No Slide Titlept.nfi.or.th/DocFile/20140319100336.pdf · Quality Control:...

การควบคมคณภาพภายใน ทางจลชววทยา

Quality Control : เปนโปรแกรมของกจกรรมตาง ๆ ทหองปฏบตการจดท าขนเพอใหแนใจวามการปฏบตทด กจกรรมตางๆ น ไดแก การควบคมคณภาพภายในอยางสม าเสมอ , การประเมนภายนอกและมาตรการทงหลายอนจะท าใหเพมความช านาญและท าใหผลการวเคราะหมความมนใจมากขน

ผลการตรวจวเคราะหจะถกตองและ

ไดรบความเชอถอขนกบปจจย วธตรวจวเคราะหทแมนย า

อาหารเลยงเชอทมคณภาพ

บคลากรมความสามารถและความช านาญ

เครองมอเครองใชชนดตาง ๆมความนาเชอถอ

เครองมอตองไดรบการควบคมจากบคลากรทไดรบการอบรม และไดรบการ มอบหมายงานแลว

การควบคมคณภาพภายในหองปฏบตการ

ทางจลชววทยา

I การควบคมคณภาพสถานทและสภาพแวดลอม II การควบคมคณภาพเครองมอ/อปกรณ III การควบคมคณภาพบคลากร IV การเกบรกษาเชอจลนทรย อางองและการควบคม คณภาพ V การควบคมคณภาพอาหารเลยงเชอ VI การควบคมคณภาพวธทดสอบ VII การควบคมคณภาพตวอยางทดสอบ

I การควบคมคณภาพ สถานทและสภาพแวดลอม

ผนงและพน

- ผวเรยบ งายตอการท าความสะอาด (ไมใชมล เพราะ

ท าความสะอาดยาก ท าการตดฟลมแทนเพอกนแสงแดด)

- ควรมพนทใชสอยเพยงพอตอการท างาน

สถานท

แยกจากกจกรรมอนๆ จ ากดผเขาออก

การจดการทจะท าใหลดการปนเปอน

บรเวณ pre-enrichment ควรแยก

จากบรเวณทใชทดสอบ


บรเวณทใชเตรยมอาหารเลยงเชอและฆาเชอ ควรแยกจากบรเวณทดสอบ

reference cultures และ certified reference cultures ตองแยกเกบรกษาแยกจากบรเวณ รบเกบตวอยาง

บรเวณรบตวอยางตองแยกจากบรเวณทใช ในการทดสอบ


การควบคมการเขาออก

หองเปลยนเสอผา

หองเตรยมตวอยาง

ชองสงตวอยางจากหองเตรยม

หองทดสอบ

หองบมตวอยาง

หองเตรยมอาหารเลยงเชอ

ผนงผวเรยบ

พนผวเรยบ ไมมรอง สออน

ตเยนเกบสารเคม

มการรกษาความสะอาดบรเวณรบตวอยางเพอ ปองกนการปนเปอน เครองมอและอปกรณตองวางในต าแหนง ใหม พนทการท างานมากทสด


การรกษาความสะอาด จดใหมการท าความสะอาดหองปฏบตการอยาง

สม าเสมอ ซงตองจดท าเปนเอกสาร โตะปฏบตการตองมการฆาเชอกอนและหลงการใชงาน


การรกษาความสะอาด (ตอ) การท าความสะอาดพนควรถดวยผาหมาดๆ และฆาเชอ

ดวยสารท าความสะอาด (หามใชไมกวาด) ไมควรมฝ นละอองในหองปฏบตการและควรใหความ

สนใจในบรเวณทท าความสะอาดยากๆ มากทสด มการตรวจสอบ อยเปนประจ า


คณภาพอากาศ ทางกายภาพ

มระบบระบายอากาศเพอลดความเสยงในการ ปนเปอน

เปนหองทมเครองปรบอากาศเพอควบคมความชน และอณหภม (อณหภมควรอยระหวาง 18-27 องศาเซลเซยส )

ความชนสมพทธควรอยระหวาง 45-50 %

สภาพแวดลอม I การควบคมคณภาพ สถานทและสภาพแวดลอม

คณภาพอากาศ ทางกายภาพ

แสงสวาง - ความเขมของแสง เพยงพอตอการท างาน( 100 แรงเทยน)

- แสงจากดวงอาทตยโดยตรงมผลตอ media/reagent/ตวอยาง


คณภาพอากาศ ทางชวภาพ

ตรวจสอบปรมาณจลนทรยในอากาศภายใน หองทดสอบ อยางนอยเดอนละ 1 ครง

ปรมาณจลนทรยไมควรเกน 15 โคโลน ตอ 15 นาท ตอ พนท 160 ตร.ซม.


Timer ตวควบคมการเปด-ปด UV

คณภาพอากาศ ทางชวภาพ

อากาศหมนเวยนในตปราศจากเชอตองไมพบ แบคทเรย / 1 ชม.

หามสบบหร หามทานอาหาร และหามดมน าใน

หองปฏบตการ


บนทกการใชงานประจ าวน

บนทกการบ ารงรกษา / ซอมเครองมอ

ประวตการสอบเทยบ / ทวนสอบเครองมอ

คมอการใชเครองมอ

II การควบคมคณภาพเครองมอ/อปกรณ

ควรจดใหมชองวางระหวางผนงต และ plate,rack , ตะกรา 2.5 ซม.

