Ms. Romeu Moreira dos Santos - Faculdade de Ciências ... · TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA TESTES...
Transcript of Ms. Romeu Moreira dos Santos - Faculdade de Ciências ... · TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA TESTES...
2Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
INTRODUÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• As respostas imunes são úteis de dois modos para diagnosticar uma
doença:
• Inicialmente Acs específicos podem ser utilizados para detectar ou
identificar um Ag de interesse.
• Ou por meio de detecção de Acs específicos no soro, é possível determinar
se um animal foi previamente exposto a um agente infeccioso.
• A mensuração das interações Ag x Ac com o propósito de diagnóstico é
denominada sorologia.
3Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
INTRODUÇÃO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• As técnicas sorológicas podem ser classificadas em três grandes
categorias:
• Testes de ligação primária
• Mensura diretamente a ligação do Ag x Ac
• Testes de ligação secundária
• Mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro.
4Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
REAGENTES UTILIZADOS EM TESES SOROLÓGICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Soro
• Antiglobulinas
• Anticorpos monoclonais
• Anticorpos específicos
5Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Teste que detectam diretamente o Ag ou Ac de interesse.
• Permitem o reconhecimento do Ag pelo Ac e os complexos imunes
formados são, então, mensurados.
• Para mensuração desta reação, um dos reagentes deve estar
quimicamente marcado
6Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Radioimunoensaios
• Ensaios de imunofluorescência
• Ensaios imunoenzimáticos
• Dispositivos descartáveis para imunoensaios
• Citometria de fluxo
7Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
HISTÓRICO
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Utilização de anticorpos em Ensaios Sorológicos - 1954: Teste de
Imunofluorescência (Weller & Coons); 1959: Radioimunoensaio
(Yallow & Berson).
• Anos 60: enzimas conjugadas a antígenos e anticorpos (Avrameas &
Uriel; Nakane & Pierce, 1966).
• Anos 70: ELISA (Engvall & Perlmann, 1971); produção de anticorpos
monoclonais (Kohler & Milstein, 1975) - desenvolvimento de novos
testes (kits comerciais).
• Métodos colorimétricos, radioativos, fluorescentes,
quimioluminescentes, etc.
8Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
RADIOIMUNOENSAIOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• São ensaios que utilizam como marcadores radioisótopos
• (Trício H3, carbono 14 ou iodo 125)
• Possuem vantagem de serem altamente sensíveis
• Desvantagens: alto custo, manipulação do isótopo
• Aplicabilidade: quantificação de hormônios, drogas, marcadores tumorais,
alérgenos, anticorpos e antígenos microbianos.
• Radioimunoensaios para anticorpos
• Radioimunoensaios para antígenos
9Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
RADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTICORPOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Teste radioalergossorbente (RAST) – mensura IgE no soro de animais alérgicos.
Discos de celulose
+ antígeno
Soro teste
Lavagem
Discos de celulose
+ antígeno +
anticorpos
Sol.
Antiglobulina
marcada
Anti-IgE
Anti-IgE se liga
a IgE + Ag
Presença de
radioatividade
10Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
RADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Imunoensaios de competição são baseados no princípio de que o Ag não
marcado irá deslocar o Ag radiomarcado dos imunocomplexos.
Ac específicos
Radioatividade no
sobrenadante
Precipitado
proteico
• Quantidade de reagente marcado (Ag ou
Ac) quantifica o Ag ou Ac não-marcado na
amostra - competição
11Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
RADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
12Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a
uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV,
emite luz no espectro visível.
A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em um
microscópio com luz UV (microscópio de fluorescência)
Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –
FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos:
direta, indireta ou sanduíche.
13Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Teste direto - pesquisa de antígenos (células ou tecidos)
Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos
Referência para sorodiagnóstico de várias doenças.
• Vírus, bactérias e protozoários
14Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Teste direto - pesquisa de antígenos
• Ex. – Raiva, Vírus da leucemia felina (FELV)
15Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos
16Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução;
determinação de classes e subclasses de anticorpos
Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescência
sob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação.
Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Cor
Fluoresceína 495 525 Verde
Rodamina 552 570 Vermelho
Vermelho Texas 596 620 Vermelho
Ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja
17Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima (ELISA) Um dos mais importantes imunoensaios empregados na medicina veterinária
Utillizado para detectar e mensurar tanto Acs como Ags.
18Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS - ETAPAS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
–Revista a superfície das cavidades de uma microplaca apropiada com Ags do agente
infeccioso que você está interessado em detectar Acs específicos.
–Adicione as amostras de soro de indivíduos a serem testados, se houver anticorpos
na amostra, eles vão se ligar aos Ags adsorvidos à superfície plástica
–Lave as cavidades da microplaca a fim de remover todos os anticorpos que não
forem específicos para o Ag em questão
–Adicione um outro tipo de Ac anti-Ig da espécie que você está pesquisando se as
amostras de soro têm ou não que deve ter sido previamente marcado com uma
enzima
–Adicione o substrato específico para a enzima e deixe a reação de degradação
enzimática prosseguir e conferir cor às cavidades da microplaca
–A intensidade da cor (DO) deve ser mensurada em leitor-fotômetro, sendo que as
leituras são proporcionais aos níveis dos Acs presentes nas amostras originais de
soro contra o Ag em questão.
19Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
Método direto – Ags
Método indireto – Acs
Sandwich e Competitivo –Ags e Acs
20Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
ELISA INDIRETO
Lavagens
Antígeno
Fonte de proteínas
estranhas ao sistema
LavagensLavagens
Soro anti
Conjugado anti
Lavagens
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
21Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
•Sandwich-ELISA (S-ELISA) / Duplo Ac-ELISA
–As amostras são adicionadas às cavidades de uma microplaca previamente
revestidas com Acs de captura específicos para Ag que se deseja detector
–As cavidades da microplaca são lavadas p/ remover o excesso de substâncias
ou Ags que não se ligaram especificamente aos Acs de captura
–Uma preparação de Ac secundário conjugado com uma enzima apropriada é
adicionada
–O substrato enzimático é então adicionada e haverá, no caso de presença de Ag
na amostra uma mudança de cor, que pode ser mensurada em leitor-fotômetro
apropriado. A intensidade de DO é proporcional à quantidade de Ag presente na
amostra.
22Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA
Lavagens
Antígeno
Fonte de proteínas
estranhas ao sistema
LavagensLavagensLavagens
Conjugadoanti
Soro anti
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
23Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOELISA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
24Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOELISA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
25Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOIMMUNOBLOTTING (Western blotting)
Transferência de proteínas separadas por eletroforese do gel de
poliacrilamida para membranas ELISA
Resolução obtida pela separação eletroforética de mistura de proteínas +
especificidade de anticorpos usados como sondas para a detecção de Ags
Suportes: membrans de nitrocelulose (interações hidrofóbicas); nylon,
polyvinyldifluoide (PVDF) alta capacidade de ligação a proteínas
Quantificação de bandas por densitometria.
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
26Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOIMMUNOBLOTTING (Western blotting)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
27Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOIMMUNOBLOTTING (Western blotting)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
28Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOIMMUNOBLOTTING (Western blotting)
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
29Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA
Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais.
Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolor
em produto colorido (deposição pode ser observada diretamente ao
microscópio óptico).
Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -Galactosidase
e Glicose Oxidase.
Método direto Acs primários conjugados (antígenos).
Método indireto Acs secundários conjugados (antígenos ou anticorpos).
Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamento
inadequado dos conjugados.
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
30Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
31Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana de
nitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar a
visualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana na
forma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado com
proteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA).
32Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
33Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
34Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOImunocromatografia
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
35Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOCitometria de Fluxo
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
• Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz e
fluorescência sob feixe de laser
• Estudo de populações de leucócitos - luz dispersa - tamanho e forma da célula
• Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B
• FACS (fluorescence-activated cell sorter) - separação de uma única célula
36Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOCitometria de Fluxo
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
37Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGOCitometria de Fluxo
TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS
38Questions & feedback? Email me – [email protected]
More PowerPoint resources and downloads available at learnppt.com.learnppt.com
LOGO
Obrigado!
REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE