Optimisation of Banana streak virus (BSV) diagnostic assays 

 

 

 

by 

 

Pål Kristian Berntzen Bjartan 

Bachelor of Chemical Engineering 

Graduate Certificate of Biotechnology 

 

A thesis submitted for the degree of  

Master of Applied Science 

 

at the 

 

Queensland University of Technology 

Centre for Tropical Crops and Biocommodities  

Science and Engineering Faculty 

 

2012 

 

 

 

 

 

 

 

i 

Abstract Bananas are one of  the world’s most  important crops, serving as a staple 

food  and  an  important  source  of  income  for millions  of  people  in  the 

subtropics. Pests and diseases are a major constraint to banana production. 

To prevent the spread of pests and disease, farmers are encouraged to use 

disease‐  and  insect‐free  planting material  obtained  by micropropagation. 

This option, however, does not always exclude viruses and concern remains 

on  the  quality  of  planting  material.  Therefore,  there  is  a  demand  for 

effective  and  reliable  virus  indexing  procedures  for  tissue  culture  (TC) 

material.  

Reliable  diagnostic  tests  are  currently  available  for  all  of  the 

economically  important viruses of bananas with  the exception of Banana 

streak viruses (BSV, Caulimoviridae, Badnavirus). Development of a reliable 

diagnostic  test  for  BSV  is  complicated  by  the  significant  serological  and 

genetic  variation  reported  for  BSV  isolates,  and  the  presence  of 

endogenous  BSV  (eBSV).  Current  PCR‐  and  serological‐based  diagnostic 

methods for BSV may not detect all species of BSV, and PCR‐based methods 

may  give  false  positives  because  of  the  presence  of  eBSV.  Rolling  circle 

amplification (RCA) has been reported as a technique to detect BSV which 

can also discriminate between episomal and endogenous BSV  sequences. 

However, the method is too expensive for large scale screening of samples 

in  developing  countries,  and  little  information  is  available  regarding  its 

sensitivity. Therefore  the development of reliable PCR‐based assays  is still 

considered the most appropriate option for large scale screening of banana 

plants for BSV. This MSc project aimed to refine and optimise the protocols 

for BSV detection, with a particular focus on developing reliable PCR‐based 

diagnostics 

Initially,  the  appropriateness  and  reliability  of  PCR  and  RCA  as 

diagnostic tests for BSV detection were assessed by testing 45 field samples 

 

ii 

of banana collected  from nine districts  in the Eastern region of Uganda  in 

February 2010. This research was also aimed at  investigating the diversity 

of  BSV  in  eastern  Uganda,  identifying  the  BSV  species  present  and 

characterising any new BSV species. Out of the 45 samples tested, 38 and 

40  samples  were  considered  positive  by  PCR  and  RCA,  respectively.  Six 

different  species of BSV, namely Banana  streak  IM virus  (BSIMV), Banana 

streak MY  virus  (BSMYV), Banana  streak OL  virus  (BSOLV), Banana  streak 

UA virus (BSUAV), Banana streak UL virus (BSULV), Banana streak UM virus 

(BSUMV), were detected by PCR and confirmed by RCA and sequencing. No 

new  species  were  detected,  but  this  was  the  first  report  of  BSMYV  in 

Uganda. Although RCA was  demonstrated  to  be  suitable  for  broad‐range 

detection of BSV, it proved time‐consuming and laborious for identification 

in field samples. 

 Due  to  the  disadvantages  associated  with  RCA,  attempts  were 

made  to develop  a  reliable PCR‐based  assay  for  the  specific detection of 

episomal BSOLV, Banana  streak GF virus  (BSGFV), BSMYV and BSIMV. For 

BSOLV and BSGFV, the  integrated sequences exist  in rearranged, repeated 

and  partially  inverted  portions  at  their  site  of  integration.  Therefore,  for 

these  two  viruses,  primers  sets  were  designed  by  mapping  previously 

published  sequences  of  their  endogenous  counterparts  onto  published 

sequences  of  the  episomal  genomes.  For  BSOLV,  two  primer  sets  were 

designed while, for BSGFV, a single primer set was designed. The episomal‐

specificity of these primer sets was assessed by testing 106 plant samples 

collected during surveys in Kenya and Uganda, and 33 leaf samples from a 

wide range of banana cultivars maintained in TC at the Maroochy Research 

Station  of  the  Department  of  Employment,  Economic  Development  and 

Innovation (DEEDI), Queensland. All of these samples had previously been 

tested  for  episomal  BSV  by  RCA  and  for  both  BSOLV  and  BSGFV  by  PCR 

using published primer sets. The outcome from these analyses was that the 

newly designed primer sets for BSOLV and BSGFV were able to distinguish 

 

iii 

between  episomal  BSV  and  eBSV  in most  cultivars with  some  B‐genome 

component.  In  some  samples, however, amplification was observed using 

the  putative  episomal‐specific  primer  sets where  episomal  BSV was  not 

identified using RCA. This may reflect a difference  in the sensitivity of PCR 

compared  to  RCA,  or  possibly  the  presence  of  an  eBSV  sequence  of 

different conformation. 

Since the sequences of the respective eBSV for BSMYV and BSIMV in 

the M.  balbisiana  genome  are  not  available,  a  series  of  random  primer 

combinations were tested in an attempt to find potential episomal‐specific 

primer  sets  for  BSMYV  and  BSIMV. Of  an  initial  20  primer  combinations 

screened  for BSMYV detection on a  small number of  control  samples, 11 

primers  sets  appeared  to  be  episomal‐specific.  However,  subsequent 

testing of two of these primer combinations on a larger number of control 

samples  resulted  in  some  inconsistent  results which will  require  further 

investigation. Testing of  the 25 primer  combinations  for episomal‐specific 

detection  of  BSIMV  on  a  number  of  control  samples  showed  that  none 

were able to discriminate between episomal and endogenous BSIMV.  

The final component of this research project was the development of 

an infectious clone of a BSV endemic in Australia, namely BSMYV. This was 

considered  important  to  enable  the  generation  of  large  amounts  of 

diseased  plant  material  needed  for  further  research.  A  terminally 

redundant fragment (1.3 × BSMYV genome) was cloned and transformed 

into  Agrobacterium  tumefaciens  strain  AGL1,  and  used  to  inoculate  12 

healthy  banana  plants  of  the  cultivars  Cavendish  (Williams)  by  three 

different methods. At 12 weeks post‐inoculation, (i) four of the five banana 

plants  inoculated by  corm  injection  showed  characteristic BSV  symptoms 

while  the  remaining plant was wilting/dying,  (ii)  three of  the  five banana 

plants  inoculated by needle‐pricking of  the  stem  showed BSV  symptoms, 

one  plant was  symptomless while  the  remaining  had  died  and  (iii)  both 

banana  plants  inoculated  by  leaf  infiltration  were  symptomless.  When 

 

iv 

banana  leaf samples were tested for BSMYV by PCR and RCA, BSMYV was 

confirmed  in  all  banana  plants  showing  symptoms  including  those were 

wilting and/or dying.  

The  results  from  this  research  have  provided  several  avenues  for 

further  research.  By  completely  sequencing  all  variants  of  eBSOLV  and 

eBSGFV and  fully  sequencing  the eBSIMV and eBSMYV  regions, episomal 

BSV‐specific  primer  sets  for  all  eBSVs  could  potentially  be  designed  that 

could avoid all  integrants of that particular BSV species. Furthermore, the 

development of an  infectious BSV clone will enable  large numbers of BSV‐ 

infected plants to be generated for the further testing of the sensitivity of 

RCA  compared  to  other  more  established  assays  such  as  PCR.  The 

development  of  infectious  clones  also  opens  the  possibility  for  virus‐

induced gene silencing studies in banana. 

    

   

 

v 

Table of Contents 

Chapter 1  Introduction ......................................................................... 1 

1.1  Bananas ............................................................................................ 1 

1.2  Pests and diseases affecting bananas .............................................. 3 

1.2.1  Pests ......................................................................................... 3 

1.2.2  Diseases ................................................................................... 5 

1.2.3  BSV diagnostics ...................................................................... 14 

1.2.4  BSV diagnostics – issues and possible solutions .................... 16 

1.3  The situation in Uganda ................................................................. 18 

1.4  Project aim and objectives ............................................................. 19 

Chapter 2  General materials and methods ......................................... 21 

2.1  General materials ........................................................................... 21 

2.1.1  Sources for specialised reagents ............................................ 21 

2.1.2  Reagents and equipment for DNA amplification ................... 21 

2.1.3  Oligonucleotide synthesis ...................................................... 21 

2.1.4  Bacterial strains ..................................................................... 22 

2.2  General methods ............................................................................ 22 

2.2.1  DNA extraction from leaf tissue............................................. 22 

2.2.2  PCR amplification ................................................................... 23 

2.2.3  RCA ......................................................................................... 23 

2.2.4  Restriction digestion .............................................................. 23 

2.2.5  Agarose gel electrophoresis ................................................... 24 

2.2.6  DNA extraction from agarose gel ........................................... 24 

2.2.7  Dephosphorylation of 5’ ends ............................................... 24 

2.2.8  DNA ligation ........................................................................... 24 

2.2.9  Transformation of E. coli ........................................................ 24 

2.2.10  Mini‐preparation protocol ..................................................... 25 

2.2.11  Sequencing ............................................................................. 25 

Chapter 3  Assessment of PCR and RCA for diagnosis of BSV in field samples..................................................................................................27 

3.1  Introduction .................................................................................... 27 

3.2  Methods ......................................................................................... 29 

3.2.1  Samples for analysis ............................................................... 29 

 

vi 

3.2.2  PCR amplification ................................................................... 29 

3.2.3  RCA amplification .................................................................. 29 

3.2.4  Cloning and sequence analysis .............................................. 33 

3.3  Results ............................................................................................ 35 

3.3.1  Sample collection ................................................................... 35 

3.3.2  PCR results ............................................................................. 35 

3.3.3  RCA results ............................................................................. 40 

3.4  Discussion ....................................................................................... 47 

Chapter 4  Development of episomal‐specific PCR assays for the detection of banana streak viruses with endogenous counterparts ........ 51 

4.1  Introduction .................................................................................... 51 

4.2  Methods ......................................................................................... 53 

4.2.1  Developing episomal‐specific primers for BSOLV and BSGFV 53 

4.2.2  Developing episomal‐specific primers for BSMYV and BSIMV  53 

4.2.3  Plant samples and nucleic acid extraction ............................. 55 

4.2.4  PCR and RCA analysis ............................................................. 55 

4.3  Results ............................................................................................ 59 

4.3.1  Identification of potential episomal‐specific primers ........... 59 

4.3.2  Primer testing ........................................................................ 65 

4.3.3  Final primer assessment using the GMGC collection ............ 70 

4.4  Discussion ....................................................................................... 76 

Chapter 5  Development of an infectious clone of Banana streak MY virus.......................................................................................................81 

5.1  Introduction .................................................................................... 81 

5.2  Methods ......................................................................................... 83 

5.2.1  Preparation of the infectious clone ....................................... 83 

5.2.2  Plant inoculation and assessment ......................................... 86 

5.3  Results ............................................................................................ 88 

5.3.1  Preparation of the infectious clone ....................................... 88 

5.3.2  Plant inoculation and assessment ......................................... 88 

5.4  Discussion ..................................................................................... 101 

Chapter 6  General discussion and conclusions..................................105 

Bibliography ........................................................................................111  

 

vii 

List of Figures 

Figure 1.1: (a) Map of the BSV genome  

                    (b) Electron micrograph of BSV ................................................. 10 

Figure 1.2: Unrooted tree showing the identified BSV species grouped into  

                    three clades ............................................................................... 12 

Figure 3.1: Districts in eastern Uganda where leaf samples were collected 

 ..................................................................................................................... 36 

Figure 3.2: Symptoms in leaf samples collected in eastern Uganda ........... 37 

Figure 4.1: (a) Map of the integrated regions of BSOLV  

                    (b) The integrated sequences were mapped onto the full‐length 

                          genome ................................................................................ 60 

Figure 4.2: (a) Map of the integrated regions of BSGFV  

                    (b) The integrated sequences were mapped onto the full‐length  

                          genome ................................................................................ 61 

Figure 4.3: Genome of (a) BSMYV and (b) BSIMV with primer sequences  

                    mapped ...................................................................................... 63 

Figure 4.4: Screening of the GMGC collection ............................................. 72 

Figure 5.1: Creation of the BSMYV infectious clone .................................... 84 

Figure 5.2: Restriction digest of plasmid DNA ............................................. 89 

Figure 5.3: Healthy banana plant ................................................................. 91 

Figure 5.4: Banana plant at 12 weeks post leaf‐infiltration ......................... 92 

Figure 5.5: Needle‐prick inoculated banana plant at 12 weeks post  

                    inoculation ................................................................................. 95 

Figure 5.6: Banana plant at 12 weeks post corm injection ......................... 96 

Figure 5.7: Sugar cane plant at 12 weeks post needle‐prick inoculation .... 97 

Figure 5.8: Screening of inoculated banana and sugarcane plants for BSMYV  

                    by PCR  (a) and RCA (b) .............................................................. 98 

Figure 5.9: Needle‐prick inoculated banana plant seven months post  

                    inoculation ................................................................................. 99 

Figure 5.10: Corm injected banana plant seven months post inoculation 100 

 

viii 

 

List of Tables Table 3.1: Plant samples used in this study ................................................. 30 

Table 3.2: Primer sequences used for PCR testing ...................................... 32 

Table 3.3: Analysis of leaf samples for BSV by PCR and sequencing ........... 38 

Table 3.4: Analysis of leaf samples for BSV by RCA and RFLP/sequencing .. 41 

Table 4.1: Primers obtained from QUT for detection of BSIMV and BSMYV54 

Table 4.2: PCR conditions for published primers used for BSV and eBSV  

                  detection ..................................................................................... 57 

Table 4.3: Potential episomal DNA‐specific primer sequences identified for  

                  BSOLV and BSGFV ........................................................................ 62 

Table 4.4: Primer combinations and results of initial screen for putative  

                  episomal‐specific primers for BSMYV and BSIMV detection ...... 64 

Table 5.1: Analysis of inoculated plants ....................................................... 90 

   

 

ix 

List of Abbreviations Common prefixes 

Symbol Prefix  Scale

k  kilo  103

m  milli  10−3

μ  micro  10−6

n  nano  10−9

p  pico  10−12

 

Abbreviations 

  approximately 

°C  degrees Celsius

A  genome component of banana derived from the Musa acuminata

species 

B  genome component of banana derived from the Musa balbisiana

species 

BanMMV  Banana mild mosaic virus

BBrMV Banana bract mosaic virus

BBTV  Banana bunchy top virus 

BLAST  Basic Local Alignment Search Tool

bp  base pair(s)

BS  Black sigatoka

BSD  banana streak disease

BSV  Banana streak virus(es)

BSnV  Banana streak n virus, where n = species' name, e.g. BSMYV 

BVX  Banana virus X

c  complementary

CDS  coding sequence

Chl:IAA chloroform‐isoamylalcohol 

CIP  calf intestinal phosphatase

CMV  Cucumber mosaic virus

 

x 

CTAB  cetyltrimethylammonium bromide

CYMV  Citrus yellow mosaic virus

D  dalton(s) 

DEEDI  Maroochy Research Station of the Department of Employment, 

Economic Development and Innovation  

dH2O  deionised water 

DNA  deoxyribonucleic acid

ds  double‐stranded 

e  endogenous 

EAHB  East African Highland Banana

EDTA  ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA  enzyme‐linked immunosorbent assay

EPRV  endogenous pararetrovirus

g  gravity

g  gram(s)

gDNA  genomic DNA 

GM  genetically modified 

GMGC  Global Musa Genomics Consortium

h  hour(s)

IC‐PCR  immunocapture‐PCR  

ICTV  International Committee on the Taxonomy of Viruses

IPTG  isopropyl β‐D‐1‐thiogalactopyranoside

ISEM  immunosorbent electron microscopy

l  litre(s)

Ke  Kenya (survey sample collection)

LB  lysogeny broth (aka. Luria broth, Lennox broth, or Luria‐Bertani 

medium) 

m  metre(s) 

M  molar concentration, mol/l

MGIS  Musa Germplasm Information System

met  methionine 

 

xi 

min  minute(s)

mol  mole(s) 

MSc  Master of Science

NA  nucleic acid

ORF  open reading frame

PCR  polymerase chain reaction

pH  ‐ log (proton concentration)

PTGS  post‐transcriptional gene silencing

PVP  polyvinylpyrrolidone

QUT  Queensland University of Technology

RCA  rolling circle amplification 

RFLP  restriction fragment length polymorphism

RNA  ribonucleic acid

RNase  ribonuclease

RT  reverse transcriptase

RTBV  Rice tungro bacilliform virus

s  second(s)

siRNA  small interfering RNA

SOC  super optimal broth with catabolite repression

spp.  species pluralis (Latin), multiple species

tRNA  transfer RNA

TAE  Tris‐Acetate‐EDTA buffer

TC  tissue culture

tris  tris (hydroxymethyl) aminomethane

U  enzyme unit(s)

Ug  Uganda (survey sample collection)

V  volt(s) 

v/v  volume per volume

VIGS  virus‐induced gene silencing

w/v  weight per volume

X‐gal  5‐bromo‐4‐chloro‐indolyl‐galactopyranoside

 

xii 

Statement of Original Authorship The work  contained  in  this  thesis  has  not  been  previously  submitted  to 

meet  requirements  for  an  award  at  this  or  any  other  higher  education 

institution. To the best of my knowledge and belief, the thesis contains no 

material previously published or written by another person except where 

due reference is made.  

  

Signature:  Date:  

  Pål K. B. Bjartan     

 

xiii 

  

Acknowledgements I would  like  to  thank a number of people  for  their guidance and  support 

throughout the course of my studies. First and foremost I want to thank my 

supervisors, Dr Anthony  James  and Prof Rob Harding,  for  their  academic 

guidance,  dedication  and  endless  patience  throughout  the  course  of my 

studies. 

I’d  also  like  to  thank  Ben  Dugdale  and  Don  Catchpoole  for  their 

advice when I couldn’t get my cloning experiments to work. Your guidance 

was crucial to the success of my experiments. Also thanks to Bojana Bokan 

for providing me PCR‐primers  and Karlah Norkunas  for providing me  the 

agro‐cells. Assistance offered by the staff of CTCB is also acknowledged. 

Also, so many thanks to my parents, Iver and Tove, for your financial 

support when QUT decided  to  screw me over  and  raise  the  tuition  fees. 

Without your help I wouldn’t have made it. 

Finally, I want to thank all the friends I’ve made throughout my stay 

in here in Oz, Mayra and Sam in particular. Even though you at times have 

been a great distraction from my studies, you are also the ones that have 

made my stay here worthwhile. You have given me memories that I’ll never 

forget  and  helped me unplug when  I  needed  it  sorely, which  in  the  end 

helped me get through my studies. 

           

 

xiv 

   

 

1 

Chapter 1 

Introduction 

1.1 Bananas 

Bananas (Musa spp.) are one of the most important, but undervalued, food 

crops in the world providing sustenance to millions of people (Jones, 2000; 

Karanja et al., 2008). Worldwide, bananas are cultivated on an area of some 

nine million  hectares; world  production  averaged  92 million  tonnes  per 

annum during 1998‐2000 and was estimated at 99 million tonnes  in 2001 

(The World Banana Economy, 1985‐2002, 2003), of which roughly one third 

was produced  in the Latin American–Caribbean region, one third  in Africa 

and one third  in the Asian–Pacific region. One of the highest consumption 

rates is in the Great Lakes region of East Africa, where bananas comprise a 

large  proportion  of  the  diet  (AfricanCrops.net).  In  Uganda,  the  average 

consumption  per  capita  was  243  kg/year  in  1996  (The  World  Banana 

Economy, 1985‐2002, 2003). 

Banana is an attractive perennial crop for developing countries due 

to  its  ability  to  produce  fruit  all  year  round  and,  thus,  provide  a  stable 

source  of  income  or  nutritious  food  (The World  Banana  Economy,  1985‐

2002, 2003; Jones, 2000). Bananas for domestic consumption are produced 

from  a multitude  of  cultivars  which  are  grown  on  various  soil  types  in 

different environments (Jones, 2000).  

  Bananas  can be divided  into  two main  categories, namely dessert 

bananas  and  cooking  bananas. Dessert  bananas  can  be  eaten  raw when 

ripe  as  they  contain  a  considerable  amount  of  sugar  and  are  easily 

digestible. There are various cultivars of dessert bananas but fruit from the 

 

2 

Cavendish  cultivar  subgroup  is  the most  common  (Jones,  2000).  In  the 

period  1998‐2000,  dessert  bananas  comprised  59%  of  annual  world 

production,  of  which  the  Cavendish  subgroup  accounted  for  47%  (The 

World Banana Economy, 1985‐2002, 2003). In contrast to dessert bananas, 

cooking bananas are usually starchy when ripe and need to be boiled, fried 

or roasted to become palatable. They are an  important part of the diet to 

many people in tropical regions, and are mainly consumed locally. Of these, 

the  plantains  are  the  most  well  known  types  (Jones,  2000).  Cooking 

bananas comprised 41% of annual world production during 1998‐2000, of 

which plantain  contributed 17%  and  the  remaining part were distributed 

among  other  cooking  cultivars,  among  them  the  East  African  Highland 

Banana  (EAHB) subgroup  (The World Banana Economy, 1985‐2002, 2003). 

In  Uganda,  cultivars  of  the  EAHB  subgroup  (including  many  different 

cooking banana cultivars) and the dessert cultivar Sukali Ndizi are the most 

popular (Bagamba et al., 2003). 

  The  overwhelming  majority  of  presently  cultivated  varieties  of 

banana  are  derived  from  the  Musa  acuminata  (with  a  designated  ‘A’ 

genome) and M. balbisiana (with a designated  ‘B’ genome) species of the 

Eumusa  series  of  Musa  (Price,  1995;  Karanja  et  al.,  2008).  Essentially, 

hybridisation between various  sub‐species of  the polymorphic  species M. 

acuminata  has  led  to  a  range  of  diploid  cultivars  (designated  AA  in  the 

generally  accepted  classification  scheme).  The  diploid  AA  cultivars  have 

given rise to the triploid AAA varieties through a meiosis‐associated process 

termed  chromosome  restitution  (Price,  1995).  This  occurs when meiosis 

breaks  down  at  the  second  division,  and  forms  viable,  diploid  egg  cells 

which are then  fertilised with haploid pollen  (Jones, 2000). Hybridisations 

between AA  cultivars  and M. balbisiana  (designated BB)  gave  rise  to  the 

various AAB and ABB types that are cultivated today. The major reason for 

the preference for cultivation of triploid cultivars by man is believed to have 

been parthenocarpy and  the absence of  seeds. Triploidy provides various 

 

3 

benefits  of  which  the most  important  are  that  plants  tend  to  be more 

vigorous  and  productive  than  diploids.  The  vast majority  of  cultivars  are 

triploids; AAA cultivars provide many of the sweeter dessert varieties, while 

AAB and ABB cultivars often provide the more starchy cooking varieties. M. 

balbisiana  is  considered  to be more disease  resistant  than M. acuminata 

and these qualities are often found in the cultivars with the B component in 

the  genome.  Only  a  few  natural  cultivars  have  been  recognised  as 

tetraploids  belonging  to  either  AAAA,  AAAB,  AABB  or  ABBB  genomic 

groups,  and  these  are  believed  to  have  arisen  from  the  fertilisation  of 

triploid egg cells by haploid pollen. Tetraploid hybrids have been artificially 

bred for disease resistance, and are becoming important in some countries 

(Jones, 2000).   

  African bananas are grouped  into  three categories, which  includes 

the East African bananas (AA, AAA, ABB and AB), which are mainly dessert 

bananas,  the African plantain bananas  (AAB) grown mainly  in central and 

west Africa, and  the EAHB  (AAA) used  for  cooking and beer preparation. 

Although  bananas  are  not  of  African  origin,  Africa  has  grown  into  an 

important zone of secondary genetic diversity (AfricanCrops.net). 

1.2 Pests and diseases affecting bananas 

1.2.1 Pests 

1.2.1.1 Rhizome and root pests 

The two major rhizome and root pests causing problems to banana plants 

are  the  banana weevil  borer  and  the  burrowing  nematode.  The  banana 

weevil  borer  (Cosmopolites  sordidus)  is  distributed widely  throughout  all 

continents of the world where banana is grown. It attacks all Musa species 

and cultivars and no resistant cultivars are known. Weevil borers are spread 

from  farm  to  farm  via  infested  sucker  planting  material,  with  on‐farm 

spread by short‐distance weevil borer movement between plants.    

 

4 

  Several  parasitic  nematodes  also  cause  damage  to  banana  and 

plantain.  The  burrowing  nematode  (Radopholus  similis)  is  the  most 

widespread and damaging nematode attacking bananas and plantains. It is 

present  throughout  the  tropics,  Australia  and  South  Africa.  R.  similis  is 

easily spread  in water run‐off, by adhering to soil particles or through de‐

suckering  tools.  As  with  the  weevil  borer,  the main  cause  of  spread  is 

infested plant material, and this is how the nematode has been introduced 

into previously clean areas (Robinson, 1996). 

1.2.1.2 Bunch pests 

The majority of banana bunch pests cause superficial peel damage which 

does  not  affect  the  eating  quality  of  the  fruit.  In  this  respect,  the 

subsistence or  cash  cropping  sector of banana production  is not  severely 

disadvantaged by bunch pests. However, for the discerning export markets 

of the world, quality standards are strict and external blemishes caused by 

bunch pests are totally unacceptable. 

  Bunch pests include various species of thrips, such as red rust thrips 

species (Chaetanaphothrips spp.),  'corky scab' thrips (caused by the Thrips 

florum complex), flower thrips (Frankliniella spp.) and the banana silvering 

thrips  (Hercinothrips bicinctus). Bunch pests also  include  some  species of 

moths, like the banana scab moth (Nacoleia octaseama), found in Australia 

and the Pacific Islands, and the banana moth (Opogona sacchari). Although 

infestation of a plantation may not be widespread,  the attacked bunches 

can be severely damaged (Robinson, 1996). 