วาง plate ซอนกนไมเกน 6 ค

ท า Intermediate check ทกเดอน

ท าการสอบเทยบปละครง

กรณใชอณหภมแบบแทงแกว ควรแชลงใน glycerin


ตบม (Incubator)

ตบม (Incubator)


บนทกอณหภมวนละ 2 ครง (เชา ,บาย)

Water bath


ควรมฝาปดเพอลดการสญเสยน าและความรอน เพอรกษาระดบอณหภม

รกษาระดบของน าใน Water bath ใหอย ไมต ากวาระดบสงสดของอาหารเลยงเชอในหลอด


ตองมการบนทกอณหภมทกวนทใชงานและบนทก อณหภม ชวงเชา – บาย

ท า Intermediate check ทกเดอน

ท าการสอบเทยบปละ 2 ครง

Water bath

Hot air oven


ใช heat-indicating tape ทกครง

สอบเทยบปละครง

ใชความรอนแหงท ≥ 170± 100C อยางนอย 2 ชม.

มการบนทกเวลาและอณหภมทใช


Hot air oven ทวนสอบ

ทางกายภาพ

ทวนสอบอณหภมอยางนอยเดอนละครง

ทางชวภาพ

ใช biological indicator spore strips (B. subtilis)อยางนอยเดอนละครง B. atrophaeus

ใช heat-indicating tape ทกครง

ควรวางภาชนะใหมทวางหางจากกนอยางนอย 1/2 นว

มบนทก ความดน อณหภม และเวลา ทใชทกครง

ทวนสอบเวลา ทก 3 เดอน

Autoclave



Autoclave ทวนสอบ

ทางกายภาพ maximum thermometer ตรวจสอบสปดาหละครง

ทางชวภาพ Geobacillus stearothermophilus

spore ampoule, อยางนอย ทกเดอน

มการสอบเทยบปละครง

สอบเทยบดวย buffer 2 ชนด กอนใชงาน ( pH 4.0, 7.0 หรอ 10.0 )

ควรมความแมนอยางนอย 0.01

สารละลาย buffer ทใชควรใชครงเดยว

ดแลรกษา electrode ไมใหสญเสยสภาพการใชงาน


pH meter

สอบเทยบทกป ควรมความละเอยด 1 ถง 2 ต าแหนง

ท าความสะอาดกอนและหลงใชงาน

ท า daily cheek เพอตรวจสอบความถกตองกอนใชงานดวยตมหรอกอนน าหนกทไมเปลยนแปลง(precision)

ตรวจเชคความแมน(accuracy)ทกเดอนดวย ตมน าหนกมาตรฐานซงสอบกลบไดถง NIST


เครองชง


เครองชง

วางเครองชงบนโตะ ทแขงแรง

การแบงกลมความเสยงในการกอโรค risk categoty 1 : ไมมความเสยงหรอมนอยมากตอผปฏบต และชมชน เปนเชอจลนทรยทไมท าใหเกดความเจบปวยในคนและสตว เชน

Lactobacillus acidophilus

II การควบคมคณภาพเครองมอ/อปกรณ ตปราศจากเชอ(Laminar Air Flow)

การแบงกลมความเสยงในการกอโรค risk categoty 2 : มความเสยงปานกลางตอผปฏบตและมความเสยง

ต าส าหรบชมชน เปนเชอโรคทสามารถท าใหคนและสตวเกดการเจบปวย ไมเปนอนตรายทรายแรงส าหรบผปฏบต ชมชน และสงแวดลอม กรณเกดการตดเชอในคนทรนแรงมวธการรกษาทมประสทธภาพ และมวธการปองกนทด สามารถควบคมการแพรกระจายของความเสยงได เชน B. cereus , E. coli


การแบงกลมความเสยงในการกอโรค risk categoty 3 : มความเสยงสงตอผปฏบต และมความเสยงต าส าหรบชมชน เปนเชอโรคทท าใหเกดความเจบปวยในคนและสตวรนแรงเปนประจ า ไมสามารถแพรเชอจากคนหนงไปอกคนหนงได มวธการรกษาทมประสทธภาพ มวธการปองกน เชน Mycobacterium bovis


การแบงกลมความเสยงในการกอโรค risk categoty 4 : มความเสยงสงตอผปฏบต และส าหรบชมชน เปนเชอโรคทท าใหเกดความเจบปวยในคนและสตวรนแรงเปนประจ า สามารถแพรเชอจากคนหนงไปอกคนหนงได ทงโดยทางตรง และทางออม ยงไมมวธการรกษาทมประสทธภาพ ไมมวธการปองกนทด เชน Ebora virus


Horizontal laminar out blow cabinet ปองกนงานจากการปนเปอน แตเปาละอองอากาศทเกดขนเขาหาผปฏบต ไมเหมาะส าหรบงานเตรยมเพอเพาะเชอ หรอการเตรยม tissue culture


Vertical laminar airflow cabinet ปองกนผลตภณฑดวยการใช vertical laminar flow ของเครองกรอง HEPA filter ปองกนผปฏบต เหมาะส าหรบงานทตองการสงแวดลอมทปราศจากเชอ ไมแนะน าใหใช gas burner (กระทบตอการไหลของอากาศ)


ท าความสะอาดกอนและหลงใชงานทกครง ตรวจ Air flow ทกครงกอนใช ถอดท าความสะอาดหลอด UV ทกเดอน สอบเทยบประสทธภาพ 1 ครงตอป ท า Air test โดยวาง plate 30 นาท หรอ 1 ชม.


