"OBTENCION DE CEPAS AXENICAS DE GIARDIA LAMBLIA A PARTIR DE HECES DE PACIENTES

SINTOMATICOS MEXICANOS' Q.B.P. Ma . Cristina Fresán Orozco

M. en C. Ma. Magdalena Fresán Orozco M. en C. Felipe Mendoza Pérez Dra. Guadalupe Ortega Pierres

Q.F.B. Julia Pérez Ramos

fi9h UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA casaabmaalti UNIDAD XOCHIMILCO. División de Ciencias Biológicas y de la Salud

Departamento de Sistemas Biológicos

ISBN-970-620-042-8 MARZO 92

INTRODUCCION.

L a G i a r d i a s i s es una p a r a s i t o s i s r e l a t i v a m e n t e común en e l hombre y los an&

males. E l a g e n t e e t i o l ó g i c o d e esta enfermedad, Giardia l ambl ia es un pará-

s i t o e n t é r i c o ( p r o t o z o a r i o ) que se t r a n s m i t e a l humano por medio del agua

y a l imentos contaminados con quis tes . (1 )

En México l a G i a r d i a s i s se p r e s e n t a c o n e x t r a o r d i n a r i a f r e c u e n c i a e n p a c i e n

tes d i a r r é i c o s , e n a l g u n o s i n d i v i d u o s c o n a n t e c e d e n t e s d e i n m u n o d e f i c i e n -

c ias y e n a q u e l l o s e x p u e s t o s ; i u n a t r a n s m i s i ó n o r a l - f e c a l ; ( 2 ) se han repor-

t a d o i n c i d e n c i a s d e l 3 a l 30 % y es de gran importanc ia debido a que a f e c

ta p r i n c i p a l m e n t e a l a p o b l a c i ó n i n f a n t i l o c a s i o n a n d o d e f i c i e n c i a s e n e l

c r e c i m i e n t o y d e s a r r o l l o c o n s e c u e n t e s a problemas de mala a b s o r c i ó n .

G i a r d i a l a m b l i a es un p a r á s i t o que pu.ede p r o d u c i r i n f e c c i o n e s s i n t o m á t i c a s

y a s i n t o m á t i c a s . E s t a última s i t u a c i ó n es de v i t a l importanc ia ya que e l

p o r t a d o r c o n s t i t u y e e l p r i n c i p a l r e s e r v o r i o d e l a enfermedad. E l e s p e c t r o

c l í n i c o d e l a enfermedad es muy ampli.0, se pueden presentar cuadros dia-

r r é i c o s agudos de cor ta durac ión o p r o c e s o s s e v e r o s y c r ó n i c o s , f r e c u e n t e -

mente acompañados de problemas de mala a b s o r c i ó n y pérdida de peso . Dentro

de los f a c t o r e s q u e c o n d i c i o n a n l a m a n i f e s t a c i ó n de l a enfermedad, s e h a

s u g e r i d o q u e d i f e r e n c i a s e n l a v i r u l e n c i a e n t r e las cepas de este organismo

pueden ser l a causa de este fenómeno. Recientemente s e h a n r e p o r t a d o d i f e -

r e n c i a s e n l a c o m p o s i c i ó n a n t i g é n i c a d e c e p a s a i s l a d a s en varias partes d e l

mundo.

3

Un aspecto importante en e l e s t u d i o d e esta p a r a s i t o s i s es e l d e s a r r o l l o

d e m é t o d o s d e d i a g n ó s t i c o e s p e c í f i c o s y c o n f i a b l e s ; ya que e l d i a g n ó s t i c o

de l a G i a r d i a s i s r u t i n a r i a m e n t e se b a s a e n e l h a l l a z g o de q u i s t e s y t r o f o -

z o i t o s e n h e c e s d i a r r e i c a s o exclusivamente de quistes en heces formadas.

E l examen c o r p o p a r a s i t o s c ó p i c o t i e n e b a j a c o n f i a b i l i d a d d e b i d o a que en un

30 a 50 % d e los p a c i e n t e s s i n t o m á t i c o s l a e m i s i ó n d i a r i a d e q u i s t e s e n las

h e c e s o es muy b a j a o es n u l a . (3,4) Otros métodos u t i l izados en e l diag-

n ó s t i c o de l a G i a r d i a s i s s o n l a aspi rac ión duodenal y l a b i o p s i a d e l yeyuno.