1.2.1.3 Leaf pests 

The  banana  aphid  (Pentalonia  nigronervosa)  is  widely  distributed  in  all 

banana‐growing areas. Its significance as a pest is due to its ability to act as 

a  vector  for  the  transmission  of  Banana  bunchy  top  virus  (BBTV, 

Nanoviridae,  Babuvirus)  from  plant  to  plant  (Robinson,  1996).  Similarly, 

mealybugs are known to transmit Banana streak virus (BSV) species (Jones 

 

5 

and Lockhart, 1993; Kubiriba et al., 2000). Various insects that visit banana 

flowers,  bract  abscission  surfaces,  cut  suckers  and  pseudostems  can  also 

mechanically  transmit  disease‐causing  bacteria  from  plant  to  plant 

(Robinson, 1996). 

1.2.2 Diseases 

Bananas  are  susceptible  to  a  range  of  serious  and  debilitating  diseases 

caused by fungi, bacteria and viruses. 

1.2.2.1 Fungal diseases 

The most serious fungal disease is known as black sigatoka (BS) (caused by 

Mycosphaerella  fijiensis),  also  called  'black  leaf  streak'.  BS  has  caused 

devastation  to  commercial  bananas  grown  in  all  tropical  localities where 

banana  is grown.  It was  first  recorded  from  the  islands of  the Pacific and 

has since spread to Asia, Latin America and Africa.  In Africa,  it has spread 

throughout West, Central and East Africa and threatens the production of 

bananas  and  plantains  in  the  area,  which  are  a  staple  food  source  for 

millions of people (Robinson, 1996; Carlier et al., 2000). 

  Another  important  banana  disease  is  Fusarium  wilt  or  Panama 

disease,  caused  by  the  soil‐borne  pathogen  Fusarium  oxysporum  f.  sp. 

cubense.  This  disease  destroyed  over  40,000  ha  of  Gros  Michel  (AAA) 

export bananas  in tropical America  in the  late 1950s and early 1960s. The 

industry was only saved by the introduction of the resistant cultivars in the 

Cavendish complex (Robinson, 1996; Ploetz and Pegg, 2000). 

1.2.2.2 Bacterial diseases 

Moko disease, caused by the bacterium Ralstonia solanacearum,  is one of 

the most serious diseases of bananas and plantains (Robinson, 1996). It has 

caused severe crop  losses  in smallholder plantations  in Latin America and 

the Caribbean. Outside the western hemisphere, it has been reported only 

in the Philippines and Indonesia. Cavendish (AAA) cultivars are known to be 

susceptible  as  are  some  ABB  cultivars  such  as  'Bluggoe'.  The  bacterium 

 

6 

infects  the  plant  through wounded  tissue,  and  can  be  transmitted  by  a 

mechanical vector such as a pruning knife, but it can also be transmitted by 

insects or by root‐to‐root contact (Robinson, 1996; Thwaites et al., 2000). 

1.2.2.3 Viral diseases 

  Several  viruses  are  known  to  infect  banana  including  BBTV, 

Cucumber mosaic virus (CMV), Banana bract mosaic virus (BBrMV), Banana 

mild  mosaic  virus  (BanMMV),  Banana  virus  X  (BVX)  and  several 

Badnaviruses collectively referred to as BSV (Karanja et al., 2008; Geering, 

2009). 

  BBTV  is  considered  the  most  devastating  of  the  viral  diseases 

infecting banana crops. It has been reported in several countries in Asia and 

the Pacific, Australia and Central Africa, but has not been reported in Latin 

America,  the  Canary  Islands,  Israel  or  South  Africa.  Disease  symptoms 

include  the development of dark  green  flecks  along  the  leaf  veins which 

produce a  'dot‐dash' pattern. Affected  leaves are more upright than usual 

and  become  pale  yellow  around  the  margin.  Emerging  leaves  become 

choked in the throat of the plant which creates the 'bunchy top' effect and 

pronounced  stunting.  The  insect  vector  of  BBTV,  the  aphid  Pentalonia 

nigronervosa,  is widespread. While BBTV  is not mechanically  transmitted, 

movement of infected plant material is a concern (Robinson, 1996; Thomas 

and  Iskra‐Caruana,  2000).  The  epidemiology  of  BBTV  is,  however,  very 

simple and the disease should therefore be able to be effectively controlled 

in developing countries. In Australia, bunchy top has been eradicated from 

some  regions  through  a  strict  inspection  and  eradication  program 

consisting  of  a  combination  of  roguing,  clean  planting material  schemes 

and  domestic  quarantine  (Robinson,  1996;  Thomas  and  Iskra‐Caruana, 

2000; Geering, 2009). Transgenic approaches to develop resistant cultivars 

have been attempted but, despite considerable research efforts, genetically 

modified  (GM) banana plants with  bunchy  top  resistance have  yet  to be 

developed (Geering, 2009). 

 

7 

  CMV  infects  Cavendish  cultivars  and  'Horn'  plantain  and  occurs 

sporadically  wherever  Musa  is  grown.  The  disease  is  characterised  by 

conspicuous,  sharply defined  interveinal  chlorosis of  the  leaves which,  in 

serious outbreaks,  can  lead  to necrosis  and  rotting of  the heart  leaf  and 

central cylinder. However, serious infection is seldom encountered. CMV is 

transmitted  from weed  and  vegetable  host  plants  to  banana  by  several 

different aphid species (Robinson, 1996; Lockhart and Jones, 2000a). 

  BBrMV  is widely distributed  in the Philippines,  India and Sri Lanka. 

There  are  also  records  of  BBrMV  from  Thailand,  Vietnam  and Western 

Samoa  (Rodoni  et  al.,  1999;  Thomas  et  al.,  2000a),  but  the  symptoms 

expressed  in  these countries were atypical, and  these  records need  to be 

verified. Little  is known about the epidemiology of BBrMV (Thomas et al., 

2000a; Geering, 2009). 

  BanMMV  (unassigned  member  of  Flexiviridae)  has  only  received 

attention  in  recent years. Following  its  identification during  routine virus‐

indexing,  this  virus  appears  to  be  one  of  the most  frequently  detected 

viruses  in Musa germplasm  (Teycheney et al., 2005a). Although BanMMV 

infections are rarely associated with obvious disease symptoms (Thomas et 

al.,  2000b;  Geering,  2009),  there  are  indications which  suggest  that  the 

virus may  interact synergistically with other banana viruses to cause more 

severe disease symptoms than either one would cause alone. For example, 

mixed  infections  of  BanMMV  and  CMV  are  correlated  with  a  necrotic 

reaction  (Caruana  and  Galzi,  1998),  and  banana  plants  in  Uganda  with 

severe stunting and bunch malformation were  shown  to be  infected with 

an  unidentified  badnavirus,  most  likely  a  BSV,  and  a  filamentous  virus 

believed to be BanMMV, whereas plants only infected with the badnavirus 

had mild disease symptoms (Tushemereirwe et al., 1996). As yet, no vector 

of  BanMMV  has  been  identified,  although  there  is  strong  circumstantial 

evidence for plant‐to‐plant transmission (Teycheney et al., 2005a). 

 

8 

  BVX, another unassigned member of the family Flexiviridae, has not 

been associated with any disease symptoms and virtually nothing is known 

about  the  epidemiology  of  this  virus.  Although  there  are  presently  no 

records  of  BVX  outside  Guadeloupe,  it  is  suspected  that  its  geographic 

distribution may be wider (Teycheney et al., 2005b). 

Banana streak virus 

BSV is the most frequently observed virus affecting banana in the Americas 

and  most  of  Africa,  in  particular  Uganda  (Tushemereirwe  et  al.,  1996; 

Harper et al., 2004, 2005; Geering, 2009) and Kenya (Karanja et  al. 2008).  

BSD is, however, rarely encountered in either Australia or South Africa. The 

reasons for this are not known, but may  include epidemiological variables 

such as vector type and abundance. Furthermore, legislation in Australia is 

used  to  regulate  the  banana  industry,  including  planting  material,  and 

subsequently virus diseases are well  controlled.  In  contrast,  in Kenya and 

Uganda, the high prevalence of the disease may be due to the inadvertent 

use of infected planting material by farmers (Geering, 2009). 

Mealybugs  (Pseudococcus  spp.)  are  the  only  known  vector  for 

banana‐infecting badnaviruses  (Jones  and  Lockhart, 1993; Kubiriba  et al., 

2000),  and  the  rate of  spread by  this means  is believed  to be  very  slow 

(Kubiriba et al., 2000). During a 2‐year  field  trial  in north Queensland, no 

natural spread of Banana streak CA virus (BSCAV) from infected to healthy 

plants was observed (Daniells et al., 2001). 

  Symptoms of BSD  can be very  severe and  include  stunting, bunch 

abnormalities, splitting and  internal necrosis of the pseudostem and  fruit. 

However,  in  some  environmental  conditions,  infected  plants may  remain 

symptomless.  Yield  losses  from BSV  infection  vary widely  (Daniells  et al., 

1999;  Lockhart  and  Jones,  2000b).  In  Cavendish,  the  yield  loss  has  been 

estimated  to  vary  from  7%  to  90%  depending  on  the  severity  of  the 

symptoms  (Lassoudière,  1974).  BSV  is  an  important  limiting  factor  to 

banana  production  in  countries  like  Kenya  and  Uganda  (Kubiriba  et  al., 

 

9 

2000;  Karanja  et  al.,  2008).  Additionally,  BSV  is  recognised  as  a  major 

constraint  to  both  the  genetic  improvement  of  banana  as  well  as 

germplasm dissemination. The reasons for this are discussed later. 

  BSVs  are  classified  in  the  genus  Badnavirus  within  the  family 

Caulimoviridae  (Lockhart, 1986; Fauquet et al., 2005). They encapsidate a 

non‐covalently  closed,  circular  dsDNA  genome  and  are  known  as 

pararetroviruses  since  they  replicate  by  reverse  transcription  via  an  RNA 

intermediate  (Lockhart  and  Jones,  2000b).  Unlike  true  retroviruses, 

however,  they  have  no  requirement  for  the  integration  of  their  viral 

genome into the host chromosome in order to replicate and their genome 

does not encode an  integrase  (Harper et al., 2002b). Like all members of 

the Badnavirus genus, BSV have bacilliform virions of approximately 30 × 

120‐150 nm (Figure 1.1b), and a circular dsDNA genome of approximately 

7.4 kbp (Harper and Hull, 1998; Lockhart and Jones, 2000b) which contains 

three open reading frames (ORFs) and a tRNAmet binding site (Figure 1.1a). 

The first two ORFs encode two small proteins (ORF 1 of 20.8 kD, and ORF 2 

of  14.5  kD)  of  unknown  function  while  the  third  ORF  encodes  a  large 

polyprotein (208 kD) that is proteolytically cleaved to produce the viral coat 

protein, movement  protein,  aspartic  protease,  reverse  transcriptase  (RT) 

and ribonuclease (RNase)‐H (Harper and Hull, 1998). 

  Replication  takes place  in both  the  cytoplasm and nucleus of host 

cells. Following entry of the viral genome into the cytoplasm, the viral DNA 

is  transported  to  the  nucleus  where  it  forms  super‐coiled  mini‐

chromosomes. The viral DNA is transcribed into polyadenylated RNA which 

is terminally redundant. Newly transcribed RNA  is transported back to the 

cytoplasm where  it has  two roles.  It can either be used as a  template  for 

viral protein synthesis, or  it can undergo reverse transcription by the viral‐

encoded  reverse  transcriptase  to  synthesise  the  virus‐sense  strand DNA. 

This DNA  can  then  re‐enter  the  nucleus  for  amplification  (Harper  et  al., 

2002b). 

 

10 

 

 

  

 

 Figure  1.1:  (a) Map  of  the  BSV  genome.  Conserved  sequence motifs  ofbadnaviruses are  indicated as black  segments. The positions of  the  threeORFs of BSV are given by filled arrows. (Modified from Harper et al., 2004)(b) Electron micrograph of BSV. The particle sizes are ca. 120 nm × 30 nm(Harper et al., 2004). 

a) 

b) 

 

11 

  Based  on  current  classification  criteria  which  delimits  individual 

species  based  on  nucleotide  differences  of  greater  than  20%  in  the 

RT/RNase H‐coding region (King et al., 2011), there are presently three BSV 

species  recognised  by  the  International  Committee  on  the  Taxonomy  of 

Viruses (ICTV), namely Banana streak GF virus (BSGFV), Banana streak MY 

virus  (BSMYV)  and  Banana  streak  OL  virus  (BSOLV),  while  one  putative 

species, Banana streak VN virus, is awaiting recognition (King et al., 2011). 

Six more species, namely Banana streak CA virus (BSCAV, previously Banana 

streak Cavendish virus), Banana streak IM virus (BSIMV, previously Banana 

streak  Imové  virus),  Banana  streak  UA  virus  (BSUAV,  previously  Banana 

streak Uganda A virus), Banana  streak UI virus  (BSUIV, previously Banana 

streak Uganda  I  virus), Banana  streak UL virus  (BSULV, previously Banana 

streak Uganda L virus), Banana streak UM virus (BSUMV, previously Banana 

streak Uganda M  virus) have  also  recently been proposed based on  full‐

length sequence analyses (Geering et al., 2011; James et al., 2011b). Partial 

genome  sequences  have  been  reported  for  nine  other  putative  virus 

species,  based  on  isolates  of  BSV  from  Uganda,  named  Banana  streak 

Uganda B–H, J and K viruses (Harper et al. 2004, 2005). However, until the 

complete  genomic  sequences  of  these  putative  viruses  have  been 

determined,  their  taxonomic  status  remains  unresolved. Nevertheless,  in 

spite  of  the  pending  status  with  ICTV,  undeniably  a  great  amount  of 

diversity exists in the collection of badnaviruses, now commonly referred to 

as BSV, infecting bananas (Figure 1.2).  

BSV is one of the few plant viruses which have integrated sequences 

present  in their host plant genome. (LaFleur et al., 1996; Harper and Hull, 

1998;  Harper  et  al.,  1999b;  Ndowora  et  al.,  1999;  Geering  et  al.,  2001, 

2005a,  b).  There  are  two  groups  of  integrated  BSV  sequences  known  to 

occur  in  banana.  The  first  group,  named  endogenous  pararetroviruses 

(EPRVs)  contains  the  majority  of  integrated  sequences  and  comprises 

incomplete virus genomes (as a result of large‐scale genome 

 

12 

 

 

 Figure 1.2: Unrooted tree showing the  identified BSV species grouped  intothree  clades  (shaded) based on nucleotide  sequence  identities of greaterthan  72%.  White  circles  represent  the  different  BSV  species  found  inUganda, and  for clarity only  the descriptor of  the Ugandan BSV species  isused (Modified from Harper et al., 2005). Using the old abbreviations somecommon BSV species  is denoted as following; BSOLV  is abbreviated BSOlV,BSCAV as BSCavV, BSGFV as BSGfV and BSMYV as BSMysV. 

 

13 

rearrangements and gene deletions or nucleotide substitutions giving rise 

to translational frame‐shifts or premature stop codons) which are incapable 

of causing  infection (LaFleur et al., 1996; Harper and Hull, 1998; Harper et 

al.,  1999b;  Ndowora  et  al.,  1999;  Geering  et  al.,  2001,  2005a,  b).  EPRV 

sequences are believed  to have been present  in  the Musa  genome  for  a 

very  long  time,  almost  certainly  pre‐dating  domestication. M.  acuminata 

and M. balbisiana have different populations of EPRVs, which suggest that 

the  integration events occurred after  the divergence of  these  species, an 

occurrence  estimated  to  have  happened  approximately  4.6 million  years 

ago  (Geering  et  al.,  2005a;  Lescot  et  al.,  2008).  Although  some  EPRV 

sequences show homology to the genomes of known episomal BSV, many 

others have no  known episomal  counterpart  (Geering  et al., 2005a).  The 

second type of integrated sequences are called endogenous BSV (eBSV) and 

consist of the entire genome of characterised episomal BSV species which 

exist as multiple non‐contiguous  regions of  the virus DNA combined with 

host‐genomic  sequences.  Under  certain  stress  conditions,  particularly  in 

vitro  propagation  and  hybridisation,  recombination  events  occur  in  the 

integrated  sequences  allowing  the  reconstituted  viral  genome  to  be 

activated  thereby  resulting  in  episomal  infections  (Ndowora  et  al.,  1999; 

Dallot et al., 2001; Gayral et al., 2008; Côte et al., 2010;  Iskra‐Caruana et 

al., 2010). Whilst the incomplete EPRVs have been found in both the A‐ and 

B‐genomes  derived  from  the  wild  progenitors  of  domesticated  banana, 

Musa acuminata (A) and M. balbisiana (B), respectively, the eBSV have only 

been detected  in  the B‐genome of various banana accessions  (Geering et 

al., 2001, 2005b; Gayral et al., 2008). 

  It  is  thought  that  the majority of eBSV  sequences  are  silenced by 

DNA methylation and heterochromatisation, although a few  inactivateable 

copies are  transcribed at  low  levels. These non‐infectious RNA  transcripts 

are then thought to  form a template  for the synthesis of small  interfering 

RNAs (siRNAs), which, in turn, maintain the epigenetic control of the virus. 

 

14 

It is only when stresses such as interspecific hybridisation or tissue culture 

(TC) propagation weakens the epigenetic control that activateable copies of 

viral DNA are transcribed to cause infection (Dallot et al., 2001; Lheureux et 

al., 2003). 

  A question which remains unanswered is why the rate of activation 

of BSV  is  low  in  some hybrids,  such  as  'Goldfinger'  (syn.  'FHIA‐01', AAAB 

genome), whilst it is high in other cultivars. The rate of activation of eBSOLV 

in 'Lady Finger' (AAB genome), a popular cultivar in subtropical Australia, is 

virtually non‐existent, even though  it has been propagated through TC  for 

many  years.  In  stark  contrast,  the  activation  rate  of  eBSOLV  in  'FHIA‐21' 

(AAAB  genome)  is  58%  after  only  six  in  vitro  subcultures  (Dallot  et  al., 

2001). The Goldfinger cultivar  is presumed to contain an activatable allele 

of eBSGFV DNA, given that this virus was originally discovered in this plant, 

but  the  activation  rate  is  extremely  low  (Gayral  et  al.,  2008).  The 

commercialisation of 'Goldfinger' gives some hope to plant breeders that it 

is possible with current technology to develop new, improved bananas and 

plantains without eBSV being a constraint (Geering, 2009). 

1.2.3 BSV diagnostics 

BSV species are serologically and genomically variable (Lockhart and Jones, 

2000b; Harper et al., 2002a) and this creates problems for the development 

of  reliable diagnostic  tests. Published methods  for BSV  detection  include 

enzyme‐linked  immunosorbent  assay  (ELISA),  polymerase  chain  reaction 

(PCR),  immunosorbent  electron  microscopy  (ISEM),  immunocapture‐PCR 

(IC‐PCR) and rolling circle amplification (RCA) (Dahal et al., 1998; Harper et 

al.,  1999a,  b,  2002a,  2004,  2005; Geering  et al.,  2000;  Le  Provost  et  al., 

2006; Karanja et al., 2008; James et al., 2011a, b). Each of these methods 

has its inherent advantages and disadvantages. 

Although ELISA allows for the screening of large numbers of samples 

at low cost, it suffers from a lack of sensitivity and is, therefore, unsuitable 

 

15 

for detection of BSV in asymptomatic plant tissue or where the virus occurs 

in low concentration (Dahal et al., 1998; Harper et al., 2005). Further, ELISA 

as well as  IC‐PCR and  ISEM,  relies on  the  initial capture of virions onto a 

surface using BSV‐specific antibodies. Due to the highly variable nature of 

the  BSV  coat  protein  (Lockhart  and  Jones,  2000b;  Harper  et  al.,  2002a, 

2005),  it  is  virtually  impossible  to  generate  an  antiserum  that 

detects/captures all isolates of BSV. This means such a diagnostic approach 

has the potential to result in false negatives. 

PCR  is  a  very  sensitive  method  for  virus  detection.  Further,  the 

reagents are now becoming available at an affordable cost for routine use 

in  developing  countries  and  the  associated  equipment  has  broad 

application  in  plant  biotechnology.  Crucial  to  the  successful  detection  of 

viruses by PCR is the availability of primers that will allow the amplification 

of viral genomic sequences. Primer sets for the specific detection of BSOLV, 

BSCAV,  BSMYV,  and  BSGFV  have  been  developed  (Geering  et  al.,  2000) 

along with degenerate primer sets  that can detect several BSV species as 

they  are  designed  to  conserved  sequences  in  the  reverse 

transcriptase/RNase H‐coding  region of ORF 3 of badnaviruses  (Harper et 

al., 2002a, 2004, 2005; Yang et al., 2003; Karanja et al., 2008). The major 

problems to date with PCR is the presence of endogenous sequences which 

may yield a positive result despite the absence of episomal virus (Harper et 

al.,  1999b,  2005;  Yang  et  al.,  2003),  and  the  use  of  several  primer  sets 

which  are  still  considered  unlikely  to  detect  the  entirety  of  the  BSV 

sequence diversity. In an attempt to circumvent the detection of integrated 

DNA,  immunocapture (IC)‐PCR  is currently used as the “gold‐standard” for 

BSV  indexing.  IC‐PCR  using  degenerate  primers  to  amplify  BSV  has  been 

demonstrated  (Harper  et  al.  2002a,  2004,  2005;  Karanja  et  al.,  2008). 

However,  this method  still  has  serious  limitations  due  to  the  inability  of 

antiserum to capture all BSV isolates (Harper et al., 2002a), along with the 

limitations  to  PCR  previously  mentioned.  Further,  the  presence  of 

 

16 

contaminating, carry‐over nucleic acid remaining  in capture tubes can also 

lead  to  false  positives  by  detection  of  EPRV  and  eBSV  sequences  in  the 

Musa  genome  (Le  Provost  et  al.,  2006;  Iskra‐Caruana  et  al.,  2009). 

Therefore,  the  development  of  a  new, more  effective  approach  that  can 

overcome the dependence of antisera to capture BSV virions is needed. 

  A new promising method for detection of BSV  is the application of 

RCA  combined  with  restriction  fragment  length  polymorphisms  (RFLPs) 

(James,  2011;  James  et  al.,  2011a).  RCA  uses  bacteriophage  φ29  DNA 

polymerase to amplify circular DNA molecules  in a sequence‐independent 

manner  (Blanco  et  al.,  1989;  Dean  et  al.,  2001).  Previous  studies  have 

shown that RCA  in combination with RFLP  is a highly reproducible tool for 

geminivirus  diagnosis,  and  is  largely  independent  of  viral  genome 

organisation, source plant type and origin, and sample preparation (Haible 

et  al.,  2006;  Schubert  et  al.,  2007).  Since  the  episomal  DNA  of  BSV  is 

circular as opposed to the integrated sequences, RCA is able to discriminate 

between episomal and  integrated BSV  sequences and  thus overcome  the 

occurrence  of  false‐positives.  An  additional  practical  advantage  of  using 

RCA  is that  it will amplify uncharacterised BSV species for which sequence 

information  is not  available, making  it useful  to detect new BSV  species. 

One of the major disadvantages of this approach, however,  is that for BSV 

identification  it  is  relatively  expensive which may make  it  prohibitive  for 

widespread use in developing countries. 

1.2.4  BSV diagnostics – issues and possible solutions 

One  of  the  difficulties  faced  by Australian  researchers  involved  in 

the  development  and  optimisation  of  diagnostic  assays  for  BSV  is  the 

limited availability of diseased plant material. Despite being widespread in 

East  Africa,  the  disease  is  sporadic  in  Australia  due  largely  to  the 

implementation of disease control programs. Further, due to the slow rate 

of  transmission by  the mealybug vector and  the  inability  to mechanically 

transmit the virus (Jones and Lockhart, 1993; Kubiriba et al., 2000; Huang 

 

17 

and Hartung, 2001), obtaining large numbers of infected plants as controls 

is difficult. One approach to generate large numbers of infected plants is to 

construct an infectious clone of the virus. 

  An  infectious  clone  is  essentially  a  replication  competent  double‐

stranded  DNA  copy  of  the  viral  genome  carried  in  a  bacterial  plasmid. 

These transgenic plasmids can be introduced into cells by transformation to 

produce infectious virus. Successful development of infectious clones of the 

Tungrovirus, Rice tungro bacilliform virus (RTBV), and the Badnavirus, Citrus 

yellow mosaic  virus  (CYMV),  have  been  reported  (Dasgupta  et  al.,  1991; 

Huang  and  Hartung,  2001).  The  existing  model  for  production  of  a 

successful infectious clone of Badnavirus involves the expression (following 

entry  to  the plant  cell) of  a  larger  than unit  length  terminally  redundant 

transcript  of  the  viral  genomic  DNA  by  host  DNA‐dependent  RNA 

polymerase, using the cloned virus DNA as template. During a normal virus 

infection, this greater than  full‐length transcript  is produced and works as 

the template for viral minus‐strand DNA synthesis using the virus‐encoded 

replicase protein, as well as a polycistronic RNA for expression of the virus 

encoded proteins (Pfeiffer and Hohn, 1983; Hohn et al., 1985; Temin, 1989; 

Medberry et al., 1990; Dasgupta et al., 1991; Qu et al., 1991; Bouhida et al., 

1993; Jacquot et al., 1999).  

There are several ways to inoculate plants with the infectious clone. 

Wounding the plant with an inoculated scalpel or shooting it into the tissue 

with a biolistic particle delivery system are  two options. The method  that 

may prove to be the most efficient is Agrobacterium‐mediated inoculation, 

where  the  vector  is  transformed  into  competent  cells  of  Agrobacterium 

tumefaciens which  in  turn are used  to  inoculate plants. This method has 

been  shown  to  be  the most  efficient  or,  in  some  cases,  the  only way  to 

cause  systemic  infection  in plants using  infectious  clones of badnaviruses 

and caulimoviruses (Grimsley et al., 1986; Dasgupta et al., 1991; Huang and 

Hartung, 2001).  

 

18 

1.3 The situation in Uganda 

Banana crops  in Uganda have two major problems. Firstly, the staple food 

landraces  of  EAHB  are  low  in  two  essential micronutrients  namely  pro‐

vitamin  A  and  iron  (Fungo  et  al.,  2007; Honfo  et  al.,  2007).  As  a  result, 

Ugandan  populations  dependent  on  a  banana‐based  diet  have  a  high 

incidence  of  vitamin  A  deficiency  and  iron  deficiency  anaemia  (Bachou, 

2002). Secondly, as with most other banana‐producing countries, Ugandan 

bananas are affected with a wide range of devastating pests and diseases 

that  threaten  the  food supply  (Robinson, 1996; Bagamba et al., 2003). Of 

these,  BSV  is  considered  the most  important  virus.  Two  approaches  are 

currently being used in an effort to overcome these two issues. 

  As  part  of  a  Bill  and Melinda  Gates  Grand  Challenges  in  Global 

Health  Project,  researchers  within  the  CTCB  at  QUT  are  attempting  to 

develop genetically modified bananas with  increased  levels of pro‐vitamin 

A and iron. This approach has been successfully used with other crops such 

as rice, and was the only real option due to the difficulties associated with 

conventional  banana  breeding,  mainly  due  to  the  low  fertility  of  the 

common cultivars and landraces. An important parallel and complementary 

project was also initiated to address the need for reliable virus indexing of 

planting material prior  to  its distribution  to  growers.  It  is with  this  latter 

project that my research project is concerned.   

  One of the widely used and accepted strategies for the production 

of  disease  free  bananas  in  developing  countries  such  as  Uganda  is 

micropropagation, often referred to as TC. Agriculture in East Africa consists 

mainly of small‐scale farm activity  in which the cultural practice  in banana 

production  has  been  for  farmers  to  transplant  banana  suckers  from  one 

farm to another. This has, in turn, substantially contributed to the efficient 

transmission of banana viruses  throughout  the  region. As a  result of  this, 

farmers are encouraged to use clean, disease‐free and  insect‐free planting 

material, which is effectively obtained by TC propagation techniques (Africa 

 

19 

Harvest, 2009). Micropropagation of bananas  involves  the excision of  the 

meristem of usually a field grown banana and its establishment in a sterile 

environment on sterile media. By applying this method, fungal, bacterial or 

nematode diseases can be avoided, as  infected or  infested meristems are 

easily  recognised  in  culture  and  discarded.  The meristems  can  then  be 

stimulated  to produce multiple plantlets  through  the manipulation of  the 

plant hormone levels in the media. Hence, a very large number of plantlets 

can be generated from a single meristem, each genetically  identical to the 

original  plant.  The  plantlets  are  then  removed  from  the  sterile 

environment, acclimatised and grown in a nursery to a size appropriate for 

planting  in the field. A danger of micropropagation, however,  is that  if the 

original  parent  plant  is  virus  infected,  all  progeny  (which may  be  in  the 

millions) will also be  infected  (Daniells et al., 2001). This not only  causes 

potentially devastating effect on the crop plants but also poses a threat of 

international virus  spread.  It  is  imperative,  therefore,  that a  reliable virus 

indexing  scheme  is  available  to  screen  for  viruses. Banana  virus  indexing 

schemes, combined with micropropagation, is well established in a number 

of  countries  including Australia. However,  the major  problem with  these 

schemes is the lack of a reliable diagnostic test for BSV.   

1.4 Project aim and objectives 

The  current  diagnostic  tests  for  BSV  have  serious  limitations  due  to  the 

extreme  serological  and  genetic  differences  between  the  BSV  species. 

Serological methods  lack  the  ability  to  detect  the  vast  differences  in  the 

BSV coat protein, and these methods are therefore unsuitable  for reliable 

detection of all BSV species. The challenge with PCR detection of BSV  lies 

firstly with the hypervariable genome, which makes the primer design very 

difficult,  and  secondly with  the  presence  of  integrated  sequences  in  the 

banana genome. Although BSV sequences are integrated in both the A‐ and 

B‐genomes of banana, it is with the B genome that the major challenges lie 

 

20 

as  this genome contains sequences  identical  to  four known episomal BSV 

species. A novel BSV diagnostic  test, based on a combination of RCA and 

RFLPs, has been developed at QUT which appears promising. However, RCA 

has  the problem  that  it  is relatively expensive and,  therefore, may not be 

affordable to developing countries where the need is highest. A PCR‐based 

diagnostic  test  is  a  cost‐effective  and  sensitive  alternative,  but  this 

approach demands  the design of primer  sets  that will avoid detection of 

eBSV. The overall aim of this project was to improve the current strategies 

for BSV detection. This aim was to be achieved through the following three 

objectives: 

1. Compare PCR and RCA as diagnostic assays for BSV  

2. Develop  episomal‐specific  primer  sets  for  BSV  species  with 

endogenous counterparts 

3. Develop  an  infectious  clone  of  BSMYV  to  generate  BSV  infected 

plant material for assessment of diagnostic tests.  

 

21 

Chapter 2   

General materials and methods 

2.1 General materials 

2.1.1 Sources for specialised reagents 

Laboratory  reagents were acquired  from  scientific  supply companies  such 

as Sigma Aldrich and Crown Scientific. Agarose for gel electrophoresis was 

obtained  from Roche Diagnostics and stain used was SYBR® Safe DNA Gel 

Stain provided by Invitrogen Corp. Agar for bacterial culture was purchased 

from Oxoid. Molecular weight markers were purchased from Bioline, while 

modifying and restriction enzymes were purchased from Roche Diagnostics 

or New England Biolabs.  

2.1.2 Reagents and equipment for DNA amplification 

Rolling circle amplification  (RCA) of DNA was conducted using  the  Illustra 

TempliPhi™  100  Amplification  Kit  provided  by  GE  Healthcare, 

Buckinghamshire,  United  Kingdom.  Polymerase  chain  reaction  (PCR) 

amplification was undertaken using GoTaq® Green Master Mix provided by 

Promega.  Both  amplification  reactions  were  undertaken  on  a  Peltier 

Thermal Cycler‐PTC200 from MJ Research. 

2.1.3 Oligonucleotide synthesis 

Oligonucleotide primers were  synthesised by GeneWorks and  supplied as 

precipitated  DNA,  usually  within  the  range  30‐50  nmol.  Stock  solutions 

were  made  by  dissolving  primers  with  deionised  water  (dH2O)  to 

concentrations  of  100  or  200  pmol/µl.  Stock  solutions were  diluted with 

dH2O to working concentrations of 5 pmol/µl. 

 

22 

 

2.1.4 Bacterial strains 

Heat‐shock  competent  Escherichia  coli  (E.  coli)  strain  XL1‐blue,  used  for 

general plasmid cloning, and Agrobacterium  tumefaciens  (A.  tumefaciens) 

strain  AGL1,  used  for  the  inoculation  of  Cavendish  banana  plants,  was 

kindly supplied by colleagues Dr Anthony James and Ms Karlah Norkunas. 

2.2 General methods 

2.2.1 DNA extraction from leaf tissue 

Total NA was  isolated  from  leaf  tissue  from various cultivars of Musa and 

Saccharum  using  a  cetyltrimethylammonium  bromide  (CTAB)‐based 

method. Either fresh tissue (0.4 g) or dried tissue (0.04 g) was ground to a 

fine powder with washed sand in liquid nitrogen with a mortar and pestle. 

To  the  ground  leaf  tissue,  3  ml  CTAB  extraction  buffer  (0.1  M  tris 

(hydroxymethyl)  aminomethane  (Tris)‐HCl  solution,  pH  8.0,  0.05  M 

ethylenediaminetetraacetic  acid  (EDTA),  pH  8.0,  1.4 M  sodium  chloride, 

0.08  M  sodium  sulphite,  10  g/l  polyvinylpyrrolidone  (PVP)  and  0.05  M 

CTAB)  was  added,  and  the  homogenate  was  distributed  to  two  2  ml 

microfuge tubes. The homogenates were incubated at 65°C for 30 min in a 

water bath, inverting tubes several times. The homogenate was centrifuged 

at 18,000 g  for 5 min.  Supernatant  (750  μl) was extracted with an equal 

volume  of  chloroform‐isoamylalcohol  (Chl:IAA)  solution  (24:1  v/v).  The 

phases were  vortexed  thoroughly and  then  centrifuged at 18,000 g  for 5 

min. Supernatant (600 μl) was removed and extracted a second time with 

an  equal  volume  of  Chl:IAA  as  described.  The  supernatant  (450  μl) was 

removed and nucleic acids (NA) precipitated by adding an equal volume of 

isopropanol  (100%). Total NA was  collected by centrifugation at 18,000 g 

for 5 min, and pellets washed using 500  μl of ethanol  (70%)  followed by 

centrifugation at 18,000 g for 1 min. Pellets were air dried and resuspended 

in  50  μl  of  dH2O  at  4°C  overnight. Where  indicated,  NA  extracts  were 

 

23 

analysed  using  the Nanodrop2000  spectrophotometer  and  diluted  to  10 

ng/μl for PCR. 

2.2.2 PCR amplification 

PCR  amplification  was  undertaken  using  GoTaq®  Green  Master  Mix 

(Promega).  Unless  otherwise  stated,  2×  GoTaq mixture,  5  pmol  each  of 

sense and anti‐sense primer, 10 ng CTAB NA extract and dH2O were added 

up to a final volume of 20 μl and then incubated in a Peltier Thermal Cycler‐

PTC200  (MJ Research) under  the  following conditions:  Initial denaturation 

at 94 °C for 2 min, followed by 35 cycles of denaturation at 94 °C for 20 s, 

annealing at the temperature specified for 20 s and extension at 72 °C for 

time  specified, with  the  subsequent  final  extension  for  a minimum  of  2 

min.  Samples  where  held  at  14  °C  until  analysis  by  agarose  gel 

electrophoresis. 

2.2.3 RCA 

DNA was  amplified  using  the  Illustra  TempliPhi  100 Amplification  kit  (GE 

Healthcare),  essentially  according  to  the manufacturer’s  instructions  but 

with slight modifications as described by James et al., (2011a). Nucleic acid 

extract (1 µl) was mixed with 3 µl of kit sample buffer and 1 µl of a 5 µM 

stock solution  (approximately 4.16 pmol/µl of each primer) of degenerate 

primers. The mixture was denatured at 95°C for 3 min and cooled on ice for 

another 3 min, and subsequently kit reaction buffer (5 µl) and polymerase 

(0.2 µl) was added. The mixtures were incubated at 30°C for 18 h and then 

the reactions were stopped by incubation at 65°C for 10 min. Samples were 

held at 14 °C prior to subsequent analysis. 

2.2.4 Restriction digestion 

Unless stated otherwise, the entire RCA reaction volume (10 µl) or 15 µl of 

miniprep DNA was digested using 2× buffer, restriction enzyme(s) (2 U) and 

dH2O in a total volume of 20 µl. The samples were incubated for 1.5‐2 h at 

the recommended temperature, by manufacturer, for each enzyme used. 

 

24 

 

2.2.5 Agarose gel electrophoresis 

Agarose  gels  were  prepared  by  melting  1%  (w/v)  solid  agarose  in  Tris‐

Acetate‐EDTA  (TAE)  buffer.  Samples were  loaded  and  electrophoresed  at 

100 V or 120 V for 45 min for PCR, and 120 V at 60 or 90 min for RCA and 

miniprep DNA restriction digests. Gels were stained with 0.25× SYBR® Safe 

DNA Gel stain. 

2.2.6 DNA extraction from agarose gel 

DNA bands were excised from agarose gels and stored at ‐20 °C until DNA 

recovery. DNA was extracted  from  the agarose gel using Quantum Prep™ 

Freeze  'N' Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns (Bio Rad), using their 

standard protocol. 

2.2.7 Dephosphorylation of 5’ ends 

The phosphate group was removed from the 5’ ends of  linearised plasmid 

DNA  by  incubating with  3  U  of  calf  intestinal  alkaline  phosphatase  (CIP, 

Roche) at 37 °C for 50 min, with the subsequent heat‐inactivation at 65 °C. 

Following dephosphorylation, CIP was removed from the DNA sample using 

agarose gel electrophoresis and DNA gel extraction using Quantum Prep™ 

Freeze 'N' Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns (Bio Rad). 

2.2.8 DNA ligation 

The specific ligation methods are described in each chapter.  

2.2.9 Transformation of E. coli 

Chemically  competent  E.  coli  strain  XL1‐blue  was  transformed  by  heat 

shock.  Approximately  10  µl  of  ligation  mix  were  added  per  50  µl  of 

competent E. coli culture and incubated on ice for about 15 min. Cells were 

heat shocked at 42 °C for 90 s, returned to ice, resuspended in 150 µl LB or 

SOC (Sambrook and Russell, 2001) and  incubated for approximately 1 h at 

37  °C with  shaking.  Transformed  E.  coli were  plated  onto  solid  LB  agar 

 

25 

medium containing the appropriate antibiotics (ampicillin, 50 µg/ml, unless 

specified otherwise), supplemented with IPTG (0.2 g/l) and X‐gal (40 mg/l) 

for white/blue selection vector systems, and incubated at 37 °C for 18‐24 h. 

Colonies  were  selected,  using  white/blue  selection  when 

possible/appropriate,  and  incubated  in  1  ml  of  liquid  LB  with  the 

appropriate antibiotics at 37 °C overnight with shaking. 

2.2.10  Mini‐preparation protocol 

Bacterial cells from overnight cultures were pelleted in a microcentrifuge at 

18,000  g  for  30  s.  Pellets were  resuspended  in  150  µl  glucose‐Tris‐EDTA 

buffer (50 mM glucose, 25 mM Tris‐HCl pH 8.0, 10 mM EDTA) by vortexing. 

Cells  were  then  lysed  by  the  addition  of  150  µl  sodium  hydroxide 

(0.2M)/sodium  dodecyl  sulphate  (1%  w/v)  solution,  followed  by  gentle 

inversion. Chromosomal DNA and proteins were precipitated by adding 150 

µl  potassium  acetate  solution  (5 M,  200  µl)  followed  by  200  µl  Chl:IAA 

solution (24:1) and centrifugation at 18,000 g for 5 min. Supernatant (400 

µl)   was  removed and  the DNA precipitated with 900 µl ethanol  (100 %), 

before  centrifuging at 18,000 g  for another 5 min. The DNA pellets were 

washed in 350 µl ethanol (70% v/v) and centrifuged again at 18,000 g for 2 

min. The pellets were air or vacuum dried and resuspended  in 50 µl dH2O 

with 1 µl RNaseA (20 µg/ml) added. 

2.2.11  Sequencing 

All sequencing reactions used plasmid DNA and the ABI Big Dye Terminator 

Cycle  Sequencing  Kit  version  3.1  (Applied  Biosystems).  Each  reaction 

contained 1 µl Big Dye v3.1 mix, 2 µl plasmid DNA, 3.33 pmol of primer, 3.5 

µl of sequencing buffer (400 mM Tris pH 9.0, 10 mM MgCl2) and dH2O in a 

final  volume  of  20  µl.  All  sequencing  cycle  reactions  used  an  initial 

denaturation of 95 °C for 5 min followed by 40 cycles of denaturation at 95 

°C  for 30 s, annealing at 50  °C  for 20 s and extension at 60  °C  for 4 min. 

Following this, extension products were precipitated by adding 0.1 volume 

 

26 

of  sodium  acetate  (3 M)  and  EDTA  (125 mM)  and  2.5  volumes  of  100% 

ethanol,  and  incubating  at  room  temperature  for  15 min.  Products were 

pelleted by centrifuging at 18,000 g for 20 min. Pellets were washed with 

250 µl ethanol (70 %) and centrifuged at 18,000 g for 5 min. The dried DNA 

pellets  were  capillary  sequenced  either  by  Griffith  University  DNA 

Sequencing Facility or at QUT. 

 

27 

Chapter 3   

Assessment of PCR and RCA for diagnosis of BSV in field samples 

3.1 Introduction 

Banana streak virus (BSV), which causes banana streak disease (BSD), is the 

most  common virus affecting banana  in  the Americas and most of Africa 

(Tushemereirwe et al., 1996; Harper et al., 2005). BSV is highly prevalent in 

Uganda and Kenya, and has a high diversity of species (Harper et al., 2002a, 

2004, 2005; Karanja et al., 2008; James, 2011; James et al., 2011b).  

PCR  is a very sensitive method  for virus detection and primer sets 

for the specific detection of nine BSV species have been reported (Geering 

et al., 2000;  James, 2011;  James et al., 2011b). However, while the EPRVs 

are  of  only  minor  concern  for  developing  primers  for  reliable  PCR 

detection, one of  the major problems  to date with PCR‐based diagnostic 

methods is the presence of endogenous BSV (eBSV) in the Musa B‐genome, 

as  they  are  full‐length  sequences  of  the  corresponding  episomal  virus 

which may  yield  a  positive  result  despite  the  absence  of  episomal  virus 

(Harper et al., 1999b, 2005; Yang et al., 2003). 

  Rolling circle amplification (RCA) combined with restriction fragment 

length polymorphisms (RFLPs) is a relatively new and promising method for 

detection of episomal BSV (James, 2011; James et al., 2011a). An additional 

practical advantage of using RCA is that it will amplify uncharacterised BSV 

species for which sequence information is not available, making it useful to 

detect new BSV species.  

 

28 

  In order to further determine the diversity of BSV in Africa, a study 

was  undertaken  to  identify  and  characterise  the  BSV  species  present  in 

eastern  Uganda  using  both  PCR‐  and  RCA‐based  tests.  This  chapter 

describes the results of this study and discusses PCR and RCA as methods 

for virus detection. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

29 

3.2 Methods 

3.2.1 Samples for analysis 

Forty‐five  leaf  samples  (Table  3.1)  were  collected  from  nine  districts  in 

eastern Uganda  in February 2010. Leaf samples were dried over silica gel 

and sent to QUT for analysis. Total nucleic acid was extracted from the leaf 

samples  as  described  in  section  2.2.1,  and  nucleic  acid  extracts  were 

diluted to 10 ng/µl using deionised water. 

3.2.2 PCR amplification 

PCR testing was conducted for the detection of BSV species using primers 

listed  in Table 3.2. As an  internal extraction control, extracts were  initially 

tested  for  the  banana  actin  gene.  PCRs were  conducted  as  described  in 

section 2.2.2 with PCR extension times set to 30 s for all primer sets, while 

specific annealing temperatures for each primer set are  listed  in Table 3.2. 

PCRs were analysed by electrophoresis through agarose gels (section 2.2.5) 

and DNA fragments visualized on a Safe imager blue‐light transilluminator. 

3.2.3 RCA amplification 

RCA testing of nucleic acid extracts was undertaken as described in section 

2.2.3. RCA  reactions were  restriction digested separately using either StuI 

or  PstI  as  described  in  section  2.2.4.  All  samples  that  yielded  no  digest 

products using these two enzymes were RCA amplified and digested again 

using EcoRI, BamHI, SacI, XbaI, SalI and HindIII in separate reactions. Digest 

products were  electrophoresed  through  agarose  gels  (section  2.2.5)  and 

DNA  fragments visualized on a Safe  imager blue‐light transilluminator. For 

samples with full‐length restriction fragments or RFLPs distinct from those 

predicted  from  characterised  full‐length BSV  species, bands were excised 

(section  2.2.6)  for  analysis  by  cloning  and  sequencing. Where  the  RFLP 

matched  to  predicted  profiles  for  BSV  species with  published  full‐length 

sequences,  these were used  to  identify  the  species present.  For  samples

 

30 

Table 3.1: Plant samples used in

 this study 

  Sample 

number 

District 

Cultivar 

Genome 

type 

Symptoms 

188 

Luwero 

Yangambi Km5 

AAA 

chlorotic streak, necrotic flecks 

189 

Luwero 

Nfuka 

EAH‐AAA 

mild

 chlorotic flecking 

190 

Luwero 

Nfuka 

EAH‐AAA 

strong chlorotic flecks 

191 

Luwero 

Lusumba 

EAH‐AAA 

strong chlorotic/necrotic flecks 

192 

Luwero 

Mpologoma 

EAH‐AAA 

mild

 chlorotic streaking 

193 

Luwero 

unsure 

EAH‐AAA 

yellow flecking 

194 

Luwero 

Mpologoma 

EAH‐AAA 

chlorotic flecking 

195 

Luwero 

Mpologoma 

EAH‐AAA 

chlorotic flecking 

196 

Luwero 

Mpologoma 

EAH‐AAA 

strong chlorotic flecking 

197 

Luwero 

Kisansa 

EAH‐AAA 

mild

 yellow flecking 

198 

Luwero 

Kisansa 

EAH‐AAA 

mild

 flecking 

199 

Kam

uli 

Mpologoma 

EAH‐AAA 

mild

 chlorotic streaking 

200 

Kam

uli 

Mpologoma 

EAH‐AAA 

mild

 chlorotic flecks 

201 

Kam

uli 

Mpologoma 

EAH‐AAA 

mild

 chlorotic flecks 

202 

Kam

uli 

Mpologoma 

EAH‐AAA 

mild

 chlorotic flecks 

203 

Kam

uli 

Malila 

EAH‐AAA 

strong chlorotic streaking 

204 

Kam

uli 

Enzirabushera 

EAH‐AAA 

strong chlorotic streaking 

205 

Jinja 

Mbazirume 

EAH‐AAA 

strong chlorotic streaking 

206 

Jinja 

Ntinka 

EAH‐AAA 

strong chlorotic streaking 

207 

Mbale 

Nam

unga 

EAH‐AAA 

mild

 yellow‐green

 flecks 

208 

Mbale 

Embululu 

EAH‐AAA 

mild

 yellow flecks 

 

31 

209 

Mbale 

Embululu 

EAH‐AAA 

strong chlorotic /necrotic flecks 

210 

Mbale 

Dihakho 

EAH‐AAA 

strong chlorosis, some necrosis 

211 

Mbale 

unknown 

EAH‐AAA 

moderate streaking 

212 

Mbale 

unknown 

EAH‐AAA 

very m

ild flecking 

213 

Manafwa 

Mbwazirume 

EAH‐AAA 

chlorotic flecking 

214 

Manafwa 

Embululu 

EAH‐AAA 

yellow blotches 

215 

Manafwa 

Murrumbidgee 

EAH‐AAA 

no sym

ptoms 

216 

Bududa 

Pisang ceylan

 AAB 

chlorosis, necrosis 

217 

Bududa 

Pisang ceylan

 AAB 

yellow/green

 chlorosis 

218 

Bududa 

Khyebusi 

EAH‐AAA 

mild

 flecking 

219 

Bududa 

Lisitalo 

EAH‐AAA 

mild

 yellow flecking 

220 

Manafa 

Kulone 

EAH‐AAA 

severe chlorosis 

221 

Manafa 

Mulure 

EAH‐AAA 

yellow blotches 

222 

Manafa 

Embululu 

EAH‐AAA 

mild

 yellow flecking 

223 

Manafa 

Embululu 

EAH‐AAA 

yellow flecks, necrosis 

224 

Manafa 

Gros Michel (Bogoya) 

AAA 

chlorotic flecking 

225 

Manafa 

Embululu 

EAH‐AAA 

strong flecking 

226 

Sironko

 Mulure 

EAH‐AAA 

chlorotic/necrotic streaks 

227 

Sironko

 Lusindalo 

EAH‐AAA 

chlorotic streaks 

228 

Sironko

 Em

bululu 

EAH‐AAA 

chlorotic streaks 

229 

Sironko

 Giant Caven

dish 

AAA 

chlorotic streaks 

230 

Sironko

 Kayinja (Pisang aw

ak) 

ABB 

chlorotic/necrotic streaks 

231 

Kapuchorw

a Mpologoma 

EAH‐AAA 

chlorotic/necrotic streaks 

232 

Kapuchorw

a Gros Michel (Bogoya) 

AAA 

chlorotic streaks 

 

32 

Table 3.2: Primer seq

uen

ces used for PCR testing 

 

Target 

BSV

 Primer nam

e Annealing

temp. (°C) 

Sequence (5'‐3') 

Product length 

(bp) 

Region of genome 

amplified 

Reference 

BSM

yV 

Mys‐F1 

57 

TAAAAGCACAGCTC

AGAACAAACC

589 

6481–7069 

Geering et al. 

(2000) 

Mys‐R1 (c) 

CTC

CGTG

ATTTCTTCGTG

GTC

BSG

FV 

GF‐F1 

64 

ACGAACTA

TCACGACTTGTTCAAGC

476 

6354–6829 

GF‐R1 (c) 

TCGGTG

GAATA

GTC

CTG

AGTC

TTC

BSCAV 

Cav‐F1 

57 

AGGATTGGATG

TGAAGTTTG

AGC

782 

6425–7207 

Cav‐R1 (c) 

ACCAATA

ATG

CAAGGGACGC

BSO

LV 

RD‐F1 

57 

ATC

TGAAGGTG

TGTTGATC

AATG

C522 

6499–7020 

RD‐R1 (c) 

GCTC

ACTC

CGCATC

TTATCAGTC

BSIMV 

B107seq1 

50 

GCTA

GGAAGAAAAGTCTG

GG

475 

7417–122 

James et al. 

(2011b) 

B109seq11 (c) 

TGCAAGTCTA

CTTACACAGC

BSU

AV 

B105seq2 

60 

CTC

AGCGGCAAGATTAGGAAGG

517 

6513–7029 

B105seq15 (c) 

TCCCCATTGGTC

GTC

ATTGC

BSU

IV 

B89seq2 

50 

GAATC

CTC

AAAGGTA

CCCC

619 

435–1053 

B89seq10 (c) 

CATG

AGGTCAAGCATA

TGC

BSU

LV 

B113seq16 

60 

GAACTG

ACAGTA

GCGCAATC

G943 

6282–7224 

B113seq17 (c) 

GACTTGGCTTGCCTG

AGTA

TCG

BSU

M 

B94seq3 

50 

GACGAGCTG

CAAGCTC

TCAGG

467 

973–1439 

B93seq5 (c) 

TGTG

CCTA

TTCTG

AGGTTGG

Musa 

actin 

ActinDNAf 

50 

CTG

GTG

ATG

GTG

TGAGCCAC

664 

  ActinDNAr  (c) 

CATG

AAATA

GCTG

CGAAACG

(c) den

otes primers that anneals to the complementary strand.

 

33 

where a consistent, novel RFLP was observed, representative samples were 

selected for cloning and sequencing.  

3.2.4 Cloning and sequence analysis 

PCR/RCA  products  were  extracted  from  agarose  gels  as  previously 

described  (section 2.2.6). A 4.5 µl aliquot of gel‐purified PCR product was 

ligated  into  pGEM®‐T  Easy  vector  (Promega)  at  4  °C  overnight  as 

recommended by  the manufacturer. RCA  fragments were  ligated  into 3 µl 

of  appropriately  digested  (section  2.2.4),  alkaline  phosphatase‐treated 

pUC19 (section 2.2.7), using 0.5 U T4 DNA ligase (Promega) and 10× ligation 

buffer in 20 µl volumes, and incubated at 4 °C overnight. Ligation reactions 

were  transformed  into  competent Escherichia coli as described  in  section 

2.2.9  and  plasmid  DNA  was  isolated  (section  2.2.10)  and  subsequently 

restriction digested (section 2.2.4),  to confirm the presence of the desired 

insert. 

DNA sequencing was carried out as described  in section 2.2.11.  In 

the  case  of  PCR  amplicons,  three  samples  which  tested  positive  for  a 

specific  BSV were  cloned  and  sequenced  to  confirm  amplification  of  the 

expected virus. For each sample (PCR or RCA derived), inserts from at least 

three  independent  clones  were  sequenced.  For  PCR  products,  universal 

m13  primers  were  used  to  sequence  plasmid  inserts,  whereas  for  RCA 

products  either  universal  primers  or  the  degenerate  badnavirus  primers 

(Badna‐FP/RP;  Yang  et  al.,  2003) which  anneal  in  the  RT/RNaseH‐coding 

region were used.  

Sequences  were  analysed  using  the  Vector  NTI  Advance  suite 

v.10.3.0  (Invitrogen  Corp.).  ContigExpress  was  used  to  trim  vector 

sequences  and  assemble  sequences  from  clones  of  each  sample.  The 

identity of cloned  fragments was determined by comparison  to published 

sequence  information  in  National  Centre  for  Biotechnology  Information 

database  (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)  using  the  Basic  local  alignment 

 

34 

search  tool  (BLAST)  programs.  For  RCA  fragments,  classification  of 

sequences  as  BSV  species was  based  on  sequence  comparisons  using  a 

region of  the RT/RNaseH‐coding  region, delimited by either  the Badna‐FP 

or  Badna‐RP  primers  (Yang  et  al.,  2003)  where  possible.  Badnavirus 

sequence  differences within  the  RT/RNaseH‐coding  region  of more  than 

20%  are  considered  to  be  distinct Badnavirus  species  (King  et  al.,  2011), 

and this was used for identification by matches to published sequences. In 

samples where the sequence obtained was outside the RT/RNaseH‐coding 

region,  identification  was  made  by  sequence  identity  to  published  full‐

length BSV sequences where similarity was greater than 80%. In the case of 

PCR products, the sequences were compared against the specific region of 

the BSV genome that PCR primers were known to amplify (Table 3.2).  

   

 

35 

3.3 Results 

3.3.1 Sample collection 

Leaf  samples were collected  from 45 plants  from nine districts  in Eastern 

Uganda during February, 2010 (Table 3.1, Figure 3.1). Of the 45 samples, 44 

were  recorded as  showing  some  symptoms associated with BSV  infection 

such as chlorotic and necrotic flecks or yellow blotches, while one sample 

was asymptomatic (Figure 3.2). Symptom expression ranged from very mild 

flecking to strong chlorotic and necrotic flecking. Of the 45 samples, three 

samples  were  from  triploid  cultivars  derived  of  both  A‐  and  B‐genome 

origin,  specifically  AAB  (samples  216  and  217)  and  ABB  (230) while  the 

remainder were triploid cultivars of pure A‐genome origin (AAA). 

3.3.2 PCR results 

Using primers specific for nine BSV species (BSCAV, BSGFV, BSIMV, BSMYV, 

BSOLV,  BSUAV,  BSUIV,  BSULV  and  BSUMV),  38  of  the  45  samples  tested 

positive  for one or more BSV  (Table 3.3). The extraction control actin PCR 

test  was  positive  for  all  samples.  Of  the  38  PCR  positive  samples,  five 

samples  (189, 219, 224, 230  and 231)  tested positive  for more  than one 

BSV species. Sample 230 (ABB genome) tested positive for all four BSV with 

known integrated counterparts, while dual infections were detected in the 

other four samples (all of which had A‐only genomes). Seven samples (195, 

196,  200,  204,  215,  218  and  227)  did  not  test  positive  despite  only  one 

sample (215) originating from symptomless leaves. 

PCR  screening  for BSMYV  resulted  in  three positive  samples  (216, 

217  and  230),  all  of  which  have  a  B‐genome  component.  BSOLV  was 

detected  in  five  samples  (188, 189, 190, 219 and 230), while BSGFV was 

detected  in one  sample  (230)  and BSIMV was detected  in  three  samples 

(219,  230  and  231).  These  four  BSV,  all  with  a  known  integrated 

counterpart, were  all  found  in  sample  230, which  has  an ABB  genotype, 

however  the  remaining   samples  in  which  these  viruses  were  detected 

 

36 

 

Figure 3.1: Districts  in eastern Uganda where  leaf samples were collected:(A) Luweero, (B) Kamuli, (C) Jinja, (D) Mbale, (E) Manafwa, (F) Manafa, (G)Bududa, (H) Sironko and (I) Kapchorwa.  

 

37 

   Figure 3.2: Symptoms in leaf samples collected

 in eastern Uganda. (a) Sam

ple 205 displayed m

ild chlorotic flecks, (b) sample 215 w

assymptomless, (c) sam

ple 221 displayed yellow blotches and (d) sample 226 displayed chlorotic and necrotic flecks.

a) 

b)

c) 

d)

 

38 

Table 3.3: A

nalysis of leaf samples for BSV

 by PCR and seq

uen

cing  

 Sample 

number 

PCR results 

Sequence ID

 

BSCAV 

BSG

FV 

BSIMV 

BSM

YV 

BSO

LV 

BSU

AV 

BSU

IV 

BSU

LV 

BSU

MV 

Species 

% identity 

188 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

+ ‐ 

‐ ‐ 

‐ BSO

LV 

98% 

189 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

+ ‐ 

+ ‐ 

‐ BSO

LV 

BSU

IV 

95% 

95% 

190 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

+ ‐ 

‐ ‐ 

‐ BSO

LV 

91% 

191 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

+ BSU

MV 

91% 

192 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ BSU

LV 

94% 

193 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ BSU

LV 

94% 

194 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ BSU

LV 

88% 

195 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐  

 196 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐  

 197 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐  

 198 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐  

 199 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐  

 200 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐  

 201 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐  

 202 

  ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

+ ‐ 

  

203 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐  

 204 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐  

 205 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐  

 206 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐  

 207 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

+ ‐ 

‐ BSU

IV 

94% 

208 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐ BSU

AV 

91% 

209 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐ BSU

AV 

93% 

 

39 

Sample 

number 

PCR results 

Sequence ID

 

BSCAV 

BSG

FV 

BSIMV 

BSM

YV 

BSO

LV 

BSU

AV 

BSU

IV 

BSU

LV 

BSU

MV 

Species 

% identity 

210 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐  

 211 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐ BSU

AV 

86% 

212 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐ BSU

AV 

88% 

213 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐  

 214 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐  

 215 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐  

 216 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐  

 217 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐  

 218 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐  

 219 

‐ ‐ 

+ ‐ 

+ ‐ 

‐ ‐ 

‐ BSIMV 

100% 

220 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐  

 221 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐  

 222 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐  

 223 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐  

 224 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

+ ‐ 

‐ BSU

IV 

95% 

225 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐  

 226 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐  

 227 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐  

 228 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐ ‐ 

‐  

 229 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ + 

‐  

 230 

‐ + 

+ + 

+ ‐ 

‐ ‐ 

‐  

 231 

‐ ‐ 

+ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

+ BSIMV 

BSU

MV 

98% 

98% 

232 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

‐ ‐ 

+ BSU

MV 

91% 

Total 

0 

1 

3 

3 

5 

15 

3 

12 

3 

    

 

40 

contain  only A‐genomes.  Four  BSVs were  only  detected  in  samples  from 

cultivars with AAA genotypes. BSUIV was detected  in  three samples  (189, 

207 and 224), as was BSUMV  (191, 231 and 232). BSUAV was detected  in 

15 samples  (203,  208–214,  220–225  and  228)  and  BSULV  in  12  samples 

(192–194, 197–199, 201, 202, 205, 206, 226 and 229). The remaining BSV 

species, BSCAV, was not detected in any of the leaf samples tested. 

To  confirm  the  specific  detection  of  each  BSV  using  PCR,  the 

amplicons  from  selected  samples  were  cloned  and  sequenced.  PCR 

amplicons from samples positive for BSMYV and BSGFV were not cloned, as 

these two BSV were only detected  in cultivars which contain a B‐genome. 

For the remaining six BSV species detected using PCR, three to four samples 

were  sequenced  (Table  3.3).  BLASTN  searches  performed  using  the 

sequences from each PCR product confirmed the specific detection of each 

BSV,  with  a  sequence  identity  of  greater  than  86%  to  the  reference 

sequence in all cases (Table 3.3). 

3.3.3 RCA results 

Of the 45 samples analysed, 40 samples were considered positive for BSV 

infection  using  RCA  (Table  3.4).  In  total,  25  of  these  40  samples  were 

analysed by cloning and sequencing of RCA products. BLAST searches of the 

sequences resulted  in a sequence  identity of at  least 91%  for all samples, 

except  those  in which BSULV was  identified,  for which  sequence  identity 

was  in the order of 82–92% (Table 3.4).  Interestingly, all cloned fragments 

matched significantly (i.e. >80%) to a published BSV sequence.  

Five  samples  (200,  215,  218,  228  and  230) were  considered  RCA 

negative  due  to  the  absence  of  restriction  fragments  following  digestion 

with  PstI,  StuI,  EcoRI,  XbaI,  BamHI,  HindIII,  SacI  and  SalI.  Of  these  five 

samples,  one  sample  (215)  was  from  an  asymptomatic  plant  with  the 

remaining  four  samples  derived  from  leaves  showing  characteristic  BSV 

symptoms.  Samples  200,  215  and  218  also  tested  negative  for  nine  BSV

 

41 

Table 3.4: A

nalysis of leaf samples for BSV

 by RCA and RFLP/sequen

cing 

 

Sample 

number 

RE digest pattern (kb

p) 

Fragments sequenced 

RFLP 

match to

sample 

Sequence ID

 

StuI 

PstI 

RE used 

Ban

d lengths

(kbp) 

Species

% 

identity 

StuI 

PstI 

188 

FLa , 6, 5, 4.2, 3.1, 2.5, 1.8, 1.6 

4.5, 3, 3×

2.5 

 + 

4.5 

3 

2.5 

 BSU

MV

 BSO

LV 

94% 

92% 

98% 

189 

‐ FL, 5, 2.5 

 + 

5 

 BSO

LV 

96% 

190 

FL, 6, 5, 4.2, 3.9, 3.1, 2.9, 2.5, 2.4, 1.8, 1.6, 

1.5 

4.5, 3, 3×

2.5 

  

 188 

BSU

MV

BSO

LV 

 

191 

6.5, 4.5, 2.5,1.7 

‐ + 

 2.5 

 BSU

MV

93% 

192 

‐ 6 

  

 193 

BSU

LV 

 193 

‐ 6 

 + 

6 

 BSU

LV 

89% 

194 

FL, 5

 FL 

  

  

N/A

b 

 195 

FL, 3

 FL 

 + 

FL 

 BSU

LV 

83% 

196 

FL 

FL 

  

  

N/A

  

197 

FL, 5

 FL 

  

  

N/A

  

198 

FL 

6 

  

 193 

BSU

LV 

 199 

FL 

6 

  

 193 

BSU

LV 

 200 

‐ ‐ 

  

  

  

201 

3, 2.5, 2

 6, 5, 2.8, 1.8 

 + 

6 

 BSU

LV 

92% 

202 

‐ 6, 2.8, 1.2 

 + 

6 

 BSU

LV 

89% 

203 

FL 

‐ + 

 FL 

 BSU

AV 

94% 

 

42 

Sample 

number 

RE digest pattern (kb

p) 

Fragments sequenced 

RFLP 

match to

sample 

Sequence ID

 

StuI 

PstI 

RE used 

Ban

d lengths

(kbp) 

Species 

% 

identity 

StuI 

PstI 

204 

6, 2

 FL 

 + 

FL 

 –c

 205 

FL 

‐  

  

 N/A

  

206 

FL 

FL, 5

  

+ FL 

 BSU

LV 

87% 

207 

FL 

4, 3.5 

  

  

N/A

  

208 

FL 

4.5, 3

 + 

 FL 

 BSU

AV 

93% 

209 

FL 

2×

3 

 + 

3 3 

 BSU

AV 

91% 

93% 

210 

FL 

2×

3 

  

 209 

BSU

AV 

 

211 

5.2, 2.4, 

FL 

 + 

FL 

 BSU

AV 

94% 

212 

5, 2.4 

FL 

  

 213 

BSU

AV 

 213 

5, 2.4 

FL 

+  

5 

 BSU

AV 

94% 

214 

5, 2.4 

FL 

  

 213 

BSU

AV 

 215 

‐ ‐ 

  

  

  

216 

FL 

FL 

+  

FL 

 BSM

YV 

99% 

217 

FL 

FL 

+  

FL 

 BSM

YV 

98% 

218 

‐ ‐ 

  

  

  

219 

4.5, 2.5, 2, 1.2, 0.9 

FL, 5, 2.7 

 + 

FL 

 BSIMV 

98% 

220 

5, 2.4 

4.5, 3.2 

 + 

4.5 

3.2 

 BSU

AV 

96% 

93% 

221 

5, 2.4 

4.5, 3

  

+ 4.5 

 BSU

AV 

94% 

222 

5, 2.4 

FL 

  

 213 

BSU

AV 

 

 

43 

Sample 

number 

RE digest pattern (kb

p) 

Fragments sequenced 

RFLP 

match to

sample 

Sequence ID

 

StuI 

PstI 

RE used 

Ban

d lengths

(kbp) 

Species 

% 

identity 

StuI 

PstI 

223 

FL 

FL 

+  

FL 

 BSU

AV 

94% 

224 

5, 2.4 

FL 

  

 213 

BSU

AV 

 225 

5, 2.4 

FL 

 + 

FL 

 BSU

AV 

93% 

226 

FL 

7, 1

  

+ 7 

 BSU

LV 

92% 

227 

‐ 5, 2.7 

 + 

5 

 BSU

LV 

85% 

228 

‐ ‐ 

  

  

  

229 

FL 

FL 

 + 

FL 

 BSU

LV 

82% 

230 

‐ ‐ 

  

  

  

231 

6, 5, 2.4, 1

 FL, 4.5, 3.5 

  

 232 

BSU

MV

 232 

6, 2

 x 3, 1.5 

FL, 4.5, 3.5 

 + 

FL 

4.5 

3.5 

 BSU

MV

91% 

93% 

91% 

Identified

  

  

  

35 

   a 

FL represents single‐cut, full‐length BSV

 bands of 7.5–8

 kbp.  

b 

“N/A” indicates samples not analysed

 by BLAST or where RFLP m

atch were not possible. 

c Not virus DNA 

 

 

44 

species by PCR, while sample 230 (ABB genome) only tested positive for the 

four BSV species with known eBSVs and was  therefore  likely  to be a  false 

positive  due  to  amplification  of  integrated  sequences. Only  sample  228, 

which was PCR positive  for BSUAV, could be considered PCR positive and 

RCA negative. 

BSOLV was  identified  in  three  samples  (188, 189 and 190; all PCR 

positive for BSOLV). For samples 188 and 190,  identification was based on 

predicted RFLPs  from published BSV  sequences  (2635, 2442 and 2312 bp 

digested with PstI;  3111,  2436  and  1842 bp digested with  StuI)  and was 

confirmed by sequencing one of the 2.5 kbp BSOLV fragments created by 

PstI  digestion  from  sample  188.  Although  a  characteristic  RFLP was  not 

observed with  sample 189, BSOLV was  identified  in  this  sample  following 

sequencing of a 5 kbp PstI fragment, which showed 96% similarity to the 

published BSOLV sequence.  

BSIMV was only identified in one sample (219; also PCR positive for 

BSIMV) by  sequence analysis of a  full‐length PstI  fragment, while BSMYV 

was  only  identified  in  two  samples  (216  and  217;  also  PCR  positive  for 

BSMYV)  by  sequence  analysis  of  full‐length  StuI  fragments  from  both 

samples.  

BSUMV was identified in three samples (188, 191 and 232; 191 and 

232 were PCR positive for BSUMV) based on sequence analysis of 4.5 and 

a  3  kbp  PstI  fragments  for  sample  188,  a  2.5  kbp  StuI  fragment  for 

sample  191  and  FL,  4.5  and  3.5  kbp  PstI  fragments  for  sample  232. 

BSUMV was  also  suspected  in  two  others  (190  and  231)  based  on  RFLP 

matches (231 was PCR positive for BSUMV). Based on the presence of 4.5 

and  3  kbp  PstI  fragments  in  sample  190  (in  addition  to  BSOLV‐specific 

fragments  therein)  which  are  identical  to  the  two  BSUMV  fragments 

sequenced  in  sample  188,  in  addition  to  a  number  of  matching  StuI 

fragments  in  both  samples,  this  sample  probably  also  contains  BSUMV. 

 

45 

Similarly  the presence of FL, 4.5 and 3.5 kbp PstI  fragments  in  sample 

231,  confirmed by  sequencing  in  sample 232  to be BSUMV,  suggests  the 

presence of BSUMV in this sample.  

BSUAV was identified in nine samples (203, 208, 209, 211, 213, 220, 

221,  223  and  225;  all  of which were  PCR  positive  for  BSUAV)  based  on 

sequence analysis of the full‐length StuI fragments from samples 203, 208 

and 223,  the  two 3 kbp PstI  fragments  from  sample 209,  the  full‐length 

PstI fragment from 211, the 5 kbp StuI fragment from sample 213, the 4.5 

kbp and 3.2 kbp PstI fragments from sample 220, the 4.5 kbp PstI fragment 

from  sample  221  and  the  full‐length  PstI  fragment  for  sample  225.  

Additionally, BSUAV was  suspected  in  five  other  samples  (210,  212,  214, 

222 and 224; all of which were PCR positive  for BSUAV) based on RFLPs. 

Sample  210  possessed  identical  StuI/PstI  RFLPs  to  sample  209  while 

samples  212,  214,  222  and  224  displayed  identical  StuI/PstI  RFLPs  to 

samples 211 and 213. Of the 15 BSUAV PCR positive samples, only sample 

228 was not considered positive using RCA.  

BSULV was identified in eight samples (193, 195, 201, 202, 206, 226, 

227 and 229; all except 195 and 227 were PCR positive for BSULV) based on 

sequencing of PstI digest  fragments  (Table 3.4) and was also suspected  in 

three samples (192, 198 and 199; all of which were PCR positive) based on 

the presence of a 6 kbp PstI fragment which  is  identical to the fragment 

observed  in  samples 193, 201 and 202  (Table 3.4). All  sequences  showed 

more than 82% similarity to the published sequence. However,  in contrast 

to BLAST  sequence  analysis  to  all other BSVs,  samples 193, 202  and 206 

displayed a  large  insertion of 100–200 bp where  the  insertion  sequences 

matched no sequences  in GenBank when conducting a BlastN search.   Of 

the 12 BSULV PCR positive samples, three samples (194, 197 and 206) with 

full‐length  digest  fragments,  consistent  with  samples  confirmed  to  be 

infected with BSULV, were not analysed by cloning and sequencing.   

 

46 

In  the  remaining  samples  (194, 196, 197, 204, 205  and 207),  all of 

which were  considered  RCA  positive  for  BSV  infection,  either  full‐length 

digest  fragments  or  distinct  profiles  precluded  identification  based  on 

RFLPs. Cloning was either unsuccessful  in these samples or,  in the case of 

sample 204, the sequence obtained was not of badnavirus origin. 

   

 

47 

3.4 Discussion 

In this chapter, banana leaf samples from eastern Uganda were analysed to 

identify the BSV species present, and to potentially detect new species of 

BSV.  Eight  species  of  BSV  were  detected  by  PCR  using  species‐specific 

primers. BSCAV was not detected  in any of  the 45  samples, while BSGFV 

and BSMYV were only detected  in cultivars with a B‐genome component. 

BSULV and BSUAV were  the most prevalent BSV species detected with 15 

and  12  PCR  positive  samples  each,  respectively.  When  tested  by 

RCA/sequencing, six known species of BSV were  identified while no novel 

BSV sequences were identified. This is the first report of episomal detection 

of  these  six  species  from  eastern Uganda,  and  is  the  first  report  of  the 

detection of BSMYV in field samples from Uganda.  

Detection of BSV using RCA  relies on either detection of predicted 

RFLPs, or cloning and sequencing of RCA fragments. As demonstrated with 

samples  of  both  BSUAV  and  BSULV  studied  in  this  project,  a  reliance  on 

distinct RFLPS for  identification can be difficult due to sequence variability 

and  thus,  in  many  cases,  sequencing  is  necessary  for  definitive 

identification. The broad sequence diversity is further illustrated in samples 

where  RCA/sequencing  identified  a  BSV  species,  but  PCR  using  species‐

specific primer did not (e.g. BSUMV in samples 188 and 190). Whether the 

failure of PCR reflects sequence diversity  in the primer binding sites  is not 

certain, but users of PCR‐based diagnostics must be mindful of this. 

In  three  samples  (194,  197  and  206)  identified  as  BSULV,  an 

insertion  of  approximately  100–200  bp  was  found  which  showed  no 

homology  to  published  sequences.  This  finding  is  not  unexpected 

considering the highly variable nature of badnavirus genomes, particularly 

since  their  location was  outside  the  coding  regions.  These  three  isolates 

may represent a novel isolate and this warrants further investigation. 

 

48 

Several discrepancies were found when comparing the results from 

PCR  and  RCA  analyses.  In  two  cases,  a  PCR  product was  amplified  from 

samples  but  the  samples  were  considered  negative  by  RCA  due  to  the 

absence  of  restriction  fragments  with  a  suite  of  restriction  enzymes. 

Conversely,  in  six  samples  testing  positive  by  RCA,  PCR  either  didn’t 

generate an amplicon or a different BSV  species was detected. The exact 

reasons  for  this  are  not  known.  At  present,  the  sensitivity  of  RCA  as  a 

diagnostic method has not been demonstrated, particularly  in comparison 

to  PCR.  That  RCA  has  less  sensitivity  for  detection  of  low  levels  of  virus 

could help explain the  failure of RCA to detect all samples detected using 

PCR.  A  loss  of  restriction  sites  due  to  sequence  variability  is  another 

possibility, while  limited cloning/sequencing of samples could explain why 

PCR detections were not all confirmed in RCA analysis. On the other hand, 

three samples which were considered positive for BSV  infection using RCA 

were not PCR positive using any of  the nine primer  sets. The  reasons  for 

this  could  include  sequence  variability  affecting  primer  binding  or  the 

presence of novel BSV species for which primers are not available. 

Both  RCA  and  PCR  have  inherent  advantages  and  disadvantages. 

PCR  is  an  inexpensive,  robust,  highly  specific  and  sensitive  method  for 

detecting BSV, and  is suitable for diagnosing known BSV species for which 

primers have been made. However,  it  faces problems with the generation 

of false positives derived from sequences integrated in the Musa B‐genome 

and with detection of uncharacterised species. RCA on the other hand has 

the  advantages  of  being  able  to  target  a  broad  spectrum  of  viruses, 

independent  of  whether  the  sequence  is  known  beforehand.  RCA  has 

issues,  however, with  cost  and with  inconclusive  species  determination. 

RFLP profiles for characterised species of BSV found in Uganda, along with 

BSMYV,  have  been  made  by  James  et  al.  (2011a,  b).  Whereas  these 

previous  studies were  focussed on  the  characterisation of BSV  species  in 

Western Uganda, the present study focussed on BSV  isolates from Eastern 

 

49 

Uganda.  The  experience  from  the  present  work,  however,  is  that  the 

restriction profiles for some BSV species are quite variable, likely due to the 

hypervariable BSV genomic sequences. RCA  is therefore more suitable  for 

non‐specific  broad‐spectrum  detection  (a  simple  yes/no  assay)  and 

investigation of potential new species. 

One option  to  improve PCR‐based diagnostics  for BSV would be to 

develop primers capable of detecting episomal BSMYV, BSIMV, BSOLV and 

BSGFV  in  banana  cultivars with  a  B‐genome  component.  DNA  sequence 

information  is  now  available  for  the  loci where  endogenous  BSOLV  and 

BSGFV are present within the M. balbisiana genome (Geering et al., 2005a, 

b; Gayral et al., 2008), thus opening the possibility of designing PCR primers 

which do not detect the eBSV sequence, and thereby specifically detect the 

episomal forms of these BSV species.   Additionally, since  little  information 

exists on the sensitivity of RCA for detection of BSV infection, screening of a 

large number of infected plants by both PCR and RCA should be undertaken 

to assess/compare  the  reliability and  sensitivity of both methods  for BSV 

diagnosis. 

    

 

50 

   

 

51 

Chapter 4   

Development of episomal‐specific PCR assays for the detection of banana streak viruses with 

endogenous counterparts 

4.1 Introduction 

Banana streak virus (BSV) species are serologically and genomically 

variable (Lockhart and Jones, 2000b; Harper et al., 2002a) and this creates 

problems  for  the  development  of  reliable  diagnostic  tests.  Several  BSV 

species are known to have some or all of their genome integrated into the 

Musa balbisiana genome. Integrated DNA of three species, namely Banana 

streak OL virus (BSOLV), Banana streak GF virus (BSGFV) and Banana streak 

IM virus (BSIMV) have been shown to be activated under stress conditions 

to  cause  episomal  infection  (Harper  et  al.,  1999b; Ndowora  et  al.,  1999; 

Lheureux et al., 2003; Geering et al., 2005a, b; Gayral et al., 2008; Côte et 

al.,  2010;  Iskra‐Caruana,  2010). A  fourth  BSV  species,  Banana  streak MY 

virus, is known to have at least part of its sequence integrated into the M. 

balbisiana genome (Geering et al., 2005a, b), and there  is speculation this 

BSV  species  can  also  be  activated  from  integrated  sequences  to  cause 

infection. Although PCR primers for the detection of these four BSV species 

have been published  (Harper et al., 1999b; Geering et al., 2000;  James et 

al.,  2011b),  they  are  not  able  to  discriminate  between  episomal  and 

endogenous sequences present  in the M. balbisiana genome, and so their 

use can result in false positives by detecting eBSV. 