ตปราศจากเชอ(Laminar Air Flow)

ทดสอบประสทธภาพของหลอด UV ทก 3 เดอน - UV light meter หรอ ใชเชอบน plate 200-300(spread plate technique)

รบแสงUV นาน 2 นาท ตองท าลายเชอไมนอยกวา 99%



UV-C : 100-280 nm (Short wave)

มความเขมของแสงมากกวา UV-B ท าใหเกดมะเรงผวหนง พบได

นอย บรรยากาศสามารถกรองไวได

UV-B : 280-315 nm (medium wave)

มความเขมของแสงมากกวา UV-A ท าใหเกดมะเรงผวหนง เปนตอ

กระจกได ตามวมองไมเหน ชนโอโซนสามารถกรองได แตปจจบน

ชนโอโซนถกท าลาย จงท าใหแสงผานมายงโลกได



UV-A : 315-400 nm (long wave)(black light)

พลงงานออนทสด ท าใหผวหนงแกเรว เหยวยน

ประโยช ใชตรวจเอกสารส าคญ เชน ธนบตร บตรเครดต

หนงสอเดนทาง



Ultraviolet light

ทดสอบประสทธภาพของหลอด UV

Spike เชอ Gram negative Rod จ านวน 200-300 โคโลน

Spread plate technique

นบจ านวนโคโลน

รบแสง UV นาน 2 นาท บม 35 องศา /48 ชวโมง

ประเมนผล ตองท าลายเชอไมนอยกวา 99 %

ตวอยาง และสารมาตรฐาน เชออางอง ควรแยกตเกบ

ตองม Thermometer ทสอบเทยบแลว จมอยใน glycerol วางในต

มการบนทกอณหภมวนละครง

ตเยน


เกบตวอยาง อณหภม 3 ± 2 OC

เชอจลนทรย อาหารเลยงเชอ อณหภม 5 ± 3 OC

แชแขง อณหภม < - 15 OC

< - 18 OC

ตเยน


- ตองไดรบการสอบเทยบกอน น าไปใชงาน - ควรมความละเอยดท เหมาะสมกบชวงทใชงาน


Thermometer/thermocouples

- การสอบเทยบจะเลอกจากหนวยงานภายนอกหรอ in-house - Reference standard หามใชงานหนก - ขณะวดเทอรโมมเตอรแบบแทงแกว ตองจมอยใน glycerol , liquid paraffin



- Reference thermometer สอบเทยบทก 5 ป - Working thermometer สอบเทยบทก 1 ป - Ice point ( 0OC ) ทก 6 เดอน



ประเภทปรอทแกว แบงการใชงาน 3 แบบ 1. Total immersion (จมถงปลายอาน) ตองท าการจมปรอทแกว ใหของเหลวอยในอณหภมทท าการวด 2. Partial immersion (จมบางสวน) ตองท าการจมปรอทแกว ลงไปถงต าแหนงท mark เอาไว 3. Complete immersion (จมทงหมด) ตองท าการจมปรอทแกว ลงไปในของทจะท าการวดทงหมด (ไมคอยพบการใชทวไปใน ปจจบน)



http://www.google.co.th/url?sa=i&rct=j&q=total+immersion+thermometer&source=images&cd=&cad=rja&docid=SmqawsaeQ1dUYM&tbnid=VGItpSpYEXlD5M:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fwww.amrl.net%2Famrlsitefinity%2Fdefault%2Faboutus%2Fnewsletter%2FNewsletter_Spring2011%2F8.aspx&ei=iE0kUcHBJq6UiQf5l4H4CA&bvm=bv.42661473,d.bmk&psig=AFQjCNH7vVctHvOq0eBJ7GCqcbdqypHaEg&ust=1361419952438593

นาฬกาจบเวลา

- เทยบเวลากบกรมอทกศาสตร โทร 1811

- ท าทวนสอบ ทก 1 ป



เครองแกว เครองแกวควรท าจากวสดคณภาพสง

• ชนด borosilicate glass และheat-resistant plastic materials

ควรตรวจสอบความเปนกรด-ดาง หลงการลาง เครองแกวทกครงดวย 0.04% BTB (bromthymol blue)

โดยผลของ BTB ตองเปนสเขยวอมน าเงน

(อยในสภาวะเปน กลาง)

ควรตรวจสอบสารตกคางในเครองแกวทมผลยบยง การเจรญของเชอจลนทรย


เครองแกว

การทดสอบสารตกคางใน petri dish

group A, B , C และ D(ท าอยางละ 6 plate) group A ลางแบบปกต

group B ลางแบบปกตและ rinse น ากลน

12 ครง

group C ลางแบบปกต rinse ดวยน ายา

ทลางในหองปฏบตการแลวปลอย

ใหแหง

group D plate พลาสตก

การทดสอบสารตกคางใน petri dish (ตอ)

น า petri dish group A, B, C ไปท าใหปราศจากเชอตาม ขนตอนของหองปฏบตการ

ใส Enterobacter aerogenes 50-150 cfu/ml

A, B, C, D A, B, C, D

0.1 ml/3 plate 1.0 ml/3 plate

บมท 35 องศา /48 ชวโมง


การอานและแปรผล - ถา group A กบ group B นบแลวเฉลยไดตางกน

นอยกวา 15% (B >A < 15%) และ group A กบ group C

นบแลวเฉลยไดตางกนมากกวา 15% (A > C > 15%)

