Nr Decizie Senat. 227 din 20.12.2013 TEZǍ DE...

Nanostructured materials based on natural extract with potential applications in therapy and biophotonics

1

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Investeşte în oameni!

Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013

Proiect POSDRU/107/1.5/S/76903 – Formarea viitorilor cercetatori-experti prin programe de burse doctorale (EXPERT)

UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREȘTI

Facultatea de Chimie Aplicată și Știința Materialelor

Departamentul de Chimie Anorganică, Chimie Fizică și Electrochimie

Nr Decizie Senat. 227 din 20.12.2013

TEZǍ DE DOCTORAT

MATERIALE NANOSTRUCTURATE PE BAZǍ DE EXTRACTE NATURALE CU POTENȚIALE APLICAȚII ȊN TERAPIE ȘI

BIOFOTONICǍ

NANOSTRUCTURED MATERIALS BASED ON NATURAL EXTRACTS WITH POTENTIAL APPLICATIONS IN THERAPY AND

BIOPHOTONICS

Autor: Ing. ANA-MARIA MANEA Conducǎtor de doctorat: Prof. Dr. AURELIA MEGHEA

COMISIA DE DOCTORAT

Președinte Prof. Vasile LAVRIC de la Universitatea POLITEHNICA din București

Conducǎtor de doctorat

Prof. Aurelia MEGHEA de la Universitatea POLITEHNICA din București

Referent Prof. Francois KAJZAR de la Universitatea POLITEHNICA din București

Referent Dr. Habil. Chantal ANDRAUD de la L’Ecole Normale Superieure Lyon

Referent Acad. Ionel Valentin VLAD de la Academia Românǎ, INFLPR, Mǎgurele

București 2014


2

Ȋn memoria tatǎlui meu,

Gheorghe


3

Cuprins

MULȚUMIRI PERSONALE 5

CUPRINS 7

ABREVIERI 11

INTRODUCERE 13

AKNOWLEDGMENT 15

I. STUDIU DOCUMENTAR 17

1. PRODUSE NATURALE CONȚINȂND PRINCIPII BIOACTIVE

LIPO- ȘI HIDROSOLUBILE 19

1.1. EXTRACT DE CEAI VERDE 19

1.2. EXTRACT DE CǍTINǍ 22

1.3. ACID DEZOXIRIBONUCLEIC 24

2. ȊNCAPSULAREA PRINCIPIILOR BIOACTIVE ȊN

NANOPARTICULE LIPIDICE 27

2.1. CARACTERISTICI ALE SLN ȘI NLC 27

2.2. METODE DE OBȚINERE A NANOPARTICULELOR LIPIDICE 29

2.2.1. Omogenizarea la presiune ȋnaltǎ 30

2.2.2. Microemulsionarea 30

2.2.3. A/U/A Metoda emulsiei duble 30

2.2.4. Emulsionarea cu solvent și evaporare 31

II. CERCETǍRI ORIGINALE 33

OBIECTIVE 35

3. MATERIALE ȘI METODE 37

3.1. MATERIALE 37

3.1.1. Lipide solide 37

3.1.2. Lipide lichide (uleiuri) 38

3.1.3. Surfactanți și co-surfactanți 38

3.1.4. Solvenți 41

3.2. METODE DE SINTEZǍ 42

3.2.1. Prepararea nanoparticulelor lipidice cu/fǎrǎ conținut

de substanțǎ bio-activǎ 43

3.3. TEHNICI DE CARACTERIZARE 44

3.3.1. Cromatografie de gaz cuplatǎ cu spectrometria de masǎ

(GS-MS) 44

3.3.2. Spectroscopia UV-VIS-NIR 44

3.3.3. Spectroscopia FT-IR 45

3.3.4. Ȋmprǎștierea dinamicǎ a luminii (DLS) 45

3.3.5. Calorimetrie de scanare diferențialǎ (DSC) 45

3.3.6. Microscopia electronicǎ de transmisie (TEM) 45

3.3.7. Spectroscopie de fluorescențǎ 46

3.3.8. Metoda chemiluminescenței 46

3.3.9. Metoda difuziei pentru determinarea activitǎții antimicrobiene 46

3.3.10. Generarea armonicii a doua (SHG) 46

3.3.11. Generarea armonicii a treia (THG) 47

3.3.12. Determinarea grosimii filmelor 48

4. SELECTAREA PRINCIPIILOR ACTIVE. CARACTERIZAREA

ULEIURILOR ȘI A EXTRACTELOR VEGETALE 49

4.1. IDENTIFICAREA SUBSTANȚELOR COMPONENTE PRIN GC-MS 49

4.2. PROCEDURA DE OBȚINERE A EXTRACTULUI DE CǍTINǍ 52

4.3. CARACTERIZAREA STRUCTURALǍ PRIN UV-VIS-NIR 55

4.4. INDICI KOVACI 56


4

4.5. CONCLUZII PARTIALE 61

5. NANOPARTICULE LIPIDICE CE ȊNCAPSULEAZǍ DIFERITE

AMESTECURI VEGETALE BIO-ACTIVE 63

5.1. EVALUAREA STABILITǍȚII NANOPARTICULELOR

LIPIDICE PE BAZA POTENȚIALULUI ELECTROCINETIC 63

5.1.1. Extract de ceai verde– SLN 63

5.1.2. Extract de cǎtinǎ– SLN 65

5.2. CARACTERIZAREA DIMENSIONALǍ ȘI MORFOLOGICǍ

(DLS, HR-TEM) 66



5.3. CARACTERIZAREA STRUCTURALǍ (UV-VIS-NIR) 68



5.4. MODIFICAREA STRUCTURALǍ A MATRICEI LIPIDICE DUPǍ

ȊNCAPSULAREA AMESTECULUI BIO-ACTIV (UV-VIS-NIR, DSC) 70



5.5. DETERMINAREA PROPRIETǍȚILOR ANTIOXIDANTE 72



5.6. DETERMINAREA PROPRIETǍȚILOR ANTIMICROBIENE 73



5.7. CONCLUZII PARȚIALE 75

6. TRANSPORTORI LIPIDICI NANOSTRUCTURAȚI CE ȊNCAPSULEAZǍ

DIFERITE AMESTECURI VEGETALE BIO-ACTIVE 77

6.1. EVALUAREA STABILITǍȚII NANOPARTICULELOR

LIPIDICE PE BAZA POTENȚIALULUI ELECTROCINETIC 77

6.1.1. Extract de ceai verde – NLC 77

6.1.2. Extract de cǎtinǎ – NLC 79

6.2. CARACTERIZAREA DIMENSIONALǍ ȘI MORFOLOGICǍ

(DLS, HR-TEM) 82



6.3. CARACTERIZAREA STRUCTURALǍ (UV-VIS-NIR) 87




ȊNCAPSULAREA AMESTECULUI BIO-ACTIV (UV-VIS-NIR, DSC) 94



6.5. DETERMINAREA PROPRIETǍȚILOR ANTIOXIDANTE 97



6.6. DETERMINAREA PROPRIETǍȚILOR ANTIMICROBIENE 99



6.7. CONCLUZII PARTIALE 103

7. PREPARAREA FILMELOR SUBȚIRI ȘI DETERMINAREA

PROPRIETǍȚILOR OPTICE LINEARE 105

7.1. PROCESAREA ȘI FUNCȚIONALIZAREA ADN-ului 105


5

7.1.1. Funcționalizarea ADN-ului cu cromofori activi 106

7.1.2. Funcționalizarea ADN-ului cu surfactantul

de tip CTMA și extract de cǎtinǎ 109

7.2. PREPARAREA FILMELOR SUBȚRI 110

7.3. CARACTERIZAREA SPECTROSCOPICǍ 111

7.3.1. Spectre UV-VIS-NIR 111

7.3.2. Spectre de fluorescențǎ 112

7.4. PROPRIETǍȚI OPTICE NELINEARE 114

7.4.1. Indicele de refracție 114

7.4.2. Generarea armonicii a treia 115


8. APLICAȚII ALE FILMELOR SUBȚIRI ȊN BIOFOTONICǍ 123

8.1. GHIDURI DE UNDǍ OPTICE 123

8.2. FILME POLING - POLED 124

8.2.1. Generarea celei de a doua armonici 127

8.3. FAZA SUSCEPTIBILITǍȚII CUBICE 131

8.3.1. Dependența concentrației de susceptibilitatea NLO de

ordinul trei 131

8.4. CONTRIBUȚIILE REZONANTE LA SUSCEPTIBILITATEA CUBICǍ 136


CONCLUZII 143

C.1. CONCLUZII GENERALE 143

C.2. CONTRIBUȚII ORIGINALE 144

C.3. PERSPECTIVE 145

LISTA DE LUCRǍRI 147

CONFERINȚE 149

BIBLIOGRAFIE 151


6

ABREVIERI

AA = Activitate antioxidantǎ

BSTFA = (bis (trimetilsilil) trifluoroacetamidǎ)

CA = Catechinǎ

Ci = Indice de cristalinitate

CL = Chemiluminescențǎ

CP = Palmitat de cetil

CTMA = Clorurǎ de cetiltrimetilamoniu

DCNP = 3-(1,1-dicianoetenil)-1-fenil-4, 5-dihidro-1H-pirazol

DLS = Ȋmprǎștierea dinamicǎ a luminii

DNA = Acid dezoxiribonucleic

DR1 = Disperse Red1

DSC = Calorimetrie diferențialǎ de scanare

E. coli = Escherichia coli

EC = Epicatechinǎ

ECG = Epicatechin-3-gallat

EGC = Epigalocatechinǎ

EGCG = Epigalocatechin-3-galat

GC-MS = Gaz Cromatografie – Spectrometria de masǎ

GS = Stearat de gliceril

GSO = Ulei din sâmburi de strugure

GTE = Extract de ceai verde

HPLC = Cromatografie lichidǎ de ȋnaltǎ performanțǎ

HPO = Ulei de sunǎtoare

HSH = Omogenizare cu grad ȋnalt de forfecare

IS = Isorhamnetin

KA = Kemferol

LN = Nanoparticule lipidice

NIR = Infraroșu apropiat

NLC = Transportori lipidici nanostructurați

NLO = Opticǎ nelinearǎ

PdI = Indice de polidispersitate

PMMA = Polimetil metracrilat

QU = Quercetinǎ

RU = Rutin

SBE = Extract de cǎtinǎ

SBO = Ulei de cǎtinǎ

SHG = Generarea armonicii a doua

SLN = Nanoparticule lipidice solide

TEM = Microscopie electronicǎ de transmisie

THG = Generarea armonicii a treia

Tw20 = Polietilen glicerol sorbitan monolaureat

Tw80 = Polietilen glicol sorbitan monooleat

UV-VIS = Ultra Violet-Vizibil

ZP = Potential zeta


7

INTRODUCERE

În prezent, cererile de produse alimentare sau de eliberare a medicamentelor sunt tot

mai specifice. În scopul de a satisface aceste cerințe, la momentul potrivit și la locul potrivit, o

metodă foarte utilă este reprezentată de încapsulare.

Încapsularea este un proces care constă ȋn antrenarea agenților activi în interiorul

particulelor și poate fi folosit, de asemenea, pentru a imobiliza celule sau enzime în

producerea de materiale sau produse alimentare, ca de exemplu în fermentație sau în

producerea metabolitului. Tehnologia de eliberare a medicamentelor pe bazǎ de nanoparticule

lipidice prezintă oportunități semnificative pentru îmbunătățirea terapeuticii medicale.

Fabricarea cu succes a nanoparticulelor lipidice a deschis o nouă eră pentru o

biodisponibilitate îmbunătățită a ambelor tipuri de medicamente și anume mai mult sau mai

puțin solubile în apă.

Cercetarea prezentatǎ ȋn aceastǎ tezǎ s-a axat pe sinteza de nanoparticule lipidice,

îmbunătățirea formulărilor prin controlul asupra dimensiunii particulelor, distribuția acestora,

profilul de încărcare cu medicament prin prelucrare și cu diferite variabile formulǎri de

materiale.

Pentru obținerea celor mai bune nanoparticule lipidice, trebuie testați și optimizați

anumiți parametrii: dimensiune micǎ, stabilitate fizico-chimică mare atestatǎ de valorile

potențialului zeta, biodegradabilitatea compușilor, eliberarea medicamentului din

nanoparticule, etc.

Pe de altă parte, nevoia de materiale optice neliniare foarte eficiente, în special în

vederea aplicării lor în toate procesǎrile de semnale total optice și în sisteme logice optice, a

condus la eforturi importante de cercetare pentru dezvoltarea și caracterizarea de noi materiale

cu proprietăți liniare și neliniare (NLO). Printre materialele propuse și cel mai mult cercetate

compușii organici par să fie foarte interesanți, ȋntrucât prezintǎ proprietǎți optice nelineare,

atât de ordinul al doilea cât și de ordinul al treilea. Cu toate acestea, o problemă întâlnită la

aceste materiale este datǎ de procesabilitatea lor în aplicații. Aceasta se referă în special la

materiale NLO de ordinul al doilea, deoarece acestea trebuie să fie noncentrosimetrice. Astfel

de constrângeri nu există la materialele cu proprietǎți de ordinul trei, deși ordinea poate fi

foarte utilǎ pentru a obține răspuns NLO mai mare. Deoarece cele mai multe aplicații practice

sunt orientate în configurații de ghiduri de undǎ, alte cerințe importante care trebuie

îndeplinite sunt:

procesabilitatea filmelor subțiri,

stabilitate termică și chimică bună,

pierderi de propagare a luminii scăzute.

Aceste cerințe sunt dificil de îndeplinit. Prin urmare, s-a propus și demonstrat cu

succes utilizarea polimerilor amorfi ca matrice pentru molecule NLO.

Cele două abordări de mai sus, și anume obținerea de nanoparticule lipidice și

fabricarea de filme subțiri cu proprietăți NLO au, în acest studiu, un punct cheie comun, și

anume, noua provocare de a obține compuși naturali bioactivi durabili. Ca urmare, ambiția

acestei teze a fost de a sintetiza materialele complet bio pentru diverse aplicații practice, cum

ar fi:

nanoparticule lipidice, unde atât matricea purtătoare cât și compușii activi

încapsulați sunt de origine vegetalǎ cum ar fi extracte de plante selective, cu

aplicație finală în diverse terapii;

filme subțiri optic active, ȋn care atât matricea de ADN cât și cromoforul activ

sunt de "origine bio", fapt ce conduce la aplicații în biofotonicǎ.

