Reduction of Methaemoglobin in Haemoglobin Samples using Gel Filtration for Continuous Removal of Reaction Products

H. B. F. DIXON & R. McINTOSH*

1. Department of Biochemistry, Cambridge.2. *Medical Research Council Abnormal Haemoglobin Research Unit.

Abstract

EVEN a small degree of oxidation of haemoglobin to methaemoglobin, such as occurs in the transport and storage of frozen red cells, interferes with the study of its oxygen dissociating properties. When abnormal are separated from normal haemoglobins, even more methaemoglobin accumulates during the manipulations involved. The methaemoglobin may be efficiently reduced by passing a haemolysate of such a partly oxidized sample by means of gel nitration through a band of reducing agent. Advantages of this method are that the methaemoglobin constantly encounters fresh reducing agent and that the continued elution quickly removes the haemoglobin formed from excess reagent. These factors are important when reduction is by dithionite, as side reactions can then destroy the haemoglobin. A similar principle can be applied to the oxidation of cytochromes1, and to the conversion of the aldimine form of aspartate aminotransferase (E.C. 2.6.1.1) into the amino form by transamination with an amino-acid2. The continuous removal of the  -oxoacid formed is particularly important in the latter case because the position of equilibrium is unfavourable to formation of the amino form.

Nature 213, 399-400 (28 January 1967)

CROMATOGRAFIA

Tecnica di separazione di molecole tra FASE STAZIONARIA FASE MOBILE

La separazione si ottiene perché le sostanze migrano con diversa velocità attraverso la fase stazionaria

La migrazione è provocata dal flusso della fase mobile o eluente

FASE STAZIONARIA

Particelle di determinate dimensioni impaccate su colonna o stratificate su un supporto solido (strato sottile)

FASE MOBILE

Viene fatta scorrere attraverso la fase stazionaria

SOSTANZE

Vengono trasportate lungo la fase stazionaria dalla fase mobile

CROMATOGRAFIA AD ADSORBIMENTO: le sostanze interagiscono con la superficie delle particelle costituenti la fase stazionaria

CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE: le sostanze si separano in base alla diversa ripartizione tra fase stazionaria e fase mobile

GEL CROMATOGRAFIA (ad esclusione molecolare): La fase stazionaria è rappresentata da un GEL, attraverso cui scorre l’eluente

GEL: viene preparato permettendo il rigonfiamento delle particelle in eccesso di eluente Generalmente la matrice del gel possiede gruppi idrofilice (-OH) Il gel viene impaccato mediante il passaggio di eluente attraverso di essa

Sephadex

E’ costituito da DESTRANO, un polisaccaride costituito da residui di glucosio

Viene prodotto da ceppi differenti di Leuconostoc mesenteroidesche crescono in un medium contenente saccarosio Successivamente il destrano viene polimerizzatocon EPICLOROIDRINA

Tre stadi nel corsodella separazione

low molecular weight

high molecular weight

Gel particles

Principio di ripartizione: le molecole piccole possono entrare nel gel attraverso i grani della fase stazionaria (equilibrio dinamico) le molecole più grosse passano attraverso i grani di gel senza interagire con esso il sistema può essere complicato a causa di particolari interazioni con la matrice del gel

ESERCITAZIONE

Sangue metaemoglobina emoglobina emoglobina ossigenata

K 3Fe(CN)6

Fe(III)marrone

Fe(II)rosso porpora

rosso

6Fe3++S2O42- 2SO4

2- + 8H+ + 6Fe2+4H2O+3

1) Aggiungo prima ditionito di sodio2) Poi metaemoglobina

marronerosso porporarosso

metaemoglobina

+6

ditionito

Na2S2O4

Principio

La metaemoglobina è più veloce e raggiunge il ditionito tornando allo stato di ossidazione Fe(II) assumendo quindi la colorazione rossae successivamente rosso più chiaro grazie alla presenza di molecole di ossigeno presenti all’interno della colonna