominently,  it  contains  the  synaptic  ribbon,  primarily  composed  of 

ribeye [82,83] tethering approximately 70‐200 synaptic vesicles with approximately 10‐

20 of  them also  tethered  to  the plasma membrane. The scaffold protein bassoon and 

possibly other scaffolds link the ribbon to the AZ membrane. The ribbon and/or bassoon 

stabilize  a  large  complement  of  Ca2+‐channels  and  a  large  RRP  (10‐20  vesicles)  and 

contribute to rapid vesicle replenishment [50,83,84].  

 

 

 

 

25

 

Box 1 Figure I legend: Schematic diagram   

illustrating  some  of  the  main  anatomical  and  molecular  differences  between 

conventional synapses of the mammalian CNS (left) and the IHC ribbon synapse (right). 

Docked  vesicles  are  shown  in  yellow,  vesicles  tethered  to  the  CAZ  or  the  ribbon  are 

shown  in  blue.  Several  synaptic  proteins  important  for  vesicle  docking,  priming  and 

fusion at CNS synapses seem to be absent from the IHC ribbon synapse, which  instead 

uses proteins that are either specific to hair cells or found  in only few other cell types. 

The table lists references for either reviews or first report (in mammals) and functional 

characterization within the CNS (preference to mouse mutants) and IHC ribbon synapses. 

“None”  indicates that a protein  is  likely absent; ”?”  indicates  lack of published data for 

mature  IHCs  (or  conflicting  results). Otoferlin  is  found on  synaptic vesicles and  in  the 

plasma membrane of hair cells (top right) and functions in vesicle priming and fusion. 

 

26

Box 2: Properties of exocytosis at the IHC ribbon synapse 

The presynaptic  function of  IHCs  is often  studied using patch‐clamp measurements of 

Ca2+‐currents and membrane capacitance (Cm) (see Fig. 2a). Depolarization opens CaV1.3 

channels  [10,11,119]  and  consequently  triggers  exocytosis.  The  ensuing  increase  in 

surface area of  the  IHC plasma membrane  can be detected as a Cm  increment  (Cm). 

Measurements of Cm reveal at least two components (fast and sustained) of exocytosis 

upon depolarization  and  the  corresponding  transmitter  release has been  revealed by 

paired pre‐ and postsynaptic recordings [40]. Paired recordings from frog hair cells and 

connecting  afferent  fibers  showed  a  good  correspondence between  the  ∆Cm  and  the 

postsynaptic  EPSC  charge  transfer  for  short and  long depolarizations  [120],  indicating 

that most if not all exocytosis occurs at synapses. The fast component of the exocytic Cm 

increase saturates with a time constant of a few milliseconds [35]. When expressed  in 

units of fused vesicles it agrees well with counts of membrane‐proximal or AZ‐tethered 

vesicles by electron microscopy [9,38,50,83] and has been interpreted as the exocytosis 

of a limited RRP tethered near the Ca2+‐channels [35,38,50,121,122]. The rate of sound‐

evoked  spikes  in  afferent  fibers  can  be  predicted  from  in  vitro  RRP  fusion  rates, 

depletion kinetics, and RRP replenishment rates [50,84,123]. This strongly suggests that 

the RRP mediates sound encoding. The slower component of the Cm rise largely reflects 

the  re‐supply  of  vesicles  into  the  RRP  and  their  subsequent  fusion with  the  plasma 

membrane. The slow component scales in amplitude with the number of synapses [122] 

and predicts auditory nerve fiber spiking with the same scale factor as needed for RRP 

exocytosis  [84].  IHC exocytosis evoked by  fast and spatially homogenous elevations of 

27

intracellular  [Ca2+]  via  UV‐flash  photolysis  of  caged  Ca2+  also  shows  two  kinetically 

distinct  phases  (Fig.  2c).  However,  the  total  flash‐evoked  Cm  increment  is  very  large 

amounting to a plasma membrane surface  increase of approximately 15% and the fast 

Cm  component  exceeds  the  size of  the depolarization‐evoked RRP  exocytosis by  100‐

times (see Fig. 2a and c). This discrepancy is currently not understood, but likely involves 

extrasynaptic  fusion  of  vesicles  during  homogenous  elevations  of  intracellular  [Ca2+] 

[124,125].  

 

Box 3. Outstanding Questions 

Can  deafness  in  otoferlin  mutants  be  rescued  by  expression  of  wild‐type 

otoferlin in IHCs? 