Teza conține 92 de figuri, 26 de tabele, 26 de ecuații și o schemă. Lucrarea de față este

alcǎtuitǎ din 8 capitole divizate în două părți și este structuratǎ astfel:

I. Studiul documentar, care cuprinde două capitole:


8

Capitolul 1 ce conține o scurtă descriere a extractelor naturale care au fost folosite în partea

experimentală a acestei teze. De asemenea, sunt prezentate pe scurt efectele lor benefice

pentru sǎnǎtate.

Capitolul 2 prezintă informații cu privire la nanoparticulele lipidice solide și transportatorii

lipidici nanostructurați, metodele și materialele folosite până în prezent în sinteza lor. De

asemenea, este datǎ și clasificarea acestora.

II. Cercetarea originalǎ prezintǎ obiectivele și rezultatele contribuțiilor originale cuprinse în

următoarele 6 capitole. Ultima parte a lucrării conține concluziile generale și bibliografia.

Capitolul 3 prezintă metodele experimentale și materialele utilizate, sinteza de nanoparticule

lipidice și tehnicile de caracterizare a sistemelor obținute.

Capitolul 4 descrie metoda care conduce la obținerea extractului de cătină (SBE) utilizat în

partea experimentală a acestei teze și analiza GC-MS a celor trei uleiuri vegetale utilizate.

Capitolul 5 urmǎrește obținerea unor nanoparticule lipidice de tip SLN libere și încărcate cu

două tipuri de extracte vegetale, și anume extractul de ceai verde și respectiv cătină.

Capitolul 6 prezintă rezultatele obținute ȋn cazul nanotransportorilor lipidici nanostructurați

(NLC) liberi și încărcați cu două tipuri de extracte vegetale, și anume ceai verde și extract de

cătină, co- încapsulând fiecare dintre cele trei uleiuri vegetale și anume uleiul din semințe de

strugure, uleiul de sunǎtoare și uleiul de cătină.

Capitolul 7 aduce informații cu privire la funcționalizarea ADN-ului, sinteza de materiale

complexe ca ADN-GTE și ADN-CTMA-SBE și prelucrarea lor în fime subțiri, precum și

caracterizarea filmelor subțiri pe bază de ADN prin mǎsurǎtori spectrale UV-VIS,

fluorescențǎ, indice de refracție și măsurători de generare a celei de a treia armonici.

Capitolul 8 este dedicat aplicațiilor practice ale fimelor pe bazǎ de ADN.

La final, sunt prezentate concluziile generale, contribuțiile originale și perspectivele de

viitor.

Rezultatele originale ale cercetărilor efectuate în timpul stagiului de doctorat au fost

subiectul a 7 articole publicate în reviste cotate ISI, la 6 dintre acestea fiind primul autor, un

articol în Buletinul Științific UPB, 8 prezentări orale la diferite conferințe internaționale

(printre care una distinsǎ cu premiul ȋntâi la “International Conference on Advanced Materials

for Photonics, Sensing and Energy Conversion Applications”(AMPSECA), 2012, 5-7

decembrie, El Jadida, Maroc), și patru postere la conferințe internaționale. Două alte articole

sunt ȋn pregǎtire și vor fi publicate în viitorul apropiat.

ACKNOWLEDGMENT

Rezultatele prezentate ȋn aceastǎ tezǎ de doctorat au fost obținute cu sprijinul financiar al

Ministerului Muncii, Familiei și Protecției Sociale prin Fondul Social European, Programul

Operațional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013, Contract nr.

POSDRU/107/1.5/S/76903.

De asemenea, rezultatele prezentate au fost obținute și cu sprijinul financiar al Fondului

Social European, Programul Operațional Sectorial Creșterea Competitivitǎții Economice –

proiect cu expert internațional, Contract nr. POS CCE nr. 634, SMIS 12575.

Rezultatele prezentate ȋn aceastǎ tezǎ de doctorat au fost obținute și cu sprijinul financiar al

Ministerului Român al Educației, Cercetǎrii, Tineretului și Sportului, prin UEFISCDI,

Contract nr. 3/2012, Code Project PN-II-PT-PCCA-2011-3.1-0316.


9

II. CERCETAREA ORIGINALǍ

OBIECTIVE

Produsele naturale sunt surse importante de compuși bioactivi și au fost considerate ca

cea mai de succes descoperire ȋn medicina modernǎ. Numeroase studii au demonstrat că

produșii vegetali proveniți de la plante sau fructe posedă un spectru mare de activitate

biologică importantă pentru lumea vie.

Scopul acestei teze de doctorat a fost de a pregăti materiale total bio cu diferite aplicații

practice:

nanoparticule lipidice, ȋn care atât matricea purtătoare cât și compușii activi

încapsulați sunt de origine vegetalǎ cum ar fi extracte de plante selective, cu aplicație

finală în diverse terapii;

filme subțiri optic active, ȋn care atât matricea ADN-ului cât și cromoforul optic activ

sunt de "origine bio", fapt ce conduce la aplicații în biofotonicǎ.

În acest sens, principalele obiective ale acestei teze sunt:

(i) obținerea și caracterizarea unor materiale nanostructurate pe bazǎ de extracte

naturale și uleiuri vegetale.

(ii) Sinteza, caracterizarea și testarea de noi materiale pe bază de ADN funcționalizat cu

cromofori naturali pentru aplicații în biofotonicǎ.

Pentru a atinge aceste obiective au fost stabilite următoarele obiective specifice propuse și

realizate:

Stabilirea de compoziții optime pentru nanoparticule libere și încărcate cu cele două

ingrediente active ca nanotransportori lipidici:

1. Extract de ceai verde

2. Extract de cǎtinǎ.

Prepararea și optimizarea parametrilor pentru obținerea de materiale pe bazǎ de

ADN/ADN-sisteme de surfactant în soluție, functionalizate cu același tip de cromofori

naturali, și anume extract de ceai verde și extract de cătină.

Pentru a îndeplini aceste obiective au fost realizate studii complexe privind sinteza,

caracterizarea și atribuirea de proprietăți specifice, urmând o serie de măsurǎtori, cum ar fi:

Crearea și dezvoltarea de procedee de co-încapsulare de extracte vegetale în diferite

nanomatrici lipidice, obținute prin folosirea a trei tipuri de uleiuri vegetale (ulei din

semințe de strugure, ulei de sunǎtoare și ulei de cătină);

caracterizarea dimensională și fizico-chimică a nanotransportorilor lipidici liberi și

încărcați cu substanțǎ activǎ (DLS, potențial electrocinetic, TEM, DSC, UV-VIS);

Evaluarea in vitro a proprietăților antioxidante a noilor transportori liberi și co-

încapsulați, pe baza analizei de chemiluminescență;

Evaluarea proprietăților antimicrobiene a noilor transportori liberi și co-încapsulați, pe

baza metodei de difuzie;

Depunerea de filme subțiri prin tehnica de acoperire „spin-coating” a materialelor pe

bazǎ de ADN funcționalizat.

Filmele subțiri preparate cu aceste noi materiale au fost apoi caracterizate folosind

următoarele tehnici:

profilometrie, (determinarea grosimii);

spectroscopie UV - VIS și de fluorescențǎ;

caracterizarea proprietǎților optice nelineare (tehnica THG).

Pe baza acestor materiale inovative se propun unele dispozitive ce pot fi realizate ca

aplicații ȋn biofotonicǎ.


10

CAPITOLUL 4

SELECTAREA PRINCIPIILOR ACTIVE. CARACTERIZAREA

ULEIURILOR ȘI A EXTRACTELOR VEGETALE

4.1. IDENTIFICAREA SUBSTANȚELOR COMPONENTE PRIN GAZ

CROMATOGRAFIE ȊN TANDEM CU SPECTROSCOPIA DE MASǍ

Pentru a identifica compușii organici s-a utilizat cromatografia de gaze în combinație cu

spectroscopia de masă, pentru cuantificarea picurilor provenite de la diverși compuși

necunoscuți și atribuirea timpului de retenție.

Datorită polarității foarte ridicate a compușilor studiați, simpla injectare a amestecului

în cromatograful de gaze nu este indicată, deoarece deteriorarea coloanei cromatografice

poate fi importantă. Pentru analiza unui extract solubil în apă, a fost utilizată metoda FAME.

Reacția generală este prezentată în schema 4.1.

Schema 4.1. Procesul de schimbare a polarității unui compus organic prin funcționalizarea cu BSTFA

După analiza GC-MS a uleiului de cătină (fig. 4.1) am observat prezența unui numǎr de opt

compuși diferiți în extractul studiat, compuși prezentați în tabelul 4.1.

Fig. 4.1. Cromatograma uleiului de cǎtinǎ


11

Tab. 4.1. Compuși, timpul lor de retenție și masa identificate în uleiul de cătină prin metoda GC-MS

Pic Timp de retenție Compus identificat ȋn baza spectrului de masǎ %

1 33.06 Acid palmitelaidic 10.007

2 33.451 Acid hexadecanoic 20.189

3 36.474 Acid linoleic 18.740

4 36.564 Acid 11-cis-octadecenoicr 16.850

5 36.687 Acid oleic 4.497

6 37.023 Acid stearic 3.297

7 51.352 à-tocoferol 5.404

8 56.334 á-sitosterol 10.131

Fig. 4.2, 4.3 și 4.4 și tabelele 4.2, 4.3 și 4.4 prezintǎ cromatogramele și compușii identificați

ȋn uleiul de sunǎtoare, uleiul din sâmburi de strugure și respectiv extractul de cǎtinǎ.

Fig. 4.2. Cromatograma uleiului de sunǎtoare

Tab. 4.2. Compușii identificați ȋn uleiul de sunǎtoare prin metoda GC-MS



2 36.575 Acid 11-cis-octadecenoic 7.161

3 51.375 à-tocoferol 8.598

4 54.767 stigmasterol 7.623

5 56.368 á-sitosterol 37.343

Fig .4.3. Cromatograma uleiului din sâmburi de strugure


12

Tab. 4.3. Compuși identificați ȋn uleiul din sâmburi de strugure prin metoda GC-MS




3 33.463 Acid oleic 17.220

4 33.955 Acid octadecanoic 2.615

5 47.154 à-Tocoferol 5.935

6 49.136 stigmasterol 4.345

7 50.11 á-sitosterol 27.539

Fig. 4.5. Cromatograma extractului de cǎtinǎ

Tab. 4.4. Compuși identificați ȋn extractul de cǎtinǎ prin metoda GC-MS

Pic Timp de retenție Compus identificat pe baza spectrului de masǎ %

1 21.797 Acid malic 11.027

2 28.638 á-DL-Arabinopyranose, 1,2,3,4-tetrakis-O-) 1.801

3 30.485 Inositol 42.119

4 32.03 Glucopiranozǎ 12.099

5 32.959 Galactopiranozǎ 0.529

6 33.06 Acid palmitelaidic 2.249



9 36.564 11-cis-Acid octadecenoic 3.499

10 36.687 11-cis-Acid octadecenoic 1.244

11 41.669 testosterone 0.751

12 42.027 Glycoside, à-methyl-trtrakis-O-(trimethylsilyl)- 1.229

13 43.359 à-D-galactopiranozida 1.525

14 51.364 à-tocoferol (vitamina E) 1.905

15 56.357 á-sitosterol 7.529


13

3.2.1. Prepararea nanoparticulelor lipidice cu/fǎrǎ conținut de material bio-

activ

Nanoparticulele lipidice au fost obținute prin realizarea unei emulsionǎri ȋn stare topitǎ

cuplatǎ cu omogenizarea cu grad ȋnalt de forfecare [93]. Figura 3.9 prezintǎ schematic

procedura utilizatǎ la obținerea nanoparticulelor lipidice.

Fig. 3.9. Schema de obținere a NLC-urilor utilizând metoda emulsionǎrii ȋn fazǎ topitǎ cuplatǎ cu

omogenizarea cu grad ȋnalt de forfecare

Faza apoasǎ, constituitǎ din amestec de surfactanți și apǎ, este ȋncǎlzitǎ sub agitare la o

temperaturǎ de 85C.

Faza lipidicǎ, constituitǎ din lipide solide și lipide lichide, reprezintǎ 10% din masa

probei. Ȋn cazul obținerii SLN se utilizeazǎ doar lipide solide. Faza lipidicǎ este ȋncǎlzitǎ la

aceeași temperaturǎ sub agitare magneticǎ. Pentru nanoparticulele ȋncǎrcate cu compuși

activi, o cantitate de 0,1, 0,17% GTE sau 0,5, 1% SBE au fost adǎugate ȋn faza lipidicǎ.

Prin contactarea celor douǎ sisteme (apos și lipidic), se formeazǎ o pre-emulsie care

este menținutǎ la regim de temperaturǎ (aprox. 85 °C) timp de 1 orǎ. Dupǎ perioada de regim

termic, pre-emulsia formatǎ este supusǎ omogenizǎrii cu grad ȋnalt de forfecare, la 25 000

rpm timp de 10 min folosind High-Shear Homogenizer PRO250, Germania.

Dupǎ etapa de omogenizare, nanoemulsia formatǎ este lǎsatǎ sǎ se rǎceascǎ sub

agitare, la o temperaturǎ sub punctul de topire al amestecului lipidic utilizat, când se produce

cristalizarea nanoemulsiei, cu formarea dispersiilor de particule solide de tip SLN și NLC.

Pentru a ȋndepǎrta excesul de apǎ, dispersiile de SLN și NLC au fost ȋnghețate la

-25C timp de 24h și ulterior au fost supuse procesului de liofilizare la -55C timp de 72h.

Nanotransportorii lipidici astfel obținuți sunt sub formǎ de pulbere, de culoare alb-gǎlbuie,

ulterior supuși caracterizǎrilor fizico-chimice specifice.

Faza apoasǎ (amestec de surfactanți, 3%)

Faza lipidicǎ (amestec GS:CP, 10%) + GTE sau SBE

Pre-emulsie lipidicǎ

1. Agitare magneticǎ, 1/2h, 85oC

2. HSH, 25.000, 2 min. Agitare magneticǎ, 1/2h, 85

oC

1. Agitare magneticǎ, 85oC, 2h

2. HSH, 25.000, 10 min.

Nanostructuri lipidice ȋn

dispersie

liofilizare, - 55 oC, 72h

Nanostructuri lipidice liofilizate

Caracterizare fizico-chimicǎ (DLS, DSC, TEM, UV-VIS)

Evaluarea in vitro a activitǎții antioxidante (metoda chemiluminescenței)


14

CAPITOLUL 5

NANOPARTICULE LIPIDICE CE ȊNCAPSULEAZǍ DIFERITE

AMESTECURI VEGETALE BIO-ACTIVE

5.1. EVALUAREA STABILITǍȚII NANOPARTICULELOR LIPIDICE PE BAZA

POTENȚIALULUI ELECTROCINETIC

5.1.1. Extract de ceai verde – SLN

Analiza stabilitǎții nanodispersiilor lipidice, pe baza valorilor potențialului

electrocinetic, arată că toate sistemele SLN libere și încărcate cu GTE au o stabilitate fizică

bună. Dupǎ cum este prezentat în Tab. 5.1, potențialul zeta al nanoparticulelor lipidice

prezintǎ valori cuprinse între -34 și -52 mV [108].