The development of a diagnostic method which can overcome  the 

dependence on antisera‐based approaches and is cost‐favourable for use in 

developing  countries  would  be  useful.  In  a  recent  study  (James,  2011) 

 

52 

comparing PCR and RCA for the detection of field isolates of BSV, PCR was 

demonstrated to be a suitable method for the detection of all characterised 

species in bananas with A only genomes. In contrast, in bananas with some 

B genome component, PCR was only suitable for detecting species without 

endogenous counterparts. DNA sequence  information  is now available  for 

the  loci where endogenous BSOLV  and BSGFV  are present within  the M. 

balbisiana  genome.  These  integrated  sequences  contain multiple  partial 

fragments  in  repeated  units  with  discontinuous  and  inverted  portions 

amongst banana genomic sequences at the integrated sites (Geering et al., 

2005a, b; Gayral et al., 2008). Based on the discontiguous nature of these 

integrated BSV sequences  it may be possible to design PCR primers which 

do  not  detect  the  eBSV  sequence,  and  thereby  specifically  detect  the 

episomal  form of BSV.  Therefore,  the objective of work described  in  this 

chapter was  to  attempt  to  develop  PCR‐based  diagnostic  assays  for  the 

specific  detection  of  episomal  DNA  for  BSV  species  with  integrated 

counterparts. 

   

 

53 

4.2 Methods 

4.2.1 Developing episomal‐specific primers for BSOLV and BSGFV  

BAC clone sequences of  the M. balbisiana genome which contain eBSOLV 

and eBSGFV are publicly available (GenBank accession numbers AF106946 

and AP009334 for eBSOLV, and AP009325 and AP009326 for eBSGFV). The 

published  eBSV  sequences were mapped  onto  published  episomal  virus 

sequences  of  BSOLV  and  BSGFV  (GenBank  accession  numbers  AJ002234 

and AY493509,  respectively)  using VectorNTI  suite  v.10.3.0,  and  analysed 

for potential primer sites which may specifically amplify episomal DNA of 

each  BSV.  Putative  primer  binding  sites were  assessed  visually  following 

mapping of the integrated DNA sequences onto the episomal form of each 

BSV  species.  By  comparing  the  annealing  sites  on  episomal  DNA  and 

binding  sites  on  the  sequence  from  the  integrated  locus,  primers  were 

selected which would  specifically amplify episomal DNA, or would  give a 

distinct product size difference when detecting the two templates.  

4.2.2 Developing episomal‐specific primers for BSMYV and BSIMV 

For  BSMYV  and  BSIMV,  sequences  of  the  respective  eBSV  in  the  M. 

balbisiana  genome  are  not  available.  Therefore,  a  selection  of  primers 

available  from  previous  studies  in  the  Centre  for  Tropical  Crops  and 

Biocommodities (CTCB), QUT (kindly provided by Dr Anthony James and Ms 

Bojana Bokan)  (Table 4.1) with annealing sites distributed across the virus 

genomes, were assessed  in different combinations. Primers were mapped 

to the full‐length BSMYV and BSIMV genomes (GenBank accession numbers 

AY805074 and HQ593112, respectively) to allow combinations of primers to 

be selected.  

 

 

54 

 

Table 4.1: Primers obtained from QUT for detection of BSIMV and BSMYV  Target virus  Primer name  Sequence (5'–3')  Reference 

BSIMV 

B107seq2  GTCCTTGAATCCTGCAATCC (c)

Anthony James, unpublished 

B108seq1  TTCCTCTGAAGCAATTATCC (c)

B108seq2  CCAGAACATACGTTATGCCB108seq3  CAATCCAGATTCTTCCTTC (c)B108seq4  GAATGCACCTGCCATCTTCCB108seq5  CTTGATGTCATTGAGTTCTTCC (c)B108seq6  CCAGCGGCAGTTACAATCCGB109seq1  CTTTGTTAACTCTGGATTCCB109seq2  ATGGAAGTAGTCATTGAGG (c)B109seq3  GAATTCATCATCATCTTCGAG (c)B109seq4  CCATCAAAGTCTTTGAGGACCCB109seq5  GCCCGATGAGCCAGTGAGC (c)B109seq6  GGCTTCCAGTACAACATCCB109seq7  CCAGAAGCTTCCTGTTCTGGB109seq8  CCCCAAGACAAGCTTACATB109seq9  ATGCAAGTCTACTTACACAGC (c)B109seq10  GTTCAAACATGAAGATTTCGGB109seq12  TGAAGGGGAAGATAACTACC

BSMYV 

Mys‐F3  GAAACTCCAAGATCAAGCTTCAGCC Anthony James, unpublished 

BSVIII_SalI_F_  GTCGACACAGGACCACTGCCATGATTGTTG

Bojana Bokan, unpublished 

BSVIII_SalI_R_  GTCGACTGGATGAGGGTCTGATCACTTTCA (c)

BSVIII_SphI_F_  GCATGCACCTACTATATCACCAGCCAGCCG

BSVIII_SphI_R_  GCATGCTCTGCATCTTTCGACAACTTTAGT (c)

BSVIII_BstXI_F_  CCATGGAAGTGGACCTAGCTGAAGGCAATC

BSVIII_BstXI_R_  CCACTTCCATGGCTGATATGATAGACCGAT (c)

BSV_ORF1_F GAATTC ATGGATACTTACTGGGATAAAACC

BSV_ORF1_R CTCGAG TCATCCAATAATAACTTTCTCCAG (c)

BSV_ORF2_F CTCGAG TCATTGTAGGGATCTTAGAATTTC

BSV_ORF2_R GAATTC ATGAGTCTAGCCAACACCAAGGCT (c)

BSV_ORF3_F CAATTG ATGACAACTCGAAGGTCCAGTCTA

BSV_ORF3_R CTCGAG CTAACCGGGATCTCCTCCGTCAGG (c)     

 (c)  denotes primers that anneals to complementary strands. 

 

55 

4.2.3 Plant samples and nucleic acid extraction 

Plant  samples  used  in  this  study  were  obtained  from  several  different 

sources:  

1. Leaf samples of bananas that had been collected during field surveys 

in Uganda  (Ug)  in 2010, and Kenya  (Ke)  in 2009 and comprised 65 

and 41 samples, respectively.  

2. A collection of 33 leaf samples from a wide range of banana cultivars 

maintained in tissue culture (TC) were obtained from the Maroochy 

Research  Station  of  the  Department  of  Employment,  Economic 

Development and Innovation (DEEDI), Queensland. 

3. Fifty‐two  nucleic  acid  extracts  prepared  from  leaf  samples  were 

obtained  from  the  Global  Musa  Genomics  Consortium  (GMGC; 

www.musagenomics.org). 

For  the  samples  collected  in Kenya  in 2009,  the 33  TC  samples obtained 

from DEEDI and 20 of the 65 samples from Uganda collected in 2010, DNA 

extracts (CTAB method) were already available and had been analysed for 

BSV  by  RCA  and  PCR  using  all  the  available  published  primer  sets  by 

Anthony James (CTCB, QUT). The remaining 45 leaf samples were collected 

from Uganda  in 2010 (Chapter 3). For the GMGC collection, samples were 

provided by CIRAD and a quality control PCR  for  the actin house‐keeping 

gene had been previously carried out (Anthony James, CTCB). 

4.2.4 PCR and RCA analysis 

Generally, PCR analysis was undertaken as described  in  section 2.2.2. For 

each  set  of  putative  episomal‐specific  primers  designed  for  BSOLV  and 

BSGFV,  the  annealing  temperature  was  optimised  by  a  gradient  PCR 

conducted  on  an  episomal  BSV‐positive  extract  using  an  annealing 

temperature range of 50 to 70 °C and an extension time of two min (BSOLV) 

or one minute  (BSGFV). Testing of BSOLV‐ and BSGFV‐specific primer sets 

 

56 

was  then  conducted by  screening  several  collections of plant  samples by 

PCR using the optimised parameters.  

As  an  initial  quick  screen  to  assess  the  suitability  of  BSMYV‐  and 

BSIMV‐specific primer  combinations,  four  samples were used. These  four 

samples  comprised  (i)  a  positive  control  sample  previously  shown  using 

RCA to be infected with the test BSV species (to test for episomal BSV); (ii) 

two  episomal  BSV‐negative  samples  from  cultivars with  some  B‐genome 

component shown to test positive for the respective eBSV using PCR with 

published primers and  (iii) a known BSV‐negative healthy sample  from an 

A‐only genome banana.  

For BSMYV, 20 primer combinations were tested while for BSIMV, 25 

primer combinations were tested. PCR was carried out using an annealing 

temperature  of  50  °C  and  extension  time  of  4  min  (BSMYV)  or  3  min 

(BSIMV). Following initial primer testing, potential episomal‐specific primer 

sets which amplified episomal BSMYV only were chosen and used to screen 

selected  samples  from  Ke2009,  Ug2010,  DEEDI  and  GMGC  sample 

collections using PCR with the annealing temperatures of 65 °C or 68 °C and 

an  extension  time  of  2  min.  Optimised  annealing  temperatures  were 

determined for the primer sets selected for BSMYV by gradient PCR, using 

an annealing temperature range of 50 to 70 °C with an extension time of 2 

min.  Further  testing  of  potential  episomal‐specific  BSIMV  primers  were 

undertaken using the conditions listed above. 

To screen for the presence of BSV, and as a comparison to detection 

with putative episomal‐specific primer sets, primers RD‐F1/R1, Mys‐F1/R1 

and  GF‐F1/R1,  which  specifically  detect  BSOLV,  BSMYV  and  BSGFV, 

respectively  (Table 4.2; Geering et al. 2000) were used  to  test  the GMGC 

sample  collection.  This  collection was  considered  to  be  free  of  episomal 

BSV due to the presumptive virus‐indexed status of the collection and also 

to  contain  accurate  data  on  sample  genotypes.  Primer  annealing

 

57 

Table 4.2: PCR conditions for published

 primers used for BSV

 and eBSV

 detection 

Target 

Primer 

nam

e 

Sequence (5'–3') 

Amplicon size 

on episomal 

target (bp) 

Region 

amplified 

(bp) 

Amplicon 

size on eBSV

 (bp) 

Annealing 

temperature 

(°C) 

Extension 

time 

Reference 

BSO

LV RD‐F1

ATCTG

AAGGTG

TGTTG

ATCAATG

C

522 

6499–7020 

522 

57 

30

s Geering et 

al. (2000) 

RD‐R1

GCTCACTCCGCATCTTATCAGTC

 (c)

eBSO

LVMusa T3‐2 

GGCTTATG

ATG

CTG

ACCACAT

 Not am

plified 

n/a 

1931 

50 

2min 

Lhereu

x et 

al. (2003) 

BSV

510 

TTCTCGACCATAAATTG

TAT (c) 

BSG

FV GF‐F1

ACGAACTA

TCACGACTTGTTCAAGC 

476 

6354–6829 

476 

64 

30

s 

Geering et 

al. (2000) 

GF‐R1

TCGGTG

GAATA

GTC

CTG

AGTC

TTC (c)

eBSG

FVVM1‐F 

TTG

TCCAAAATCTG

CTCGTG

 Not am

plified 

n/a 

481 

50 

(Côte et al., 

2010) 

VM1‐R 

TGTAATTCCTG

CTCCTG

CAA (c) 

BSM

YV

Mys‐F1 

TAAAAGCACAGCTC

AGAACAAACC 

589 

6481–7069 

589 

57 

30

s Geering et 

al., (2000) 

Mys‐R1 

CTC

CGTG

ATTTC

TTCGTG

GTC

(c) 

BSIMV B107seq1 

GCTA

GGAAGAAAAGTC

TGGG 

475 

7417–122 

475 

50 

30

s James et al., 

(2011b) 

B109seq11 TG

CAAGTC

TACTTACACAGC (c) 

  

 (c) 

den

otes primers that anneals to complementary strands.

 

58 

temperatures and extension times  for these two primers sets are  listed  in 

Table 4.2. 

For  the  detection  of  eBSV  loci  in  plant  samples  primer  sets  that 

were designed to amplify the border region between the integrated BSOLV 

and BSGFV  and banana  chromosomal DNA  (Ndowora,  1998;  Lheureux  et 

al., 2003; Côte et al., 2010) were used. PCR was conducted on the GMGC 

collection samples using annealing temperatures and extension times listed 

in Table 4.2. 

RCA  was  conducted  on  the  nucleic  acid  samples  obtained  from 

GMGC to screen for the presence of episomal BSV. RCA was undertaken as 

described in section 2.2.3, with RCA products digested using StuI.  

PCR and RCA reactions were analysed by agarose gel electrophoresis 

as described in section 2.2.5. 

 

 

59 

4.3 Results 

4.3.1 Identification of potential episomal‐specific primers  

4.3.1.1 BSOLV and BSGFV 

A  comparison  of  eBSOLV  and  eBSGFV  sequences  with  their  respective 

episomal  sequences  (Figure 4.1  and  Figure 4.2)  allowed  several potential 

episomal DNA‐specific primer sets to be identified (Table 4.3).  

For BSOLV, two primer sets were designed to amplify  fragments of 

1489  and  1249  bp  from  an  episomal  template.  The  sense‐strand  primer 

annealing sites were chosen at 5240–5261 and 5480–5503 bp for BSOLV‐F3 

and  ‐F2,  respectively. The anti‐sense primer annealing site was  located at 

6705–6728 for BSOLV‐R2. 

For BSGFV, a single primer set was designed which was predicted to 

amplify  a  729  bp  fragment  from  episomal  BSGFV  DNA. When  designing 

primers  for BSGFV,  the  sense primer annealing  site was  chosen at 6075–

6096 bp while  the anti‐sense primer annealing  site was  located at 6781–

6803 bp.  

4.3.1.2 BSMYV and BSIMV 

Because  the published sequence of  integrated BSMYV and BSIMV are not 

publicly available, a more random approach was taken  for these two BSV. 

Primers which were previously available were obtained and mapped onto 

their  respective  BSV  episomal  genome  sequences  (Figure  4.3)  and  then 

combinations selected (Table 4.4). Combinations were made to ensure that 

all regions of the genome of both viruses were included in the assessment, 

with amplicons ranging from 925 to 3937 bp produced  in PCRs for BSMYV 

and ranging from 837 to 3144 bp for BSIMV (Table 4.4). 

 

60 

 

 

 

 

Figure  4.1:  (a) Map  of  the  integrated  regions  of  BSOLV.  The  integratedBSOLV  segments  are  illustrated by  green  arrows or  green  lines  for  smallfragments. (b) The integrated sequences were mapped onto the full‐lengthgenome. The primer sites are marked as blue lines. As illustrated in a), theydo not bind to a single continuous fragment but are  located on fragmentsthat are far apart on the M. balbisiana genome. Primers that anneal to thecomplementary strand are marked “(c)”. 

a) 

b) 

 

61 

 

  

  Figure  4.2:  (a) Map  of  the  integrated  regions  of  BSGFV.  The  integratedBSGFV  segments  are  illustrated  by  green  arrows  or  as  a  green  line  forsegment  #6.  (b)  The  integrated  sequences  were mapped  onto  the  full‐length genome. The primer sites are marked as blue lines. As illustrated ina),  they do not bind  to  a  single  continuous  fragment but  are  located onfragments  that  are  far  apart  on  the  M.  balbisiana  genome  and  bothprimers  bind  to  the  complementary  strand.  Primers  that  anneal  to  thecomplementary strand are marked “(c)”. 

a) 

b) 

 

62 

Table 4.3: Potential episomal D

NA‐specific primer seq

uen

ces identified

 for BSO

LV and BSG

FV 

Target 

virus 

Primer 

nam

e Sequence (5'–3') 

Amplicon size 

on episomal 

target (bp) 

Region 

amplified 

(bp) 

Amplicon size 

on eBSV

 (bp) 

Annealing 

temperature 

(°C) 

Extension 

time 

BSO

LV BSO

LV‐F2 

CAAGTA

GCAATG

GACCCAGAGTC

T 1249 

1489 

5480–6728 

5240–6728 

2412 

2898 

61 

57 

1 2 min 

min 

BSO

LV‐R2 CCCTG

TCAGGATTTC

TGGATG

TTC (c)

BSO

LV‐F3 

GTG

ATC

AGGCCTTCAAGCTC

AA 

BSG

FV BSG

FV‐F1 TC

TGTG

CTTATG

CAAGTG

GACG 

729 

6075–6803 

Not am

plified

60 

30 s 

BSG

FV‐R1 GAGGGTC

GTC

TATG

TCGGAGTTG (c)

  

 (c) den

otes primers that anneals to complemen

tary strands

 

63 

 

      

Figure  4.3: Genome of  (a) BSMYV  and  (b) BSIMV with primer  sequencesmapped. Primers that anneal to the complementary strand are denoted ‘c’. 

a) 

b) 

 

64 

 

Table 4.4: Primer combinations and results of initial screen for putative episomal‐specific primers for BSMYV and BSIMV detection 

     

PCR product 

length (bp) 

Primer selection PCR test results 

Primer set # 

Forward primer 

Reverse  primer 

Positive control 

B‐genome 

1a 

B‐genome 

2 

A‐genome

b 

BSMYV 1  BSV_ORF1_F  BSV_ORF2_R  925 ‐  ‐  ‐  ‐ 2  BSVIII_BstXI_R_  1486 +  ‐  ‐  ‐ 3  BSVIII_SphI_R_  3581 ‐  ‐  ‐  ‐ 4  BSV_ORF2_F  BSVIII_BstXI_R_  960 +  ‐  ‐  ‐ 5  BSVIII_SphI_R_  3050 ‐  ‐  ‐  ‐ 6  BSV_ORF3_F  BSVIII_SphI_R_  2655 ‐  ‐  ‐  ‐ 7  BSVIII_SalI_R_  3937 ‐  ‐  ‐  ‐ 8  BSVIII_BstXI_F_ BSVIII_SphI_R_  2102 +  ‐  ‐  ‐ 9  BSVIII_SalI_R_  3384 +  ‐  ‐  ‐ 10  BSVIII_SphI_F_  BSVIII_SalI_R_  1288 +  +  +  ‐ 11  BSV_ORF3_R  2961 +  ‐  ‐  ‐ 12  BSVIII_SalI_F_  BSV_ORF3_R  1679 +  ‐  ‐  ‐ 13  BSV_ORF1_R  3274 ‐  ‐  ‐  ‐ 14  Mys‐F1  BSV_ORF1_R  2220 ‐  ‐  ‐  ‐ 15  BSV_ORF2_R  2615 ‐  ‐  ‐  ‐ 16  BSVIII_BstXI_R_  3170  +  ‐  ‐  ‐ 17  Mys‐F3  BSV_ORF3_R  1139  +  ‐  ‐  ‐ 18  BSV_ORF1_R  2739  ‐  ‐  ‐  ‐ 19  BSV_ORF2_R  3134  +  ‐  ‐  ‐ 20  BSVIII_BstXI_R_  3689  +  ‐  ‐  ‐ 

BSIMV             1  B107seq1  B109seq5  2151  +  ‐  +  ‐ 2  B109seq1  B109seq5  1181  ‐  ‐  ‐  ‐ 3  B109seq1  B109seq3  1995  ‐  ‐  ‐  ‐ 4  B109seq7  B109seq5  964  ‐  ‐  ‐  ‐ 5  B109seq7  B109seq3  1778  ‐  ‐  ‐  ‐ 6  B109seq4  B109seq3  1111  +  ‐  +  ‐ 7  B109seq4  B109seq2  1927  +  ‐  +  ‐ 8  B109seq1  B109seq2  2811  ‐  ‐  ‐  ‐ 9  B109seq4  B108seq5  2899  +  ‐  +  ‐ 10  B109seq6  B108seq5  2112  ‐  ‐  ‐  ‐ 11  B109seq6  B108seq3  2677  ‐  ‐  ‐  ‐ 12  B109seq8  B108seq3  1828  +  ‐  +  ‐ 13  B109seq1  B108seq1  2686  ‐  ‐  ‐  ‐ 14  B109seq12  B108seq3  992  +  ‐  +  ‐ 15  B109seq12  B108seq1  1850  ‐  ‐  ‐  ‐ 16  B109seq12  B107seq2  2848  +  ‐  +  ‐ 17  B108seq2  B108seq1  837  ‐  ‐  ‐  ‐ 18  B108seq2  B107seq2  1835  ‐  ‐  ‐  ‐ 19  B108seq2  B109seq11  2827  ‐  ‐  ‐  ‐ 20  B108seq4  B107seq2  1048  +  ‐  +  ‐ 21  B108seq4  B109seq11  2039  +  ‐  +  ‐ 22  B108seq6  B109seq11  1428  +  ‐  +  ‐ 23  B108seq6  B109seq5  3144  +  ‐  +  ‐ 24  B107seq1  B109seq5  2151  +  ‐  +  ‐ 25  B107seq1  B109seq3  2990  ‐  ‐  ‐  ‐ 

a  ‘B‐genome 1’ and ‘B‐genome 2’ are samples from cultivars with some B‐genome component previously tested negative for the listed BSV by RCA and positive by PCR using published primers for the listed BSV. 

b   ‘A‐genome’ is a healthy banana cultivar with an A‐only genome. 

 

65 

4.3.2 Primer testing 

4.3.2.1 BSOLV 

PCR  annealing  temperatures were  initially  optimised  for  the  two  BSOLV 

primer  sets  (F2/R2  and  F3/R2)  using  gradient  PCR  on  a  known  episomal 

BSOLV‐infected  sample  as  template.  The  results  from  this  pilot  study 

showed  that  the optimal annealing  temperatures  for amplification of  the 

expected  size  amplicons  from  a  known  episomal  BSOLV  template  using 

primer pairs F2/R2 and F3/R2 were 61°C and 57°C, respectively (Table 4.3).  

Following  optimisation,  primers  BSOLV‐F2/R2 were  used  to  test  a 

total of 106 samples, derived from Ke2009 and Ug2010 survey collections, 

which had previously been tested for episomal BSV by RCA and for BSOLV 

by PCR using published primers RD‐F1/R1. Of these 106 samples, 17 were 

previously shown to be infected with episomal BSOLV using RCA (and all 17 

were also PCR positive using published primers RD‐F1/R1). When  the 106 

samples were tested using BSOLV‐F2/R2, the expected size product of 1.2 

kbp was amplified from 16 of the 17 samples previously shown to contain 

episomal  BSOLV  (with  only  sample Ug190  testing  negative).  Additionally, 

two  further samples, Ug230  (from a cultivar with an ABB genome), which 

had tested PCR positive using primers RD‐F1/R1, and Ug201 (from a cultivar 

of pure A‐genome origin), which had tested PCR negative using primers RD‐

F1/R1, were also positive using BSOLV‐F2/R2. Of the remaining 87 samples 

in  these  two  collections  (22  of  which  contained  some  B‐genome 

component), three samples (Ke156, Ke176 and Ug219, all from cultivars of 

pure A‐genome origin), which had previously tested BSOLV positive by PCR 

using primers RD‐F1/R1, tested negative by PCR using BSOLV‐F2/R2. These 

three  samples,  along  with  Ug201,  were  all  RCA  positive  for  badnavirus 

infection;  however,  BSOLV  was  not  confirmed  in  these  samples.  

Furthermore,  Ug230,  which  tested  positive  using  both  RD‐F1/R1  and 

BSOLV‐F2/R2, was negative by RCA. 

 

66 

To  further  assess  the  ability  of  primers  BSOLV‐F2/R2  for  specific 

detection of episomal BSOLV,  the primers were used  to screen  the DEEDI 

collection.  Previous  RCA  analysis  had  shown  that  sample  5  contained 

episomal BSOLV based on RFLP identification. Additionally, when the DEEDI 

collection was  screened  using  published  primers  RD‐F1/R1,  14  of  the  33 

samples  (all  from  cultivars  with  some  B‐genome  component),  including 

sample 5, tested positive for BSOLV. PCR screening of the DEEDI collection 

using BSOLV‐F2/R2 resulted  in  four positive samples  (5, 10, 12 and 26) all 

from cultivars with some B‐genome component, all of which were positive 

using primers RD‐F1/R1.  

The  second  potential  episomal‐specific  primer  set,  BSOLV  F3/R2, 

was  also  tested  for  their  ability  to detect BSOLV  infection by  screening  a 

subset of 20 samples (233–252) from the Ug2010 survey sample collection. 

For  these  20  samples,  primer  set BSOLV  F3/R2  gave  the  same  results  as 

primer set BSOLV F2/R2. Therefore, no further testing of BSOLV F3/R2 was 

undertaken. PCR screening resulted in nine positive samples (Ug2010: 237–

240, 242, 243, 245, 247 and 248), comprising two samples from cultivars of 

pure  A‐genome  and  seven  with  some  B‐genome  component.  All  nine 

samples were considered positive  for BSOLV when previously screened by 

RCA.  Of  the  remaining  11  samples  which  tested  negative  using  BSOLV 

F3/R2,  five  of  which  contain  some  B‐genome  component,  none  were 

previously considered positive for episomal BSOLV using RCA.  

PCR screening of the DEEDI samples using BSOLV F3/R2 resulted  in 

the same four positive samples as primers BSOLV F2/R2, only one of which 

was considered positive when screened by RCA.  

4.3.2.2 BSGFV 

PCR annealing temperatures were  initially optimised for the BSGFV 

primer set (BSGFV‐F1/R1) using gradient PCR on a known episomal BSGFV‐

infected sample as template. The results from this pilot study showed that 

 

67 

the optimal annealing temperatures for amplification of the expected 729 

bp amplicons from a known episomal BSGFV template was 60°C (Table 4.3). 

Following  optimisation,  primers  BSGFV‐F1/R1 were  used  to  test  a 

total of 106 samples, derived from Ke2009 and Ug2010 survey collections, 

which had previously been tested for episomal BSV by RCA and for BSGFV 

by  PCR  using  published  primers  GF‐F1/R1.  Of  these  106  samples,  13 

samples were known to be infected with episomal BSGFV using RCA (and all 

13 were also PCR positive using the published primers GF‐F1/R1). When the 

106 samples were tested using the newly developed primers BSGFV‐F1/R1, 

the  expected  size  product  of  700  bp was  amplified  from  all  of  the  13 

samples previously  shown  to  contain episomal BSGFV  (Ke2009: 146, 148, 

176,  180  and  181;  Ug2010:  239,  240,  242,  244,  246–248  and  250). 

