Molekularne in fiziološke tehnike v mikrobni ekologiji
96
1 (Moderne) tehnike in metode v mikrobni ekologiji
Transcript of Molekularne in fiziološke tehnike v mikrobni ekologiji
1
(Moderne) tehnike in metode v mikrobni ekologiji
2
Metode v mikrobni ekologiji:1. molekularna biologija2. fiziologija3. molekularna biologija in fiziologija4. analiza in statistika5. modeliranje6. ...
3
Definiraj pojem - ‘’moderne’’?
SIR (Anderson in Domsch, 1989; 1993)- Substrate Induced Respiration - Substratnoinducirana respiracijaPCR (Khorana et al.,1971; Mullis et al., 1983) – Polymerase Chain Reaction –verižna reakcija s polimerazo
CLPP – community level physiological profiling - Kratkotrajno metabolno profiliranje združb (Degens et al., 1999; 2001)
SIGR (Colores et al., 1996) - substrate induced growth response - substratnoinduciran rastni odziv
MicroResp (Chapman et al., 2003) - microtitre-plate based respiration system –mikrotitrski sistem za spremljanje respiracije
D/TGGE (1989, Muyzer et al., 1993) – Denaturing/Temperature Gradient Gel Electrophoresis – denaturacijska / temperaturna gradientna gelska elektroforeza
Real-Time T-RFLP (2005)
T-RFLP(Liu et al., 1995) – Terminal Restriction Fragment Length PolymorphismReal-Time PCR (1995) – PCR v realnem času,
Microarrays - Mikročipi (1995),
4
Pa je modernost vse, kar je pomembno?
Prag detekcije?
Ali je zgolj ,,modna’’?
Velikostni razred napak?Ločljivost? Interference?
Kaj želite z neko metodo pokazati?Kaj lahko z neko metodo sploh raziščete?Ali je vaša metoda prava za reševanje zastavljenega problema?
Vir novih informacij.
5
Osnovna vprašanja:
Kakšna je raznolikost mikrobne združbe v vzorcu?Kako je raznolikost mikrobne združbe odvisna od parametrov okolja?Kako je raznolikost mikrobne združbe povezana s funkcijo?Kako je funkcija mikrobne združbe odvisna od parametrov okolja?Kakšna je funkcija mikrobne združbe v vzorcu?
Zanima nas kakšna je:Stabilnost ekosistema (strukture in funkcije) ?Prožnost -,,Resilience’’ – kako hitro se ekosistem vrne v izhodiščno stanje po motnji ?Upornost -,,Resistance’’ – kako dolgo se ekosistem upira motnji ?Velikost, raznolikost in aktivnost posameznih funkcionalnih skupin?
raznolikost
funkcija
6
Pestrost, raznolikost - ,,diversity’’:
Makroekologi definirajo bioraznolikost z vrstami in jo razlikujejo v treh prostorskih območjih:
α (znotraj izbranega mesta),ß (med izbranimi mesti),
γ (čez celotno območje).
Raznolikost znotraj enega prostorskega območja je definirana v skladu s tremi dolgo poznanimi parametri: - bogatost vrst (,,species richness’’) – število vrst na obravnavanem
področju- enakomernost vrst (,,species eveness or equitability’’) – relativna
zastopanost vrste- sestava vrst (,,species composition’’) – opis dejanskih vrst ali OTE (operacijskih taksonomskih enot v molekularni ekologiji) prisotnih v vzorcu.