Stabilitatea nanoparticulelor încărcate cu GTE este dependentă de surfactantul utilizat.

Aceasta este mai mare atunci când se utilizează Tw20. În același timp, stabilitatea

termodinamică a sistemelor GTE-SLN conținând Tw20 crește odată cu creșterea conținutului

de GTE, ȋn timp ce, valorile potențialului zeta măsurate pentru sistemele GTE-SLN ce conțin

Tw80 nu depind de cantitatea de GTE introdusǎ în matrice. Cu toate acestea, potențialul

electrocinetic este mai mic atunci când sistemul SLN este încărcat cu GTE. Valorile obținute

indică o bună stabilitate a nanoparticulelor.

Tabel 5.1. Compoziția și caracterizarea fizico-chimicǎ a sistemelor SLN libere și ȋncǎrcate cu GTE [109]

Proba Compozițiaa Caracteristici DSC

GTE % Surfactant principalb ZP

(mV)

C.I. P.t./umǎr °C

free-SLN1 - Tw20 -44,9±1,07 70,45 51,8

SLN-GTE1 0,1 Tw20 -36,3±1,07 68,15 51,8

SLN-GTE2 0,17 Tw20 -46,6±0,702 60,35 53,6/47,7/44,0

free-SLN2 - Tw80 -52,3±0,551 - -

SLN-GTE3 0,1 Tw80 -34,4±2,55 66,76 51,8

SLN-GTE4 0,17 Tw80 -34,1±0,596 62,76 53,4 a Probele sunt preparate cu 10% (w/w) amestec lipidic, cu un raport de CP:GS = (1:1)

b Un amestec de 1% lecitinǎ:poloxamer (1:1) a fost adǎugat la surfactanții neionici

5.2. CARACTERIZAREA DIMENSIONALǍ ȘI MORFOLOGICǍ (DLS, HR-TEM)


Evaluarea distribuției dimensiunii particulelor sistemelor de tip SLN a fost efectuată

pentru două tipuri de sisteme optimizate Tw20 sau cu Tw80/lecitinǎ/bloc copolimer. Figura

5.3 prezintă distribuția mărimii particulelor de SLN libere și SLN încărcate cu GTE preparate

cu Tw20 și respectiv Tw80. Compozițiile sistemelor SLN libere și încărcate cu GTE sunt date

în tabelul 5.1. În ceea ce privește eficiența celor două tipuri de surfactanți neionici utilizați,

observăm că matricea lipidică preparatǎ cu Tw20 conduce la un diametru mediu al

particulelor mai mic pentru matricea lipidicǎ liberǎ (Zave = 119 nm), în timp ce pentru

matricea preparatǎ cu Tw80 valoarea măsurată este mai mare: Zave = 211 nm.


15

Ca o primă observație, putem afirma că dimensiunea tuturor particulelor sistemelor

SLN crește cu conținutul de GTE. Cele mai mari valori sunt obținute cu surfactant Tw80 (a se

vedea fig. 5.3). Mai mult decât atât, valorile obținute pentru Pdl, variind ȋntre 0,2-0,27,

sugereazǎ un grad bun de omogenitate pentru toate sistemele investigate. Observăm că Pdl

depinde de tipul de surfactant utilizat, fiind aproape la fel pentru toate sistemele SLN

preparate cu Tw20, în timp ce, atunci când este folosit surfactantul Tw80 Pdl crește odată cu

creșterea conținutului de ceai verde.

Aceste evaluări de dimensiune au fost confirmate prin măsurători de microscopie

electronică de transmisie (TEM). Acestea au fost efectuate în scopul de a obține informații cu

privire la dimensiunea reală și caracteristicile morfologice ale sistemelor SLN.

0

50

100

150

200

250

300

Free

-SLN

1

SLN

-GTE

1

SLN

-GTE

2

Free

-SLN

2

SLN

-GTE

4

SLN

-GTE

5

Zav

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Pd

l Zav

Pdl

Fig. 5.3. Analiza dimensionalǎ DLS a sistemelor GTE-SLN

Fig. 5.4. Imaginea TEM pentru proba SLN-GTE2

Figura 5.4 prezintă, ca exemplu, una din imaginile TEM ale sistemelor SLN. Se poate

vedea că nanoparticulele lipidice obținute sunt aproape de formă sferică și distribuția

dimensiunii lor este îngustǎ. Din imaginea TEM, rezultă că distribuția dimensiunilor

particulelor este în intervalul 100-200 nm. Este bine cunoscut faptul că încorporarea de

medicamente în matricea lipidică duce întotdeauna la creșterea dimensiunii, în comparație cu

SLN liber [110]. Coroborând toate informațiile obținute cu privire la dimensiunea

nanoparticulelor se poate afirma că GTE a fost încărcat în SLN.

5.3. CARACTERIZAREA STRUCTURALǍ A SISTEMELOR SLN (UV-VIS-NIR)


Pentru a demonstra prezența GTE în sistemele SLN și pentru a verifica stabilitatea

după încapsulare, spectrele electronice ale sistemelor SLN libere și GTE-SLN au fost

înregistrate și comparate cu cele ale GTE ȋn pudrǎ (figura 5.7). Ceaiul verde absoarbe în

domeniul UV-VIS, cu absorbanță maximă la dubletul 312-364 nm. Culoarea galbenă a


16

pulberii provine de la compuși polifenolici. Spectrele de reflexie UV-VIS ale sistemelor SLN

încărcate cu GTE, preparate cu surfactanți neionici de tip Tw20 (fig. 5.7 a) și Tw80 (fig. 5.7

b) dovedesc clar prezența GTE în nanoparticule lipidice, prin intermediul umerilor în regiunea

menționatǎ mai sus, ce însoțesc benzile de absorbție caracteristice surfactanților în regiunea

UV. Cu toate acestea, se poate observa lipsa benzii de la 488 nm provenitǎ de la cafeinǎ, din

GTE ȋn pudrǎ, sugerând că acest compus nu este încapsulat în interiorul SLN.

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

220 420 620 820 1020 1220 1420 1620 1820 2020

Wavelength (nm)

Refl

ecta

nce %

SLN_Tw20

GTE

SLN_Tw20_0.1%GTE

SLN_Tw20_0.17%GTE

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

220 420 620 820 1020 1220 1420 1620 1820 2020

Wavelength (nm)

Refl

ecta

nce %

SLN_Tw80

GTE

SLN_Tw80_0.1%GTE

SLN_Tw80_0.17%GTE

Fig. 5.7. Spectrele de absorbție UV-VIS ale GTE și ale sistemelor SLN cu și fǎrǎ GTE


ȊNCAPSULAREA AMESTECULUI BIO-ACTIV (UV-VIS-NIR, DSC)


Conform ecuației Thomson, temperatura punctului de topire scade cu scǎderea

dimensiunii particulelor [111]. Transformarea materialului lipidic pudrǎ în nanoparticule

lipidice schimbă comportamentul de topire al lipidelor, fiind însoțită de apariția unor

modificări α și β cu temperaturi de topire inferioare. Ȋn general, temperatura inițialǎ și punctul

de topire al nanoparticulelor lipidice sunt cu aproximativ 1-3 °C mai scăzute în comparație cu

materialul original. Agenții tensioactivi distribuiți ȋn faza lipidicǎ topitǎ în timpul procesului

de preparare pot denatura cristalizarea, ceea ce duce la o entalpie de topire mai scăzutǎ. Figura

5.9 prezintă curbele de topire DSC corespunzătoare sistemelor SLN încărcate, comparativ cu

sistemul SLN liber. Parametrii deduși din aceste curbe sunt prezentați în tabelul 5.1.

a

b


17

Sistemele SLN încărcate cu GTE și preparate cu două tipuri de surfactanți neionici

prezintă un comportament endotermic similar într-un interval de temperatură adecvat. Acest

lucru indică faptul că tipul de surfactant neionic utilizat nu conduce la modificări

semnificative în rețeaua lipidicǎ. Temperaturile de topire ale sistemelor SLN încărcate cu

extract de ceai verde sunt deplasate cu aproximativ 1-2 °C în comparație cu sistemul SLN

liber. Aceasta sugerează o ușoară creștere a diametrului dimensiunii particulelor, confirmatǎ

de analiza DLS.

Fig. 5.9. Curbele DSC pentru sistemele SLN ȋncǎrcate cu GTE, ȋn comparație cu sistemul SLN liber: 1

- SLN1-liber; 2 – SLN-GTE2; 3 – SLN-GTE4

5.5. DETERMINAREA PROPRIETǍȚILOR ANTIOXIDANTE


Proprietățile antioxidante ale sistemelor SLN dezvoltate au fost măsurate prin metoda

chemiluminescenței, care este o tehnică adecvată pentru a studia prezența radicalilor liberi de

oxigen [113]. În scopuri comparative soluțiile sistemelor SLN libere, sistemele SLN ȋncǎrcate

cu GTE și GTE în pudrǎ au fost expuse la un sistem generator de radicali liberi care

elibereazǎ o energie ridicatǎ, radicali liberi intermediari.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Free-

SLN

1GTE

SLN

-GTE1

SLN

-GTE2

Free-

SLN

2GTE

SLN

-GTE3

SLN

-GTE4

AA

%

Fig. 5.11. Activitatea antioxidantǎ a sistemelor GTE-SLN

Capacitatea antioxidantă depinde de diverși factori, cum ar fi: tipul de surfactant, tipul

și concentrația extractului încapsulat, tipul de lipide solide. Lipidele solide alese pentru

procedura de sinteză a sistemelor SLN au fost cetil palmitatul și gliceril stearatul, care conduc

la formarea acizilor grași liberi. Este cunoscut faptul că acizii grași saturați supuși unui proces

de peroxidare conduc la formarea radicalilor liberi de tip peroxi și hidroperoxizi [114].

În cazul tuturor sistemelor SLN încărcate cu GTE, valorile activitǎții antioxidante sunt

mai mari decât cele observate pentru sistemele SLN libere sau GTE în pudrǎ. Acest lucru


18

duce la un efect sinergetic între matricea lipidică structurală complexă și GTE bioactiv

încapsulat. Utilizarea de surfactanți neionici Tw20 și Tw80, precum și a două concentrații

diferite de extract bioactiv (0,1 și 0,17%), nu conduce la diferențe semnificative ale activitǎții

antioxidante. Cea mai mare activitate antioxidantǎ a fost obținutǎ în cazul ȋn care s-a folosit

Tw20 drept surfactant și o concentrație de 0,17% GTE (AA=99,6%), în timp ce, cea mai mică

valoare a fost obținutǎ când s-a utilizat Tw80 drept surfactant și o concentrație de 0,1% GTE

(AA=87,3%).

5.6. DETERMINAREA PROPRIETǍȚILOR ANTIMICROBIENE


Free-SLN1

SLN-GTE1

SLN-GTE2

GTE

Fig. 5.13. Activitatea antibacteriǎ a sistemelor SLN-GTE ȋmpotriva bacteriei Escherichia coli

Tab. 5.3. Diametrul zonei de inhibare a GTE-SLN împotriva Escherichia Coli

Probǎ

IZ pentru

microorganisme

patogene, mm

Escherichia coli

S 11,17±0,29

GTE 28,3±0,28

Free-SLN1 15,3±0,30

SLN-GTE1 13,0±0,22

SLN-GTE2 20,0±0,21

Free-SLN2 -

SLN-GTE3 12,17±0,29

SLN-GTE4 19,1±0,21

Activitatea antibacteriană a sistemelor SLN libere, SLN ȋncǎrcate cu GTE și GTE ȋn

pudrǎ asupra microorganismelor a fost determinată prin măsurarea dimensiunii zonei de


19

inhibiție (IZ, mm). Au fost luate în considerare doar zone clare, distincte de inhibare din jurul

sondelor de agar. Rezultatele raportate sunt valorile medii a trei experimente și sunt

prezentate cu abaterile standard (SDS).

S-au testat sistemele SLN libere și încărcate cu extract de ceai verde pentru activitate

antibacteriană potențialǎ împotriva Escherichia coli care este acceptatǎ ca un indicator al

contaminării produselor alimentare. Toate sistemele SLN testate au rezistat la acestǎ bacterie.

Mai mult decât atât, unele dintre sistemele GTE-SLN sunt foarte eficiente împotriva

dezvoltării bacteriei.

Cea mai bună activitate antibacteriană împotriva bacteriei testate a fost obținutǎ pentru

proba SLN-GTE2 preparatǎ cu Tw20 și conținând 0,17 % GTE pentru care a fost observată o

zonă de inhibiție de 20,00 mm. Cea mai micǎ valoare a fost înregistrată pentru proba SLN-

GTE4 preparatǎ cu Tw80 și o concentrație de 0,17 % GTE. Aceste rezultate sunt în

concordanță cu cele obținute din analiza DLS și măsurătorile activitǎții antioxidante. Extractul

de ceai verde bioactiv prezintă o bună activitate antibacteriană, cu o zonă de inhibiție de 28

mm comparativ cu 11,17 mm obținutǎ pentru soluția de etanol utilizatǎ ca referință.

CAPITOLUL 6

TRANSPORTORI LIPIDICI NANOSTRUCTURAȚI CE

ȊNCAPSULEAZǍ DIFERITE AMESTECURI VEGETALE BIO-ACTIVE

6.1. EVALUAREA STABILITǍȚII NANOPARTICULELOR LIPIDICE PE BAZA

POTENȚIALULUI ELECTROCINETIC

6.1.1. Extract de ceai verde – NLC

Analiza stabilitǎții nanotransportorilor lipidici nanostructurați, pe baza valorilor

potențialului electrocinetic, aratǎ cǎ toate sistemele NLC-GTE prezintǎ o stabilitate fizicǎ

excelentǎ, cu valorile electronegative cuprinse ȋntre -30 mV și -58 mV [108, 115], (tabelul

6.1), [116].

În ceea ce privește cele trei tipuri de uleiuri vegetale utilizate pentru obținerea de matrici

lipidice tendința de creștere a stabilității este ȋn ordinea urmǎtoare: GSO<HPO<SBO. Pentru

NLC preparate cu cele două tipuri de surfactanți, stabilitatea pentru nanostructurile preparate

cu Tw20 este mai bună decât pentru nanostructurile preparate cu Tw80 în cazul uleiurilor

GSO și HPO, dar inversǎ pentru nanoparticule încărcate cu SBO.