How is otoferlin distributed between various membranous organelles such as the 

various  populations  of  synaptic  vesicles  and  endosomes  and  the  plasma 

membrane? To answer  this question,  further  immunogold electron microscopy 

and super‐resolution light microscopy are needed. 

Which  interacting protein(s) of otoferlin are  relevant  to  its  function  in priming 

and fusion? 

Does otoferlin act as the Ca2+‐sensor of fusion in hair cells? How precisely does it 

promote fusion? 

What  is  the precise molecular mechanism underlying  the promotion of vesicle 

priming by otoferlin?  

28

Do  ferlins  employ  a  common  mechanism  in  mediating  membrane  fusion 

reactions? 

How do the six (or seven) C2 domains co‐operate in ferlin function?  

How precisely does Ca2+ concentration affect ferlin function?  

 

References 

1 Safieddine, S. and Wenthold, R. J. (1999) SNARE complex at the ribbon synapses of cochlear hair cells: analysis of synaptic vesicle- and synaptic membrane-associated proteins. Eur. J. Neurosci. 11, 803–812 2 Strenzke, N. et al. (2009) Complexin-I Is Required for High-Fidelity Transmission at the Endbulb of Held Auditory Synapse. J. Neurosci. 29, 7991–8004 3 Uthaiah, R. C. and Hudspeth, A. J. (2010) Molecular Anatomy of the Hair Cell’s Ribbon Synapse. J. Neurosci. 30, 12387–12399 4 Nouvian, R. et al. (2011) Exocytosis at the hair cell ribbon synapse apparently operates without neuronal SNARE proteins. Nat Neurosci. 14, 411–413 5 Yasunaga, S. et al. (1999) A mutation in OTOF, encoding otoferlin, a FER-1-like protein, causes DFNB9, a nonsyndromic form of deafness. Nat. Genet. 21, 363–369 6 Ruel, J. et al. (2008) Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am. J. Hum. Genet. 83, 278–292 7 Baig, S. M. et al. (2011) Loss of Ca(v)1.3 (CACNA1D) function in a human channelopathy with bradycardia and congenital deafness. Nat. Neurosci. 14, 77–84 8 Roux, I. et al. (2006) Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. Cell. 127, 277–289 9 Pangršič, T. et al. (2010) Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nat Neurosci. 13, 869–876 10 Platzer, J. et al. (2000) Congenital deafness and sinoatrial node dysfunction in mice lacking class D L-type Ca2+ channels. Cell. 102, 89–97 11 Brandt, A. et al. (2003) CaV1. 3 channels are essential for development and presynaptic activity of cochlear inner hair cells. The Journal of neuroscience. 23, 10832–10840 12 Seal, R. P. et al. (2008) Sensorineural Deafness and Seizures in Mice Lacking Vesicular Glutamate Transporter 3. Neuron. 57, 263–275 13 Moser, T. et al. (2006) Diagnostik und Therapie der auditorischen Synaptopathie/Neuropathie. HNO. 54, 833–841 14 Starr, A. et al. (2008) Perspectives on Auditory Neuropathy: Disorders of Inner Hair Cell, Auditory Nerve, and Their Synapse. In The Senses: A Comprehensive Reference pp. 397–412, Academic Press 15 Brose, N. et al. (2010) Synaptopathy: dysfunction of synaptic function? Biochem. Soc. Trans. 38, 443–444

29

16 McNeil, P. L. and Kirchhausen, T. (2005) An emergency response team for membrane repair. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 499–505 17 Beurg, M. et al. (2008) Calcium- and otoferlin-dependent exocytosis by immature outer hair cells. J. Neurosci. 28, 1798–1803 18 Dulon, D. et al. (2009) Otoferlin Is Critical for a Highly Sensitive and Linear Calcium-Dependent Exocytosis at Vestibular Hair Cell Ribbon Synapses. The Journal of Neuroscience. 29, 10474 –10487 19 Augustin, I. et al. (1999) Munc13-1 is essential for fusion competence of glutamatergic synaptic vesicles. Nature. 400, 457–461 20 Varoqueaux, F. et al. (2002) Total arrest of spontaneous and evoked synaptic transmission but normal synaptogenesis in the absence of Munc13-mediated vesicle priming. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 9037 –9042 21 Geppert, M. et al. (1994) Synaptotagmin I: a major Ca2+ sensor for transmitter release at a central synapse. Cell. 79, 717–727 22 Littleton, J. T. et al. (1994) Calcium Dependence of Neurotransmitter Release and Rate of Spontaneous Vesicle Fusions Are Altered in Drosophila Synaptotagmin Mutants. PNAS. 91, 10888–10892 23 Nishiki, T. and Augustine, G. J. (2004) Synaptotagmin I synchronizes transmitter release in mouse hippocampal neurons. J. Neurosci. 24, 6127–6132 24 Liu, H. et al. (2009) Autapses and Networks of Hippocampal Neurons Exhibit Distinct Synaptic Transmission Phenotypes in the Absence of Synaptotagmin I. J. Neurosci. 29, 7395–7403 25 Yoshihara, M. and Littleton, J. T. (2002) Synaptotagmin I Functions as a Calcium Sensor to Synchronize Neurotransmitter Release. Neuron. 36, 897–908 26 Ramakrishnan, N. A. et al. (2009) Direct interaction of otoferlin with syntaxin 1A, SNAP-25, and the L-type voltage-gated calcium channel Cav1.3. J. Biol. Chem. 284, 1364–1372 27 Johnson, C. P. and Chapman, E. R. (2010) Otoferlin is a calcium sensor that directly regulates SNARE-mediated membrane fusion. J. Cell Biol. 191, 187–197 28 Helfmann, S. et al. (2011) The crystal structure of the C₂A domain of otoferlin reveals an unconventional top loop region. J. Mol. Biol. 406, 479–490 29 Reisinger, E. et al. (2011) Probing the Functional Equivalence of Otoferlin and Synaptotagmin 1 in Exocytosis. The Journal of Neuroscience. 31, 4886 30 Schwander, M. et al. (2007) A forward genetics screen in mice identifies recessive deafness traits and reveals that pejvakin is essential for outer hair cell function. J. Neurosci. 27, 2163–2175 31 Neher, E. and Sakaba, T. (2008) Multiple Roles of Calcium Ions in the Regulation of Neurotransmitter Release. Neuron. 59, 861–872 32 Poskanzer, K. E. et al. (2003) Synaptotagmin I is necessary for compensatory synaptic vesicle endocytosis in vivo. Nature. 426, 559–563 33 Nicholson-Tomishima, K. and Ryan, T. A. (2004) Kinetic Efficiency of Endocytosis at Mammalian CNS Synapses Requires Synaptotagmin I. PNAS. 101, 16648–16652 34 Yao, J. et al. (2012) Uncoupling the roles of synaptotagmin I during endo- and exocytosis of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 15, 243–249

30

35 Moser, T. and Beutner, D. (2000) Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 883 36 Spassova, M. A. et al. (2004) Evidence that rapid vesicle replenishment of the synaptic ribbon mediates recovery from short-term adaptation at the hair cell afferent synapse. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 5, 376–390 37 Cho, S. et al. (2011) Recovery from Short-Term Depression and Facilitation Is Ultrafast and Ca2+ Dependent at Auditory Hair Cell Synapses. The Journal of Neuroscience. 31, 5682 –5692 38 Graydon, C. W. et al. (2011) Sharp Ca2+ Nanodomains beneath the Ribbon Promote Highly Synchronous Multivesicular Release at Hair Cell Synapses. J. Neurosci. 31, 16637–16650 39 Levic, S. et al. (2011) Developmental Acquisition of a Rapid Calcium-Regulated Vesicle Supply Allows Sustained High Rates of Exocytosis in Auditory Hair Cells. PLoS ONE. 6, e25714 40 Goutman, J. D. and Glowatzki, E. (2007) Time course and calcium dependence of transmitter release at a single ribbon synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 16341–16346 41 Liberman, M. C. (1980) Morphological differences among radial afferent fibers in the cat cochlea: An electron-microscopic study of serial sections. Hearing Research. 3, 45–63 42 Meyer, A. C. and Moser, T. (2010) Structure and function of cochlear afferent innervation. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 18, 441–446 43 Rutherford, M. A. et al. (2012) Spike Encoding of Neurotransmitter Release Timing by Spiral Ganglion Neurons of the Cochlea. J. Neurosci. 32, 4773–4789 44 Glowatzki, E. and Fuchs, P. A. (2002) Transmitter release at the hair cell ribbon synapse. Nat. Neurosci. 5, 147–154 45 Singer, J. H. and Diamond, J. S. (2006) Vesicle Depletion and Synaptic Depression at a Mammalian Ribbon Synapse. Journal of Neurophysiology. 95, 3191 –3198 46 Roux, I. et al. (2009) Myosin VI is required for the proper maturation and function of inner hair cell ribbon synapses. Hum. Mol. Genet. 18, 4615–4628 47 Heidrych, P. et al. (2009) Otoferlin interacts with myosin VI: implications for maintenance of the basolateral synaptic structure of the inner hair cell. Hum. Mol. Genet. 18, 2779–2790 48 Heidrych, P. et al. (2008) Rab8b GTPase, a protein transport regulator, is an interacting partner of otoferlin, defective in a human autosomal recessive deafness form. Hum. Mol. Genet. 17, 3814–3821 49 Zak, M. et al. (2012) Ergic2, a brain specific interacting partner of otoferlin. Cell. Physiol. Biochem. 29, 941–948 50 Frank, T. et al. (2010) Bassoon and the Synaptic Ribbon Organize Ca2+ Channels and Vesicles to Add Release Sites and Promote Refilling. Neuron. 68, 724–738 51 Shin, O.-H. et al. (2010) Munc13 C2B-Domain – an Activity-Dependent Ca2+-Regulator of Synaptic Exocytosis. Nat Struct Mol Biol. 17, 280–288 52 Martens, S. et al. (2007) How Synaptotagmin Promotes Membrane Fusion. Science. 316, 1205–1208