7
Funkcija:
Možnost spremljanja preko 500 encimskih reakcij v ekosistemu
Ugotavljanje limitnih faktorjev v ekosistemu
Mapiranje odziva mikrobnih združb na parametre okolja (razpon):temperatura, voda, pH, tekstura, gostota,parcialni tlaki plinov (kisik, ogljikov dioksid, metan, vodik), osvetljenost, koncentracije substratov, produktov, inhibitorjev, elektronskih
akceptorjev in donorjev, stresni dejavniki,Vmax, Kmquorum sensing in razgradnja signalov
Ugotavljanje rastnih pogojev mikroorganizmov v laboratorijskih razmerah
8
Sklopi obravnavanih tehnik v mikrobni ekologiji:
1. molekularna biologija2. fiziologija3. molekularna biologija in fiziologija4. analiza in statistika
9
1. Tehnike molekularne biologije
Število vseh metod Frekvenca uporabe metode
10
Resolucija metodDružina Rod Vrsta Podvrsta Sev
Sekvenciranje DNASekvenciranje genov za 16S rRNA
ARDRADNA-DNA reasociacija
ITS-PCRRFLP PFGE LFRFAMultilocis Izocyme
Whole cell protein profilingAFLPRAPD
rep-PCR
ARDRA – Amplified Ribosomal DNA Restriction AnalysisITS- PCR ali ARISA= intergenic spacer –PCR ali Amplified Ribosomal Intergenic Spacer AnalysisRFLP – Restriction Fragment Length PolymorphismPFGE – Pulse Field Gel ElectrophoresisLFRFA - Low-Frequency Restriction Fragment Analysis AFLP – Amplified Fragment Length PolymorphismRAPD – Random Amplified Polymorphic DNArep-PCR – repetitive sequence -PCR
11
Skupine metod:
i.DNA-DNA disociacija, reasociacija in hibridizacijaii.PCR: RFLP – restriction fragment length polymorphism
ARISA – amplified ribosomal intergenic spacer analysisrep-PCR: REP-PCR – Repetitive Extragenic Palindomic -PCR,
BOX-PCR – palindromski box elementi v genomu ERIC-PCR - Enterobacterial Repetitive Intergenic
Consensus PCR
SSCP – single stranded conformation polymorphismDGGE/TGGET-RFLPanaliza pojavljanja vzorcevkloniranje in sekvenciranjeanaliza sekvenc
12
iii.metagenomika
iv.direktna rekonstrukcija genomov iz okolja
v. mikrobne in metabolne mreže
Skupine metod:
13
i. DNA-DNA disociacija, reasociacija in hibridizacija
- Disociacija celokupne DNA – določanje deleža GC populacije, deleža GC genoma izolata
- Reasociacija celokupne DNA - določanje števila ekvivalentov genomov E.coli v ekološkem vzorcu
- Reasociacija DNA dveh genomov – dolčanje vrstnih odnosov med izolati
- Mikročipi – identifikacija izolatov, spremljanje sprememb v odkriviljivosti tarčnih DNA, RNA v vzorcih okolja
- FISH – Fluorescentna In Situ Hibridizacija
Hiperkromni efekt ?
14
-- DisociacijaDisociacija celokupne DNA in delež GC populacije ali genoma sevacelokupne DNA in delež GC populacije ali genoma seva
L. Øvreås, F.L. Daae,V. Torsvik,F. Rodrıg. 2003. Microb. Ecol. 46:291-301
15
--ReasociacijaReasociacija celokupne DNA ali DNA dveh celokupne DNA ali DNA dveh sevovsevov
ugotavljanje števila ekvivalentov ugotavljanje števila ekvivalentov genomovgenomov E.E.colicoli v ekološkem vzorcuv ekološkem vzorcuugotavljanje ugotavljanje medvrstnih medvrstnih odnosov med odnosov med sevisevi
Naravna tla Naravna tla –– 40004000--8000 različnih 8000 različnih genomovgenomovOnesnažena tla Onesnažena tla –– 350350--1500 različnih 1500 različnih genomovgenomov
22%37%
32%
Torsvik V, Goksoyr J,Daae FL. 1990. ApplEnviron Microbiol. 56:782-7.
L. Øvreås, F.L. Daae,V. Torsvik,F. Rodrıg. 2003. Microb. Ecol. 46:291-301
M.luteus +E.coliE.coli
E.coli
Govejitimus
Mikrobna združba
16
Prednosti:- uporaba celokupne DNA - enostavna in poceni oprema – spektrofotometer
Pomanjkljivosti:- Slabša resolucija od drugih molekularnih tehnik- Slabša ponovljivost – velik vpliv majhnih sprememb v
temperaturi in ionov v sledeh na diasociacijsko/reasociacijsko kinetiko
Disociacija Disociacija / / ReasociacijaReasociacija celokupne DNA ali DNA dveh celokupne DNA ali DNA dveh sevovsevov
17
--MikročipiMikročipifragmenti fragmenti genomske genomske DNA DNA PCR produktiPCR produktioligonukleotidi oligonukleotidi
natisnjeni na 2D, 3D natisnjeni na 2D, 3D gelskigelski nosilecnosilec
Uporaba:Uporaba:1. identifikacija 1. identifikacija izolatovizolatov, , 2. spremljanje sprememb v 2. spremljanje sprememb v odkriviljivostiodkriviljivosti tarčnihtarčnih DNA DNA in RNA v čistih kulturah in in RNA v čistih kulturah in vzorcih iz okolja.vzorcih iz okolja.
Cho and Tiedje, 2001, Appl. Envir.Microbiol., 67: 3677 - 3682.
18
(i) Kar vemo, je vse kar potrebujemo.