O analiză detaliată a valorilor potențialului zeta obținute pentru diferite variante de

compoziții scoate în evidență unele schimbări sistematice care permit diferențierea între

contribuțiile uleiurilor vegetale co-încărcate. Într-adevăr, atunci când comparǎm stabilitatea

NLC libere cu cea a NLC încărcate, aceasta crește cu conținutul de GTE la limita de încărcare

redusă (0,1 %), în timp ce scade la o ȋncǎrcare cu un conținut mai mare de GTE (0,17 %),

pentru ambele tipuri de surfactanți utilizați.

În cazul uleiului de sunǎtoare există o scădere semnificativă a valorilor ZP, de 15-20

mV, fără a se observa o influență considerabilă a conținutului de GTE sau a tipului de

surfactant utilizat. Totuși toate sistemele au rămas pe un domeniu de stabilitate ridicat.

Sistemele NLC încărcate cu GTE au prezentat în toate cazurile stabilitate similarǎ sau mai

mare în comparație cu sistemele NLC libere atunci când s-a folosit uleiul de cǎtinǎ.

Acest comportament sugerează că, în cazul utilizǎrii uleiului de sunǎtoare și în special a

uleiului din sâmburi de strugure prin creșterea conținutului de GTE, capacitatea de încărcare

ȋn matricea lipidică este depășită, și astfel, stabilitatea sistemului este diminuatǎ. Această

concluzie este susținută de analiza comparativă utilizând DSC care arată că nanoparticulele

preparate cu GSO și o concentrație de 0,17 % GTE suferǎ o rearanjare ȋn rețeaua lipidicǎ,


20

ceea ce duce la o grilă mai ordonatǎ și, ca urmare, la o potențialǎ expulzare a substanței

active.

Dimpotrivă, pentru SBO stabilitatea NLC-urilor încărcate este semnificativ mai mare în

comparație cu NLC-urile libere. Acest fapt poate fi interpretat printr-o mai bună

compatibilitate între GTE și componentele SBO, și astfel, este posibilǎ o acomodare mai bună

a ambelor uleiuri în matricea lipidică.

Tab. 6.1. Compoziția și caracterizarea fizico-chimicǎ a sistemelor NLC libere și ȋncǎrcate cu GTE

[117] Proba Compoziția

a Caracteristici DSC

GTE

%

Surfactantp

rincipalb

Ulei ZP

(mV)

C.I. P.t./umǎr °C

free-NLC1 - Tw20 GSO -37,8±1,87 63,85 50,4

NLC-GTE1 0,1 Tw20 GSO -42,8±0,404 - -

NLC-GTE2 0,17 Tw20 GSO -30,5±0,808 79,49 49,1/58

free-NLC2 - Tw80 GSO -33,9±1,63 - -

NLC-GTE3 0,1 Tw80 GSO -35,8±0,608 - -

NLC-GTE4 0,17 Tw80 GSO -22,6±2,25 82,26 50,1

free-NLC3 - Tw20 HPO -55,3±0,721 - -

NLC-GTE5 0,1 Tw20 HPO -42,1±1,00 79,99 -

NLC-GTE6 0,17 Tw20 HPO -43,7±0,551 76,53 49,4

free-NLC4 - Tw80 HPO -57,9±0,361 92,36 49/57,5

NLC-GTE7 0,1 Tw80 HPO -41,1±0,60 83,33 -

NLC-GTE8 0,17 Tw80 HPO -37,6±1,06 88,07 49,1/41,1/55,9

free-NLC5 - Tw20 SBO -44,7±0,819 76,05 50,5/59,5

NLC-GTE9 0,1 Tw20 SBO -44,6±0,643 - -

NLC-GTE10 0,17 Tw20 SBO -46,4±0,520 82,83 51/58,2

free-NLC6 - Tw80 SBO -40,5±0,473 - -

NLC-GTE11 0,1 Tw80 SBO -47,5±0,624 - -

NLC-GTE12 0,17 Tw80 SBO -54,6±1,91 89,36 49,1 a

Toate sistemele NLC au fost preparate cu 10% (w/w) amestec lipidic, cu un raport de

CP:GS:GSO/HPO/SBO = (1,16:1,16:1) .

b Un amestec de 1% lecitinǎ:poloxamer (1:1) a fost adǎugat surfactanților neionici

6.2. CARACTERIZAREA DIMENSIONALǍ ȘI MORFOLOGICǍ (DLS, HR-TEM)


Evaluarea distribuției mărimii NLC-urilor a fost realizată în sisteme optimizate cu Tw20

sau Tw80/lecitinǎ/copolymer tip bloc, în funcție de concentrațiile de GTE încapsulate și de

tipul de ulei vegetal utilizat în formarea matricei lipide. Figura 6.3 prezintă distribuția mărimii

particulelor celor trei serii NLC-GTE de probe preparate cu GSO, HPO și respectiv SBO.


21

Compozițiile tuturor NLC-urilor libere și a NLC-urilor încărcate cu GTE sunt date în tabelul

6.1.

În ceea ce privește eficacitatea celor trei tipuri de uleiuri vegetale utilizate, se observă că

matricea lipidică preparatǎ cu GSO (figura 6.3a) prezintă cel mai mic diametru mediu al

particulelor pentru matricea lipidică liberă și anume Zave = 125,6 nm, în timp ce pentru

celelalte două matrici preparate cu HPO și SBO sunt obținute valori relativ ridicate.

Ca primă observație, putem afirma că atât dimensiunea NLC-urilor cât și valorile Pdl

cresc cu conținutul de GTE pentru toate cele trei tipuri de uleiuri vegetale utilizate și sunt

obținute valori mai mari atunci când se utilizează surfactantul Tw80, comparativ cu Tw20

(vezi tabelul 6.1). Mai mult decât atât, valorile scăzute observate pentru Pdl, variind ȋntre

0,15-0,30, indică un grad bun de omogenitate pentru toate sistemele investigate, cu o tendință

de creștere similară pentru Tw80 față de Tw20 și cu creșterea conținutului de ceai verde.

0

50

100

150

200

250

300

Free-N

LC1

NLC-GTE1

NLC-GTE2

Free-N

LC2

NLC-GTE3

NLC-GTE4

Zav

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Pd

l Zav

Pdl

0

50

100

150

200

250

300

350

Free-N

LC3

NLC-GTE5

NLC-GTE6

Free-N

LC4

NLC-GTE7

NLC-GTE8

Zav

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Pd

l Zav

Pdl

0

50

100

150

200

250

300

350

Free

-NLC

5

NLC

-GTE

9

NLC

-GTE

10

Free

-NLC

6

NLC

-GTE

11

NLC

-GTE

12

Zav

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Pd

l Zav

Pdl

Fig. 6.3. Analiza dimensionalǎ DLS a sistemelor NLC-GTE preparate cu diferite uleiuri: GSO (a),

HPO (b) și SBO (c)

Ca valori limită, cea mai mică dimensiune medie a mărimii diametrului particulei a fost

obținută atunci când s-a utilizat GSO, Tw20 ca surfactant neionic principal și o concentrație

a

b

c


22

de 0,1 % GTE (Zave = 145,1 nm; Pdl 0,203), în timp ce, cele mai mari diametre (Zave =

317,2 nm și Pdl 0,294) au fost obținute pentru SBO, surfactantul Tw80 și o concentrație de

0,17 % GTE.

Aceste evaluări de dimensiune au fost confirmate prin analiza de microscopie

electronică de transmisie (TEM) așa cum va fi discutat mai târziu.

Imagini TEM reprezentative de NLC preparate cu cele trei tipuri de uleiuri vegetale,

Tw20 folosit ca surfactant neionic și încărcate cu 0.17 % GTE sunt prezentate în figura 6.4.

Se poate observa că particulele sunt de formă sferică și nu depind de tipul de ulei

utilizat. Dimensiunea diametrului mediu a acestor particule este cuprinsǎ între 195 nm și 257

nm. Această observație confirmă o structură cristalină mai puțin ordonatǎ a fazei lipidice

(forma α de cristalizare), știind că o structură ordonată (forma β) este caracteristicǎ pentru

cristale alungite [63, 123]. Prevenirea conformației β este de dorit, deoarece este asociatǎ cu

expulzarea componentului activ încapsulat [124]. Această observație este confirmată și de

analiza DSC. Dimensiunea particulelor diferitelor formulări este în bună concordanță cu

datele DLS (figura 6.3).

Fig. 6.4. Imagini de microscopie electronicǎ de transmisie pentru NLC-GTE2 preparat cu GSO (a);

NLC-GTE6 preparat cu HPO (b); NLC-GTE10 preparat cu SBO (c)

a

c

b


23

6.3. CARACTERIZAREA STRUCTURALǍ (UV-VIS-NIR)


Compoziția chimică, bogatǎ ȋn polifenoli specifici extractelor vegetale co-încărcate în

matricile lipidice studiate, determină NLC-urilor spectre UV-VIS specifice. Acestea sunt

foarte utile în evaluarea NLC-urilor încǎrcate, chiar la scară nano ȋntrucât componentele GTE

absorb puternic în domeniul UV. Prin urmare, spectrele de reflexie UV-VIS reprezintă o

dovadă clară a prezenței GTE în NLC-urile preparate cu trei tipuri de uleiuri vegetale.

Deoarece stabilitatea GTE este o condiție de bază pentru a menține proprietățile sale, pentru a

observa prezența și stabilitatea acestuia după încapsulare, au fost comparate spectrele

electronice ale NLC-urilor încărcate cu GTE, NLC-urilor libere și GTE ȋn pudrǎ.

Spectrul electronic al ceaiului verde prezintă o absorbţie slabă pe tot domeniul vizibil,

cu o absorbanţă maximă la dubletul 312-364 nm care conferă culoarea galbenă provenită de la

structurile polifenolice, care se prelungeşte cu absorbţie semnificativă la 488 nm, provenită de

la structuri chinonice și anume, cafeinǎ.

Aceste benzi din domeniul vizibil îşi pun amprenta pe spectrul electronic al probei în

care s-a încapsulat extractul de ceai verde în matricea lipidică (NLC-GTE2 (fig. 6.7 a)). În

proba NLC-GTE2 banda de absorbție de la 312 nm este deplasată la 280 nm și sunt

evidențiate în mod clar benzile n-π* ale compușilor fenolici. În domeniul vizibil, un umăr

semnificativ la 366 nm rămâne în continuare.

Proba NLC1-liber prezintă un maxim pronunţat în domeniul UV la 248 nm, cu un umăr

la 268 nm care poate fi atribuit dublelor legături din structura acizilor nesaturaţi (oleic,

linoleic). Umărul de la 268 nm poate fi o contribuţie din structura fenolică a tocoferolului,

component majoritar în uleiul din sâmburi de strugure.

Într-o probă similară, NLC2-liber (fig. 6.7 b), preparat cu un agent activ de suprafață

mai voluminos Tw80, spectrul electronic al probei păstrează în principal aliura matricei

lipidice, dar are loc o inversare a intensităţii benzilor de la 258 nm respectiv 282 nm care apar

uşor deplasate la 260 nm respectiv 284 nm (vezi fig. 6.7 b). Totodată, partea dinspre vizibil

este uşor lărgită ca urmare a contribuţiei benzilor chinonice de la 488 nm din extractul de ceai

verde. Se poate aprecia că acest component (Tween 80) ar diminua capacitatea de încapsulare

a principiului activ (GTE) în matricea lipidică.

Ȋn proba preparată cu HPO (fig. 6.7 c) prezenţa uleiului de sunătoare este pusă în

evidenţă prin umărul de la 310 nm care prin banda prelungită spre domeniul vizibil conferă

culoarea slab gălbuie a acestuia.

În proba NLC încapsulat cu GTE (NLC-GTE6) prezenţa principiului activ este clar

evidenţiată prin benzile de la 288 nm (deplasat de la 312 nm) şi 374 nm (deplasat de la 364

nm).

Într- o probă similară, NLC4 liber (fig. 6.7 d), preparatǎ cu un surfactant mai voluminos

Tw80, acesta produce de asemenea unele modificări batocrome în matricea lipidică (250 nm

faţă de 242 nm) respectiv (300 nm faţă de 288 nm). De asemenea unele modificări minore în

intensitatea şi largimea benzilor specifice ceaiului verde pot fi observate şi în proba

încapsulată (fig. 6.7 d).

În proba NLC5-liber (fig. 6.7 e) preparatǎ cu SBO, prezenţa acestuia este clar pusă în

evidenţă prin banda intensă de la 446 nm specifică culorii roşii a acestui extract. Încapsularea

extractului de ceai verde în această matrice lipidică este evidenţiată prin prezenţa benzii din

vizibil de la 452 nm a cărei poziţie este intermediară între umărul de la 488 nm din GTE şi

banda cătinei de la 446 nm. În plus, se remarcă contribuţia şi a benzii de la 364 nm din GTE

prin atenuarea minimului probei încapsulate NLC - GTE10 (fig. 6.7 e) de la 446 nm.

Înlocuirea surfactantului Tw20 cu Tw80 aduce o uşoară modificare a benzii cătinei din

domeniul vizibil de la 446-438 nm în matricea lipidică. Se constată unele modificări şi pentru

benzile probei de GTE încapsulat, cu unele deplasări batocrome (286 nm-proba NLC-GTE10


24

– 298 nm – proba NLC- GTE12), respectiv de la 452 nm la 466 nm. Şi în acest caz

modificările se pot atribui efectelor sterice induse în matricea lipidică de substituentul alchilic

mai voluminos (Tw80).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

220 440 660 880 1100 1320 1540 1760 1980 2200

Wavelength (nm)

Refl

ecta

nce %

Free-NLC1

GTE

NLC-GTE2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

220 440 660 880 1100 1320 1540 1760 1980 2200

Wavelength (nm)

Refl

ecta

nce %

Free-NLC2

GTE

NLC-GTE4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

220 440 660 880 1100 1320 1540 1760 1980 2200

Wavelength (nm)

Refl

ecta

nce %

Free-NLC3

GTE

NLC-GTE6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

220 440 660 880 1100 1320 1540 1760 1980 2200

Wavelength (nm)

Refl

ecta

nce %

Free-NLC4

GTE

NLC-GTE8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

220 440 660 880 1100 1320 1540 1760 1980 2200

Wavelength (nm)

Refl

ecta

nce %

Free-NLC5

GTE

NLC-GTE10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

220 440 660 880 1100 1320 1540 1760 1980 2200

Wavelength (nm)

Reflectan

ce %

Free-NLC6

GTE

NLC-GTE12

Fig. 6.7. Spectrele de absorbție UV-VIS pentru NLC-uri cu și fǎrǎ GTE comparativ cu spectrele de

absorbție ale GTE ȋn pudrǎ

a b

c d

e f


25


ȊNCAPSULAREA AMESTECULUI BIO-ACTIV (UV-VIS-NIR, DSC)

6.4.1. Green tea extract – NLC

După cristalizare, particulele pot suferi diferite tranziții polimorfe, care sunt determinate

în principal de tipul constituenților lipidici [128]. Structura cristalină lipidicǎ este în general

corelată cu capacitatea de încǎrcare cu substanțǎ activǎ. Pe mǎsurǎ ce NLC-urile trec de la o

stare solidǎ mai puțin ordonatǎ la o stare solidǎ mai ordonatǎ, apare fenomenul nedorit de

eliberare bruscǎ a componentei active, ȋn detrimentul unei eliberǎri controlate a acesteia. Prin

urmare, este esențialǎ verificarea stǎrii lipidice solide și polimorfismul nanoparticulelor

lipidice [129].

