塩基に偏りがある配列を - Illumina, Inc....3 Whole...

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塩基に偏りがある配列を

MiSeqでシーケンスするには酒井名朋子

Sr Technical Applications Scientist

イルミナ株式会社

2

Overview

塩基に偏りがある配列とは?

Base Callのためのパラメタ―計算

– Template Generation

– Matrix

– Phasing と Prephasing

– Pass Filter

– Quality Scoreの計算

塩基に偏りがある場合のRunQualityの改善策

3

Whole Genomeサンプルの塩基は多様です

Whole Genomeサンプルシーケンス中の各Libraryは様々な配列を持つ。

– Libraryは“バランスが取れている”

– Libraryは“多様である”

Covarisなどによる物理的断片化

（ランダム）

5’ Adapter 3’ Adapter

gDNA

最終Library

4

塩基に偏りがあるサンプルとは？

PCR Amplicon シーケンス中の各配列は、同一の配列を持つ。

– 異なる配列はターゲット箇所のみ

– 多様性の低いサンプル


配列の中に相同性があるものは塩基に偏りがある（＝Low diversity)と解釈

ほかのLow Diversityサンプルの例: 16s, ChIP-Seq, Methyl-Seq

5

このサンプルはLow Diversity？

% Base

6

SAVではこんな結果になります

– Intensity がぎざぎざ

– PFが低い

– Phasing/pre-phasing が高い

– ＞Q30％が低い

なぜか？

– Base Callを行うアルゴリズムは、多様な塩基を想定して走るため

Low Diversityサンプルを流すとどんな結果になるか？

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Sequence中に行うBase Callのアルゴリズム

（RTA:Real Time Analysis）

8

RTAによるBase Call

Template Generation—クラスターの位置決め（番地決め）

9

Template Generation

CGAT

CYCLE 1 CYCLE 2

最初の4サイクルまでにFC上で取得された画像を使用

CYCLE 3 CYCLE 4

10

Template Generation

CGAT

CYCLE 1 CYCLE 2 CYCLE 3 CYCLE 4

この位置情報はR1、R2を通して使用される.

塩基がCallされる際、この位置情報を基にどのクラスターからのIntensityか識別する。

RTAはこれらの4サイクル分の画像を解析し、クラスターの位置を決める。

隣り合うクラスターも特定のサイクルで異なるintenshityを持つ場合は識別可能。

TEMPLATE（クラスターの位置）:

11



Matrix の計算—このシグナルはどの塩基からのシグナルか？

12

Matrix の計算: 蛍光の映り込み（クロストーク）

クロストークとは

– Green LEDを照射すると、GとTの蛍光が発光する。

– Tからシグナルを取っている際、Gからものシグナルも一部カウントされる

– このクロストーク（ほかのチャンネルからの映り込み）を把握する必要がある。

T G

T

cluster 1

G

cluster 2からのシグナルを

除外したい

13

Matrix の計算: 蛍光の補正（Corrected Intensities）

蛍光色素にはそもそも蛍光の強弱がある

例）Gは多くの場合Intensityがもっとも低い

このままではGのCall頻度が低くなる

Intensityを平均化し、Corrected

Intensitiesを算出する

14

Matrix の計算: 蛍光の映り込みと蛍光の補正

Matrix を計算することでそれぞれの塩基を正確に特定可能

T

cluster 1

G

cluster 2

を除外

Tで画像を取得している際,

Gからの映り込みを無視する

Gで画像を取得している際,

TとGのシグナルを平均化する

T

cluster 1

を除外

G

cluster 2

15




Phasing の補正—SBS反応のモニター

16

Phasing/prephasingの計算

Prephasing

A A

Phasing

G C C C C C

目安：phasing <0.4% prephasing <0.5%

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Quality Filtering (PF)—このクラスターからのシグナルは不純がないか？

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Quality Filtering (PF)

RTAはシグナルの純度でクラスターにフィルターを掛ける

– 純度が高いと “pass filter”と認識される

純度の計算には CHASTITYを適用

IA

IB

A C G T

BA

A

II

IC

CHASTITY Formula

19


A C G T

CHASTITY Formula

6

6/(6+0) = 1.0 Cしか存在しないので、Chastity =1の

純度が高いシグナル

純度が高い例：

20


A C G T

CHASTITY Formula

6

1.5

6/(6+1.5) = 0.8 近隣クラスターのSignal

を拾うが、Chastity は0.8

でまだ当該クラスターのBase Callに影響は及ぼさない範囲

通常の場合：

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A C G T

CHASTITY Formula

6/(6+5) = 0.54

6

5

隣り合うクララスターが重なると、純度が低くなる。

CHASTITY <0.6

25サイクルまでに<0.6が2度以上でるとFilterを通らない。

純度が低い例：

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Phred Quality Scores—Callされた塩基のクオリティは?

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Phred Quality Scores

Quliatyスコアとはなにか？

Callされた塩基が間違いである可能性を示す指標

Q Tableとスコア計算式により算出される

計算式は解としてQscoreを算出する

イルミナではQ30 以上の確率で正しい塩基の割合をスペックとしています。

– ＞Q30%

塩基が間違いである確率 Base call の精度

Q-score

1 in 10000 99.99% Q40

1 in 1000 99.9% Q30

1 in 100 99% Q20

1 in 10 90% Q10

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RTAによるBase Call いつ計算されるか？


– サイクル1-4、R1のみ


– サイクル1-4、R1とR2


– サイクル1-12、R1とR2


– サイクル1-25

Phred Quality Scores—Callされた塩基のクオリティは?