สรป : สารทใชลาง(detergent) มคณสมบตยบยงการเจรญ ของเชอ

แตการลางตามปกตสามารถก าจดสารยบยงไดหมด


การอานและแปรผล (ตอ)

- ถา group B และ group D ตางกนมากกวา 15%

สรป : แสดงวา plate plastic มสารตกคางทมคณสมบต

ในการยบยงการเจรญของเชอ

- ถา group A-D นบแลวเฉลยไดตางกนนอยกวา 15 %

สรป: ไมมผลกระทบจากสารพษหรอสารยบยง

Loops

• Nickel alloy หรอ platinum-iridium สามารถเผาไฟได

• ขนาดอยางนอย 3 mm

ถงพลาสตกใสตวอยาง

กรรไกร

ชอน

ปเปต

โถปน

การทดสอบ Sterility อปกรณตาง ๆ

ตองมความรความสามารถ มประสบการณ

ไดรบการฝกอบรมใหรหนาท เพอคณภาพของผลการ

วเคราะหทดสอบ

ตองเลอกบคลากรจาก

- ประวตการศกษา

- ประสบการณ

III การควบคมคณภาพบคลากร

บคลากรใหม ฝกอบรมขนตอนการด าเนนงานและวธการทดสอบท

เกยวของตามลกษณะงาน

ใหผรบการฝกเฝาดการท างานของผทดสอบทไดรบการฝกอบรมผานแลว


บคลากรใหม

ผควบคมงานเฝาดการปฏบตงานทดสอบของผรบการฝกอบรม

ผานและมอบหมายงาน

ไมผานและมขนตอนการด าเนนงานตอ


เพราะวธการตรวจวเคราะหมการพฒนาอยางรวดเรว ตองหาความรใหม ๆ เพมเตม และฝกฝนใหเกด ประสบการณอยางตอเนอง

- การดงานทอน

- ฝกงานทอน

- การเขาฟงสมมนาทางวชาการ

บคลากรเกา III การควบคมคณภาพบคลากร

III การควบคมคณภาพบคลากร บคลากรเกา วธการทดสอบประสทธภาพเจาหนาท - การใช certified reference material

- การใช spiked sample

- การวเคราะหแบบ replicate พรอมๆ กบเจาหนาททผานการอบรมแลว

- การเขารวมท า PT

ตงขอก าหนดวาเจาหนาทท าการทดสอบตวอยางจ านวนเทาใดจงจะบอกไดวา ผาน

ก าหนดวาตองไดคาทถกตองใกลเคยงกบเจาหนาท ทผานการอบรมแลวแคไหนจงยอมรบ

III การควบคมคณภาพบคลากร การประเมนผล

สวมเสอกราวนสออน สะอาด สภาพด ไมสวมเสอกราวนออกนอกบรเวณปฏบตงาน สวมหมวกปกคลมผม หากจ าเปน การลางมอ : กอนและหลงการปฏบตงาน และทนททออก จากหองน า หลกเลยงการพดคย ไอ ขณะปฏบตงาน หามสบบหร กนอาหาร ดมน า บรเวณทดสอบ

III การควบคมคณภาพบคลากร สขลกษณะของบคลากร

ความส าคญของเชอจลนทรยอางอง - ใชเปนเชอมาตรฐานส าหรบการทดสอบ - ใชในการควบคมคณภาพอาหารเลยงเชอ - ใชในการท า method validation - ใชในการทดสอบประสทธภาพภายใน

IV การเกบรกษาเชอจลนทรยอางองและ การควบคมคณภาพ

รกษาสมบตทางพนธกรรม

รกษา viability ของเชอ


- เลอกใชวธการเกบวธใดกไดตามความเหมาะสม - ตองใชเชอจลนทรยอางองจากหนวยงานระดบ ชาตทเปนทยอมรบหรอองคกรทเปนทยอมรบ จากหนวยรบรอง


การเกบเชอจลนทรยอางองใหเปนไปตามขอก าหนด

♣ ขอครอบครองเชอจลนทรย ♣ บนทกการรบเชอ -ชอเชอ - lot number - code ของเชอ เชน E. coli :ATCC 25922 - วนทรบ - วนทเตรยม - ผลการทดสอบ ความบรสทธ รปราง ชวเคม


ขนตอนการเกบเชอจลนทรยอางอง


ขนตอนในการเกบรกษาเชอจลนทรย

เลยงใหเจรญ

ทดสอบความบรสทธและคณสมบตเฉพาะ

เกบเปน stock เชอ ตดปาย

จดเกบ stock ในสภาวะทเหมาะสม

- Master Culture

• เชอทเปน freeze dried ampoule หรอ frozen glycerol bead

• ใชในการเตรยม stock culture

• จะใชตอเมอ stock culture หมด หรอ stock culture สญเสย viability หรอแยก contamination


ระดบของเชอมาตรฐาน

- Stock Culture

• เกบในรปของ frozen glycerol beads มอายประมาณ 2 - 5 ป

• ใชในการเตรยม working culture ส าหรบใชในงาน routine


- Working Culture

• จะตองไมน า subculture มาเปน ref. Culture อก

• ไมมการสญเสย viability

• ไมมการเปลยนแปลงรปรางลกษณะของเซลล

• ไมมการเปลยนแปลงคณสมบตทางชวเคม

• มการบนทกการน าไปใช


- Working Culture (ตอ)