Probele NLC încărcate cu GTE, preparate cu cele trei tipuri de uleiuri vegetale au un

comportament endotermic similar, într-un interval de temperatură adecvat. Aceasta indică

faptul că tipul de ulei vegetal utilizat nu conduce la modificări semnificative în rețeaua

lipidicǎ.

În intervalul de temperatură 30-80 °C, s-a observat prezența unui maxim endoterm

principal în jurul valorii 49-51 °C. Acesta este însoțit de un umăr care apare la 57-59 °C.

Vârful este atribuit în principal lipidelor solide CP și GS, în timp ce umărul este rezultatul

prezenței uleiurilor vegetale (GSO, HPO și SBO).

Curba endotermǎ la temperaturi sub 60 °C sugerează prezența diferitelor faze cristaline

lipidice mai puțin ordonate. Acest comportament era de așteptat, datorită amestecului de

lipide complexe utilizat pentru prepararea matricei purtătoare. Obținerea unei structuri

cristaline ordonate este puțin probabilǎ datorită creșterii numărului de componente lipidice

lichide, și astfel, heterogenitatea lor chimicǎ poate fi considerată un avantaj.

Prin compararea curbelor DSC ale probelor de NLC cu și fǎrǎ GTE și amestecurilor fizice

de lipide (figurile 6.9 a, b, c) pot fi făcute următoarele observații:

Prezența surfactanților conferă rețelei lipidice un aranjament ordonat. Se poate observa

prin îngustarea domeniului de topire, în cazul probelor de NLC comparativ cu

amestecurile fizice de lipide solide și lichide.

Temperaturile de topire ale probelor de NLC încărcate cu GTE sunt decalate cu

aproximativ 1 °C fațǎ de cele ale NLC-libere, indicând o perturbare a matricei lipidice

și o ușoară creștere a diametrului particulelor. Mai mult decât atât, prin compararea

NLC-urilor încărcate cu GTE cu NLC-urile libere s-a observat că încorporarea GTE în

matrice lipidică solidǎ a condus la o scădere a aranjamentului cristalin, subliniatǎ de o

intensitate scăzută a picului endoterm. Acest fapt a fost observat pentru toate uleiurile

vegetale utilizate (fig. 6.9 a, b, c).

Sistemele NLC încărcate cu GTE, preparate cu surfactantul de tip Tw20 și cu GSO

(fig. 6.9 a) indică un aranjament lipidic similar cu cel al sistemului NLC-liber. Pe de

altă parte, NLC-urile încărcate cu GTE, preparate cu surfactantul de tip Tw20 indicǎ

un aranjament cristalin mai puțin ordonat. Intensitatea picului endotermic scade în

comparație cu cea a sistemelor NLCS libere.


26

Fig. 6.9. Comparație ȋntre curbele DSC pentru NLC-uri cu și fǎrǎ GTE și curbele DSC pentru

amestecurile fizice de lipide: a- NLC-uri preparate cu GSO (1 – pudrǎ, 2 - NLC-GTE2, 3 – NLC-

GTE4, 4 - NLC1-liber); b – NLC-uri preparate cu HPO (1 - pudrǎ, 2 – NLC-GTE6, 3 – NLC-GTE8, 4

- NLC4-liber); c – NLC-uri preparate cu SBO (1 - pudrǎ, 2 – NLC-GTE10, 3 – NLC-GTE12, 4 – NLC5-liber)

c

b

a


27

6.5. DETERMINAREA PROPRIETǍȚILOR ANTIOXIDANTE

6.5.1. Extract ceai verde – NLC

Efectul benefic al ceaiului verde asupra sănătății este recunoscut datoritǎ proprietǎților

sale antioxidante [132].

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Free

-NLC

1

GSO

GTE

NLC

-GTE

1

NLC

-GTE

2

Free

-NLC

2

GSO

GTE

NLC

-GTE

3

NLC

-GTE

4

AA

%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Free

-NLC

3

HPO

GTE

NLC

-GTE

5

NLC

-GTE

6

Free

-NLC

4

HPO

GTE

NLC

-GTE

7

NLC

-GTE

8

AA

%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Free-

NLC

5

SBO

GTE

NLC

-GTE

9

NLC

-GTE

10

Free-

NLC

6

SBO

GTE

NLC

-GTE

11

NLC

-GTE

12

AA

%

Fig. 6.11. Activitatea antioxidantǎ a NLC-GTE: a – NLC preparate cu GSO, b – NLC preparate cu

HPO, c – NLC preparate cu SBO

În toate probele testate (fig. 6.11 a, b, c), activitatea antioxidantă (AA) a NLC-urilor

ȋncǎrcate cu GTE a fost îmbunătățită în comparație cu cea a GTE pur. Cea mai mare diferență

a fost observată la concentrații scăzute de GTE. Prin creșterea conținutului de GTE s-a

observat o creștere mică a AA pentru NLC-urile ȋncǎrcate cu GTE pentru ambele tipuri de

agenți tensioactivi și pentru toate cele trei tipuri de uleiuri vegetale utilizate. Există doar o

mică diferență între AA a probelor NLC-ȋncǎrcate cu GTE și preparate cu cele două tipuri de

surfactanți. Acest lucru este valabil și pentru cele trei tipuri de uleiuri vegetale.

a

b

c


28

Prima explicație pentru comportamentul antioxidant manifestat de probele NLC

ȋncǎrcate cu GTE a fost atribuitǎ dimensiunii medii și efectului de încapsulare a GTE. Cu

toate acestea, având în vedere proprietățile antioxidante ale celor trei tipuri de uleiuri vegetale

utilizate, AA a sistemelor NLC libere ar trebui să fie, de asemenea, luatǎ în considerare.

Ținând seama de toate aceste aspecte, capacitatea antioxidantă a probelor NLC ȋncǎrcate

cu GTE poate fi determinatǎ de performanțele matricelor lipidice complexe prin intermediul

unei sinergii între componentele lipidice. Într-adevăr, acizii grași de la toate cele trei tipuri de

uleiuri vegetale utilizate pot acționa în sinergie, afectând astfel AA totală a sistemelor NLC

obținute. În acest fel, s-a demonstrat că abilitatea de a capta radicalii liberi din uleiuri vegetale

este mai mare decât cea a altor antioxidanți individuali, deoarece există multe grupǎri libere

care sǎ-i dezactiveze.

6.6. DETERMINAREA PROPRIETǍȚILOR ANTIMICROBIENE


Tab. 6.3. Diametrul zonei de inhibiție a GTE-NLC ȋmpotriva Escherichia Coli

Uleiurile vegetale pot fi o sursă bogată de agenți antimicrobieni. Din acest motiv,

probele de NLC ȋncǎrcate cu GTE au fost testate pentru capacitatea lor de a dezvolta o

activitate antimicrobiană împotriva Escherichia coli, care este și un indicator de contaminare

a alimentelor. Zona de inhibiție a fost măsurată și exprimată în milimetri. Toate experimentele

au fost realizate în triplicat, iar rezultatele sunt raportate ca medie a celor trei experimente.

Rezultatele reprezentative ale activității antibacteriene a NLC-urilor ȋncǎrcate cu GTE

împotriva Escherichia coli sunt date în Tabelul 6.3.

Rezultatele cercetǎrilor au arătat o variație semnificativă în activitatea antibacteriană a

sistemelor NLC-GTE, care depinde de uleiurile vegetale utilizate și de concentrația de GTE.

Sample

IZ pentru

microorganisme

patogene, mm

Escherichia coli

S 13,0±0,17

GTE 28,3±0,28

Free-NLC1 11,3±0,11

NLC-GTE1 12,0±0,2

NLC-GTE2 28,3±0,57

Free-NLC2 -

NLC-GTE3 -

NLC-GTE4 -

Free-NLC3 12,0±0,2

NLC-GTE5

NLC-GTE6 33,3±0,28

Free–NLC4 -

NLC-GTE7 -

NLC-GTE8 -

Free-NLC5 19,7±0,55

NLC-GTE9 11,3±0,11

NLC-GTE10 15,0±0,3

Free-NLC6 -

NLC-GTE11 13,0±0,15

NLC-GTE12 15,0±0,3


29

În ceea ce privește uleiurile vegetale utilizate pentru prepararea NLC-urilor, activitatea lor

antibacteriană este în creștere ȋn ordinea: SBO<GSO<HPO.

Toate probele de NLC-GTE testate au fost foarte eficiente împotriva Escherichia coli.

Este evident din prezentul studiu cǎ sistemele NLC ȋncǎrcate cu GTE au o bună activitate

antimicrobiană.

CAPITOLUL 7

PREPARAREA FILMELOR SUBȚIRI ȘI DETERMINAREA

PROPRIETǍȚILOR OPTICE LINEARE

7.3. CARACTERIZAREA SPECTROSCOPICǍ

7.3.1. Spectrele de absorbție UV-VIS

Spectrele de absorbție UV-VIS au fost obținute utilizând un spectrometru JASCO.

După cum se poate observa din Fig. 7.9, atât GTE și ADN-ul prezintă un domeniu larg de

transparență ȋn domeniul vizibil. Absorbția ADN-ului este situatǎ la aproximativ 270 nm și se

suprapune cu banda de absorbție a GTE în domeniul de lungimi de undă 250-320 nm. Dincolo

de lungimea de undă de 320 nm absorbanța provine de la GTE care se manifestă printr-un

umăr (vezi Fig. 7.9). Aceste benzi de absorbție ale GTE duc la fluorescențǎ atunci când se

excitǎ cu luminǎ la o lungime de undă corespunzătoare. Partea din dreapta a Fig. 7.9 prezintă

benzile de absorbție ale filmelor subțiri obținute pentru complexul ADN-GTE cu diferite

concentrații de GTE fațǎ de ADN. Se observă o creștere a absorbanței la 340-360 nm cu

creșterea concentrației de GTE.

Fig. 7.9. Spectre de absorbţie UV-VIS pentru complexul ADN-GTE 15 % şi soluţii de GTE.

Figura inserată indică umerii de la energie joasă ale benzilor de absorbţie pentru diferite

concentraţii de GTE (spectre de absorbție ale filmelor de ADN-GTE)[143, 144]

7.3.2. Spectre de fluorescențǎ

Spectrele de fluorescență au fost obținute cu ajutorul unui spectrofluorometru FP-

6500, JASCO, Japonia și sunt prezentate în Figurile 7.11 (a, b) pentru soluțiile studiate și

filmele subțiri preparate cu AND-GTE. Figura 7.11 (a) prezintă spectrele de fluorescență

obținute ȋn aceleași condiții pentru GTE singur și complexul ADN-GTE, excitate la o

lungimea de undǎ de 355 nm. Fluorescența complexului este semnificativ mai mare decât cea

a GTE singur și arată influența matricei de ADN. O astfel de îmbunătățire a intensitǎții

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

200 250 300 350 400 450 500

Wavelenght (nm)

Op

tical d

en

sit

y

DNA-GTE15%

GTE

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

300 320 340 360 380 400 420 440

Wavelength (nm)

Op

tical d

en

sit

y

DNA-GTE5%

GTE

DNA-GTE10%

DNA-GTE15%


30

fluorescenței în matricea de ADN a fost semnalată și pentru un alt luminofor care este

sulforodamina [145, 146]. Figura 7.11 (b) prezintǎ fluorescența filmelor subțiri de ADN-GTE,

la diferite concentrații de GTE. Măsurătorile au fost efectuate în aceleași condiții ca și pentru

soluții. Se observă creșterea intensității fluorescenței cu creșterea concentrației de GTE pentru

filmele ce conțin 5% GTE și 10% GTE. Pentru filmele ce conțin 15 % GTE fluorescența este

aproape la fel ca pentru 10% GTE sugerând stingerea fluorescenței datoratǎ probabil agregǎrii

moleculelor active.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

300 400 500 600 700 800 900

Wavelength (nm)

Flu

orescen

ce i

nte

nsit

y (

arb

.u.)

DNA-GTE 5%

GTE

0

20

40

60

80

100

120

140

380 430 480 530 580

Wavelength (nm)

Flu

orescen

ce i

nte

nsit

y (

arb

.u.)

DNA-GTE15%

DNA-GTE10%

DNA-GTE5%

Fig. 7.11. Spectre de fluorescențǎ ale complexelor ADN-GTE pentru soluții (a) și filme subțiri (b)

Figurile 7.12 (a, b) comparǎ spectrele de fluorescențǎ ale SBE și complexului ADN-

CTMA-SBE ȋn soluție de butanol cu excitare la 405 nm și mǎsurate ȋn aceleași condiții.

Fig. 7.12. Spectre de fluorescențǎ ale soluțiilor (a) filmelor subțiri (b) complexului ADN-CTMA-SBE

(c) soluțiilor de SBE (d) soluțiilor ADN CTMA-SBE și (e) filmelor subțiri [147, 148, 149]

0

10

20

30

40

50

60

410 460 510 560 610 660 710

Wavelength (nm)

Flu

ore

sc

en

ce

In

ten

sit

y

(arb

. u

nit

s)

Film_DNA-CTMA-SBE2%

Film_DNA-CTMA-SBE5%

Film_DNA-CTMA-SBE10%

Film_DNA-CTMA-SBE15%

0

10

20

30

40

50

60

70

415 465 515 565 615 665 715 765

Wavelength (nm)

Flu

orescen

ce I

nte

nsit

y (

arb

.

un

its)

Sol_SBE2%

Sol_DNA-CTMA-

SBE2%

Film_DNA-CTMA-SBE2%_Ex_405nm

0

5

10

15

20

415 455 495 535 575 615 655 695 735 775

Wavelength (nm)

Flu

ore

sc

en

ce

Inte

ns

ity

(a

rb

. u

nit

s)

0

5

10

15

20

415 465 515 565 615 665 715

Wavelength (nm)

Flu

orescen

ce In

ten

sit

y

(arb

. u

nit

s)

Sol_SBE2%

Sol_SBE5%

Sol_SBE10%

Sol_SBE15%

(a)

(c)

(b)

(e)

0

20

40

60

80

100

415 465 515 565 615 665 715

Wavelength (nm)

Flu

ore

sc

en

ce

In

ten

sit

y

(arb

. u

nit

s)

Sol_DNA-CTMA-SBE2%

Sol_DNA-CTMA-SBE5%

Sol_DNA-CTMA-SBE10%

Sol_DNA-CTMA-SBE15%

(d)

b a


31

Din figura 7.12 (a) ce prezintǎ spectrele de flurescențǎ pentru SBE și complexul de

ADN-CTMA-SBE se poate observa influența puternicǎ a ADN-ului. Spectrul de fluorescențǎ

al complexului ADN-CTMA-SBE este deplasat spre lungimi de undǎ mai mici comparative

cu spectrul obținut pentru SBE. Totodatǎ, intensitatea fluorescenței este semnificativ mai

mare. Cum s-a menționat anterior un astfel de comportament s-a observat și pentru

sulforodaminǎ și pentru GTE [150]. Fig. 7.12 (b) prezintǎ spectrul de fluorescențǎ al unui film

subțire ce conține aceeași concentrație de SBE ȋn raport cu ADN-ul (2%). Se constatǎ cǎ atât

ȋn cazul stǎrii solide cât și ȋn cazul soluției se obține un spectru similar. Figurile 12 (c) și (d)

comparǎ spectrele de fluorescențǎ pentru SBE singur și complexat ȋn ADN-CTMA ȋn diferite

concentrații ȋn raport cu ADN-CTMA. Toate filmele au fost excitate cu o luminǎ de lungime

de undǎ de 405 nm iar spectrele au fost ȋnregistrate ȋn aceleași condiții. Se constatǎ stingerea

fluorescenței cu creșterea concentrației de SBE. Totodatǎ, se observǎ o bandǎ de emisie

importantǎ la aprox. 675 nm și o bandǎ mai slabǎ la lungimi de undǎ mai mici. Pentru

complexul ADN-CTMA-SBE se observǎ un comportament diferit: banda de emisie de la

aprox. 675 nm este mai slabǎ iar la aprox 500 nm se obțin douǎ benzi intense, ce nu s-au

observat (sau au fost de intensitate slabǎ) ȋn cazul spectrelor obținute pentru soluția ce conține

doar SBE. Stingerea fluorescenței cu creșterea concentrației de cromofor este observatǎ și ȋn

acest caz, dar aparent este mai puțin importantǎ pentru soluțiile de ADN-CTMA-SBE decât

pentru soluția de SBE. Se constatǎ de asemenea o schimbare in intensitatea relativǎ a celor

douǎ benzi, una la aprox. 486 nm și a doua la 515 nm. Intensitatea benzii de la 486 nm scade

cu creșterea concentrației ȋn timp ce intensitatea benzii de la 515 nm crește cu creșterea

concentrației. Pentru filmele subțiri (Fig. 7.12 (e)) se observǎ practic absența stingerii

fluorescenței pentru concentrațiile de SBE studiate ȋn matricea de ADN-CTMA, ceea ce este

total contrar a ceea ce s-a observat pentru soluții (Fig. 7.12 (c)).

7.4. PROPRIETǍȚI OPTICE NELINEARE

7.4.1. Determinarea indicelui de refracție

Tehnicile de rezonanţă Fabry Perot oferă o metodă relativ simplă de măsurare a

indicelui de refracţie ordinar al filmelor subţiri. Aceasta necesită filme de calitate optică bună,

suficient de groase, precum şi un indice de refracţie suficient de mare al substratului pe care

este depus. Intr-adevăr, principiul de măsurare se bazează pe interferenţa fasciculului incident

cu cel reflectat pe interfaţa filmului subţire/substrat, cum este prezentat schematic în Fig. 7.1.

Fig. 7.1. Principiul interferenţelor Faby-Perot pentru măsurarea indicelui de refracţie ordinar

Diferenţa de drum optic dintre fasciculul incident şi cel refractat este egală cu:

dnl 2 (7.1)

unde d este grosimea filmului subţire. Astfel, maximele de interfernţă vor avea loc când


32

l = 2j iar minimele de interferențǎ pentru l = (2j+1) cu j=1,2,3, … .

Indicele de refracţie al ITO este mare, astfel încât se crează un fascicul luminos

reflectat suficient de intens la interfaţa ADN-GTE/ITO. De asemenea, calitatea optică a

filmului subţire, omogenitatea şi grosimea sa (1500 nm) sunt suficient de bune pentru a obţine

modele de interferenţă Fabry-Perot, după cum se observă din Fig. 7.13. Astfel se constată

minime şi maxime de interferenţă bine definite. Ȋn experimentele noastre s-au măsurat

grosimile filmelor subţiri cu un profilometru model Dektak 120 al firmei KLA Tencor.

Grosimea mare a filmelor a condus la câteva maxime şi minime ce permit determinarea

dispersiei indicelui de refracţie, cum se arată în Fig. 7.14.

0

0.05

0.10

0.15

0.20

400 500 600 700 800

DNA-GTE5%/ITO

Wavelength (nm)

Opt

ical

den

sity

Fig. 7.13. Modele de interferenţă Fabry-Perot observate pentru un film subţire de complex ADN-GTE

5%, depus pe un substrat de sticlă acoperit cu ITO

Ȋn Fig. 7.14 se prezintă verificarea datelor experimentale ale indicelui de refracţie cu

valorile calculate.

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

300 400 500 600 700

Wavelength (nm)

Ref

ract

ive

inde

x

Fig. 7.14. Dispersia indicelui de refracţie pentru filmul subţire de complex ADN-GTE 5 %

determinată prin metoda de rezonanţe Fabry-Perot. Cercurile reprezintă valori experimentale, iar linia

continuă reprezintǎ fitarea unei curbe Sellmeier

7.4.2. Generarea celei de a treia armonici

Mǎsurǎtorile THG s-au efectuat cu ajutorul unei instalații experimentale recent

construitǎ ȋn Centrul de Competențe pentru Biotronicǎ și Biofotonicǎ Avansatǎ din

Universitatea POLITEHNICA din București, și este reprezentatǎ schematic ȋn Fig. 7.15. Sursa

de lumină în infraroşu este un laser în pulsuri cu comutare Q tip Garnet (Nd:YAG) pe bază de

Ytriu şi aluminiu dopat cu neodium (Quantel, model Brillant B), operând la lungimea de undă


33

fundamentală de 1064,2 nm, cu durata pulsului de 5 ns și viteza de operare de 10 Hz. Ambele

unde, fundamentală şi armonică (532 nm) se situează în domeniul spectral de transparenţă.

BOXCAR

LASER

P AL

ST

PMT

/2F1 F2

Si PD

TF

BOXCAR

LASER

P AL

ST

PMT

/2F1 F2

Si PD

TF

Fig. 7.15. Instalaţia experimentală pentru determinarea THG pentru materiale solide. Si –

fotodiodǎ rapidă pentru măsurarea energiei razei laser, F1, F2 filtre, L lentile convergente, S

proba, ST suport probǎ, PMT fotomultiplicator, DV voltmetru.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 5 10 15 20 25

theory

data

Incidence angle (degrees)

TH

G in

ten

sity

(arb

. un

its)

0

0.2

0.4

0.6

0 10 20 30

theorydata


TH

G inte

nsity (

arb

. u

nits)

(a) (b)

Fig. 7.16. Intensitatea THG calculatǎ (linia continuǎ) și mǎsuratǎ pentru substratul de sticlǎ (a) și pentru substrat + filmul subțire ADN-GTE 15 % (b)

Tab. 7.4. Dependența concentrației GTE cu raportul susceptibilitǎților THG complex ADN-GTE / sticlǎ, precum și de valorile absolute THG calibrate cu susceptibilitatea cubicǎ a substratului de sticlǎ

Compus

Indice de refracție

n3 n ),,;3(/

),,;3(

)3(

)3(

glass

comp

),,;3()3( comp

x10-14

esu

ADN-CTMA

1,512a

1,488a

3,70,4b

7,80,8b

ADN-5 % GTEc

1,633 1,490 2,50,3 5,30,6

ADN-10 % GTEc

1,6488 1,490 2,80,3 8,91,2

ADN-CTMA-15 % GTEc

1,664 1,490 9,40,9 19,72,0

ANA-CTMA – 15 % DR1b

1,512 1,488 40,94 85,99

Siliced

1,4761 1,44967 0,670,07c

1,430,14c

Sticlǎe

1,53820 1,50664 1 2,10,2

a - Grote et al. [158]

b - Krupka et al.[159] (corectat pentru valoarea actualǎ a susceptibilitǎții THG pentru silice)


34

c – valori personale

d - Gubler and Bosshard [160]

e - Morichere et al. [161] (recalculatǎ cu valoarea nouǎ a susceptibilitǎții THG pentru silice d)

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 10 20 30

THEORYEXPER.

INCIDENCE ANGLE (degrees)

TH

G I

NT

EN

SIT

Y (

arb

. units)

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0 10 20

theoryexper


TH

G inte

nsity (

arb

. units)

(a) (b)

Fig. 7.17. Intensitǎți THG observate (cercuri goale) și calculate (linie continuǎ) pentru substrat (a) și

pentru substrat + film subțire de ADN –CTMA – SBE 15 % (b). Intensitǎțile teoretice au fost calculate

utilizând formula dedusǎ de Kajzar et al. [151] pentru THG ȋn filme subțiri depuse pe substrat.

Table 7.5. Valorile susceptibilitǎții THG pentru filmele subțiri ADN – CTMA – SBE studiate

comparative cu mǎsurǎtori similare efectuate pe substrat de sticlǎ purǎ, calibrate independent prin mǎsurǎtori similare pe lamele de silice purǎ

Material Indice de

refracție n3

Indice de

refracție n ),,;3(

/),,;3(

)3(

)3(

glass

mat

),,;3()3( comp

x10-14

esu

Silica

1,4761 1,44967 0,670,07 1,430,14a

Glass

1,53820 1,50664 1 2,10,2b

ADN-CTMA 1,512 c 1,488

c 3,70,4

d 7,80,8

d

ADN-CTMA-SBE 2% 1,512 c 1,488

c 3,50,4

e 7,40,8

e

ADN-CTMA-SBE 5% 1,512 c 1,488

c 4,60,5

e 9,71,1

e

ADN-CTMA-SBE 10% 1,512 c 1,488

c 7,10,8

e 14,91,7

e

ADN-CTMA-SBE 15% 1,512 c 1,488

c 14,21,5

e 29,83,2

e

CAPITOLUL 8

APLICAȚII PRACTICE ȊN BIOFOTONICǍ

8.2. FILME POLING - POLED

Figura 8.3 prezintǎ spectrul de absorbție al unui film subțire, orientat și neorientat, de

tip PMMA-DCNP. Grosimea filmului este de 340 nm.


35

-0.05

0

0.05

0.10

0.15

400 450 500 550 600

poled filmunpoled film

Wavelength (nm

Op

tica

l d

en

sity

Fig. 8.3. Spectrul de absorbție al unui film subțire orientat și neorientat de tip PMMA-DCNP [165]

Pentu prelucrarea rezultatelor am realizat programe pe calculator care să permită

calculul dependenţei intensităţii armonicelor de unghiul de incidențǎ pentru un film orientat şi

pentru o plăcuţă de monocristal de cuarţ. Ca urmare s-au obținut susceptibilităţile NLO de

ordinul doi ale filmului orientat. Figura 8.7, indică, folosind acest program, intensitatea SHG

calculată şi măsurată în funcţie de unghiul de incidenţă pentru un sistem de polimer PMMA-

DCNP orientat. Se observă o concordanţă foarte bună ȋntre datele experimentale și cele

calculate. Se constată de asemenea că la incidenţa normală valoarea intensitǎții SHG este

zero. Aceasta se datoreşte faptului că moleculele sunt orientate perpendicular pe suprafaţa

filmului subţire, astfel încât la incidenţă normală câmpul electric optic face un unghi de 90o cu

axa de orientare şi cos (90°) = 0.

0

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

0 20 40 60 80

theoryexper. data


SH

G in

ten

sity (

arb

. u

nits)

Fig. 8.7. Dependenţa intensităţii SHG măsurată (cerculeţe) şi fitată (linia continuă) de unghiul de

incidenţă θ. Grosimea filmelor, d = 340 nm

Fig. 8.5. Dispozitivul de orientare corona pentru studiul cineticii de orientare prin măsurători SHG in

situ


36

S-a studiat de asemenea cinetica de orientare prin SHG in situ utilizând un suport de

“poling” cu un orificiu după cum este prezentat în figura 8.5. Orificiul permite trecerea

fasciculelor fundamentale şi armonice în timpul orientării. Variaţia temporalǎ a semnalului

SHG este prezentată în fig. 8.6. Declanșarea câmpului de orientare (poling) determină

generarea câmpului armonic cu saturare în 66s în cazul sistemului guest–host PMMA–DCNP.

8.2.1. Generarea celei de a doua armonici

Pentru fabricarea unui modulator de fază electro-optic sunt necesare materiale

noncentrosimetrice astfel încât operarea dispozitivului să se bazeze pe efectul electro-optic

liniar (efect Pockels). Astfel de materiale îşi schimbă indicele de refracţie sub acţiunea

câmpului electric aplicat. Modificarea indicelui de refracţie (în elipsoidul indicelui de

refracţie al materialului) cadrul de referinţă este reprezentatǎ de următoarea ecuaţie:

jijii Ern

n2

3

(8.1)

unde rij este coeficientul electro-optic liniar al materialului, n este indicele său de refracţie şi

jE este componenta j a câmpului electric aplicat cu frecvenţa ω. Această variaţie a indicelui

de refracţie conduce la modularea undei purtătoare date de:

nl

2 (8.2)

unde l este este lungimea de propagare şi λ este lungimea de undă a fasciculului de lumină.

Pentru a obţine modularea intensităţii pentru semnalul transportat este necesară o

interferenţă cu un alt fascicol, de referinţă, aceasta realizându-se de obicei folosind un

modulator Mach-Zehnder.

În vederea obţinerii unui film subţire noncentrosimetric pe bază de ADN cu un

coeficient electro-optic diferit de zero am funcţionalizat complexul ADN-CTMA cu o

moleculă noncentrosimetrică înalt responsivă. Pentru aceasta am ales 3-(1,1-dicianotenil)-1-

fenil-4, 5-dihidro-1H-pirazol (DCNP), solubil în butanol, care este şi solvent pentru

complexul ADN-CTMA. Cromoforul a fost furnizat de Universitatea Wroklaw din Polonia.