– サイクル25以降、さかのぼって計算される

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PCR Amplicon はなぜBaseCallに影響を及ぼすか？

26

PCRAmpliconでのTemplate Generation

CYCLE 2 CYCLE 3 CYCLE 4

PhiX

CGAT

CYCLE 1

Amplicon

TEMPLATE

(クラスターの位置)

サイクル毎に異なる塩基が光るので、隣り合うクラスターは別の蛍光を発色。

隣り合っていても、異なるクラスターと認識される。

12個でなく、

8つと認識される

TEMPLATE

隣り合うクラスターは同じものと認識されてしまう

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Matrix の計算: 蛍光の映り込みと蛍光の補正への影響

Matrix を計算することでそれぞれの塩基を正確に特定可能

T

PCR Amplicons:

参照となるシグナルが存在せず、正しく補正

できない

T

cluster 1

G

cluster 2

を除外

Tで画像を取得している際,

Gからの映り込みを無視する

Gで画像を取得している際,

TとGのシグナルを平均化する

T

cluster 1

を除外

G

cluster 2

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Quality Filtering (PF) におけるPCR Ampliconの影響

Templateが正しく作成されないので、Overlapと認識されることが多くなる

12のうち8つのみ認識.

TEMPLATE

A C G T

CHASTITY Formula

6/(6+5) = 0.54

6

5

(CHASTITY <0.6)

X

X X

5つのみ pass filter

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Low DiversityサンプルのRun結果を改善させる

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方法1: Library designを再考する

R1とR2の最初12サイクルに多様性を持たせる

例 1: Long PCRを行い産物を断片化、DNA insertに多様性を持たせる.

– Nextera XTを使用

例 2: PCRprimerにN-NNNNまでの塩基を入れ、Offset PCR Primerで多様性を持たせる

– 文献を参照:Hummelen et al., Plos ONE 5: e12078


12 bases 12 bases

31

方法 1: Nextera XTを使用してLibrary Designを再考する

32

方法 1: Nextera XTを使用してLibrary Designを再考する

注意点:

– 1 ng のPCR Ampliconが必要

– 最短300bpのAmpliconが必要（1kbp程度が望ましい）

– 両端50bp程度Coverageが落ちる

http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_sample_prep_kit.ilmn?scid=2012018PR1




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方法1: Library designを再考する

R1とR2の最初12サイクルに多様性を持たせる


12 bases 12 bases

RTAによる計算 Sequence Qualityは向上するか?

Library

TEMPLATE GEN YES

MATRIX YES

PHASING YES

PASS FILTER YES

Qscore (%>Q30) YES

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方法2：Ampliconの種類を増やす

– TruSeq Custom Amplicon (TSCA)の場合最少16種類必要


Library Number Density MCS2.2 Spike-in

TEMPLATE GEN YES YES?

MATRIX YES YES?

PHASING YES YES?

PASS FILTER YES YES?

Qscore (%>Q30) YES YES?

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方法3:クラスター密度を減らす

– 通常の半分程度に抑える

500K clusters/mm2程度

Yieldが減少する



TEMPLATE GEN YES YES? YES?

MATRIX YES YES? NO

PHASING YES YES? NO

PASS FILTER YES YES? YES?

Qscore (%>Q30) YES YES? YES?

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方法4: MCSを2.2にUpgradeする

– Phasing, Prephasingの計算がすべてのサイクルで行われ、Base Callに反映される

Phasing, Prephasingの誤計算によるQuality Scoreの低下か解消される

– Matrix補正の計算に使用するサイクルも増加(-11サイクル)

– Upgrade手順等はTechnical Supportにお問い合わせください。



TEMPLATE GEN YES YES? YES? NO

MATRIX YES YES? NO YES

PHASING YES YES? NO YES

PASS FILTER YES YES? YES? NO

Qscore (%>Q30) YES YES? YES? YES?

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方法 5: PhiXをv/v30-50 % spike in する

– 塩基の多様性を上げる

– サンプルからのYieldは減少する

– ほかのIndex付のサンプルでも問題なし

– サンプルリードに一部PhiX配列が検出されるする

BWAでPhiXにMappingして取り除く



TEMPLATE GEN YES YES? YES NO YES?

MATRIX YES YES? NO YES YES?

PHASING YES YES? NO YES YES?

PASS FILTER YES YES? YES? NO YES?

Qscore (%>Q30) YES YES? YES? YES? YES?

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まとめ

Low diversity サンプルとはSequence リードが単一であるサンプルを指す

Low diversity サンプルではRTAの計算が正しく行われない

– Template Generation (サイクル 1-4)

– Matrix (サイクル1-4, R1 and R2)

– PhasingとPrephasing (サイクル 1-12, R1 and R2)

– Pass Filter (サイクル 25)

– Quality 計算 (サイクル 25 以降、さかのぼって)

どのように改善するか:

– Library design を再考する

– Ampliconの種類を増やす

– クラスター密度を減らす

– MCSを2.2にUpgradeする

– PhiXなどのバランスの良いサンプルをSpike Inする

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