• มอายประมาณ 1 - 4 สปดาห ขนอยกบความถในการใชงาน ชนดของเชอ

• เลยงเชอใน agar plate or agar slant

• เกบในตเยน

• น ามาใชส าหรบ QC test method, QC media, Validation


ตามขอก าหนด ISO/IEC 17025 ถอวา media เปน critical material ตองมการทวนสอบกอนน าไปใชในการทดสอบ

หอง lab จะตองจดใหมวธการปฏบตเกยวกบการ จดซอ การยอมรบ การเกบรกษาอาหารเลยงเชอ

ตองมการทดสอบประสทธภาพและมการบนทกผล

V การควบคมคณภาพอาหารเลยงเชอ

ประเภทของอาหารเลยงเชอ ♣ Simple media /Non-selective media เชน Peptone water , TSB, PCA, NA, PDA Selective enrichment media เชน TT broth, RVS broth, Alkaline peptone water , TSB 10%NaCl ♣ Differential selective media เชน XLD, EMB, MSEY, TCBS


http://www.google.co.th/url?sa=i&rct=j&q=salmonella&source=images&cd=&cad=rja&docid=k7LaZcm5IzmiVM&tbnid=5vNGStqjMZJKiM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fen.wikipedia.org%2Fwiki%2FFile%3ASalmonella_growing_on_XLD_agar.JPG&ei=m1kkUYSDEJCeiQfKm4D4Cw&bvm=bv.42661473,d.bmk&psig=AFQjCNFq_M3FgwbShKfUObJKEB6UdpNfHw&ust=1361423017243092

ประเภทของอาหารเลยงเชอ - Biochemical media เชน TSI, LIM, น าตาลตางๆ


- มระบบการประเมน supplier และขนตอนการจดซอ - ขอใบ certificate ส าหรบ lot no. ทสงซอ - เมอไดรบมาแลวควรตรวจดวายงอยในชวงท ไมเกนวนหมดอาย - ขวดไมช ารด ฝายงอยในสภาพทปดผนก


การซอและการตรวจรบอาหารเลยงเชอ

รน วนเดอนปทผลต วนเดอนปทหมดอาย จ านวนและขนาดทไดรบ วน เดอน ป ทไดรบ สถานทเกบ ชอผรบ วน เดอน ป ทเปดใช ผลการทดสอบ(Productivity และ/ หรอ Selectivity)


การซอและการตรวจรบอาหารเลยงเชอ

การปราศจากเชอ(Sterility)

การเจรญของเชอ(Growth)

การยบยงและสนบสนนการเจรญของเชอ (Positive & Negative)


การทดสอบคณภาพอาหารเลยงเชอ

ตรวจสอบการปราศจากเชอ(Sterility check)

- ท าการสม 1 หลอด/plate /ขวด ตอ Lot

- หรอ ท าการสม 1 -4 % จากจ านวนทเตรยม

- น าไปบมตามวธ


การยบยงและสนบสนนการเจรญของเชอ

(Positive & Negative) - ไมไดก าหนด ความถ

- แตละ media ตองทดสอบกบเชอ Positive & Negative


Negative control

: S. aureus

Positive control : E. coli

- วดคาความเปนกรดดาง ท 250C

- ตรวจพนจอาหารเลยงเชอ

ความหนาของอาหารเลยงเชอ

ส

ความใส/สงปลอมปน

ความขน/ความคงตว/ความชน - ทวนสอบปรมาตร dilution buffer 2 %


ทางกายภาพ

- Ready-to-use media

มใบ Certificate จากผผลตทไดรบการรบรอง

มาตรฐาน ISO

* อาจไมจ าเปนตองตรวจสอบซ า

* ตองมการเกบรกษาอยางเหมาะสม



ตวอยางใบ Certificate


- กรณทเตรยมจากอาหารเลยงเชอ Dehydrated media หรอ Basic individual components ควรตรวจสอบ โดยวธ Qualitative เปนอยางนอยแตวธ quantitative จะประกนคณภาพไดดกวา โดยปฏบตตามวธการ ตรวจสอบใน ISO 11133-2:2003,2011

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 เชอทตองการ

(stationary phase) เชอทเราตองการ

Test medium Ref. medium

Spread plate 0.1 ml

Quantitative plating method Solid Media 1. for non-selective medium การทดสอบ Productivity ของอาหารเลยงเชอชนดแขง

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7


Spread plate 0.1 ml

Working culture of control strain (stationary phase)

Target culture


Quantitative plating method (ตอ) Solid Media 2. for selective medium การทดสอบ Productivity และ Selectivity ของอาหารเลยงเชอชนดแขง

Working culture of control strain (stationary phase)

Target culture

Non Target culture

Non Target culture

การค านวณคา Productivity ratio(PR)

PR = Ns / No

Ns = จ านวนเชอจลนทรยทงหมดบน Test medium

No = จ านวนเชอจลนทรยทงหมดบน Reference medium

(จ านวนเชอบน plate ทน ามาใชควร 100 cfu/plate)

Quantitative plating method (ตอ)

Calculation of selectivity ratio(SF)

SF = Do –Ds

Do = dilution สงสดทเชอเจรญได ไมนอยกวา 10 cfu บน Reference medium

Ds = dilution สงสดทเชอเจรญได บน Test medium


Criteria for interpretation a non – selective medium PR 0.7 a selective medium - target microorganism PR 0.1 - non-target microorganism SF 2 Colony appearance and size Typical of wanted (target) microorganism


ลกษณะโคโลนทตองการ

Semi-quantitative streaking method based on ecometry Solid Media 3. for selective medium and non- selective medium

เลยงเชอ target organism และ non-target organism

streak บน plate โดยแบง plate เปน 4 สวน (sector A-D) A

B

C

D

1 2 3 4

5 6 7 8

10

12

13

14 15

16

9

11

• Streak 1 µl loop ไมตองเผา loop • แตละแนว streak หางกนประมาณ 0.5 Cm • loop ควรเอยงท ามม 20-30 องศากบ agar

Test medium

Semi-quantitative streaking method based on ecometry (ตอ) Solid Media 3. for selective medium and non- selective medium

บมตามความเหมาะสม น ามานบคะแนนเพอหาคา growth index GI

ถาเชอเจรญขนเตมเสนได 1 คะแนน ถาเชอเจรญขนครงเสนได 0.5 คะแนน ถาเชอเจรญนอยกวาครงเสน หรอไมเจรญ ได 0 คะแนน น าผลรวมคะแนนของ sector A ถง D รวมกนจะไดเปนคา GI

Semi-quantitative streaking method based on ecometry (ตอ) Solid Media 3. for selective medium and non- selective medium

Interpretation of results Selective medium target microorganism ขนอยางนอย 6 คะแนน non-target microorganism ไมมการเจรญ Non-selective medium Growth index GI มากกวา 6 คะแนน

-เลยงเชอ target และ non-target(อาจใชเชอเดยวหรอหลายเชอ)

Streak 1 µl loop บน plate -บมตามความเหมาะสม

1

2

3

4

5

Qualitative streaking method Solid Media 4. for selective medium and non- selective medium

Interpretation

เชอขนเตมเสนใหนบ 2 คะแนน

เชอขน ครงเสนใหนบ 1 คะแนน

เชอไมขนหรอขนนอยกวาครงเสนใหนบ 0 คะแนน

Solid Media 4. for selective medium and non- selective medium Qualitative streaking method (ตอ)

Criteria for interpretation

non-selective agar : ควรได 2 คะแนนในแตละเชอททดสอบ

selective agar: เชอ target : ควรได 2 คะแนน

เชอ non-target : ควรได 0 หรอ 1 คะแนน

Colony appearance and size Typical

of wanted (target) microorganism

Solid Media 4. for selective medium and non- selective medium Qualitative streaking method (ตอ)

1.Prepare liquid medium

2.Prepare stationary phase cultures of the test strains

10 ml 10 ml

Test broth Reference broth

dilute

10-100 cfu/0.1 ml for target microorganism

> 1,000 cfu/0.1 ml for non-target microorganism

Quantitative dilution method for target and non target microorganism Liquid Media 5. for selective medium and non- selective medium การทดสอบ Productivity และ Selectivity ของอาหารเลยงเชอชนดเหลว

เชอ target

10-100 cfu/หลอด

เชอ non-target

> 1000 cfu/หลอด

Test b Ref. b Test b Ref. b บมตามความเหมาะสม

Dilute ตามความเหมาะสม

Spread plate 0.1 ml

non-selective medium non-selective medium บมตามความเหมาะสม

Liquid Media 5. for selective medium and non- selective medium การทดสอบ Productivity และ Selectivity ของอาหารเลยงเชอชนดเหลว

Quantitative dilution method for target and non target microorganism (ตอ)

Calculation and Interpretation

Productivity ratio:

Non-selective broth : PR 0.7

Selective broth : 0.1

Selectivity Factor : SF 2


เชอ target เชอ non-target

100-1000 cfu/หลอด

บมตามความเหมาะสม(transport media)

บมทอณหภมหอง 45 นาท( diluents)

Spread plate 0.1 ml

non-selective medium

non-selective medium

บมตามความเหมาะสม

เชอ non-target เชอ target

ชดท 1 ชดท 2

Spread plate 0.1 ml

Liquid Media 6. for diluents and transport media Quantitative dilution method for target and non target microorganism (ตอ)

Calculation

-นบปรมาณของเชอ target และ เชอ non-target ภายหลง spread บนnon-selective medium

-เปรยบเทยบปรมาณเชอ ในชดท 1 (ไมบม) และชดท 2(บมกอนน าไป spread บน non-selective medium)

Interpretation

ทงเชอ target และ non-target ของชดท 2 ควรมปรมาณอยในชวง 50%ของปรมาณเชอทนบไดในชดท 1


1.เตมเชอ non-target

> 1,000 cfu/หลอด

2.เตมเชอ target 10-100 cfu +

non-target > 1,000 cfu/หลอด

10 ml 10 ml

Test b Test b บมตามความเหมาะสม

Streak 10 µl

non-selective medium Specific selective medium บมตามความเหมาะสม

Semi-quantitative single tube method for target, non target and mixed culture

Liquid Media 6. for selective medium การทดสอบ Productivity และ Selectivity ของอาหารเลยงเชอชนดเหลว

Interpretation

Productivity ของเชอ target : ตองขนอยางนอย 10 โคโลนบน selective medium

Selectivity ของเชอ non-target : ตองไมขน (Total inhibition) หรอ ขนนอยกวา 10 โคโลนบน non-selective medium