Interestingly,  a  700  bp  product was  also  amplified  from  two  additional 

samples  (Ug243  and  251,  also  positive  using  primers  GF‐F1/R1)  from 

cultivars with  some B‐genome  component. When previously  screened by 

RCA,  sample  243  had  been  considered  positive  for  badnavirus  (although 

BSGFV had not been  identified) while sample 251 had tested negative  for 

badnavirus. Of  the  remaining  91  samples  previously  tested  in  these  two 

collections, 22 of which contained some B‐genome component, none were 

found  to contain episomal BSGFV using primers BSGFV‐F1/R1. The  strong 

correlation between  the  results obtained using primers BSGFV‐F1/R1 and 

those  obtained  using  RCA  suggested  that  primers  BSGFV‐F1/R1  were 

promising candidates for PCR‐based detection of episomal BSGFV.  

To  further  test  the  ability  of  primers  BSGFV‐F1/R1  to  specifically 

detect episomal BSGFV, the primers were used to test the DEEDI collection. 

Previous RCA analysis had shown that none of these 33 samples contained 

episomal  BSGFV,  although  15  samples  (all  from  cultivars  with  some  B‐

genome  component)  had  tested  PCR  positive  for  BSGFV  using  published 

primers  GF‐F1/R1  suggesting  the  presence  of  eBSGFV.   When  these  33 

samples  were  tested  using  primers  BSGFV‐F1/R1,  all  samples  tested 

 

68 

negative,  consistent  with  previous  work  using  RCA  and,  in  contrast  to 

screening with published primers GF‐F1/R1, no episomal BSGFV was found. 

This  result  further  demonstrated  the  ability  of  primers  BSGFV‐F1/R1  to 

avoid detection of eBSGFV in B‐genome banana cultivars.  

4.3.2.3 BSMYV  

PCR was undertaken with 20 BSMYV‐specific primer combinations to assess 

their  ability  to  specifically  detect  episomal  BSMYV  (Table  4.4).  For  initial 

screening,  four  DNA  extracts  were  selected  which  included  one  known 

BSMYV‐infected Cavendish (AAA‐genome),  two from banana cultivars with 

some B‐genome  component  (Ug239 and Ug240) which were negative  for 

episomal BSMYV but positive for eBSMYV and one from a healthy banana 

cultivar  with  an  A‐only  genome  (Ug236).  Importantly,  the  sample 

containing  BSMYV,  as  well  as  samples  Ug239  and  Ug240  containing 

eBSMYV,  all  tested  positive  using  the  previously  published  BSMYV 

diagnostic primers Mys‐F1/R1. 

Of the 20 primer sets selected, 11 of these (numbered 2, 4, 8, 9, 10, 

11, 12, 16, 17, 19 and 20; Table 4.4) amplified the expected product from 

the  known  episomal  BSMYV‐infected  sample. Of  these  11,  however,  one 

primer set (number 10) also amplified the expected size product from the 

two  samples, Ug239  and Ug240, which  contained  eBSMYV.  No  products 

were amplified  from any of  the  samples using  the  remaining nine primer 

sets  (Table  4.4).  Primer  sets  12  and  17 were  selected  for  further  testing 

based on the amplification of strong bands of a relatively small size (1703 

bp and 1109 bp,  respectively). To  further optimise  these primer  sets,  the 

primers were used  to  test  two  known  episomal BSMYV positive  samples 

(Ke149  and  Ug249),  as well  as  two  RCA‐negative  samples with  some  B‐

genome component (Ug239 and 240). Whereas primer set 17 amplified the 

expected 1.1 kbp amplicon  in all  four samples,  the use of primer set 12 

resulted in the amplification of the expected 1.7 kbp amplicon only in the 

 

69 

two episomal BSMYV‐positive samples, although a weak amplicon of 600 

bp was present in sample 239.   

Based on  the promising  results obtained using primer  set 12,  this 

set  of  primers  was  subsequently  used  to  screen  41  samples  from  the 

Ke2009  survey  sample  collection.  Of  these  41  samples,  eight  were 

previously  shown  to  be  infected  with  episomal  BSMYV  using  RCA. 

Additionally, all eight RCA positive samples were PCR positive when tested 

with  published  primers  Mys‐F1/R1.  PCR  screening  using  primer  set  12 

resulted  in  seven  positive  samples  (Ke149,  150,  173,  175,  176,  182  and 

184),  all  of  which  were  previously  shown  to  be  infected  with  episomal 

BSMYV  using  RCA. Of  the  remaining  34  samples  (11  from  cultivars with 

some B‐genome component), none were considered positive when tested 

with primer set 12. The 600 bp band previously observed in the two RCA‐

negative  samples  from  cultivars  of  some  B‐genome  component was  not 

detected in any of the samples. 

4.3.2.4 BSIMV 

The method for assessing the specificity of primers for detecting episomal 

BSIMV was  essentially  the  same  as  for  BSMYV.  For  initial  screening,  25 

BSIMV‐specific  primer  combinations were  tested  for  potential  episomal‐

specificity  on  four  DNA  extracts  including  one  known  episomal  BSIMV‐

infected,  two  from  banana  cultivars  with  some  B‐genome  component 

(Ug241 and Ug244) which were negative  for episomal BSIMV but positive 

for eBSIMV and one from a healthy banana cultivar with an A‐only genome 

(Ug236). Samples Ug236, 241 and 244 were all shown to test positive using 

the previously published BSIMV diagnostic primers (Table 4.2).  

Of the 25 primer sets selected, 12 of these (numbered 1, 6, 7, 9, 12, 

14, 16, 20, 21, 22, 23 and 24) amplified the expected products (Table 4.4) 

from the known episomal BSIMV‐infected sample. However, all of these 12 

primer  sets  also  amplified  the  same  sized products  from Ug241, but not 

 

70 

Ug244, both of which were known to be negative for episomal BSIMV but 

positive  for  eBSIMV.    None  of  the  remaining  13  primer  sets  amplified 

products from any samples (Table 4.4). Based on these results, none of the 

25  primers  sets  were  considered  specific  for  the  detection  of  episomal 

BSIMV.  

To  further  investigate  the  reasons  for  the  amplification  of  the 

products produced  from  sample Ug241  and not Ug244 by  the 12 primer 

sets listed above, four of the primer sets (1, 6, 14 and 20) were chosen for 

further analysis. The primer sets were selected based on either intensity of 

amplicon (set 1), small size of amplicons (set 6) or both these criteria (sets 

14 and 20), and also because they amplified different regions on the BSIMV 

genome.  All  four  primer  sets were  used  to  screen  10  samples  from  the 

DEEDI collection (DEEDI: 4, 5, 10, 12, 13, 16, 23, 27, 28 and 31), all of which 

were  derived  from  cultivars with  some  B‐genome  component  and were 

considered negative for BSIMV when tested previously by RCA and/or PCR. 

Amplicons of the expected size were detected  in eight, 10, nine and six of 

the  10  samples  using  primer  sets  1,  6,  14  and  20,  respectively.  The 

detection of the expected product  in samples previously demonstrated to 

be  negative  by  RCA  was  highly  suggestive  of  non‐specific  amplification, 

possibly of eBSIMV, using these four primer combinations. As such further 

testing was discontinued. 

4.3.3 Final primer assessment using the GMGC collection 

To further assess the ability of the putative episomal‐specific primer 

pairs BSOLV‐F2/R2, BSGFV‐F1/R1 and BSMYV set 12, all three primer pairs 

were used to screen the GMGC collection. This collection was chosen as  it 

was believed to include a virus‐indexed, true‐to‐type collection comprising 

a  broad  genetic  base  of Musa  germplasm.  As  such,  it was  expected  to 

provide a reliable sample set with which to assess the episomal‐specificity 

of the primers. 

 

71 

When the 52 samples from the GMGC collection were screened by 

PCR using primers BSGFV‐F1/R1, 11 positive  samples  (GMGC: 1–4, 9, 10, 

27, 32, 34, 45 and 46) comprising one sample (32) from a cultivar of pure A‐

genome  and  ten  with  some  B‐genome  component,  were  PCR  positive. 

Using  primer  set  BSOLV‐F2/R2,  three  positive  samples  (12,  18  and  20; 

Figure  4.4a)  were  detected,  all  of  which  contained  some  B‐genome 

component. Using primer  set  12  for BSMYV detection,  the  expected  size 

1.7 kbp amplicon was generated in 21 samples (GMGC: 1–5, 9–12, 17, 18, 

20,  21,  34,  36,  39–41,  45,  46  and  48),  all  of which  possessed  some  B‐

genome  component.  The  large  number  of  positive  samples  was 

unexpected, as  this collection was considered  to be  free of episomal BSV 

infection.  

In order to clarify the episomal virus status of the GMGC collection, 

a  subset  of  samples  was  tested  using  RCA.  The  ten  B‐genome  samples 

which were PCR positive using BSGFV‐F1/R1 as well as  the  three samples 

which were PCR positive using BSOLV‐F2/R2, were RCA‐amplified and  the 

reactions digested using StuI to detect episomal BSV DNA. Of the 10 BSGFV 

PCR‐positive samples tested, four (2, 3, 34 and 45) produced digest profiles 

indicative of BSGFV  infection  (6034 and 1229 bp), while the remaining six 

samples did not produce any digest products. Of the three samples which 

tested positive using BSOLV‐F2/R2, no positive identification of BSOLV could 

be made using RCA, based on known RFLPs  for  this virus. However, clear 

bands of approximately 3 kbp in samples 12 and 18 and 5 kbp in sample 20, 

along with  several  smaller bands  in  these  samples were detected, which 

could indicate that BSV infection associated with a distinct RFLP profile may 

be  present.  This  finding  indicates  that,  although  the  GMGC  sample 

collection was originally believed to be free of episomal BSV infection, this 

was  clearly  not  the  case.  Therefore,  the  detection  of many  PCR  positive 

samples using the primers developed  in this study could be considered to 

 

72 

Figure 4.4: Screen

ing of the GMGC collection using (a) the episomal specific primer sets, BSO

LV F2–R

2, and (b) the published

 primer sets,

RD‐F1–F2. “M” den

otes marker lanes, “+” is positive control and “NTC

” is a negative template control. 

 

73 

be a reflection of episomal BSV  infection  in some samples, despite not all 

testing positive for episomal BSV in this instance.  

As  a  comparison  to  the  results  obtained  using  the  putative 

episomal‐specific  primers,  published  primers  for  the  detection  of  BSOLV, 

BSGFV and BSMYV, which detect both episomal and eBSV sequences, were 

used  to  screen  the 52  samples  in  the GMGC  collection. Using primer  set 

RD‐F1/R1  (for detection of BSOLV), a  total of 30  samples  (1–5, 9–13, 15, 

17–21, 23, 27, 28, 30, 36, 39–41 and 43–48) tested positive  (Figure 4.4b), 

comprising five samples from A‐only genotype cultivars (13, 15, 19, 43 and 

44),  24  samples  from  cultivars  with  some  B‐genome  component  and 

sample 30 with an AS genotype. However,  the positive A‐genome cultivar 

samples  produced  weak  amplicons  compared  to  samples  with  some  B‐

genome  component.  These  primers,  not  intentionally  designed  to  avoid 

amplifying eBSOLV, thus amplified 24 out of the 26 samples from cultivars 

having some B‐genome component in this collection. In contrast, only three 

of these 24 B‐genome samples were amplified using the primer sets BSOLV‐

F2/R2 (12, 18 and 20).  

Using primer  set GF‐F1/R1  (for detection of BSGFV),  a  total of 28 

samples (1–5, 9–13, 18, 20, 21, 23, 27, 28, 30, 32, 34, 36, 39–41 and 43–47) 

tested  positive,  comprising  four  samples  from  A‐only  genotype  cultivars 

(13,  32,  43  and  44),  23  samples  from  cultivars  with  some  B‐genome 

component  and  again  sample  30  with  an  AS  genotype.  However,  the 

positive A‐only cultivar samples again displayed weak amplicons compared 

to  samples with  some B‐genome  component.  In  contrast, 11 of  these 28 

positive samples were positive when tested using primer set BSGFV‐F1/R2, 

including sample 32 with a AAA genome.  

Using primer set Mys‐F1/R1 (for detection of BSMYV), a total of 27 

samples (1–5, 9–13, 17–21, 23, 27, 28, 34, 36, 39–41, 44–46 and 48) tested 

positive, comprising three samples  from A‐only genotype cultivars  (13, 19 

 

74 

and 44) and 24  samples  from  cultivars with  some B‐genome  component. 

However,  the  positive  A‐only  cultivar  samples  again  displayed  weak 

amplicons  compared  to  samples  with  some  B‐genome  component.  In 

comparison,  21  samples  from  cultivars with  some  B‐genome  component 

were  amplified  using  the  putative  episomal‐specific  primer  set  12,  all  of 

which were positive using Mys‐F1/R1.  

As  these  three  published  primer  sets  were  not  designed  to  be 

selective between episomal and integrated BSV sequences, it was expected 

that all samples which contain a B‐genome could test positive for BSV using 

these primer sets, as a result of amplification of eBSV sequences. However, 

the  detection  of  BSV  in  A‐only  genome  samples  was  of  concern.  Since 

activation of BSV from eBSV sequences is only known to occur in B‐genome 

banana cultivars, the detection of BSV in A‐only genome samples using the 

published primers, but not using the putative episomal‐specific primer sets 

developed  herein,  suggested  that  the  newly  designed  primers were  not 

detecting episomal infection in some samples.  

To further resolve this issue, primer sets were obtained which were 

specific  to  the  integrated  loci of both BSGFV  and BSOLV  and  these were 

also used to test the 52 samples in the GMGC collection. The occurrence of 

positive results in DNA samples using these primer sets should be indicative 

of the presence of B‐genome DNA, as eBSV loci are only known to occur in 

bananas which contain  some B‐genome component. PCR was carried out 

using  two  published  primer  sets  specific  to  the  junction  of  eBSV/Musa 

genomic sequences of the integrated loci of eBSOLV and eBSGFV. 

PCR  screening  using  the  eBSOLV‐specific  primer  set,  Musa‐T3‐

2/BSV510,  resulted  in  a  total  of  28  positive  samples,  comprising  four 

samples (6, 7, 13 and 19) of A‐only genomes and 24 samples from cultivars 

with some B‐genome component (1–5, 9–12, 17, 18, 20, 21, 23, 27, 34, 36, 

39–41,  and  45–48).  The  amplicons  produced  from  the  A‐only  genome 

samples were very faint, while the eBSOLV primer set failed to amplify two 

 

75 

B‐genome samples (28 and 31). This result suggested that Musa B‐genome 

DNA was  present  in  at  least  four  samples  considered  to  contain  A‐only 

genome DNA, while in two samples either B‐genome DNA was not present, 

or these distinct cultivars do not contain eBSOLV.  

PCR  screening  of  the  GMGC  collection  using  the  eBSGFV‐specific 

primer  set,  VM1‐F/R,  also  resulted  in  a  total  of  28  positive  samples, 

comprising three samples of A‐only genomes  (33, 43 and 44), 24 samples 

from cultivars with some B‐genome component (1–5, 9–12, 18, 20, 21, 23, 

27,  28,  34,  36,  39–41,  and  45–48),  and  sample  30  (AS‐genome).  The 

amplicons  for  the A‐genome  cultivars were  again  very  faint.  The eBSGFV 

primer set failed to amplify two B‐genome samples (17 and 31), and in one 

sample  (48),  a  distinct  fragment  of  approximately  1.2  kbp was  amplified 

instead of the expected 481 bp amplicon. Consistent with previous findings 

using primers  for eBSOLV, PCR using primers  for eBSGFV  indicated that B‐

genome DNA was  present  in  several  samples  considered  to  have  A‐only 

genomes, while several samples with B‐genomes were not positive. 

In  summary,  testing  of  the  GMGC  collection  using  primers which 

were  specific  for  eBSV  loci  indicated  that  the  true‐to‐type  status  of  this 

collection, which originally made this sample set attractive for screening for 

episomal BSV specificity, was not assured. Further, the demonstration that 

this  collection  contained  episomal  BSV  in  several  samples  tested 

confounded efforts to make an accurate assessment of the specificity of the 

putative episomal‐specific primers developed in this study.  

   

 

76 

4.4 Discussion 

The  aim  of  this  chapter  was  to  design  primers  which  specifically 

amplify episomal virus DNA for the four BSV species which have integrated 

counterparts  within  the  M.  balbisiana  genome.  This  was  theoretically 

possible  because,  at  least  for  two  BSV  species  (BSOLV  and  BSGFV),  the 

endogenous  sequences  exist  as multiple  discontinuous  partial  fragments 

for which  BAC  clone  sequences were  available  (Geering  et  al.,  2005a,  b; 

Gayral et al., 2008). However,  for BSMYV and BSIMV,  information on  the 

structure of the integrated sequences was not available and primer design 

in this case was essentially random. 

BAC clone sequences of the integrated versions of BSOLV and BSGFV 

were mapped onto  the genomes of  their corresponding episomal viruses, 

and  potentially  episomal‐specific  primer  sets were  identified.  The  initial 

screening for BSOLV in previously‐indexed field samples using BSOLV‐F2/R2 

generated promising  results with 16 out of 17  samples known  to contain 

episomal BSOLV detected, and a  large number of B‐genome  samples not 

giving  rise  to  the expected PCR product. Several additional  samples were 

also  positive where  BSV  infection was  present  but  BSOLV  had  not  been 

confirmed by RCA analysis. Similar  results were obtained when  screening 

the DEEDI collection, with a known episomal BSOLV‐infected sample testing 

positive  and  the  majority  of  B‐genome  samples  not.  However,  the 

detection of a positive  result  in  several  samples  is of  interest as  this may 

indicate either episomal BSOLV infection in these samples, or the presence 

of an alternate, uncharacterised eBSOLV locus which amplified. If episomal 

BSOLV  is present,  then PCR using BSOLV‐F2/R2 may be more sensitive  for 

BSV detection than RCA. 

Similar promising  results were obtained when primer pair BSGFV‐

F1/R1 was used to test previously‐indexed field samples, with 13 out of 15 

PCR‐positive  samples  previously  identified  as  infected  with  episomal 

BSGFV.  Of  the  two  additional  field  samples  which  tested  positive,  one 

 

77 

sample was RCA positive, but a different BSV was  identified  (BSOLV), and 

one  sample  from  a  cultivar  of  some  B‐genome  component  was  RCA 

negative. Of the remaining 91 samples, none were previously shown to be 

positive  for episomal BSGFV. When the BSGFV‐F1/R1 primer set was used 

to  screen  the  DEEDI  collection  no  samples  tested  positive,  which  was 

consistent with previous work to detect episomal BSGFV using RCA. These 

results  indicated  some  success  in  avoiding  detection  of  eBSGFV  in  B‐

genome samples using  these primers, since both  the  field collections and 

DEEDI  collection  contained  a  range  of  banana  cultivars  with  some  B‐

genome component where no eBSGFV was detected.  

  Of an initial 20 primer combinations screened for BSMYV detection, 

11 appeared promising with BSMYV‐free B‐genome samples not amplified 

in  the  initial  test, despite amplification  in  the positive  control  sample. Of 

these,  two  primer  sets,  12  and  17,  which  seemed  the most  ideal  with 

respect to amplicon strength and size, were  investigated further. Since set 

17  was  subsequently  found  to  amplify  eBSMYV  in  the  following  PCR 

optimisation  step,  only  set  12 was  used  further  to  screen  field  samples. 

When  testing  the  Ke2009  collection  (41  samples),  seven  out  of  eight 

samples  with  episomal  BSMYV  were  detected  although  only  weak 

amplicons were  generated. While  the  primers  selected  showed  promise, 

further work would be required to give acceptable PCR‐based detection.  

  Initial  tests  using  the  available  BSIMV  primer  sets  resulted  in 

amplification from one of the two episomal BSIMV negative samples used 

as negative  controls,  implying amplification of eBSIMV. To  investigate  the 

possibility  that  the  positive  B‐genome  sample  could  prove  to  be  an 

exception,  10  BSIMV  RCA‐negative  samples  with  some  B‐genome 

component were used  to  test  four of  the 25 primer sets. The primer sets 

each amplified between six and ten of these samples which suggested that 

the  primers  were  not  suitable  for  discrimination  of  episomal  and 

endogenous BSIMV.  

 

78 

To  further  assess  the  episomal‐specificity  of  BSOLV,  BSGFV  and 

BSMYV primers, a reference collection (GMGC) of 52 banana samples from 

a  diverse  range  of  cultivars  (including  26  cultivars with  some  B‐genome 

component) was analysed. The high confidence  in cultivar  identification  in 

this sample set, along with the BSV‐indexed status, should have allowed a 

straightforward assessment of primer specificity for episomal targets. 

Using BSOLV F2/F3–R2, three of the 52 samples were positive (from 

cultivars  with  some  B‐genome  component)  while  all  remaining  samples 

tested negative. These  three  samples were  later  screened by RCA and all 

three  samples were  considered potentially BSV positive. Screening of  the 

GMGC  collection  using  BSGFV‐F1/R1  resulted  in  11  positive  samples  (10 

from  cultivars  of  some  B‐genome  component).  The  10  samples  from  B‐

genome cultivars were screened by RCA using a single  restriction enzyme 

and  four were considered BSGFV positive. These results were unexpected 

since all samples were presumed to be BSV free, as international collections 

are virus‐indexed. However, the maintenance of bananas as TC accessions 

can lead to the activation of eBSV sequences and episomal infections. With 

13 PCR positive samples from B‐genome cultivars it is not unreasonable to 

postulate that BSV infection in these samples arose from activation of eBSV. 

Although episomal BSV  infection was not confirmed  in all 14 PCR‐positive 

samples, only a single RCA reaction and digest were attempted and further 

work may identify episomal BSV in other samples.  

Twelve of the 13 GMGC samples screened using RCA were also PCR 

positive  for  BSMYV  using  primer  set  12.  None  of  these  12  samples 

produced  the  expected  approximately  full‐length  band  previously 

associated with a BSMYV infection in RCA analysis. While this could mean a 

loss of the StuI restriction site due to mutation of the BSMYV genome or a 

difference in sensitivity between RCA and PCR, it is also possible that these 

positive  results  using  primer  set  12 were  caused  by  the  amplification  of 

eBSMYV sequences. 

 

79 

The  detection  of  eBSV  sequences  in  A‐genome  samples  (using 

primers for eBSOLV and eBSGFV), as well as detection of BSV sequences in 

A‐genome  samples,  complicated  the  analysis.  The  presence  of  BSV 

sequences in A‐genome samples suggests that either (i) contamination with 

B‐genome cultivar’s DNA has occurred, (ii) previous virus indexing failed or 

(iii) cultivar identification should be called into question. These issues could 

be addressed by (i) obtaining samples from the same cultivars but from an 

alternative  source  and/or  (ii)  conduct  further  testing  using  the  putative 

eBSV‐specific primers to confirm their specificity. Further, the virus status of 

the source material should be independently validated.    

RCA  is a  relatively new diagnostic method  for badnavirus detection 

and  no  information  exists  on  its  sensitivity,  for  example  where  virus 

infection  is  at  a  low  concentration.  It must  therefore  be  considered  that 

PCR results  in RCA‐negative samples may reflect a difference  in sensitivity 

of  PCR  and  RCA  for  BSV  detection.  A  comprehensive  assessment  of  the 

sensitivity  of  RCA  compared  to  PCR  would  shed  light  on  this  aspect  of 

episomal  BSV  diagnosis.  Designing  PCR  primer  sets  that  can  distinguish 

between  integrated  and  episomal  BSV,  by  mapping  the  integrated 

sequences onto their episomal counterpart appears possible.  The potential 

existence of eBSVs of different  conformity  from  the published  sequences 

(for BSGFV and BSOLV) may be an issue and further genomic sequencing of 

Musa germplasm would shed light on this, as well as allow characterisation 

of the eBSMYV and eBSIMV loci. 

   

 

80 

   

 

81 

Chapter 5   

Development of an infectious clone of Banana streak MY virus 

5.1 Introduction 

An important issue faced by Australian‐based BSV researchers is the limited 

availability  of  diseased  plant material. While  BSV  is  widespread  in  East 

Africa,  the  disease  is  sporadic  in  Australia  due  largely  to  the 

implementation of strict quarantine and disease control programs. Further, 

due to the slow rate of transmission by the mealybug vector, the inability to 

mechanically transmit the virus (Jones and Lockhart, 1993; Kubiriba et al., 

2000;  Huang  and  Hartung,  2001)  and  difficulties  in  importing  diseased 

material due to quarantine restrictions, obtaining large numbers of infected 

plants  is time consuming and  laborious. The development of an  infectious 

BSV clone would overcome these difficulties. 

Successful development of infectious clones of the tungrovirus, Rice 

tungro bacilliform virus (RTBV), and the badnaviruses, Citrus yellow mosaic 

virus  (CYMV) and Sugarcane bacilliform  virus  (SCBV), have been  reported 

(Dasgupta et al., 1991; Bouhida et al., 1993; Huang and Hartung, 2001). The 

model  proposed  for  production  of  a  successful  infectious  clone  (for 

Badnavirus)  involves the expression (following entry to the plant cell) of a 

larger‐than‐unit‐length,  terminally  redundant  transcript  of  the  viral 

genomic DNA by host DNA‐dependent RNA polymerase, using  the cloned 

virus DNA as template. This greater‐than‐full‐length transcript  is produced 

during  normal  virus  infection  and  is  the  template  for  viral minus‐strand 

DNA  synthesis  using  the  virus‐encoded  replicase  protein  as  well  as  a 

polycistronic RNA for expression of the virus encoded proteins (Pfeiffer and 

Hohn,  1983;  Hohn  et  al.,  1985;  Temin,  1989;  Medberry  et  al.,  1990; 

 

82 

Dasgupta et al., 1991; Qu et al., 1991; Bouhida et al., 1993; Jacquot et al., 

1999). Delivery methods for the  infectious DNA molecule  into  intact plant 

cells  can  involve  particle  bombardment  or  Agrobacterium‐mediated 

transformation. 

  Researchers within the CTCB at QUT have recently developed rolling 

circle amplification  (RCA) as an assay  for the detection of a wide range of 

episomal BSV species  in  infected plants (James, 2011; James et al., 2011a, 

b). However, a regular supply of infected material is now required in order 

to  optimise  the  assay  and  allow  comparative  analyses  to  other  assay 

formats such as polymerase chain reaction (PCR). The research described in 

this chapter was aimed at developing an  infectious clone of a BSV species 

endemic  in Australia, namely Banana streak MY virus  (BSMYV),  to enable 

the  generation  of  large  numbers  of  infected  plants  for  use  in  future 

diagnostic assay optimisation and validation.  Further, since the badnavirus 

SCBV has been shown to infect banana (Bouhida et al. 1993), the ability of 

the BSV clone to infect sugarcane was also investigated.  