S i n embargo, ambos r e s u l t a n t r a u m á t i c o s p a r a e l p a c i e n t e y requieren de ins-

t r u m e n t a l s o f i s t i c a d o . ( 5 ) Los m é t o d o s s e r o l ó g i c o s p a r a l a d e t e c c i ó n de l a

i n f e c c i ó n o f r e c e n v e n t a j a s e n c u a n t o a m e j o r a r l a c o n f i a b i l i d a d y s e n s i b i l i

dad de l o s ensayos. Asimismo, e l empleo de cepas a is ladas localmente pueden

ser un f a c t o r i m p o r t a n t e e n e l d e s a r r o l l o de dichos métodos debido a l a s

d i f e r e n c i a s a n t i g é n i c a s r e p o r t a d a s e n c e p a s d e o r i g e n g e o g r á f i c o d i f e r e n t e .

-

E l o b j e t i v o d e este t r a b a j o es e l de a i s lar cepas d e G i a r d i a l a m b l i a a par-

t i r d e h e c e s d e p a c i e n t e s m e x i c a n o s y , a d a p t a r l a s a l c u l t i v o a x é n i c o , para

l o c u a l era n e c e s a r i o o b t e n e r g r a n d e s c a n t i d a d e s d e q u i s t e s , d e s c o n t a m i n a r -

los, establecer la metodología d e l d e s e n q u i s t a m i e n t o , l o g r a r su c u l t i v o y

su p o s t e r i o r a x e n i z a c i ó n .

MATERIAL Y METODOS.

OBTENCION DE MUESTRAS: L a s m u e s t r a s p a r a a i s l a m i e n t o d e q u i s t e s d e G i a r d i a

l a m b l i a f u e r o n o b t e n i d a s d e p a c i e n t e s s i n t o n á t i c o s p r o v e n i e n t e s d e l L a b o -

r a t o r i o d e Análisis C l í n i c o s d e l Grupo Médico "Medic ina Famil iar de México

S.A.", y d e l H o s p i t a l I n f a n t i l d e l S e c t o r S a l u d .

75 m u e s t r a s o b t e n i d a s d e estas f u e n t e s se sometieron a examen c o p r o p a r a s i t o s

c ó p i c o p a r a d e s c a r t a r a q u e l l a s c o n m ú l t i p l e s p a r á s i t o s y d e t e r m i n a r a p r e c i a -

t i v a m e n t e l a c a n t i d a d de q u i s t e s p r e s e n t e s .

OBTENCION Y PURIFICACION DE QUISTES: P a r a l a o b t e n c i ó n d e l o t e s c o n altas

c o n c e n t r a c i o n e s d e q u i s t e s se u t i l i z a r o n d i f e r e n t e s m é t o d o s p a r a s e l e c c i o n a r

a q u e l q u e p e r m i t i e r a l a o b t e n c i ó n d e un mayor número de q u i s t e s s i n a l te -

rar l a i n t e g r i d a d d e é s t o s .

Método de Sheff ie1d.- (6) L a s h e c e s f u e r o n e m u l s i f i c a d a s e n a g u a , p a s a d a s a

través de un t a m i z p a r a remover l a s p a r t í c u l a s g r a n d e s , e l f i l t r a d o se l a v ó

tres veces con agua centr i fugando a 3000 rpm/l min.; e l sedimento de l a Ú l tima c e n t r i f u g a c i ó n se r e s u s p e n d i ó e n un m l . de agua y se h i z o p a s a r a través

de un g r a d i e n t e d e s a c a r o s a (0 .5 - 1.5 M) p r e v i a m e n t e e s t a b i l i z a d o . Los

tubos a s í preparados fueron centr i fuga .dos a 1000 rpm/30 min. / 5'C, a l cabo

de los c u a l e s se c o l e c t a r o n los q u i s t e s d e las i n t e r f a s e s a g u a : s a c a r o s a

0 . 5 M y s a c a r o s a 0 .5 - 0 . 7 5 M se d i l u y e r o n 1 : l O en agua y se r e c e n t r i f u g a r o n

a 2500 rpm/3 min . rep i t iendo e l p r o c e s o tres v e c e s ; e l p a q u e t e f u e r e s u s p e l

dido en 1 m 1 de agua y observada a l m i c r o s c o p i o para h a c e r u n a a p r e c i a c i ó n

5

c u a l i t a t i v a de l a p r e p a r a c i ó n .