Complecşii ADN-CTMA-DCNP au fost obţinuţi prin solubilizarea sub agitare a complexului

gazdă ADN-CTMA cu moleculele oaspete (DCNP) în butanol, într-un raport de masă adecvat

pentru a obţine concentraţiile dorite. Filmele subţiri s-au obţinut prin procedeul spin-coating

la depunerea din soluţia de ADN-CTMA-DCNP pe substrat de sticlă foarte curat. Filmele s-au

uscat apoi la 50 °C (sub temperatura de denaturare a ADN-ului). Proprietăţile lor spectrale în

domeniul UV-VIS s-au caracterizat cu un spectrometru JASCO V560. Grosimea filmelor s-a

determinat prin profilometrie folosind un aparat DEKTAK 120 al firmei KLA Tencor.

Pentru a obţine un aranjament nontrocentrosimetric de orientare a momentelor de

dipol ale moleculelor de cromofor optic activ am realizat un sistem corona poling reprezentat

ȋn Fig. 8.5. Această tehnică implicǎ aplicarea unei tensiuni ridicate la electrodul acicular, ceea

ce conduce la ionizarea gazului din jurul electrodului. Sarcinile se depun pe suprafaţa filmelor

subţiri creând în interior un câmp electric intens, care orientează momentele de dipol ale

moleculelor în direcţia sa (cf Fig. 8.5). Temperatura filmului subţire poate fi controlată cu un

termostat, astfel cǎ temperatura de poling poate fi stabilită precis. Acest lucru este important,

întrucât mobilitatea cromoforului depinde de temperatură. Cantitatea de dipoli orientaţi şi

comportarea lor temporală se determină prin tehnica de generare a celei de a doua armonice

(SHG). SHG este un proces NLO de ordinul al doilea, iar susceptibilitatea SHG este corelată

direct cu descrierea efectului electro-optic liniar.

Pentru a studia cinetica de poling a filmelor subţiri de ADN-CTMA s-a utilizat tot

dispozitivul SHG in situ prezentat în Fig. 8.5. În acest caz cantitatea de ordine polară poate fi


37

măsurată direct în timpul procesului de poling. Pentru aceasta se realizează un orificiu în

suportul gros de cupru al filmului subţire, care permite trecerea fasciculului optic.

Întrucât maximul intensităţii SHG apare la unghi de incidenţă mai mare (nu existǎ

SHG la incidenţă normală datorită mecanismului de poling) proba trebuie să fie înclinată faţă

de fasciculul de lumină incident (la unghi de cca 45o). Măsurătorile s-au efectuat la un unghi

de incidenţă fix.

Figura 8.6 ilustrează comportarea temporală a intensităţii SHG măsurate în timpul

procesului corona poling.

Se observă că la aplicarea câmpului electric de poling semnalul SHG creşte rapid şi

după scurt timp (66s) atinge un maxim şi se stabilizează, contrar situaţiei observate în cazul

filmelor de ADN-CTMA-DCNP.

Fig. 8.6. Variaţia temporală a semnalului SHG pentru polimerul PMMA-DCNP studiat în timpul

orientării. Săgeata indică momentul în care s-a aplicat voltajul de orientare corona (5.2 kV)

8.3. FAZA SUSCEPTIBILITǍȚII CUBICE

În acest capitol am prezentat o metodă care permite determinarea susceptibilitǎții NLO

a cromoforului din soluții solide (cromofor introdus într-o matrice de polimer amorf), prin

măsurarea variației cu concentrația susceptibilității NLO a filmelor subțiri.

0

2

4

6

8

0 0.15 0.30 0.45

Phase = /2, modulusPhase = /2, imag. partPhase = /2, real partPhase = 0

Concentration (w)

(3)

, re

al, im

agin

ary

part

s (

arb

. units)

Fig. 8.8. Variația susceptibilitǎții cubice calculate (modul parte imaginarǎ și parte realǎ) cu

concentrația de cromofor NLO pentru o soluție solidǎ cu faza Ф = 0 (curba de sus) și faza Ф = π/2


38

0

2

4

6

8

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Phase = /4, modulusPhase = /4, imaginary partPhase = /4, real part

Concentration (w)

(3)

, re

al, im

agin

ary

part

s (

arb

. units)

Fig. 8.9. Variația susceptibilitǎții cubice calculate (modul parte imaginarǎ și parte realǎ) cu

concentrația de cromofor NLO pentru o soluție solidǎ cu faza Ф = π/4

0

10

20

30

0 0.05 0.10 0.15

exper.

fit

Concentration (w)

(3

) (-3

;,

,)

(10

-14

esu

)

Fig. 8.11. Variaţia susceptibilităţii THG cu concentraţia de colorant din filmele subţiri ale complexului

ADN – CTMA – Rodamina 610: cerculețe (valori măsurate, Manea et al [101], linia continuă valori fitate) (metoda I)

S-a măsurat variaţia cu concentraţia a susceptibilităţii cubice ),,;3()3( în

filme subţiri de Rodamină 610 încorporată în matrice de ADN-CTMA. Această dependenţă

este ilustrată în Fig. 8.11.

Se observă că susceptibilitatea cubică nu creşte liniar cu concentraţia cum se

presupune de obicei, ci iniţial este aproape constantă, cu o uşoară tendinţă de scădere, după

care creşte. Această comportare se datoreşte faptului că ),,;3()3( este o mărime

complexă, cu partea reală dată de expresia:

)3()3()3( cos1

1msR C

C

(8.3)

unde C este concentraţia în procente de masă, )3(

m este susceptibilitatea substratului, care este

reală şi pozitivă, )3(

s este modulul susceptibilităţii de ordinul trei al solutului, iar este

faza sa, ( i

ss e)3()3( )

Pentru partea imaginară avem următoarea expresie:

sin1

)3()3(

Im sC

C (8.4)

Astfel, modulul susceptibilităţii cubice NLO al soluţiei solide este funcţie de

concentraţia procentuală a Rodaminei 610 şi este dată de expresia:

2/1

2)3(32

)3(32/1

2)3(

Im

2)3()3(

2sin4

1

1

mSmSR CC

C (8.5)


39

Prin fitarea datelor experimentale pe această ecuaţie se obţin faza şi valorile

susceptibilităţii pentru moleculele de solut şi pentru matrice. Rezultatele sunt prezentate în

tabelul 8.2, iar valorile calculate sunt redate prin curba continuă din Fig. 8.11. Se observă o

foarte bună concordanţă între valorile măsurate și curba fitată.

Valoarea complexă a susceptibilităţii cubice pentru Rh610 provine din rezonanţa de

doi fotoni cu banda de absorbţie de la 530 nm, adică la jumătatea lungimii de undă a

fasciculului laser fundamental.

Am propus de asemenea o a doua metodă de fitare a pătratului susceptibilităţii cubice

(metoda II) obţinute din experiment pe baza ecuaţiei:

2sin4

1

1 2)3(32

)3(32/1

2)3(

Im

2)3(2

)3(

mSmSR CCC

(8.6)

Și această metodă conduce la o concordanţă foarte bună, cu valori uşor diferite de

prima metodă, după cum se observă din Tabelul 8.2. Diferenţa se datoreşte erorilor de

rotunjire ale calculatorului.

Table 8.2. Valori ale parametrilor de fitare obţinuţi prin cele două metode

Metoda (3) ( 3 ; , , )m

x10-14

esu

(3) ( 3 ; , , )s

x10-14

esu

Faza Ф

rad

I 11,9 228,2 1,37

II 11,6 218,8 1,57

CONCLUZII

C.1. CONCLUZII GENERALE

În prezent, un accent deosebit se pune pe utilizarea materialelor biodegradabile.

Materialele biodegradabile cele mai eficiente sunt cele pe bază de produse naturale. Printre

aceste produse naturale, din ce ȋn ce mai utilizate sunt uleiurile și extractele naturale.

Având în vedere faptul că aceste produse naturale, au atât de multe efecte benefice

pentru sǎnǎtate unul din principalele obiective a fost de a sintetiza nanotransportori

lipidici nanostructurați cu uleiuri naturale pentru aplicații terapeutice. Principalele

concluzii referitoare la sinteza și caracterizarea acestor nanoparticule lipidice solide

sunt:

Nanoparticule lipidice încărcate cu extract de cǎtinǎ respectiv de ceai verde cu

activități antioxidante și antibacteriene semnificative s-au sintetizat cu succes folosind

tehnica de omogenizare cu grad ȋnalt de forfecare.

Pe baza acestei metode, au fost obținute cu succes nanoparticulele lipidice cu

dimensiuni mici.

Nanoparticulele lipidice obținute au prezentat o stabilitate fizică bună, cu valori ale

potențialelor zeta negative.

Evaluarea in vitro a proprietăților antioxidante a demonstrat că toate sistemele SLN

încărcate cu GTE și respectiv sistemele SLN încărcate cu SBE sunt caracterizate

printr-o activitate antioxidantă ridicată, pentru ambele tipuri de surfactanți neionici

utilizați, Tw 20 respectiv Tw80.

Activitatea antibacteriană a probelor testate a demonstrat o eficiență extrem de mare

ȋmpotriva bacteriei E. coli.

În ceea ce privește sistemele de NLC principalele concluzii sunt:

Cea mai micǎ dimensiune a fost obținutǎ pentru transportatorii lipidici nanostructurați

preparați cu Tw20 ȋn comparație cu NLC-urile preparate cu Tw80.


40

Referitor la conținutul de GTE s-a observat că pentru toate cele trei tipuri de uleiuri

vegetale utilizate au fost obținute dimensiuni mai mici ale particulei pentru probele de

NLC ȋncǎrcate cu 0,1 % GTE.

Evaluarea potențialului zeta al sistemelor NLC ȋncǎrcate cu GTE a arǎtat cǎ aceste

sisteme prezintǎ o stabilitate fizică excelentă.

Evaluarea in vitro a proprietăților antioxidante a demonstrat că pentru toate probele

NLC ȋncǎrcate cu GTE, activitatea antioxidantă este îmbunătățită în comparație cu cea

a extractului de ceai verde ȋn pudrǎ.

Evaluarea in vitro a proprietăților antioxidante a sistemelor NLC ȋncǎrcate cu SBE

sugerează o îmbunătățire a activității antioxidante pentru toate sistemele NLC

ȋncǎrcate cu SBE, în comparație cu sistemele NLC libere, atunci când sunt preparate

cu fiecare dintre cele trei tipuri de uleiuri vegetale: GSO, SBO și HPO.

Rezultatele DSC au arătat că sistemele NLC preparate cu HPO sau SBO și Tw20 duc

la un aranjament cristalin mai puțin ordonat. Intensitatea picurilor lor endotermice este

mai scăzutǎ, în comparație cu aceea a sistemelor NLC libere.

Studierea activității antibacteriene atestă faptul că extractul de ceai verde (GTE) ar

putea fi utilizat fie ca un antioxidant natural bun, fie pentru un posibil supliment

alimentar sau ca agent antimicrobian în industria farmaceutică.

Studiile efectuate ȋn cea de a doua parte a tezei de doctorat au demonstrat, de

asemenea, că este posibil să se obțină materiale funcționale pe bazǎ de ADN cu proprietăți

neliniare cu aplicații ȋn fotonicǎ. Principalele rezultate obținute sunt:

Complecșii ADN-GTE obținuți prin tehnica de acoperire spincoating pot fi prelucrați

în filme subțiri de o calitate optică bunǎ.

Complecșii sintetizați prezintă fotoluminescențǎ când sunt excitați în banda de

absorbție din domeniul UV.

Intensitatea fluorescenței este semnificativ mai mare în sistemele ADN-GTE decât în

GTE.

Complexul ADN-CTMA-SBE prezintă o bandă de absorbție mare în domeniul vizibil,

care se datorează SBE, deoarece complexul ADN-CTMA este transparent în domeniul

vizibil. Această bandă de absorbție mare, se datorează prezenței diferitelor

componente în SBE. SBE prezintă fluorescență în soluție, ȋn complecșii de soluții

ADN-CTMA și, de asemenea, în filmele subțiri.

Proprietǎțile NLO de ordinul al treilea ale filmelor subțiri preparate cu ADN-GTE, cu

o concentrație de 5 %, 10 % și 15%, au fost caracterizate prin tehnica de generare a

armonicii a treia. Se observă o susceptibilitate relativ mare pentru sistemele de ADN-

GTE, cu un domeniu larg de transparență. Această valoare mare a susceptibilitǎții

THG este atribuitǎ contribuțiilor rezonanței a trei fotoni.

Complecșii pe bazǎ de ADN sunt potențiali candidați interesanți pentru fabricarea de

diode emițătoare de lumină biologicǎ albastrǎ (BIOLEDs) și pentru lasere albastre

(BIOLASERS).

Un alt cromofor interesant studiat pentru aplicații în polimeri electro-optici este 3-

(1,1-dicianoetenil)-1-fenil-4, 5-dihidro-1H-pryazol (DCNP). Am obținut un grad înalt

de orientare polarǎ a cromoforului DCNP la sarcina micǎ într-un timp scurt de

polaritate. Astfel, utilizarea concentrațiilor mari de molecule NLO nu este necesarǎ.

Dimpotrivǎ, concentrații mari de cromofor determinǎ agregarea acestora și ca urmare

la difuzia luminii și pierderi mari prin propagare. De asemenea, ordinea polarǎ, după

cum s-a discutat în teză, este de așteptat să fie insensibilǎ la iluminare.

C.2. CONTRIBUȚII ORIGINALE

Pe baza rezultatelor prezentate în acest studiu legate de activitățile antioxidante și

antibacteriene ale sistemelor NLC ȋncǎrcate cu GTE/SBE, preparate cu cele trei uleiuri


41

vegetale, se poate concluziona că noile sisteme NLC dezvoltate sunt potențial interesante

pentru utilizare ca suplimente alimentare sau agenți antimicrobieni în farmacologie. Astfel de

extracte de plante pot contribui la dezvoltarea nanomedicinei ca remediu eficient împotriva

diferiților agenți patogeni umani și specifici animalelor.

Uleiurile folosite în această cercetare sunt de origine vegetală. Două dintre ele: uleiul

de cătină și uleiul de sunătoare, nu au fost utilizate până în prezent pentru sinteza de

nanoparticule lipidice.