 

   

 

83 

5.2 Methods 

5.2.1 Preparation of the infectious clone 

The  strategy  for  the  construction  of  an  infectious  clone  of  BSMYV  was 

based  on  previously  reported  strategies  for  other  members  of  the 

Caulimoviridae  family,  with  minor  modifications.  This  strategy  utilises  a 

terminally  redundant cloned DNA molecule which contains  the  intergenic 

region (which possesses the regulatory sequences for genome expression) 

at both ends of the molecule. The terminally redundant virus sequence was 

amplified  in  two pieces by RCA, with  a  common  site  selected within  the 

coding portion of the genome allowing the two molecules to be joined with 

an uninterrupted reading frame. The two BSMYV fragments were amplified 

by  RCA  (Section  2.2.3)  using  gDNA  extracted  from  a  BSMYV‐infected 

banana  leaf  sample  (Section  2.2.1)  as  template.  Restriction  sites  for 

digesting the RCA‐amplified DNA were determined based on the published 

sequence  of  the  BSMYV  genome  (GenBank  No.  AY805074;  Figure  5.1). 

Following amplification, the products from the two reactions were double‐

digested  either with  XmaI  and  SalI  or with  SalI  and  StuI.  The  pOpt‐EBX 

vector (kindly supplied by Don Catchpoole) was chosen as the binary vector 

as  it  contains  suitable  restriction  sites  in  the multiple  cloning  site. Vector 

DNA was digested with XmaI and StuI as described in section 2.2.4, except 

that  the  digest was  incubated  overnight.  Following  digestion,  the  vector 

was analysed using agarose gel electrophoresis (section 2.2.5), gel‐purified 

(section 2.2.6) and de‐phosphorylated (section 2.2.7). 

  The two virus‐derived fragments were  ligated  into  linearised pOPT‐

EBX  vector  DNA  by mixing  pOpt‐EBX  DNA  (10  µl,  14  ng/µl),  linearised 

XmaI and SalI‐fragment DNA (23 µl, 6.9 ng/µl) and SalI and StuI‐fragment 

DNA  (13 µl, 6.4 ng/µl), 10×  ligation buffer  (6 µl), T4 DNA  ligase  (3 µl, 1 

U/µl, Promega) and adding distilled water  to a  total volume of 60 µl. The 

ligation mixture was incubated at 4 °C overnight. The reaction was  

 

84 

 

 

  

 Figure  5.1: Creation  of  the BSMYV  infectious  clone.  Two  fragments wereproduced  by  digestion  of  RCA‐amplified  BSMYV  DNA  (green).  Thesefragments were ligated together into the pOpt‐EBX binary vector, creating aterminally  redundant  BSMYV  insert  in  the  vector.  Functional  codingsequences  (CDS)  are  coloured  in orange, while  the  flanking,  inactive CDSfragments at each end of the insert are cross‐hatched. 

 

85 

transformed  into 300  μL of competent E. coli cells and    the    transformed  

cells  selected on LB with kanamycin (50 µg/ml; Section 2.2.9). Plasmid DNA 

was  isolated and screened  for the BSMYV  insert DNA using StuI and SmaI 

digestion (Sections 2.2.10 and 2.2.4). Additionally, to confirm the predicted 

ligation across the SalI site at position 5422 in the BSMYV genome, PCR was 

done  using  primers  BSVIII_Sph1_F  and  BSV_ORF3_R  (Table  4.1)  at  an 

annealing  temperature of 55  °C and an extension  time of 3 min. Selected 

clones were  sequenced across all  three  restriction  sites  to  confirm  insert 

presence  and  orientation,  and  (for  the  SalI  ligation  site)  to  confirm  the 

integrity  of  the  ORF3  reading  frame.  Sequencing  was  conducted  using 

primers  NPTII‐Int‐R  (5'‐GGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGG‐3')  over  the 

XmaI‐site,  RB  (5'‐GCTGCACTGAACGTCAGAAGC‐3')  over  the  StuI‐site  and 

Mys‐F2  (5'‐CAGGGGTATATCGGGGAAGAG‐3') over the SalI‐site as described 

in section 2.2.11. 

After  confirming  the  integrity of  the  infectious  clone  in pOPT‐EBX, 

the cloned DNA was transformed in Agrobacterium. Miniprep DNA (30 µl) 

was  precipitated  as  described  in  the mini‐preparation  protocol  (Section 

2.2.10) and dissolved  in deionised water (10 µl). The DNA was then added 

to  competent  Agrobacterium  tumefaciens  strain  AGL1  cells  (50  µl).  The 

mixture was transferred to a pre‐chilled electroporator cuvette (path length 

= 2 mm) (BioRad) and pulsed in an EC100 electroporator (Sigma‐Aldrich) at 

2.8 kV (14 kV/cm) for 5 ms then immediately suspended in 1 ml of SOC. The 

culture was  then  incubated  at 28  °C  for  approximately 2 h with  shaking. 

Transformed cells were selected on LB agar with kanamycin (50 µg/ml) and 

rifampicin  (25  µg/ml),  and  incubated  for  two  days  at  28  °C. One  colony 

from  each  plate  was  selected  and  incubated  in  1 ml  of  liquid  LB  with 

kanamycin (50 µg/ml) and rifampicin (25 µg/ml) at 28 °C for two days and 

plasmid  DNA  was  isolated  as  described  in  section  2.2.10.  As  described 

above, PCR was used  to  confirm  the presence of  the  recombinant vector 

 

86 

DNA (Section 2.2.2) using the primers Mys‐F2 and BSV_ORF3_R (Table 4.1) 

with an annealing temperature of 50 °C and an extension time of 2 min. 

5.2.2 Plant inoculation and assessment 

Banana  and  sugar  cane  plants  were  inoculated  using  recombinant 

Agrobacterium harbouring the cloned BSMYV DNA. Tissue cultured banana 

plants (cultivar Williams‐Cavendish) and setts from field grown sugar cane 

plants  (cultivar  Q155)  were  planted  in  premium  grade  potting  mix 

(Searles®, Australia) and grown to the 3rd–4th leaf stage. A mixed inoculum 

was  prepared  by  combining  three  individual  Agrobacterium  cultures 

(originating  from  three  distinct  colonies)  into  liquid  LB  (50  ml) 

supplemented with kanamycin (50 µg/ml) and rifampicin (25 µg/ml) which 

was  incubated  for  two  days  at  28  °C.  The  culture was  centrifuged  after 

incubation to precipitate cells, and the media was removed. The cell pellet 

was re‐suspended in MMA‐solution (10 ml; 10 mM MES, 10 mM MgCl2, 200 

µM acetosyringone) and  incubated at  room  temperature  for 2‐3 h before 

inoculation. The plants were inoculated by three methods: 

1. Corm  inoculation  –  200‐500  µl  of  inoculum was  injected  into  the 

corm of five banana plants. 

2. Leaf  infiltration  –  200‐500  µl  of  inoculum  were  pressed  into  the 

abaxial surface of the leaf using a 1 ml syringe on two banana plants. 

3. Small  needle‐pricks  (approximately  20)  were  made  along  the 

pseudostem  of  five  banana  plants  and  into  the  approximate 

meristematic  region  between  the  third  and  fourth  fully‐expanded 

leaves of four sugar cane plants, and 10‐15 µl of  inoculum  injected 

at each site. 

The plants were grown in a plant growth room at a temperature of 

28  °C,  a  relative  humidity  of  70%  and  illumination  at  350  µmol 

photons/(m2∙s) with a 16 h photoperiod. The plants were observed at 5 and 

 

87 

12  weeks  post‐inoculation,  and  leaf  samples  collected  12  weeks  post‐

inoculation and analysed by PCR and RCA. 

PCR  screening was  conducted  using  BSMYV‐specific  primers Mys‐

F1/R1  (Table  4.2)  as  described  in  section  2.2.2.  RCA  was  conducted  as 

described  in  section  2.2.3  and  reaction  products  were  digested  using 

SmaI/StuI as described in section 2.2.4. To test for the presence of residual 

A. tumefaciens, a PCR test was performed using the primers VCF‐AGL1 (5’–

GCCTTAAAATCATTTGTAGCGACTTCG–3’)  and  VCR‐AGL1  (5’–

TCATCGCTAGCTCAAACCTGCTTCTG–3’) as described in section 2.2.2 with an 

annealing temperature of 63 °C and extension time of 30 s. 

   

 

88 

5.3 Results 

5.3.1 Preparation of the infectious clone 

RCA‐amplified BSMYV DNA was digested in two separate reactions using (i) 

StuI/SalI  and  (ii)  XmaI/SalI  to  produce  fragments  of  6564  and  3247  bp, 

respectively.  The  fragments were  gel purified  and  ligated  into XmaI/StuI‐

digested  pOpt‐EBX  vector  DNA,  yielding  a  terminally  redundant  BSV 

fragment  of  9811  bp  (or 1.3  × BSMYV  genome)  in  the  binary  vector  (a 

total recombinant plasmid length of 18040 bp). Recombinant plasmid DNA 

was  subsequently  transformed  into  E.  coli  and  colonies  screened  for  the 

presence  of  both  inserts  by  restriction  analysis  using  StuI  and  SmaI  to 

produce  fragments of 5489 bp and 2161 bp  (Figure 5.2). The presence of 

the cloned inserts was verified by PCR amplification across the SalI ligation 

site  and  the  correct  alignment  confirmed  by  sequence  analysis  over  all 

three  ligation  sites.  DNA  from  three  colonies  confirmed  to  contain  the 

complete  terminally  redundant  BSV molecule was  then  transformed  into 

Agrobacterium tumefaciens strain AGL1 for plant infection studies. 

5.3.2 Plant inoculation and assessment 

Banana plants were  inoculated using  three different methods while sugar 

cane  plants  were  inoculated  using  the  needle‐prick method  only  (Table 

5.1).  None  of  the  three  uninoculated  banana  plants  developed  any 

symptoms  (Figure  5.3).  At  five  weeks  post‐inoculation,  two  out  of  five 

banana  plants  inoculated  using  the  corm‐injection method  showed mild 

leaf  streaking, while  the  remaining  banana  and  sugar  cane  plants were 

symptomless.  

At  12  weeks  post‐inoculation  (Table  5.1),  the  two  banana  plants 

inoculated using the leaf infiltration method remained free from symptoms 

of BSV  infection, although the  infiltrated  leaves were senescing and dying 

(Figure  5.4).  Three  of  the  five  needle  prick‐inoculated  banana  plants 

showed mild leaf streaking on the newest leaves, while one plant remained 

 

89 

 Figure  5.2:  Restriction  digest  of  plasmid  DNA  isolated  from  13  E.  colicolonies. Lanes 1, 5 and 8 show the presence of the predicted 5489 bp and2161  bp  inserts.  The  8  kbp  band  represents  the  pOpt‐EBX  vector.  “M”denotes molecular weight marker lanes.  

a) 

 

 

90 

Table 5.1: A

nalysis of inoculated plants 

 

Species 

Cultivar 

Inoculation 

method 

Plant no. 

Symptoms (12 weeks) 

Analysis 

BSM

YV 

(PCR) 

Agrobacterium 

(PCR) 

Bad

navirus 

(RCA) 

Musa 

 hybrid 

Cavendish  

(Williams) 

Corm

 injection 

1 

Strong leaf streaking, stunting 

+ ‐ 

+ 

2 

Wilted

/dying 

+ ‐ 

Failed 

3 

Strong leaf streaking, stunting 

+ ‐ 

+ 

4 

Strong leaf streaking, stunting 

+ ‐ 

+ 

5 

Strong leaf streaking, stunting 

+ ‐ 

+ 

Needle 

pricking 

1 

Weak leaf streaking 

+ ‐ 

+ 

2 

No sym

ptoms 

‐ ‐ 

‐ 

3 

Dead 

+ ‐ 

+ 

4 

Weak leaf streaking 

+ ‐ 

+ 

5 

Very weak leaf streaking 

+ ‐ 

+ 

Leaf 

infiltration 

1 

No sym

ptoms 

‐ ‐ 

‐ 

2 

No sym

ptoms 

‐ ‐ 

‐ 

Saccharum 

hybrid 

Q155 

Needle 

pricking 

1 

No sym

ptoms 

a (+)

a  ‐ 

‐ 

2 

No sym

ptoms 

(+) 

‐ ‐ 

3 

No sym

ptoms 

(+) 

‐ ‐ 

4 

No sym

ptoms 

‐ ‐ 

‐ 

 a Brackets indicates very weak band

 

91 

 

 Figure 5.3: (a) Healthy banana plant with (b) green leaves.  

 

92 

 

Figure 5.4: Banana plant at 12 weeks post leaf‐infiltration with the BSM

YV infectious clone showing no disease sym

ptoms. The infiltrated

leaf (circled) is sen

escing.

 

93 

symptomless and the remaining plant was dead (Figure 5.5). All of the five 

corm‐injected banana plants were smaller than the healthy control plants. 

Of  these  five plants,  four  showed  strong  leaf  streaking  symptoms  (Figure 

5.6),  while  the  remaining  plant  was  stunted  and  dying.  Of  the  four 

inoculated sugar cane plants, none showed any symptoms of BSV infection 

at 12 weeks post‐inoculation (Figure 5.7). 

At  12 weeks post‐inoculation,  a  leaf  sample was  taken  from  each 

inoculated plant and tested for the presence of BSV by PCR and RCA. A leaf 

sample was  also  taken  from  a  healthy  banana  plant  (Williams‐Cavendish 

cultivar) to use as a control  for PCR and RCA screening  (Figure 5.8). Using 

PCR, a band of  the size expected  for BSMYV  (589 bp) was amplified  from 

extracts  derived  from  all  seven  banana  displaying  typical BSV  symptoms. 

Further, the dead plant  inoculated using the needle prick method and one 

wilted/dying plant  inoculated by corm  injection also tested positive (Table 

5.1, Figure 5.8). When samples from the inoculated sugar cane plants were 

tested by PCR, very weak bands of the expected size were amplified from 

three  of  the  four  plants.  To  confirm  that  the  results  were  due  to  the 

presence of BSV and not due to residual A. tumefaciens, extracts were also 

tested for the presence of Agrobacterium by PCR. These were compared to 

a positive control using gDNA extracted from untransformed A. tumefaciens 

(strain AGL1) as template. While a band of the expected size (approximately 

800 bp) was amplified from the positive control, all plants tested negative, 

indicating it is unlikely that residual agrobacteria were present. 

Extracts from all plant samples were also tested by RCA to confirm 

the PCR results. Bands of the sizes expected for BSMYV (2159 bp and 5491 

bp) were obtained from extracts derived from all seven banana displaying 

typical BSV symptoms. Further, one dead plant inoculated using the needle 

prick  method,  also  tested  positive.  The  RCA  reaction  failed  for  the 

wilted/dying  plant  inoculated  by  corm  injection.  No  product  of  the 

 

94 

expected band sizes was obtained for the four inoculated sugar cane plants 

when tested by RCA (Figure 5.8). 

  Three symptomatic corm injected plants and the three symptomatic 

needle pricked plants, all shown to be BSMYV infected by PCR and RCA, were 

kept  in  the  growth  room  for  further  observation.  Seven  months  post‐

inoculation they all showed strong leaf streaking (Figures 5.9 & 5.10), with the 

three corm‐injected plants still expressing the strongest symptoms.  

 

95 

   

b) 

 Figure  5.5:  Needle‐prick  inoculated  banana  plant  at  12  weeks  postinoculation (a) showing mild leaf streaking on the newest leaves (b). 

a) 

b) 

 

96 

 

 

Figure 5.6: B

anana plant at 12 weeks post corm

 injection (a) showing strong leaf streaking on m

ost leaves (b). 

b) 

a) 

 

97 

 

 Figure 5.7: Sugar cane plant at 12 weeks post needle‐prick  inoculation (a).None of the leaves expressed any symptoms of disease (b).  

a)  b)

 

98 

 Figure 5.8: Screen

ing of inoculated banana and sugarcane plants for BSM

YV by PCR  (a) and RCA (b) . “M

” den

otes marker lanes, “H

S” is

sample from a healthy banana plant, “+” is positive control and “NTC

” is a negative template control.

 

99 

  

Figure 5.9: N

eedle‐prick inoculated banana plant seven m

onths post inoculation. The plant expressed

 clear leaf streaking symptoms. 

 

100 

 

 Figure 5.10: Corm

 injected

 banana plant seven m

onths post in

oculation. This plant expressed

 the strongest leaf streaking symptoms, and

was stunted compared to the non‐inoculated controls.

 

101 

5.4 Discussion 

In this chapter, an infectious clone of BSMYV was generated using an RCA‐ 

based cloning strategy. Unlike previously described strategies, which have 

necessitated the purification of virions in order to extract genomic DNA for 

manipulation, in this study the BSV genomic DNA was amplified using RCA 

prior to further manipulation thus avoiding the difficulties often associated 

with  virus  purification.  BSMYV  was  chosen  because  this  BSV  species  is 

endemic to Australia.  

  Since banana is not a natural host for A. tumefaciens (De Cleene and 

Ley, 1976; Escobar and Dandekar, 2003),  it was considered  that  the most 

aggressive Agrobacterium strain available would  increase the  likelihood of 

successful  infection. As such, Agrobacterium  tumefaciens strain AGL1 was 

used as  the host  strain  for plant  inoculation  in  this  study as  this  strain  is 

routinely used in our laboratory for banana transformation (Hoekema et al., 

1983, Lazo et al., 1991, Khanna et al., 2004). The infectivity of the putative 

infectious  clone  was  tested  on  both  banana  and  sugarcane.  The  AAA‐

genome Cavendish cultivar was chosen as the test banana cultivar because 

(i)  BSMYV  is  known  to  infect  this  cultivar  and  produce  characteristic 

symptoms (Geering et al., 2000) and (ii) the absence of integrated copies of 

the  BSMYV  genome  in  banana  cultivars  derived  from  Musa  acuminata 

facilitates the subsequent detection of BSMYV using PCR‐based testing. The 

infectivity  on  sugarcane was  also  examined  since  successful  infection  of 

banana by SCBV has been previously reported (Bouhida et al. 1993). 

Three different inoculation methods were used based on those used 

previously  for  other  members  of  Caulimoviridae.  The  corm  injection 

method  was  based  on  the method  described  by  Boulton  et  al.  (1989), 

which was used  for  successful  agroinoculation of  rice  and banana plants 

with  RTBV  (Dasgupta  et  al.  1991)  and  SCBV  (Bouhida  et  al.  1993), 

respectively.  The  needle  pricking  and  leaf  infiltration  methods  were 

 

102 

modified  from  the  stem  slash  and  needle  press  inoculation  methods 

described  in Huang  and Hartung  (2001)  for  successful  agroinoculation  of 

sweet orange with CYMV. 

Twelve  weeks  post‐inoculation,  four  of  the  five  banana  plants 

inoculated by corm injection expressed characteristic leaf streaking, as well 

as stunting, while one plant had almost died. The presence of BSMYV was 

confirmed in all five plants using PCR and these results were verified using 

RCA with the exception of one plant for which RCA failed. Four out of five 

needle‐prick  inoculated  bananas  showed  some  leaf  streaking  on  the 

newest  leaves  at  12  weeks  post‐inoculation  and  again  infection  was 

confirmed  in  the  symptomatic  plants.  Bananas  inoculated  using  leaf 

infiltration did not show symptoms of BSV infection.  

Of the three inoculation methods used, corm injection was the most 

effective with  a  100%  infection  rate. Banana  plants  inoculated  using  this 

method were  also  the  first plants  to express  symptoms of BSV  infection. 

Although  the  reason  for  the  high  infectivity  using  corm  injection  is 

unknown, the fact that the corm contains a large amount of rapidly dividing 

meristematic  tissue  which  is  conducive  to  viral  replication  is  a  possible 

explanation.  The  use  of  needle  prick  inoculation  was  also  reasonably 

efficient  with  four  out  of  five  inoculated  plants  becoming  infected. 

However, compared to corm‐inoculated plants, the symptoms were slower 

to develop and no stunting was observed. Due to the limited availability of 

plants, only two plants were  inoculated using the  leaf  infiltration method. 

Although leaf infiltration yielded no infection, the fact that only two plants 

were tested precludes any meaningful comparisons to be made. However, 

banana  leaves were difficult  to  infiltrate due  to  the brittleness of  the  leaf 

tissue which resulted in damage to the leaves and this may account for the 

lack of  infectivity. Given  the  results  from  this  study,  it  is  clear  that  corm 

injection was  the most  reliable approach  for  infecting banana plants, and 

this method is recommended when conducting further experiments.  

 

103 

For sugar cane, only a single inoculation method, needle pricking of 

the meristem, was  attempted  due  to  limited  availability  of  plants  at  the 

time  of  the  experiment.  No  disease  symptoms  were  observed  on  any 

sugarcane  plants  and  all  plants  tested  negative  for  BSMYV  by  RCA  at  12 

weeks post‐infection. However, very weak bands of  the  size expected  for 

BSMYV were amplified from three samples using PCR, suggesting very  low 

levels  of  infection with  BSMYV.  These  results  clearly  indicate  a  need  for 

further investigation. Previous work has demonstrated that, whereas noble 

sugar  canes  (Saccharum  officinarum)  can  show  symptoms  of  badnavirus 

infection  (eg.  SCBV)  commercial  hybrids  usually  do  not  (Lockhart  and 

Autrey, 2000). This might explain why symptoms were not observed on the 

commercial hybrid, Q155. The differences observed  in  the  results of PCR 

and RCA testing may simply reflect differences in the sensitivity of the two 

methods or might suggest non‐target amplification in PCR. Despite previous 

studies  demonstrating  badnavirus  transmission  across  species  (between 

sugar  cane  and  banana)  (Bouhida  et  al.,  1993;  Reichel  et  al.,  1997)  and 

recent  studies which  show  that  certain  species  of  SCBV  and  BSV  are  so 

closely related that they barely can be considered separate species (Muller 

et al.,  2011),  cross‐species  infection of plants  using BSMYV  could not be 

conclusively demonstrated in this study.  

  To establish greater knowledge on the efficiency of the  inoculation 

methods  and  propensity  for  infection,  a  range  of  different  banana  and 

sugarcane cultivars could be included in follow‐up studies. Further, electron 

microscopic  examination  of  sap  or  partially  purified  extracts  from 

inoculated plants is needed to demonstrate the presence of virions.  

In  summary,  this  study  demonstrates  that  agro‐inoculation  is  an 

effective  approach  for  delivery  of  an  infectious  clone  to  banana. 

Importantly,  this  method  now  provides  a  fast  and  efficient  means  of 

generating large numbers of BSV‐infected plants for comparative testing of 

RCA and PCR as diagnostic methods. 

 

104 

   

 

105 

 

Chapter 6 

General discussion and conclusions 

Banana  is  an  important  part  of  the  diet  for millions  of  people  in  Sub‐

Saharan Africa, in particular Kenya and Uganda (Jones, 2000; Karanja et al., 

2008). However, pests and diseases are an enormous constraint to banana 

production  in  these countries. The best  strategy  for preventing pests and 

diseases  of  banana  in  the  East  African  region  is  considered  to  be 

distribution of disease‐ and insect‐free planting material obtained by tissue 

culture (TC) techniques. However, TC faces  issues with viruses, which exist 

intracellularly and could, in cases where a virus infection are present in low 

concentrations, not be detected during TC. In theory, a single plant can be 

the progenitor to offspring in the millions using TC. Because viruses can be 

retained in plants during TC, infected plants can be accidentally distributed.  

Banana  streak  disease,  caused  by  BSV,  is  widespread  in  Kenya 

(Karanja et al., 2008) and Uganda  (Tushemereirwe et al., 1996; Harper et 

al., 2002a, 2004, 2005). Additionally, BSV species are a serious constraint to 

the  international distribution of Musa germplasm due  to poor diagnostic 

protocols and  the presence of  full‐length  integrated sequences which can 

become activated during TC  to cause episomal virus  infection. Diagnosing 

BSV  is  difficult  due  to  considerable  nucleotide  sequence  variability  in 

characterised  BSV  isolates  and  the  presence  of  endogenous  BSV  (eBSV) 

sequences present in the Musa genome. 

To  assess  the  appropriateness  and  reliability  of  PCR  and  RCA  as 

diagnostic  tests  for  BSV  detection,  45  field  samples  of  banana  collected 

from nine districts  in the Eastern region of Uganda  in February 2010 were 

tested using RCA and PCR. In total, 40 samples were considered positive for 

 

106 

BSV  infection  by  RCA  and  38  by  PCR, with  episomal  infection  of  six  BSV 

species  confirmed.  No  new  species  were  found  and,  based  on  partial 

sequences  found  in  Uganda  (Harper  et  al.  2004,  2005),  nine  previously 

reported  putative  BSV  species  were  not  detected.  Further  studies  on 

banana  in East Africa would help  confirm  the existence of  these putative 

BSV species.  Interestingly, Banana streak MY virus (BSMYV) was  identified 

in  two samples of  the cultivar Pisang ceylan  (AAB genome)  from Bududa. 

This  is an  important result as BSMYV has not previously been reported  in 

field samples from Uganda. 

When screening field samples for BSV infection, PCR proved to be a 

better method for detection of the known BSV species, as this assay format 

is highly specific to  its target sequence and therefore allows  identification 

of  the  BSV  species  without  further  work.  Constraints  for  PCR‐based 

diagnostics  remain  however, with  primers  not  available  for  putative  BSV 

species  which  have  not  been  fully  characterised,  and  because  of  the 

presence  of  four  endogenous  BSV  (eBSV)  in  the  Musa  B‐genome.  To 

address  the  constraints  of  eBSV,  PCR  primers  that  could  discriminate 

between  integrated  and  episomal  sequences  of  four  BSV  species  were 

investigated. Promising  results were obtained  for Banana  streak OL  virus 

(BSOLV) and Banana streak GF virus (BSGFV), with primer design based on 

the  known  sequence  of  eBSOLV  and  eBSGFV  sequences.  However,  for 

BSMYV and Banana streak IM virus (BSIMV), where primers were randomly 

selected, results were not as encouraging. Characterising  the eBSIMV and 

eBSMYV within the M. balbisiana genome may enable the design of primer 

sets specific to the episomal counterparts of these two BSVs. Additionally, 

further efforts to refine and optimise the use of putative episomal‐specific 

primers  for  detection  of  BSGFV  and  BSOLV would  assist  to  alleviate  the 

constraints to PCR created by eBSVs. 