Método de Roberts y Thompson.-(7) Las heces emuls i f i cadas con agua se depo-

s i t a r o n e n un co lchón de sacarosa 1 M ( v o l / v o l ) e n f r í o , se c e n t r i f u g a r o n a

2500 rpm/l5 min./20"C, se c o l e c t a r o n los q u i s t e s de l a i n t e r f a s e a g u a - s a c a r o

sa 1 M y se lavó c o n s o l u c i ó n s a l i n a c e n t r i f u g a n d o a 3 0 0 0 rpm/lO min. repi-

t i é n d o s e esta o p e r a c i ó n tres veces, e l paquete s e resuspendió en 1 m 1 de so-

l u c i ó n s a l i n a y se p r o c e d i ó a o b s e r v a r a l m i c r o s c o p i o para h a c e r una apreciz

c i ó n c u a l i t a t i v a .

-

Método de Faust . - (8 ) Las heces suspendidas en agua se pasaron por un tamiz

de alambre y g a s a , se c e n t r i f u g a r o n a 2 0 0 0 rpm/l min. y se l a v a r o n tres ve-

ces con agua en las mismas condic iones de t iempo y v e l o c i d a d d e c e n t r i f u g a -

c i ó n , e l í i l t imo sedimento se r e s u s p e n d i ó e n s o l u c i ó n d e F a u s t ( S u l f a t o d e

Z i n c 1.180 de densidad) y se c e n t r i f u g a r o n a 2 0 0 0 rpm/l min. colectando l o s

q u i s t e s c o n p i p e t a P a s t e u r d e l a p e l í c u l a s u p e r f i c i a l , l a v á n d o s e é s t o s , tres

veces con agua, e l paquete se resuspendió en 1 m1 de agua y se p r o c e d i ó a

o b s e r v a r l o a l m i c r o s c o p i o como en l o s c a s o s a n t e r i o r e s .

Método Modificado.- Los q u i s t e s o b t e n i d o s p o r e l método de Faust y l a v a d o s ,

fueron pos ter iormente co locados en un c o l c h ó n f r í o d e s a c a r o s a 0.85 M y

c e n t r i f u g a d o s a 2500 rpm/30 min./4'C para l a e l i m i n a c i ó n d e d e t r i t u s y co-

l e c t a d o s d e la i n t e r f a s e a g u a - s a c a r o s a y lavados tres veces en amortiguador

d e f o s f a t o s ph 7 . 2 .

6

Durante e l p r o c e s o d e c o n c e n t r a c i ó n d e q u i s t e s f u e n e c e s a r i o e l i m i n a r c o n t a

minantes como e n t e r o b a c t e r i a s y hongos. Para t a l e f e c t o los q u i s t e s f u e r o n

sometidos a d o s c o m b i n a c i o n e s d e a n t i b i ó t i c o s , c u y a e f e c t i v i d a d se probó

mediante s iembra de los q u i s t e s t r a t a d o s , e n m e d i o s d e c u l t i v o e s p e c í f i c o s .

Los p r i m e r o s a n t i b i ó t i c o s e n s a y a d o s f u e r o n u n a m e z c l a d e p e n i c i l i n a 500 U I / m l

y gentamic ina 50 mi l imoles/ml en agua des t i lada e s t é r i l , l o s c u a l e s f u e r o n

a d i c i o n a d o s a l o s q u i s t e s d e j á n d o l o s a c t u a r d u r a n t e 24 h o r a s a 4°C a l cabo

d e los c u a l e s se c e n t r i f u g a r o n a 3000 rpm durante 5 min. a 5°C resuspendién-

d o l o s e n a g u a d e s t i l a d a es tér i l adic ionada de los a n t i b i ó t i c o s m e n c i o n a d o s .