Semi-quantitative single tube method for target, non target and mixed culture (ตอ)

LST : ดการเจรญ การสรางกส

Working culture of target and non-target control strain (stationary phase)

เชอ target เชอ non-target

10 ml

Test broth

บมตามความเหมาะสม

Qualitative single tube method Liquid Media 7. for selective medium and non- selective medium

TSB : ดการเจรญ

ไมขน

ขน +2

Calculation

หลอดขนถงขนมาก แสดงวาเชอเจรญ = 2 คะแนน

หลอดขนนอย แสดงวาเชอเจรญไมด = 1 คะแนน

หลอดไมขน แสดงวาเชอไมเจรญ = 0 คะแนน

Qualitative single tube method (ตอ)

Interpretation

non-selective broth : ตองได 2 คะแนนในแตละเชอททดสอบ

selective broth : เชอ target - ตองได 2 คะแนน

เชอ non-target - ตองได 0 หรอ 1 คะแนน

สรป : การควบคมคณภาพอาหารเลยงเชอ

1.Quantitative : ใชกบอาหารเลยงเชอ

ชนดใหม

ผผลตรายใหม

ทใชนบจ านวน (lot หรอ batch ทรบใหม) 2.Semi- Quantitative ใชกบอาหารเลยงเชอ

Selective medium (lot หรอ batch ทรบใหม) 3.Qualitative ใชกบอาหารเลยงเชอทหองปฏบตการเตรยม

ขอ1 จากขอมล จงประเมนอาหารเลยงเชอ Baird parker Lot. No. ใหมวาสามารถ

น ามาใชในหองปฏบตการไดหรอไม

อาหาร Baird parker : อาหาร TSA

S. aureus (โคโลน) S. aureus (โคโลน)

Dilution 10 (-5) = 40 Dilution 10 (-5) = 45

Dilution 10 (-6) = 5 Dilution 10 (-6) = 3

E. coli ไมเจรญ E. coli

Dilution 10 (-6) = 60

Dilution 10 (-7) = 7

ขนตอนการเตรยมอาหารเลยงเชอ - สตร - ยหอของสวนประกอบ - วธการเตรยม - pH เรมตน / สดทาย


- เวลา , อณหภมทใชในการฆาเชอ - ฉลาก (label) - การเกบรกษา, ระบวนหมดอาย - การควบคมคณภาพ


- dehydrated media เกบในขวดปดฝาใหแนนในททเยน และแหง ไมมแสง ถาก าหนดวาตองแชในตเยนและมดกตอง ปฏบตตาม - หลงจากเปดขวด media ใชงานแลวควรใชใหหมดภายใน 6 เดอน - media ทมสเปนองคประกอบ ควรเกบในททปองกนแสงโดย เกบในทมด ขวดสเขม หอดวยฟอยล - สภาพของอาหารเลยงเชอจะตองไมเปลยนแปลง - มระบบบนทก stock และบนทกการน าไปใช


การเกบรกษา media กอนเปดใชงาน

- หองปฏบตการควรจดใหมขอมลสภาวะการเกบอาหาร เลยงเชอชนดตาง ๆ - องคประกอบและ packaging ของอาหารเลยงเชอจะ มผลตออายของ media - ปรมาณของเหลวทหายไปตองไมเกน 10 %


การเกบรกษา media ทเตรยมแลว


การเกบรกษา media ทเตรยมแลว (ตอ) - Optimum temperature สวนใหญ 4 - 6 0C เกบได เปนระยะเวลาหลายเดอน - liquid media สวนใหญเกบไวทอณหภม 40 C ได เปนระยะเวลาหลายเดอน แตกม liquid media บางชนดทมอายสน ไดแก tetrathionate broth

- ปองกนอาหารเลยงเชอจากการถกแสงแดด เนองจาก อาจท าใหประสทธภาพของอาหารเลยงเชอลดลง เนองจากเกด การสราง peroxides หรอท าให stability ของส (dye) ลดลง

- Solid media สวนใหญจะเกบไวไดหลายเดอน ถาเกบใน airlight container เชน เกบใน tube ทเปนฝาเกลยว


การเกบรกษา media ทเตรยมแลว (ตอ)


การเกบรกษา media ทเตรยมแลว (ตอ)

- Agar plate จะมปญหาในการเกบรกษาคอ Contamination และ dehydration อาจปองกน ไดดวย การหมหอหรอ seal plate ดวยถงพลาสตก เกบรกษาท อณหภม 4 0C

(ตองคว า plate)

• Membrane fill broth (MF) เกบใน SCREW CAP ท 4 0C เกบได 96 ชวโมง

• agar หรอ broth เกบใน loose-cap tubes ท 4 0C เกบได 2 สปดาห

• agar หรอ broth เกบใน tightly screw-cap tubes ท 4 0C เกบได 3 เดอน


เวลาในการเกบรกษาอาหารเลยงเชอ

• อาหารแบบวนทเทลงใน plate และเกบใน ถงพลาสตกทปดสนท ท 4 0C เกบได 2 สปดาห

(กอนใชท าการ dry plate โดยเปดฝา คว าหนา plate

ท าใน oven 25-50 0C หรอ Laminar flow cabinet)

• อาหารแบบวนทเกบใน flask ขนาดใหญม screw-cap ท 4 0C เกบได 3 เดอน


เวลาในการเกบรกษาอาหารเลยงเชอ


การละลาย Agar medium

ถาหลงจากฆาเชอแลว ยงไมไดท าการ pour plate ใหสามารถ ทงไวใหแขง แลวสามารถน ากลบมาใชไดโดยอนญาตใหท า การละลายไดอกหนงครง ถาเหลอใหทงไดเลย อณหภมทใชเท plate 47-50 OC อณหภมทใชเทลงใน ตวอยาง plate 44-47 OC เมอท าการละลาย media แลว ตองใชภายในไมเกน 4 ชม.