Principala contribuție originală este metoda de determinare experimentală a fazei

susceptibilitǎții cubice a unui solut încorporat în soluții solide prin metoda generǎri celei de a

treia armonici, propusǎ și demonstratǎ în timpul stagiului de doctorat. Astfel de soluții solide

constau dintr-o matrice transparentă (cel puțin în lungimile de undă fundamentale și

armonice) și un cromofor NLO distribuit izotrop. Deși metoda a fost demonstratǎ pentru

măsurători THG, aceasta poate fi ușor generalizată pentru procese superioare NLO și la alte

tehnici experimentale. Cu toate acestea, este necesară determinarea susceptibilității NLO ca

funcție de concentrația substanței dizolvate, adică mai multe măsurători. În schimb, oferă nu

numai faza și modulul susceptibilității NLO a solutului, dar și a matricei, în cazul în care

aceasta este necunoscutǎ. Faza matricei se presupune a fi zero, așa cum este de obicei cazul

pentru majoritatea polimerilor sintetici și transparenți și pentru biopolimeri. De asemenea, din

aceastǎ cauzǎ semnul pǎrții imaginare nu poate fi determinat; este totuși posibil, cu condiția ca

partea imaginară a susceptibilitǎții NLO a matricei sǎ fie cunoscutǎ.

Complecșii pe bazǎ de ADN sunt potențiali candidați interesanți pentru fabricarea de

diode emițătoare de lumină biologicǎ albastrǎ (BIOLEDs) și pentru lasere albastre

(BIOLASERS).

Faptul că rezultatele obținute ȋn timpul cercetǎrii doctorale au fost de un mare interes

este demonstrat prin articolele publicate în diferite reviste cotate ISI care au factorul de

impact cumulat de 13,423 și scorul relativ de influență cumulat de 9,617.

C.3. PERSPECTIVE

Rezultatele obținute în această teză de doctorat privind materialele cu proprietăți NLO a

deschis o nouǎ poartǎ pentru noi perspective, și anume, aplicații ale biomaterialelor în

fotonică și biofotonicǎ. În acest sens,

mai multe sisteme de electroni conjugați, cum ar fi antocianinii, vor fi testate ca

materiale „guest” pentru proprietăți NLO.

Moleculele fotoresponsive sintetizate natural vor fi încorporate în matrice

biopolimericǎ. Materialele noncentrosimetrice necesare vor fi obținute prin orientarea

lor, în scopul de a obține materiale cu proprietǎți optice neliniare îmbunătățite de

ordinul doi.

Structura electronică a moleculelor dopante va fi optimizatǎ pentru a explora

contribuții rezonante mai bune pentru susceptibilitǎțile NLO de ordinul al treilea.

Se are ȋn vedere, de asemenea, proiectarea de dispozitive, cum ar fi OLED-uri, ferestre

inteligente, modulatoare electro-optice pentru transmitere de semnal optic etc., bazate

pe aceste noi biomateriale.


42

LISTA DE LUCRǍRI

1. Ana-Maria Manea, Francois Kajzar, Ileana Rău, A method for determination of real

and imaginary parts of third-order NLO susceptibility in solutions, Optical Materials,

35 (5), 2013, 1099 – 1102, FI = 1,918, SRI = 1,496.

2. Florica Adriana Jerca, Valentin Jerca, Francois Kajzar, Ana-Maria Manea, Ileana

Rau, Dumitru Mircea Vuluga, Simultaneous two and three photon resonant

enhancement of third-order NLO susceptibility in an azo-dye functionalized polymer

film, Physical Chemistry Chemical Physics, 15, 2013, 7060-7063, FI = 3.829, SRI =

2.057.

3. Ana-Maria Manea, Francois Kajzar, Ileana Rau, Aurelia Meghea, Fluorescence,

spectroscopic and NLO properties of green tea extract in deoxyribonucleic acid,

Optical Materials, 36 (1), 2013, 140-145, FI = 1,918, SRI = 1,496.

4. Ana-Maria Manea, Ileana Rau, Alexandrina Tane, Francois Kajzar, Lech Sznitko,

Andrzej Miniewicz, Poling kinetics and second order NLO properties of DCNP doped

PMMA based thin film, Optical Materials, 36 (1), 2013, 69-74, FI = 1,918, SRI =

1,496.

5. Ana-Maria Manea, Camelia Ungureanu, Aurelia Meghea, Effect of vegetable oils on

obtaining lipid nanocarriers for sea buckthorn extract encapsulation, Comptes Rendus

Chimie, (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.crci.2013.10.020, FI = 1.920, SRI = 1.536.

6. Ana-Maria Manea, Bogdan Stefan Vasile, Aurelia Meghea, Antioxidant and

Antimicrobial Activities of Green Tea Loaded Into Nanostructured Lipid Carriers,

Comptes Rendus Chimie, (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.crci.2013.07.015 , FI =

1.920, SRI = 1.536.

7. Ana-Maria Manea, Ileana Rau, Francois. Kajzar, Aurelia Meghea, Preparation,

linear and NLO properties of DNA-CTMA-SBE complexes, Proc. of SPIE Vol. 8901,

(2013), indexata ISI, ISBN 9780819497703, art. no. 89010S, doi 10.1117/12.2029326.

8. Ana-Maria Manea, Corina Andronescu, Aurelia Meghea, Green tea extract loaded

into solid lipid nanoparticles, UPB, accepted.

http://dx.doi.org/10.1016/j.crci.2013.10.020



43

BIBLIOGRAFIE

[93] I. Lacatusu, M.N. Badea, A.-M. Manea, A. Meghea, “Cryoprotector effect on main properties of

lipid nanoparticles loaded with bio-active compounds”, Journal of Optoelectronics and Advanced

Materials, 14, 3-4, 2012, 336-343.

[101] A.-M. Manea, A. Tane, R. Zgarian, J.G. Grote, F. Kajzar, I. Rau, “Optical third-harmonic generation measurements in biopolymer complexes”, Proc. Of SPIE, 8545, 2012, Q1-Q9,

doi:10.1117/12.978653.

[102] A.-M. Manea, A. Tane, R. Zgarian, J. G. Grote, F. Kajza, I. Rau, „Optical Third-Harmonic Generation Measurements In Biopolymer Complexes”, Optical Materials and Biomaterials in Security

and Defence Systems Technology, 24-27 Sept. 2012, Edinburgh, United Kingdom, poster.

[108] W. Mehnert, K. Mäder, “Solid lipid nanoparticles: production, characterization and

applications”, Adv Drug Deliv Rev, 47, 2001, 165-196. [109] A.-M. Manea, C. Andronescu, A. Meghea, “Green tea extract loaded into solid lipid

nanoparticles”, UPB, 2013, accepted.

[110] T. Helgason, T.S. Awad, K. Krisybergsson, D.J. McClements, J. Weiss, “Effect of surfactant surface coverage on formation of solid lipid nanoparticles (SLN)”, J Colloid Interface Sci, 334, 2009,

75-81.

[111] R.J. Hunter, “Foundations of colloidal science”, Oxford University Press, 1, 1986. [113] G.K. Jayaprakasha, T. Selvi, K.K. Sakarian, “Antibacterial and antioxidant activities of grape

(Vitis vinifera) seed extracts”, Food Res Int, 36, 2003, 117-122.

[114] J.R. Vercellotti, A.J. St. Angelo, A.M. Spanier, “Lipid oxidation in food”, American Chemical

Society, ACS 500, 1992. [115] T.H. Wu, F.L. Yen, L.T. Lin, T.R. Tsai, C.C. Lin, T.M. Cham, “Preparation, physicochemical

characterization, and antioxidant effects of quercetin nanoparticles”, Int J Pharm, 346, 2008, 160-168.

[116] A.-M. Manea, B.S. Vasile, A. Meghea, “Antioxidant and Antimicrobial Activities of Green Tea Extract Loaded into Nanostructured Lipid Carriers”, Comptes Rendus Chimie, 2013,

http://dx.doi.org/10.1016/j.crci.2013.07.015.

[117] A.-M. Manea, I. Lacatusu, C. Ungureanu, A. Meghea, “Antioxidant And Antimicrobial Activities Of Green Tea Extract Loaded Into Nanostructured Lipid Carriers”, Optical Materials and

Biomaterials in Security and Defence Systems Technology, 24-27 Sept. 2012, Edinburgh, United

Kingdom, oral presentation.

[120] A.-M. Manea, C. Ungureanu, A. Meghea, „Effect of vegetable oils on obtaining lipid nanocarriers for sea buckthorn extract encapsulation”, Comptes Rendus Chimie, (2013),

http://dx.doi.org/10.1016/j.crci.2013.10.020.

[121] A.-M. Manea, I. Lacatusu, A. Meghea, “Synthesis And Antioxidant Activity Of Lipid Nanocarriers Loaded With Sea Buckthorn Extract”, Tird International Workshop on Advanced Nano-

and Biomaterials and Their Device Applications (nabm), 19-23 Sept. 2012, Timisoara, Romania,

poster.

[122] A.-M. Manea, I. Lacatusu, A. Meghea, „The Effect Of Various Vegetable Oils In Obtaining Lipid Nanocarriers For Sea Buckthorn Extract Encapsulation”, International conference on Advanced

Materials for Photonics, Sensing and Energy Conversion Applications (AMPSECA) 2012, 5-7

December, El Jaded, Maroc, oral presentation. [123] H. Bunjes, “Structural properties of solid lipid based colloidal drug delivery systems”, Curr Opin

Colloid In, 16, 2011, 405-411.

[124] J.W. Hageman, Marcel Dekker, ”Crystallization and polymorphism of fats and fatty acids”, NY USA, 1988, 29-67.

[128] K. Sato, „Crystallization behaviour of fats and lipids - a review”, Chem Eng Sci, 56, 7, 2001,

2255-2265.

[129] H. Bunjes, K. Westesen, H.J.K. Michel, "Crystallization tendency and polymorphic transitions in triglyceride nanoparticles", Int J Pharm, 129, 1996, 159-173.

[132] V.S. Kumaran, K. Arulmathi, P. Kalaiselvi, “Senescence mediated redox imbalance in cardiac

tissue: Antioxidant rejuvenating potential of green tea extract”, Basic Nutritional Investigations, 25, 2009, 847-854.

[143] A.-M. Manea, I. Rau, F. Kajzar, Aurelia Meghea, „Thin Film Processing, Spectroscopic and

NLO Properties of Green Tea Molecules Embedded In Deoxyribonucleic Acid”, Workshop on




44

Organic Electronics and Photonics, WOREN 16-22 February, 2013, Zlockie, Polonia, oral

presentation.

[144] A.-M. Manea, Ileana Rau, F. Kajzar, A. Meghea, “Functionalized bioderived thin films for application in phototonics”, RICCCE XVIII, Sinaia, Romania, 4 – 7 September, 2013, oral

presentation.

[145] Z. Yu, J. Hagen, Y. Zhou, D. Klotzkin, J. Grote, A. Steckl, “Photoluminescence and lasing from

deoxyribonucleic acid (DNA) thin films doped with sulforhodamine”, Appl. Opt., 46, 9, 2006, 1507-1513.

[146] Z. Yu, Y. Zhou, D. Klotzkin, J. Grote, A. Steckl, “Stimulated emission of sulforhodamine 640

doped DNA distributed feedback (DFB) laser devices”, Proc. SPIE, 6470, 2007, 64700. [147] A.-M. Manea, I. Rau, F. Kajzar, A. Meghea, “Preparation, Linear and NLO properties of DNA-

CTMA-SBE complexes”, SPIE Security+Defence 2013 Internationales Congress Centre Dresden, 23-

26 September 2013, Dresden, Germany, oral presentation. [148] A.-M. Manea, I. Rau, F. Kajzar, A. Meghea, “Fluorescence and NLO properties of DNA-

CTMA-SBE complexes”, 2nd International Workshop on Nano and Bio-Photonics (IWNBP2013), 03-

08 November 2013, Biarritz, France, oral presentation.

[149] A. M. Manea, Ileana Rau, F. Kajzar, A. Meghea, „Preparation, linear and NLO properties of DNA-CTMA-SBE complexes”, Proc. of SPIE Vol. 8901, (2013), indexata ISI, ISBN 9780819497703,

art. no. 89010S, doi 10.1117/12.2029326.

[150] A.-M. Manea, I. Rau, F. Kajzar, A. Meghea,”Fluorescence, spectroscopic and NLO properties of green tea extract in deoxyribonucleic acid”, Opt. Mater., 36, 1, 2013, 140-145.

[151] F. Kajzar, J. Messier, C. Rosilio, "Nonlinear optical properties of thin films of polysilane”, J.

Appl. Phys., 60, 1986, 3040-3044.

[157] A.-M. Manea, F. Kajzar,

I. Rau, “A method for determination of real and imaginary parts of

third-order NLO susceptibility in solid solutions”, Opt. Mat., 35, 5, 2013, 1099–1102.

[158] J. Grote, D. Diggs, R. Nelson, J. Zetts, F. Hopkins, N. Ogata, J. Hagen, E. Heckman, P. Yaney,

M. Stone, L. Dalton, Mol. Cryst. Liq. Cryst., 426, 2005, 3. [159] O. Krupka, A. El-Ghayoury, I. Rau, B. Sahraoui, J.G. Grote, and F. Kajzar, ”NLO Properties of

Functionalized. DNA Thin Films”, Thin Solid Films, 516, 24, 2008, 8932-8936.

[160] U. Gubler and C. Bosshard, "Optical third-harmonic generation of fused silica in nonlinear optical susceptibility chi3", Phys Rev. B, 61, 2000, 10702-10710.

[165] A.M. Manea, I. Rau, A. Tane, F. Kajzar, L. Sznitko, A. Miniewicz, “Poling kinetics and second

order NLO properties of DCNP doped PMMA based thin film”, Optical Materials, 36 (1), 2013, 69-

74. [191] F.A. Jerca, V. Jerca, F. Kajzar, A.-M. Manea, I. Rau, D.M. Vuluga, „Simultaneous two and

three photon resonant enhancement of third-order NLO susceptibility in an azo-dye functionalized

polymer film”, Physical Chemistry Chemical Physics, 15, 2013, 7060-7063. [192] F.A. Jerca, V.V. Jerca, Ileana Rau, A.M. Manea, F. Kajzar, D.M. Vuluga, “Simultaneous two

and three photon resonant enhancement of third-order NLO susceptibility in azo-dye polymer film”,

RICCCE XVIII, Sinaia, Romania, 4 – 7 September, 2013, oral presentation.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925346712005575



http://journals.ohiolink.edu/ejc/article.cgi?issn=09253467&issue=v35i0005&article=1099_amfdortnsiss

http://journals.ohiolink.edu/ejc/article.cgi?issn=09253467&issue=v35i0005&article=1099_amfdortnsiss

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09253467/35/5

Nr Decizie Senat. 227 din 20.12.2013 TEZǍ DE...

Documents

Transcript of Nr Decizie Senat. 227 din 20.12.2013 TEZǍ DE...