E s t e p r o c e d i m i e n t o se r e p i t i ó c u a n t a s v e c e s f u e n e c e s a r i o h a s t a a l c a n z a r l a

d e s c o n t a m i n a c i ó n , l a c u a l se c o r r o b o r ó p o r s i e m b r a e n c a l d o t i o g l i c o l a t o y

e n c a l d o d e s o y a t r i p t i c a s e í n a .

E l o t r o método u t i l i z a d o para l o g r a r l a descontaminación en menos tiempo

c o n s i s t i ó e n l a v a r los q u i s t e s con PBS pH 7.2-Tween 2 0 a una Concentración

f i n a l d e 0 . 5 %, dos v e c e s , c e n t r i f u g a n d o a 3000 rpm/5 min. / 5°C; lavando

una vez más con PBS pH 7 .2 es tér i l y resuspendiendo e l paquete en 1 m 1 d e l

mismo amortiguador adicionando l o s s i g u i e n t e s a n t i b i ó t i c o s a una concentra-

c i ó n f i n a l d e : a m i k a s i n a 1 2 5 mcg/ml, R.ocephin 50 mcg/ml y g r i s e o f u l v i n a

12 mcg/ml incubando durante 24 h o r a s a. 4 " C , r e p i t i e n d o este procedimiento

cada 24 h h a s t a a l c a n z a r l a e l iminac . ión de contaminantes , l a cual. se veri-

f i c ó p o r c u l t i v o e n c a l d o t i o g l i c o l a t o y c a l d o s o y a t r i p t i c a s e í n a .

7

DESENQUISTAMIENTO

Q u i s t e s a i s l a d o s d e m u e s t r a s d e h e c e s , d e p a c i e n t e s s i n t o m á t i c o s c o n G i a r d i s

sis, mediante e l método de f l o t a c i ó n d e F a u s t y pasados a través de un c o l -

chón de sacarosa 0 .85 M fueron sometidos a l p r o c e s o d e d e s e n q u i s t a m i e n t o , e n

un primer ensayo, basándonos en e l método d e R i c e y S c h a e f e r ; ( 9 ) se u t i l i -

zaron 5 x 10 q u i s t e s r e s u s p e n d i d o s e n 0 . 5 m 1 d e a g u a d e s t i l a d a e s t é r i l , los

cuales fueron incubados a 37°C durante 30 minutos en una solución compuesta

d e 5 m 1 d e H C 1 ph 2 . 0 , 2 . 5 m 1 de una so luc ión ba lanceada de Hanks ( c o n t e n i e n

do 2 9 mM d e c l o r h i d r a t o d e L - c i s t e í n a y 67 mM de 2 -mercapto-e tanol ) , y 2 . 5 m 1

0 .1 M d e b i c a r b o n a t o d e s o d i o p a r a i n d u c i r e l d e s e n q u i s t a m i e n t o ; a l término

d e l a i n c u b a c i ó n se r e s u s p e n d i e r o n los quistes en medio TYI-S-33 complements

do con suero bovino a l 15 % y b i l i s a l 5 %, l a v a n d o p o r c e n t i f u g a c i ó n a

2 5 0 0 rpm/2 min. en dicho medio, e l sedimento se resuspendió en medio f resco

y se d e p o s i t ó e n un por taob je tos excav ,ado co locando un c u b r e o b j e t o s e l c u a l

f u e s e l l a d o c o n p a r a f i n a e i n c u b a d o e n p o s i c i ó n i n v e r t i d a a 37 "C durante una

h o r a h a s t a o b s e r v a r e l desenquistamiento microscópicamente .

5

Un segundo ensayo de desenquistamiento comprendió dos etapas una de induc-

c i ó n a pH b a j o y l a o t r a de desenquistamiento en e l medio de cul t ivo TYI-S-33

(10) E l p r o c e d i m i e n t o se l l e v ó a cabo en tubos de c e n t r í f u g a d e 15 m 1 con-

t e n i e n d o 1 m 1 de una suspensión de quistes con una concentración de 1 . 5 m i -

l l o n e s p o r m l . A esta suspensión se l e agregaron 9 m 1 de HC1 pH 0 . 5 en PBS

y se a g i t ó p e r f e c t a m e n t e , p r o c e d i é n d o s e a i n c u b a r a 37"C/ 2 0 min . con ag í ta -

c i ó n c o n s t a n t e . Al cabo de este tiemp o los q u i s t e s se sedimen.tan por centr&

fugación a 2 0 0 0 rpm/5 min. y se lavan con PBS ph 7.2 es tér i l adic ionado con

9

antibióticos a una concentración final de: ampicilina 200 mcg/ml, penicilina,

250 mcg/ml, Rocephin 50 mcg/ml y nistatina 50 mcg/ml. Para el desenquista-

miento se usó el medio TYI-S-33 complementado con bilis bovina al 5 % y sue

ro bovino al 15 % inactivado a 56°C por 30 minutos y adicionado de los ant&

bióticos a las concentraciones finales anteriormente citadas. Los quistes

se incubaron a 3 7 ° C evaluándose el desenquistamiento por la aparición de

trofozoítos adheridos a las paredes del tubo que contiene el medio. En el

momento en que se empezaron a ver los primeros trofozoítos adheridos a la

pared de los tubos, se les cambió el medio de cultivo por medio fresco.

Este procedimiento se repitió cuantas veces fue necesario hasta tener un

cultivo confluente.

10 "_ . . "

AXENIZACION

Una vez que se logró contar con el cultivo confluente se procedió a resembrar

los aislados , las dos primeras resiembras se llevaron a cabo con el medio

de desenquistamiento que es el que se ha venido usando hasta ahora; a partir

de la tercera resiembra se utiliza el rnedio de mantenimiento que lleva suero

bovino al 10 por ciento pero en el cual aún se adicionaron antibióticos, re-

sembrándolos dos veces por semana . A partir de la quinta resiembra se determina la axenización del cultivo

respecto a la presencia de otros microorganismos . Esta prueba se llevó a cabo manteniendo parte del aislado con antibióticos y parte sin ellos . A las 24 horas de incubación se observa si existe contaminación aparente; si

no la hay, se resiembra en caldo tioglicolato, medio de Luria y Sabouraud.

OBTENCION DE CURVAS DE CRECIMIENTO.

Estas se obtuvieron inoculando 1 x lo4 trofozoítos de los diferentes aisla-

dos en tubos conteniendo 16 m1 de medio TYI-S-33, los cultivos se incubaron

a 37OC en un medio anaeróbico, la cuenta celular de cada cultivo se llevó a

cabo cada 24 horas empleando el método de tinción de azul de tripano en cá-

mara hemacitométrica para determinar viabilidad y número de trofozoítos.

11

RESULTADOS.

L a s m u e s t r a s p r o c e s a d a s p o r e l método de S h e f f i e l d aunque d e e x c e l e n t e ca l i -

dad en cuanto a l a a u s e n c i a d e d e t r i t u s , p r e s e n t a b a n u n a p é r d i d a c o n s i d e r a -

b l e d e q u i s t e s , n o as í las t r a t a d a s p o r e l método de Roberts y Thompson en

donde no exist ía g r a n p é r d i d a d e q u i s t e s p e r o c o n s e r v a b a n muchos d e t r i t u s .

En e l c a s o d e l mgtodo de Faust , aun cuando quedaban detritus se conservaban

g r a n d e s c a n t i d a d e s d e q u i s t e s , p o r l o que se decidió combinar este f l t i m o ,

con e l d e R o b e r t s y Thompson, obteniéndose muest ras con a l tas c o n c e n t r a c i o -

n e s d e q u i s t e s y b a s t a n t e l impias.

L a e l i m i n a c i ó n d e c o n t a m i n a n t e s b a c t e r i a n o s d e los q u i s t e s , cuando se u t i l i -

zó p e n i c i l i n a y g e n t a m i c i n a se lograban en 15 a 18 días ; en cambio cuando

se usó amikas ina , Rocephin y g r i s e o f u L v i n a d i c h a e l i m i n a c i ó n se a l c a n z a b a e n

6 a 8 d í a s . S i n embargo l o s q u i s t e s as í t r a t a d o s n o l o g r a b a n ser desenquis-

t a d o s , suponemos que sea debido a l t i e m p o q u e t r a n s c u r r í a e n t r e l a emisión

d e l o s q u i s t e s y e l ensayo por l o que se d e c i d i ó p r o c e d e r a d e s e n q u i s t a r l o s

e n a m b i e n t e d e a n t i b i ó t i c o s p e r o a p a r t i r d e m u e s t r a s r e c i é n e m i t i d a s o has-

t a de tres d l a s p o s t e r i o r e s a s u e m i s t ó n .

En cuanto a l desenquistamiento, el método propuesto p o r R i c e y S c h a e f f e r nos

p e r m i t i ó o b s e r v a r l o a l m i c r o s c o p i o , s i n e m b a r g o , a l c o l c a r l a suspensión de-

p o s i t a d a e n el p o r t a o b j e t o s e x c a v a d o e n e l medio TYI-S-33 para s u c u l t i v o se

p e r d i e r o n los t r o f o z o í t o s y n o f u e p o s i b l e o b t e n e r l a monocapa. Por l o que

se d e c i d i ó u t i l i z a r e l método d e Bingham y Meyer que propone e l u s o d e j u g o

g á s t r i c o o u n a s o l u c i ó n d e HCl para o b s e r v a r l a l i b e r a c i ó n de los t r o f o z o í t o s

con e l c u a l se l o g r ó o b s e r v a r t a n t o e l desenquistamiento como o b t e n e r e l c u l -

13

tivo confluente.

Para el desenquistamiento se procesaron 75 muestras de heces provenientes de

pacientes sintomáticos. De estas se eligieron un total de 16 muestras de a-

cuerdo a los siguientes criterios: número de quistes , limpieza de los mismos

y ausencia de formas quísticas de otros parásitos.

De las 16 muestras que se seleccionaron para su proceso se logró el desenquis-

tamiento en seis casos y los datos relevantes de los aislados obtenidos se

muestran en la tabla número 1.

La nomenclatura utilizada para la designación de los aislados emplea el lugar

en donde se obtuvieron l o s aislados, seguido del mes , año y número de muestra.

Las muestras se obtuvieron de pacientes sintomáticos los cuales presentaban

como síntomas más frecuentes diarrea, dolor abdominal y malestar general.

El periodo de axenización fluctúa entre 7 y 12 semanas y la densidad celular

final fue entre 1.3 y 1.9 x 10 trofozoítos por ml. 6

Una vez obtenidos l o s cultivos axénicos se procedió a hacer las curvas de

crecimiento de cada uno de ellos de acuerdo a lo descrito en material y métg

dos, con el objeto de determinar el tiempo de generación.

Todos los aislados alcanzaron la fase logaritmica en 24 horas y el tiempo

de generación promedio fué de 12.13 horas.

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Lo Q,

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CONCLUSIONES.

Se estableció un método adecuado para la obtención de quistes de Giardia lamlia

a partir de heces de pacientes sintomáticos con Giardiasis empleando el méto-

do de Faust con la modificación de pasar la muestra obtenida por este método

a través de un colchón de sacarosa 0.85 M.

La eliminación de microorganismos contaminantes en las muestras de quistes se

logró en menor tiempo empleando una combinación de antibióticos consistente

en Ampicilina, Amikasina, Rocephin y griseofilvina.

Se indujo el desenquistamiento de los quistes aislados empleando una solución

de HC1 pH 0.5 y el medio TYI-S-33 complementado con bilis bovina al 5% y suero

bovino descomplementado al 15 %.

El uso de los antibióticos mencionados permitió la obtención de cultivos

axénicos de Giardia lamblia.

El periodo de axenización se logra en un promedio de 10 semanas.

La densidad celular final fue de 1.6 x 10 células/ml.

El tiempo de generación promedio fue de 12.13 horas.

Se cuenta actualmente con cinco ailados axénicos.

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