ตวอยางแบบบนทกการเตรยม อาหารเลยงเชอ

ว/ด/ป Bath No. Media น ำหนก(g) ปรมำตร(ml) pHเรม pHสดทำย ผเตรยม QC media Sterility ผรบผดชอบ

Positive Negative

ใชน ากลนหรอ deionized water

มการบนทกผลการตรวจ คณภาพน า

ควรเลอกซอจากบรษททม certificate

คณภาพน าทใชในหองปฏบตการ


คณภาพของน าทใชในหองปฏบตการจลชววทยา

<0.1 mg/ l Annually Heavy metals total

< 500 CFU/ml Monthly Becteriological tests : Heterotrophic plate count

< 0.1 mg/l Monthly or with each use Total chlorine residual

< 1.0 mg/l Monthly Total organic carbon

5.5 – 7.5 With each use pH

< 2 µmhos/cm at 25 C

Monthly or each new batch Chemical tests : Conductivity

Limit Monitoring Frequency Test

- ท า duplicate อยางนอยเดอนละครง หรอ 10 % ของตวอยาง หรอ หนงตวอยางตอการทดสอบ (test run) หรอ หนงตวอยางตอสปดาห ถาตวอยางตอสปดาห นอยกวา 10

V I การควบคมคณภาพวธทดสอบ

No. Duplicate Analyses Logarithms of Counts Range of Logarithms

D1 D2 L1 L2 ( Rlog) (L1-L2)

1 89 71 1.9494 1.8513 0.0981

2 38 34 1.5798 1.5315 0.0483

3 58 67 1.7634 1.8261 0.0627

. . . . . .

. . . . . .

14 7 6 0.8451 0.7782 0.0669

15 110 121 2.0414 2.0828 0.0414

Precision criterion

Precision criterion

Rlog = 0.0981+0.0483+0.0627+…….+0.0669+0.0414 = 0.71889 R = Rlog /n = 0.71889/15 = 0.0479 Precision criterion = 3.27 R = 3.27(0.0479) = 0.1566

- Spike ตวอยางดวย positive และ negative control culture ส าหรบ test method นน ๆ ดวยปรมาณเชอท ทราบคา - sterility check ของ media ท าทก 1-4% และ glassware โดยใชน ากลนทฆาเชอแลวแทนตวอยาง โดย ท าการทดลองไปพรอม ๆ กบการทดสอบ ตวอยาง

No.

Duplicate Analyses

Logarithms of Counts

Range of Logarithms

D1 D2 L1 L2

(

L1

-

L2 )

1 89 71 1.9494 1.8513

0.0981

2 38 34 1.5798 1.5315

0.0483

3 58 67 1.7634 1.8261

0.0627

. . . . . .

. . . . . .

14 7 6 0.8451 0.7782

0.0669

15 110 121 2.0414 2.0828

0.0414

VI การควบคมคณภาพวธทดสอบ

- ควรทดสอบทนททตวอยางเขามาถงหองปฎบตการ - ในกรณทตองมการเกบรกษาตวอยางตองเกบรกษาท อณหภมและภาวะทเหมาะสม โดย

อาหารแชแขง เกบทอณหภม < -180C อาหารแชเยน เกบทอณหภม 1-50C แตตอง ทดสอบภายใน 36 ชวโมง

VII การควบคมคณภาพตวอยางทดสอบ

ตวอยางน า เกบทอณหภม 0-40C แตตองทดสอบภายใน 24 ชวโมง

อาหารกระปองและอาหารแหงเกบทอณหภมหอง

VII การควบคมคณภาพตวอยางทดสอบ

เอกสารอางอง - ISO 7218: 2007;Microbiology of food and animal feeding stuffs-

General requirements and guidance for micro biological examinations

- Stanadard Methods for the Examination of water and waste water, 22nd ,2012 ., American Public Health Association.

- Bacteriological Analytical Manual .Food Sampling and Preparation of Sample Homogenate, 2003

- ISO 11133-1:2009, Microbiology of food and animal feeding stuffs –Guidelines on preparation and

production of culture media –part 1 : General guideline on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory.

- ISO 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs –Guidelines on preparation and

production of culture media –part 2 : Practical guidlines on performance testing of culture media .

เอกสารอางอง

- APHA 2001 , Compendium of method for the microbiological examination of food 4th ., chapter 1

laboratory quality assurance. - ISO 11133-2:2011, Microbiology of food and animal feeding stuffs –Guidelines on preparation and production

of culture media –part 2 : Practical guidlines on performance testing of culture media .Amendment 1 : Test microorganisms for commonly used culture media.

เอกสารอางอง

No Slide Titlept.nfi.or.th/DocFile/20140319100336.pdf · Quality Control:...

Documents

Transcript of No Slide Titlept.nfi.or.th/DocFile/20140319100336.pdf · Quality Control:...