31

53 Hui, E. et al. (2009) Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca2+-regulated fusion. Cell. 138, 709–721 54 Chapman, E. R. (2008) How Does Synaptotagmin Trigger Neurotransmitter Release? Annual Review of Biochemistry. 77, 615–641 55 Rizo, J. and Rosenmund, C. (2008) Synaptic vesicle fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 665–674 56 Martens, S. and McMahon, H. T. (2008) Mechanisms of membrane fusion: disparate players and common principles. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 543–556 57 Sørensen, J. B. (2009) Conflicting Views on the Membrane Fusion Machinery and the Fusion Pore. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 513–537 58 Migliosi, V. et al. (2002) Q829X, a novel mutation in the gene encoding otoferlin (OTOF), is frequently found in Spanish patients with prelingual non-syndromic hearing loss. J. Med. Genet. 39, 502–506 59 Mirghomizadeh, F. et al. (2002) Substitutions in the conserved C2C domain of otoferlin cause DFNB9, a form of nonsyndromic autosomal recessive deafness. Neurobiol. Dis. 10, 157–164 60 Rodríguez-Ballesteros, M. et al. (2003) Auditory neuropathy in patients carrying mutations in the otoferlin gene (OTOF). Hum. Mutat. 22, 451–456 61 Varga, R. et al. (2003) Non-syndromic recessive auditory neuropathy is the result of mutations in the otoferlin (OTOF) gene. J Med Genet. 40, 45–50 62 Varga, R. et al. (2006) OTOF mutations revealed by genetic analysis of hearing loss families including a potential temperature sensitive auditory neuropathy allele. J Med Genet. 43, 576–581 63 Rodríguez‐Ballesteros, M. et al. (2008) A multicenter study on the prevalence and spectrum of mutations in the otoferlin gene (OTOF) in subjects with nonsyndromic hearing impairment and auditory neuropathy. Human Mutation. 29, 823–831 64 Wang, D.-Y. et al. (2010) Screening mutations of OTOF gene in Chinese patients with auditory neuropathy, including a familial case of temperature-sensitive auditory neuropathy. BMC Med. Genet. 11, 79 65 Marlin, S. et al. (2010) Temperature-sensitive auditory neuropathy associated with an otoferlin mutation: Deafening fever! Biochem. Biophys. Res. Commun. 394, 737–742 66 Longo-Guess, C. et al. (2007) A missense mutation in the conserved C2B domain of otoferlin causes deafness in a new mouse model of DFNB9. Hear Res. 234, 21–28 67 Santarelli, R. et al. (2009) Abnormal cochlear potentials from deaf patients with mutations in the otoferlin gene. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 545–556 68 Starr, A. et al. (1996) Auditory neuropathy. Brain. 119 ( Pt 3), 741–753 69 Tekin, M. et al. (2005) A novel missense mutation in a C2 domain of OTOF results in autosomal recessive auditory neuropathy. American Journal of Medical Genetics Part A. 138A, 6–10 70 Matsunaga, T. et al. (2012) A prevalent founder mutation and genotype–phenotype correlations of OTOF in Japanese patients with auditory neuropathy. Clinical Genetics. DOI: 10.1111/j.1399-0004.2012.01897.x 71 Walter, A. M. et al. (2011) Multiple Ca2+ sensors in secretion: teammates, competitors or autocrats? Trends Neurosci. 34, 487–497

32

72 Lek, A. et al. (2012) Ferlins: regulators of vesicle fusion for auditory neurotransmission, receptor trafficking and membrane repair. Traffic. 13, 185–194 73 Washington, N. L. and Ward, S. (2006) FER-1 regulates Ca2+ -mediated membrane fusion during C. elegans spermatogenesis. J. Cell. Sci. 119, 2552–2562 74 Neef, A. et al. (2007) Probing the mechanism of exocytosis at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 27, 12933–12944 75 Rouillon, I. et al. (2006) Results of cochlear implantation in two children with mutations in the OTOF gene. Int. J. Pediatr. Otorhinolaryngol. 70, 689–696 76 Choi, B. Y. et al. (2009) Identities and frequencies of mutations of the otoferlin gene (OTOF) causing DFNB9 deafness in Pakistan. Clinical Genetics. 75, 237–243 77 Jiménez, J. L. and Bashir, R. (2007) In silico functional and structural characterisation of ferlin proteins by mapping disease-causing mutations and evolutionary information onto three-dimensional models of their C2 domains. Journal of the neurological sciences. 260, 114–123 78 Cho, W. and Stahelin, R. V. (2006) Membrane binding and subcellular targeting of C2 domains. Biochim. Biophys. Acta. 1761, 838–849 79 Zhai, R. G. and Bellen, H. J. (2004) The architecture of the active zone in the presynaptic nerve terminal. Physiology. 19, 262–270 80 Gundelfinger, E. D. and Fejtova, A. (2011) Molecular organization and plasticity of the cytomatrix at the active zone. Curr. Opin. Neurobiol. DOI: 10.1016/j.conb.2011.10.005 81 Haucke, V. et al. (2011) Protein scaffolds in the coupling of synaptic exocytosis and endocytosis. Nat. Rev. Neurosci. 12, 127–138 82 Schmitz, F. et al. (2000) RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein’s journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28, 857–872 83 Khimich, D. et al. (2005) Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434, 889–894 84 Buran, B. N. et al. (2010) Onset coding is degraded in auditory nerve fibers from mutant mice lacking synaptic ribbons. The Journal of Neuroscience. 30, 7587 85 tom Dieck, S. et al. (1998) Bassoon, a novel zinc-finger CAG/glutamine-repeat protein selectively localized at the active zone of presynaptic nerve terminals. J. Cell Biol. 142, 499–509 86 Altrock, W. D. et al. (2003) Functional inactivation of a fraction of excitatory synapses in mice deficient for the active zone protein bassoon. Neuron. 37, 787–800 87 Hallermann, S. et al. (2010) Bassoon Speeds Vesicle Reloading at a Central Excitatory Synapse. Neuron. 68, 710–723 88 Cases-Langhoff, C. et al. (1996) Piccolo, a novel 420 kDa protein associated with the presynaptic cytomatrix. Eur. J. Cell Biol. 69, 214–223 89 Mukherjee, K. et al. (2010) Piccolo and bassoon maintain synaptic vesicle clustering without directly participating in vesicle exocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 6504 90 Ohtsuka, T. et al. (2002) Cast a Novel Protein of the Cytomatrix at the Active Zone of Synapses That Forms a Ternary Complex with RIM1 and Munc13-1. J Cell Biol. 158, 577–590

33

91 Ohara-Imaizumi, M. et al. (2005) ELKS, a Protein Structurally Related to the Active Zone-associated Protein CAST, Is Expressed in Pancreatic β Cells and Functions in Insulin Exocytosis: Interaction of ELKS with Exocytotic Machinery Analyzed by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Molecular Biology of the Cell. 16, 3289 –3300 92 Gregory, F. D. et al. (2011) Harmonin inhibits presynaptic Cav1.3 Ca2+ channels in mouse inner hair cells. Nat Neurosci. 14, 1109–1111 93 Bellocchio, E. E. et al. (2000) Uptake of glutamate into synaptic vesicles by an inorganic phosphate transporter. Science. 289, 957–960 94 Fremeau, R. T., Jr et al. (2001) The expression of vesicular glutamate transporters defines two classes of excitatory synapse. Neuron. 31, 247–260 95 Takamori, S. et al. (2001) Identification of differentiation-associated brain-specific phosphate transporter as a second vesicular glutamate transporter (VGLUT2). J. Neurosci. 21, RC182 96 Olofsson, B. et al. (1988) Expression of the ras-related ralA, rho12 and rab genes in adult mouse tissues. Oncogene. 3, 231–234 97 Geppert, M. et al. (1997) The small GTP-binding protein Rab3A regulates a late step in synaptic vesicle fusion. Nature. 387, 810–814 98 Shupliakov, O. et al. (2011) How synapsin I may cluster synaptic vesicles. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22, 393–399 99 Cesca, F. et al. (2010) The synapsins: Key actors of synapse function and plasticity. Progress in Neurobiology. 91, 313–348 100 Wang, Y. et al. (1997) Rim is a putative Rab3 effector in regulating synaptic-vesicle fusion. Nature. 388, 593–598 101 Schoch, S. et al. (2002) RIM1[alpha] forms a protein scaffold for regulating neurotransmitter release at the active zone. Nature. 415, 321–326 102 Gebhart, M. et al. (2010) Modulation of Cav1.3 Ca2+ channel gating by Rab3 interacting molecule. Molecular and Cellular Neuroscience. 44, 246–259 103 Hata, Y. et al. (1993) Synaptic vesicle fusion complex contains unc-18 homologue bound to syntaxin. Nature. 366, 347–351 104 Verhage, M. et al. (2000) Synaptic assembly of the brain in the absence of neurotransmitter secretion. Science. 287, 864–869 105 Brose, N. et al. (1995) Mammalian Homologues of Caenorhabditis elegans unc-13 Gene Define Novel Family of C-domain Proteins. Journal of Biological Chemistry. 270, 25273 106 Walent, J. H. et al. (1992) A novel 145 kd brain cytosolic protein reconstitutes Ca(2+)-regulated secretion in permeable neuroendocrine cells. Cell. 70, 765–775 107 Jockusch, W. J. et al. (2007) CAPS-1 and CAPS-2 Are Essential Synaptic Vesicle Priming Proteins. Cell. 131, 796–808 108 Jahn, R. and Scheller, R. H. (2006) SNAREs — engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631–643 109 Matthew, W. D. et al. (1981) Identification of a synaptic vesicle-specific membrane protein with a wide distribution in neuronal and neurosecretory tissue. J. Cell Biol. 91, 257–269 110 Perin, M. S. et al. (1990) Phospholipid binding by a synaptic vesicle protein homologous to the regulatory region of protein kinase C. Nature. 345, 260–263

34

35

111 Geppert, M. et al. (1991) Synaptotagmin II. A novel differentially distributed form of synaptotagmin. J. Biol. Chem. 266, 13548–13552 112 Sun, J. et al. (2007) A dual-Ca2+-sensor model for neurotransmitter release in a central synapse. Nature. 450, 676–682 113 Johnson, S. L. et al. (2009) Synaptotagmin IV determines the linear Ca2+ dependence of vesicle fusion at auditory ribbon synapses. Nat Neurosci. 13, 45–52 114 Takahashi, S. et al. (1995) Identification of two highly homologous presynaptic proteins distinctly localized at the dendritic and somatic synapses. FEBS Lett. 368, 455–460 115 McMahon, H. T. et al. (1995) Complexins: cytosolic proteins that regulate SNAP receptor function. Cell. 83, 111–119 116 Reim, K. et al. (2001) Complexins regulate a late step in Ca2+-dependent neurotransmitter release. Cell. 104, 71–81 117 Reim, K. et al. (2005) Structurally and functionally unique complexins at retinal ribbon synapses. The Journal of cell biology. 169, 669 118 Catterall, W. A. (2011) Voltage-gated calcium channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, a003947 119 Dou, H. et al. (2004) Null mutation of alpha1D Ca2+ channel gene results in deafness but no vestibular defect in mice. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 5, 215–226 120 Li, G. L. et al. (2009) The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Neuroscience. 29, 7558 121 Brandt, A. et al. (2005) Few CaV1. 3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. J Neurosci. 25, 11577 122 Meyer, A. C. et al. (2009) Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nat Neurosci. 12, 444–453 123 Wittig, J. H., Jr and Parsons, T. D. (2008) Synaptic ribbon enables temporal precision of hair cell afferent synapse by increasing the number of readily releasable vesicles: a modeling study. J. Neurophysiol. 100, 1724–1739 124 Beutner, D. et al. (2001) Calcium Dependence of Exocytosis and Endocytosis at the Cochlear Inner Hair Cell Afferent Synapse. Neuron. 29, 681–690 125 Fuchs, P. A. et al. (2003) The afferent synapse of cochlear hair cells. Current Opinion in Neurobiology. 13, 452–458