In  contrast  to PCR, RCA proved  time‐consuming  and  laborious  for 

detection of BSV in field samples. RFLPs for a range of previously published 

 

107 

BSV  (James,  2011;  James  et  al.,  2011a,  b)  provided  little  aid  to  the 

characterisation of the BSV  isolates studied, as few samples yielded RFLPs 

which  were  previously  characterised.  Instead,  many  samples  had 

approximately  full‐length  restriction  fragments  or,  in  some  cases,  various 

different RFLPs for the same BSV species. In effect, the only way to identify 

the BSV  species  following RCA was  to clone and  sequence  the  restriction 

fragments.  This  time‐  and  labour‐intensive  process  makes  RCA  a  vastly 

more costly method for diagnosis in field samples compared to PCR, where 

specific identification of BSV species is the objective, despite needing to do 

many individual PCR assays for the known species of BSV. However, RCA still 

presents certain advantages over PCR  including the non‐sequence specific 

nature  of  amplification,  which  makes  it  suitable  for  detecting  and 

identifying  new  BSV  species  and  mutated  versions  of  known  BSVs. 

Additionally,  for  screening  of  field  collected  plant  material  for  future 

micropropagation  it would  be more  time  and  cost  effective  to  use  RCA 

because,  from  a  practical  perspective,  it  is  not  relevant  to  know  which 

species  of  BSV  infects  the  plant  material,  only  to  know  whether  it  is 

infected or not, so that infected plant material can be discarded.  

For  plants  in  TC  systems  that  have  been  screened  initially with  a 

non‐specific broad‐range assay such as RCA, PCR could still serve a purpose. 

Only four eBSV species are believed to cause episomal infection as a result 

of  activation  during  TC.  If  episomal‐specific  primer  sets  for  all  four  BSVs 

with an integrated counterpart were developed, PCR would provide a time 

and  cost  effective way  of  conducting  routine  screening  of  plant material 

prior  to  distribution  from  TC,  since  only  specific  detection  of  these  four 

species, which can be activated during TC, is warranted. 

While RCA has been demonstrated  to detect a wide  range of BSV 

species and to specifically detect the episomal form of BSV DNA in infected 

plants  (James,  2011;  James  et  al.,  2011a,  b),  this method  is  a  recently 

utilised assay  format and  there  is no published  information  regarding  the 

 

108 

sensitivity of RCA compared to other assay formats. Furthermore, a central 

issue  faced  by  researchers  in  Australia when  developing  and  optimising 

newly  developed  assays  (e.g.  RCA)  for  BSV  detection  is  the  limited 

availability of diseased plant material due  to  the  implementation of strict 

quarantine and disease control programs. Mealybugs are  the only known 

vector  for  BSV,  but  transmission  is  very  slow  (Jones  and  Lockhart,  1993; 

Kubiriba  et al.,  2000; Huang  and Hartung,  2001), which makes  obtaining 

large numbers of  infected plants  time  consuming  and  laborious.  Thus,  in 

order  to provide  a method  for  the  rapid production of  large numbers of 

BSV‐infected plants as a means to assist further research and optimisation 

on  diagnostic methods  for  BSV  detection,  an  infectious  clone  of  a  BSV 

species endemic in Australia, namely BSMYV, was successfully generated. 

Agro‐inoculation  of  the  corm was  found  to  be  the most  effective 

way  of  inoculating  banana  with  the  BSMYV  infectious  clone,  although 

needle‐prick  inoculation of the stem was also successful. These  initial test 

results  potentially  allow  for  the  effective  infection  of  a  wide  range  of 

banana  cultivars  for  further  studies on  the  sensitivity of new diagnostics 

assays  for  BSV  detection.  Importantly,  the  development  of  a  BSMYV 

infectious clone opens the possibility for using virus‐induced gene silencing 

(VIGS) as a tool for studying gene function in this important crop plant.  

VIGS  offers  an  attractive  and  quick  alternative  for  disrupting  the 

expression of a gene, without the need to genetically transform the plant 

(Baulcombe, 1999). Using VIGS, a recombinant virus carrying a sequence of 

a host gene is used to infect the plant. When the virus infects and spreads 

systemically  the  host  gene  is  expressed  by  the  infecting  virus.  The  host 

plant responds by degrading the expressed sequence (and  its endogenous 

counterpart) in a process termed post‐transcriptional gene silencing (PTGS) 

(Baulcombe,  1999).  The  result  of  PTGS  is  to  effectively  ‘silence’  the 

endogenous gene expression and so studies of gene function can be made 

by assessing  the  loss of  function as a  result of PTGS  (Ratcliff et al., 1997; 

 

109 

Schöb et al., 1997; Baulcombe, 1999; Liu et al., 2002; Verchot‐Lubicz, 2002; 

Zhang  et  al.,  2009;  Purkayastha  et  al.,  2010).  Successful  studies  utilising 

VIGS  have  been  conducted  using  Rice  tungro  bacilliform  virus  (RTBV) 

(Purkayastha  et  al.,  2010),  a  rice‐infecting  pararetrovirus  from  the  family 

Caulimoviridae,  demonstrating  the  general  utility  for  these  large  double‐

stranded DNA viruses for VIGS studies (Hay et al., 1991; Hull, 1996; King et 

al., 2011). 

In  conclusion,  the  outcome  of  this  project  has  been  the  further 

investigation of PCR‐ and RCA‐based diagnostic assays for BSV, with specific 

emphasis  on  the  development  of  PCR‐based  assays  that  can  distinguish 

between  episomal  and  integrated  BSV  sequences  for  BSVs  with  known 

eBSVs. These assays are  ideally suited  for application  in East Africa where 

the  rapid development of  the TC nursery  industry has generated concern 

over  the  multiplication  and  distribution  of  TC  material  which  has  not 

undergone virus  indexing. Combined with diagnostics  for other  important 

banana viruses,  such as Banana bunchy  top virus  (BBTV), BSV diagnostics 

will  improve  the  quality  of  TC material  which  is  distributed  to  farmers 

throughout this region. 

   

 

110 

 

111 

Bibliography 

Africa Harvest. 2009. http://africaharvest.org/ (accessed 19/05/2010). 

AfricanCrops.net. Background Information on Banana. http://www.africancrops.net/rockefeller/crops/banana/index.htm (accessed 18/04/2010). 

Bachou, H. 2002. The Nutrition Situation in Uganda. Nutrition 18 (4):356‐358.   

Bagamba, F, Karamura, E, Gold, CS, Barekye, A, Blomme, G, Tushemereirwe, WK and Tinzaara, W. 2003. Socioeconomic assessment of pest management practices in Lwengo sub‐country, Uganda. In Farmer‐participatory testing of integrated pest management options for sustainable banana production in Eastern Africa, edited by Blomme, G, Gold, C and Karamura, E: inibap. 

Baulcombe, DC. 1999. Fast forward genetics based on virus‐induced gene silencing. Current Opinion in Plant Biology 2:109‐113.   

Blanco, L, Bernad, A, Lazaro, JM, Martin, G, Garmendia, C and Salas, M. 1989. Highly efficient DNA synthesis by the phage phi 29 DNA polymerase. Symmetrical mode of DNA replication. Journal of Biological Chemistry 264 (15):8935‐8940. 

Boulton, MI, Buchholz, WG, Marks, MS, Markham, PG and Davies, JW. 1989. Specificity of Agrobacterium‐mediated delivery of maize streak virus DNA to members of the Graminae. Plant Molecular Biology 12:31‐40.   

Bouhida, M, Lockhart, BEL and Olszewski, NE. 1993. An analysis of the complete sequence of a sugarcane bacilliform virus genome infectious to banana and rice. Journal of General Virology 74:15‐22.   

Carlier, J, Fouré, E, Gauhl, F, Jones, DR, Lepoivre, P, Mourichon, X, Pasberg‐Gauhl, C and Romero, RA. 2000. Black leaf streak. In Diseases of Banana, Abacá and Enset, ed. Jones, DR: CAB International.   

Caruana, M and Galzi, S. 1998. Identification of uncharacterised filamentous viral particles on banana plants. Acta Horticulturae: International Symposium on Recent Advances in Banana Crop Protection for Sustainable Production and Improved Livelihoods 490:323‐336. 

 

 

 

112 

Côte, FX, Galzi, S, Folliot, M, Lamagnère, Y, Teycheney, P‐Y and Iskra‐Caruana, M‐L. 2010. Micropropagation by tissue culture triggers differential expression of infectious endogenous Banana streak virus sequences (eBSV) present in the B genome of natural and synthetic interspecific banana plantains. Molecular Plant Pathology 11 (1):137‐144.   

Dahal, G, Pasberg‐Gauhl, C, Gauhl, F, Thottappilly, G and Hughes, Jd’A. 1998. Studies on a Nigerian isolate of banana streak badnavirus: II. Effect of intraplant variation on virus accumulation and reliability of diagnosis by ELISA. Annals of Applied Biology 132:263‐275.   

Dallot, S, Acuña, P, Rivera, C, Ramírez, P, Côte, F, Lockhart, BEL and Caruana, ML. 2001. Evidence that the proliferation stage of micropropagation procedure is determinant in the expression of Banana streak virus integrated into the genome of the FHIA 21 hybrid (Musa AAAB). Archives of Virology 146:2179‐2190.   

Daniells, JW, Geering, ADW, Bryde, NJ and Thomas, JE. 2001. The effect of Banana streak virus on the growth and yield of dessert bananas in tropical Australia. Annals of Applied Biology 139:51‐60.   

Daniells, JW, Thomas, JE and Geering, ADW. 1999. Banana Streak Disease ‐ An Illustrated Field Guide. Ed. Queensland Horticulture Institute, Information Series QI99018. Brisbane, QLD: Department of Primary Industries.   

Dasgupta, I, Hull, R, Eastop, S, Poggi‐Pollini, C, Blakebrough, M, Boulton, MI and Davies, JW. 1991. Rice tungro bacilliform virus DNA independently infects rice after Agrobacterium‐mediated transfer. Journal of General Virology 72:1215‐1221. 

De Cleene, M and Ley, JD. 1976. The Host Range of Crown Gall. Botanical Review 42 (4):389‐466.   

Dean, FB, Nelson, JR, Giesler, TL and Lasken, RS. 2001. Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply‐Primed Rolling Circle Amplification. Genome Research 11 (1095‐1099).    

Escobar, MA and Dandekar, AM. 2003. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends in Plant Science 8 (8):380‐386.   

Fauquet, CM, Mayo, MA, Maniloff, J, Desselberger, U and Ball, LA. 2005. Virus Taxonomy: 8th report of the International Committee of the Taxonomy of Viruses: Elsevier Academic Press, Amsterdam.   

Fungo, R, Kikafunda, JK and Pillay, M. 2007. Variation of ß‐carotene, iron and zinc in bananas grown in east Africa. African Crop Science Conference Proceedings 8:211‐2126.   

 

 

113 

Gayral, P, Noa‐Carrazana, J‐C, Lescot, M, Lheureux, F, Lockhart, BEL, Matsumoto, T, Piffanelli, P and Iskra‐Caruana, M‐L. 2008. A Single Banana Streak Virus Integration Event in the Banana Genome as the Origin of Infectious Endogenous Pararetrovirus. Journal of Virology 82 (13):6697‐9710.   

Geering, ADW. 2009. Viral Pathogens of Banana: Outstanding Questions and Options for Control. ISHS Acta Horticulturae 828:39‐50.  

Geering, ADW, McMichael, LA, Dietzgen, RG and Thomas, JE. 2000. Genetic Diversity Among Banana Streak Virus Isolates from Australia. Virology 90 (8):921‐928.   

Geering, ADW, Olszewski, NE, Dahal, G, Thomas, JE and Lockhart, BEL. 2001. Analysis of the distribution and structure of integrated Banana streak virus DNA in a range of Musa cultivars. Molecular Plant Pathology 2 (4):207‐213.     

Geering, ADW, Olszewski, NE, Harper, G, Lockhart, BEL, Hull, R and Thomas, JE. 2005a. Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses. Journal of General Virology 86:511‐520. 

Geering, ADW, Poggin, MM, Olszewski, NE, Lockhart, BEL and Thomas, JE. 2005b. Characterisation of Banana streak Mysore virus and evidence that its DNA is integrated in the B genome of cultivated Musa. Archives of Virology 150:787‐796.   

Grimsley, N, Hohn, B, Hohn, T and Walden, R. 1986. "Agroinfection" an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences 83:3282‐3286. 

Haible, D, Kober, S and Jeske, H. 2006. Rolling circle amplification revolutionizes diagnosis and genomics of geminiviruses. Journal of Virological Methods 135:9‐16. 

Harper, G, Dahal, G, Thottappilly, G and Hull, R. 1999a. Detection of episomal banana streak badnavirus by IC‐PCR. Journal of Virological Methods 79:1‐8. 

Harper, G, Hart, D, Moult, S and Hull, R. 2002a. Detection of Banana streak virus in field samples of bananas from Uganda. Annals of Applied Biology 141:247‐257.   

Harper, G, Hart, D, Moult, S and Hull, R. 2004. Banana streak virus is very diverse in Uganda. Virus Research 100:51‐56. 

Harper, G, Hart, D, Moult, S, Hull, R, Geering, A and Thomas, J. 2005. The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda. Archives of Virology 150:2407‐2420.   

Harper, G and Hull, R. 1998. Cloning and Sequence Analysis of Banana Streak Virus DNA. Virus Genes 17 (3):271‐278.   

 

114 

Harper, G, Hull, R, Lockhart, B and Olszewski, N. 2002b. Viral Sequences Integrated into Plant Genomes. Annual Review of Phytopathology 40 (1):119‐136.   

Harper, G, Osuji, JO, Heslop‐Harrison, JSP and Hull, R. 1999b. Integration of Banana Streak Badnavirus into the Musa Genome: Molecular and Cytogenic Evidence. Virology 255:207‐213.   

Hay, JM, Jones, MC, Blakebrough, ML, Dasgupta, I, Davies, JW and Hull, R. 1991. An analysis of an infectious clone of rice tungro bacilliform virus, a plant pararetrovirus. Nucleic Acids Research 19:2615‐2621.   

Hoekema, A, Hirsch, PR, Hooykaas, PJJ and Schilperoort, RA. 1983. A binary plant vector strategy based on separation of vir‐ and T‐region of the Agrobacterium tumefaciens Ti‐plasmid. Nature 303:179‐180.   

Hohn, T, Hohn, B and Pfeiffer, P. 1985. Reverse transcription in CaMV. Trends in Biochemical Sciences 10:205‐209.   

Honfo, F, Hell, K, Coulibaly, O and Tenkouano, A. 2007. Micronutrient value and contribution of plantain‐derived foods to daily intakes of iron, zinc, and β−carotene in Southern Nigeria InfoMusa 16 (1‐2):2‐6.   

Huang, Q and Hartung, JS. 2001. Cloning and sequence analysis of an infectious clone of Citrus yellow mosaic virus that can infect sweet orange via Agrobacterium‐mediated inoculation. Journal of General Virology 82:2549‐2258. 

Hull, R. 1996. Molecular biology of rice tungro viruses. Phytopathology 34:275‐297.   

Iskra‐Caruana, M‐L, Baurens, F‐C, Gayral, P and Chabannes, M. 2010. A Four‐Partner Plant‐Virus Interaction: Enemies Can Also Come from Within. The American Phytopathological Society 23 (11):1394‐1402.   

Iskra‐Caruana, M‐L, Gayral, P, Galzi, S and Laboureau, N. 2009. How to Con‐trol and Prevent the Spread of Banana Streak Disease when the Origin Could Be Viral Sequences Integrated in the Banana Genome? ISHS Acta Horticulturae 828:77‐84. 

Jacquot, E, Hagen, LS, Michler, P, Rohfritsch, O, Stussi‐Garaud, C, Keller, C, Jacquemond, M and Yot, P. 1999. In situ localization of cacao swollen shoot virus in agroinfected Theobroma cacao. Archives of Virology 144:259‐271.   

James, AP. 2011. "Viruses of banana in East Africa." PhD thesis, Centre for Tropical Crops and Biocommodities, Faculty of Science and Technology, Queensland University of Technology, Brisbane. 

 

 

 

 

115 

James, AP, Geijskes, RJ, Dale, JL and Harding, RM. 2011a. Development of a Novel Rolling‐Circle Amplification Technique to Detect Banana streak virus that also Discriminates Between Integrated and Episomal Virus Sequences. Plant Disease 95 (1):57‐62.   

James, AP, Geijskes, RJ, Dale, JL and Harding, RM. 2011b. Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa. Annals of Applied Biology 158:346–353.   

Jones, DR. 2000. Introduction to Banana, Abacá and Enset. In Diseases of Banana, Abacá and Enset, ed. Jones, DR, 1‐36: CABI Publishing.   

Jones, DR and Lockhart, BEL. 1993. Banana Streak Disease. In Musa Disease Fact Sheet No 1. Montpellier, France: International Network for the Improvement of Banana and Plantain. 

Karanja, L, Wangai, A, Harper, G and Pathak, RS. 2008. Molecular Identification of Banana streak virus Isolates in Kenya. J. Phytopathology 156:678‐686. 

Khanna, H, Becker, D, Kleidon, J and Dale, J. 2004. Centrifugation Assisted Agrobacterium tumefaciens‐mediated Transformation (CAAT) of embryogenic cell suspensions of banana (Musa spp. Cavendish AAA and Lady finger AAB). Molecular Breeding 14 (3):239‐252.   

King, AM, Lefkowitz, E, Adams, MJ and Carstens, EB. 2011. Virus Taxonomy : Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Vi‐ruses. Burlington: Elsevier Academic Press. 

Kubiriba, J, Legg, JP, Tushemereirwe, W and Adipala, E. 2000. Vector Transmission of Banana streak virus in the screenhouse in Uganda. Annals of Applied Biology 139:37‐43.   

Lassoudière, A. 1974. La mosaïque dite "á tirets" du bananier 'Poyo' en Côte d'Ivoire. Fruits 29:349‐357. 

Lazo, GR, Stein, PA and Ludwig, RA. 1991. A DNA Transformation–Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium. Nature Biotechnology 9:963‐967.   

LaFleur, DA, Lockhart, BEL and Olszewski, NE. 1996. Portions of the banana streak badnavirus genome are integrated in the genome of its hosts Musa spp. Phytopathology 86:S100–S101.   

Le Provost, G, Iskra‐Caruana, M‐L, Acina, I and Teycheney, P‐Y. 2006. Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR. Journal of Virological Methods 137:7‐13. 

 

 

 

 

116 

Lescot, M, Piffanell, P, Ciampi, AY, Ruiz, M, Blanc, G, Leebens‐Mack, J, Silva, FRD, Santos, CMR, D'Hont, A, Garsmeur, O, Kanamori, ADVH, Matsumoto, T, Ronning, CM, Cheung, F, Haas, BJ, Althoff, R, Arbogast, T, Hine, E, Jr, GJP, Sasaki, T, Jr, MTS, Miller, RNG, Glaszmann, J‐C and Town, CD. 2008. Insights into the Musa genome: Synthetic relationships to rice and between Musa species. BMC Genomics 9 (58):1471‐2164.   

Lheureux, F, Carreel, F, Jenny, C, Lockhart, BEL and Iskra‐Caruana, ML. 2003. Identification of genetic markers linked to banana streak disease expression in inter‐specific Musa hybrids. Theoretical and Applied Genetics 106:594‐598.   

Liu, Y, Schiff, M and Dinesh‐Kumar, SP. 2002. Virus‐induced gene silencing in tomato. The Plant Journal 31 (6):777‐786.   

Lockhart, BEL. 1986. Purification and Serology of a Bacilliform Virus Associated with Banana Streak Disease. Phytopathology 76 (10):995‐999. 

Lockhart, BEL and Autrey, LJC. 2000. Sugarcane bacilliform virus. In A guide to sugarcane diseases, ed. Rott, P, Bailey, RA, Comstock, JC, Croft, BJ and Saumtally, AS, 268‐272: CIRAD and ISSCT.   

Lockhart, BEL and Jones, DR. 2000a. Banana Mosaic. In Diseases of Banana, Abacá and Enset, ed. Jones, DR, 256‐263: CAB International.   

Lockhart, BEL and Jones, DR. 2000b. Banana Streak. In Diseases of Banana, Abacá and Enset, ed. Jones, DR, 263‐274. Wallingford, UK: CAB International.   

Medberry, SL, Lockhart, BEL and Olszewski, NE. 1990. Properties of Commelina yellow mottle virus's complete DNA sequence, genomic discontinuities and transcript suggest that it is a pararetrovirus. Nucleic Acids Research 18 (18):5505‐5513.   

Muller, E, Dupuy, V, Blondin, L, Bauffe, F, Daugrois, J‐H, Nathalie, L and Iskra‐Caruana, M‐L. 2011. High molecular variability of sugarcane bacilliform viruses in Guadeloupe implying the existence of at least three new species. Virus Research 160 (1‐2):414‐419.   

Ndowora, TCR. 1998. "Development of an enzyme immunoassay to detect serologically diverse isolates of banana streak virus and characterization of viral sequences integrated into the Musa sp." Ph.d thesis, University of Minnesota. 

Ndowora, T, Dahal, G, LaFleur, D, Harper, G, Hull, R, Olszewski, NE and Lockhart, B. 1999. Evidence That Badnavirus Infection in Musa Can Originate from Integrated Pararetroviral Sequences. Virology 255:214‐220.   

 

 

117 

Pfeiffer, P and Hohn, T. 1983. Involvement of reverse transcription in the replication of cauliflower mosaic virus: a detailed model and test of some aspects. Cell 33:781‐789.   

Ploetz, RC and Pegg, KG. 2000. Fusarium Wilt. In Diseases of Banana, Abacá and Enset, ed. Jones, DR, 143‐159: CAB International.   

Price, NS. 1995. The origin and development of banana and plantain cultivation. In Bananas and Plantains, ed. Gowen, S, 1‐14: Chapman & Hall.   

Purkayastha, A, Mathur, S, Verma, V, Sharma, S and Dasgupta, I. 2010. Virus‐induced gene silencing in rice using a vector derived from a DNA virus. Planta 232 (6):1531‐1540.   

Qu, R, Bhattacharyya, M, Laco, GS, deKochko, A, Rao, BLS, Kaniewska, MB, Elmer, JS, Rochester, DE, Smith, CE and Beachy, RN. 1991. Characterization of the Genome of Rice Tungro Bacilliform Virus: Comparison with Commelina Yellow Mottle Virus and Caulimoviruses. Virology 185:354‐364.   

Ratcliff, F, Harrison, BD and Baulcombe, DC. 1997. A Similarity Between Viral Defense and Gene Silencing in Plants. Science 276:1558‐1560.   

Reichel, H, Belalcázar, S, Múnera, G, Arévalo, E and Narváez, J. 1997. First Report of Banana Streak Virus Infecting Sugarcane and Arrowroot in Colombia. Plant Disease 81 (5):552.   

Robinson, JC. 1996. Bananas and Plantains. Ed. Atherton, J and Rees, A, Crop Production Science in Horticulture. Wallingford: CAB International.   

Rodoni, BC, Dale, JL and Harding, RM. 1999. Characterization and expression of the coat protein‐coding region of banana bract mosaic potyvirus, development of diagnostic assays and detection of the virus in banana plants from five countries in southeast Asia. Archives of Virology 144 (9):1725‐1737.   

Sambrook, J and Russell, DW. 2001. Molecular Cloning: a laboratory manu‐al. 3rd ed. 3 vols. Vol. 3. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.   

Schubert, J, Habekuß, A, Kazmaier, K and Jeske, H. 2007. Surveying cereal‐infecting geminiviruses in Germany ‐ Diagnostics and direct sequencing using rolling circle amplification. Virus Research 127:61‐70.   

Schöb, H, Kunz, C and Jr, FM. 1997. Silencing of transgenes introduced into leaves by agroinfiltration: a simple, rapid method for investigating sequence requirements for gene silencing. Molecular and General Genetics 256 (5):581‐585. 

 

118 

Temin, HM. 1989. Retrons in bacteria. Nature 339:254‐255.   

Teycheney, P‐Y, Laboureau, N, Iskra‐Caruana, M‐L and Candresse, T. 2005a. High genetic variability and evidence for plant‐to‐plant transfer of Banana mild mosaic virus. Journal of General Virology 86 (11):3179–3187.   

Teycheney, P‐Y, Marais, A, Svanella‐Dumas, L, Dulucq, M‐J and Candresse, T. 2005b. Molecular characterization of banana virus X (BVX), a novel member of the Flexiviridae family. Archives of Virology 150 (9):1715‐1727.   

Thomas, JE and Iskra‐Caruana, ML. 2000. Bunchy Top. In Diseases of Banana, Abacá and Enset, ed. Jones, DR, 241‐253: CAB International.   

Thomas, JE, Iskra‐Caruana, ML, Magnaye, LV and Jones, DR. 2000a. Bract Mosaic. In Diseases of Banana, Abacá and Enset, ed. Jones, DR, 253‐256: CAB International.   

Thomas, JE, Lockhart, BEL and Iskra‐Caruana, ML. 2000b. Banana Mild Mosaic. In Diseases of Banana, Abacá and Enset, ed. Jones, DR, 275‐278: CAB International.   

Thwaites, R, Eden‐Green, SJ and Black, R. 2000. Diseases Caused by Bacteria. In Diseases of Banana, Abacá and Enset, ed. Jones, DR, 213‐239: CAB International.   

Tushemereirwe, WK, Karamura, EB and Karyeija, R. 1996. Banana streak virus (BSV) and an associated filamentous virus (unidentified) disease complex of highland bananas in Uganda. InfoMusa 5 (1):9‐12.  

The World Banana Economy, 1985‐2002. 2003. http://www.fao.org/docrep/007/y5102e/y5102e00.htm (accessed 19/05/2010).  

Verchot‐Lubicz, J. 2002. Soilborne viruses: advances in virus movement, virus induced gene silencing, and engineered resistance. Physiological and Molecular Plant Pathology 62:55‐63. 

Yang, IC, Hafner, GJ, Revill, PA, Dale, JL and Harding, RM. 2003. Sequence  diversity of South Pacific isolates of Taro bacilliform virus and the development of a PCR‐based diagnostic test. Archives of Virology 148:1957‐1968.   

Zhang, C, Yang, C, Whitham, SA and Hill, JH. 2009. Development and Use of an Efficient DNA‐Based Viral Gene Silencing Vector for Soybean. The American Phytopathological Society 22 (2):123‐131.