(ii) Primarna sekvenca nukleinskih kislin določa obnašanje sond na površju mikročipa
(iii) Zadovoljiva mera testiranja in validiranja nam omogoča izbor sond s popolnim načinom obnašanja na površju čipa
(iv) Validacijski eksperimenti in izbrane sonde se bodo obnašale enako idealno pri analizi drugih vzorcev in okolij.
Slabosti:osnovne predpostavke pri gradnji mikročipov:
Prednosti mikročipov:-Idealno orodje prihodnosti !!!-Veliko informacij pridobimo z enim samim eksperimentom-Možnih veliko število ponovitev v kratkem času-Velika ponovljivost v strogo definiranih pogojih
19
Pomanjkanje kultiviranih divjih sevov.Mišljenje, da mikroorganizmi iz zbirk sevov in sekvence iz baz podatkov, predstavljajo dobršen in povsem zadovoljiv delež v naravi prisotnih organizmov.Mišljenje, da a priori razumevanje tarč dovoljuje tehnikam razvozlavanje signala na čipu v natančen profil mikrobne združbe ali profil ekspresije genov.Kakšen je termodinamski vpliv površja na stabilnost dvoverižnih DNA in specifičnost hibridizacij? Kaj se sploh dogaja na površju mikročipa?Tehnične težave pri označevanju fragmentov DNA, Omejitve pri difuziji označenih fragmentov DNA na površino mikročipa Omejitve pri zaznavanju signalov na čipuOmejitve pri analizi dobljenih signalov – kdaj je signal pozitiven in kdaj ne
Druge pomanjkljivosti pri izgradnji mikročipov:
20
-FISH- fluorescentna in situ hibridizacijaPrednosti:
Detekcija celic ,,v njihovem okolju’’ s specifičnimi sondami omogoča taksonomsko uvrstitev (gen za 16S rRNA, recA, gyrB), Omogoča štetje različnih taksonomskih skupin hkrati Analiza večjega števila vzorcev je možnaDetekcija in kvantifikacija aktivnih celic s sondami za 16S rRNA – čeprav količina 16S rRNA slaba mera za aktivnost mikroorganizmov –
r in K strategija mikrobov
Slabosti:Sekundarne strukture tarčnih genov otežkočajo hibridizacijoPotrebne so sekundarne sonde, ki olajšajo hibridizacijo na neugodna mestaSpecifičnost sond omejena s podatkovnimi bazami pomožne sondeNeenaka permeabilnost celicLočevanje signala od ozadja
21
ii. PCR: prednosti in pomanjkljivosti- omogoča pomnoževanje tarčnih genov iz ozadja
- napake polimeraze - napake naleganja začetnih oligonukleotidov - inhibitorne snovi v vzorcih- ojačevalci pomnoževanja- sekundarne strukture DNA tarčnih genov po denaturaciji- učinkovitost pomnoževanja – spreminjanje razmerij med PCR
produkti- ,,primer-dimer’’ produkti- kimerne sekvence- različne sestave reakcij so potrebne za pomnoževanje iz različnih
vzorcev – primerljivost dobljenih rezultatov?
22
Metode, ki temeljijo na PCR:
RFLP – restriction fragment length polymorphismARISA – amplified ribosomal intergenic spacer analysisrep-PCR:REP-PCR – Repetitive Extragenic Palindomic -PCR,
BOX-PCR – palindromski box elementi v genomu ERIC-PCR - Enterobacterial Repetitive Intergenic
Consensus PCRSSCP – single stranded conformation polymorphismDGGE/TGGET-RFLPanaliza tipizacij v mikrobnih združbah
kloniranje in sekvenciranjeanaliza sekvenc in knjižnic
Real-Time PCR, c-PCR - kompetitivni PCR
Tipizacijske Tehnike (T.T.)
Analiza T.T.
Sekvenčne tehnike
Kvantifikacija
23
Tipizacijske tehnikePCR / RFLP – restriction fragment length polymorphism
- fragmente z restrikcijsko endonukleazo razrezanega produkta PCR se ločuje z gelsko elektroforezo.- omogoča hitra in enostavno, vendar grobo tipizacijo skupne mikrobne združbe.- je presejalna metoda za analize velikih knjižnic različnih genov pred sekvenciranjem, - omogoča združevanje klonov v operacijske taksonomske enote (OTE), to je skupine z enakim restrikcijskim vzorcem
RFLP profili klonov Groba tipizacija združb – opaziš razliko?
24
Prednosti RFLP:- hitra, enostavna, poceni metoda za primarne analize združb in
klonov- ponovljiva- omogoča nadaljne analize podatkov – Nabiralčeva krivulja,
rarefakcija, različni indeksi raznolikosti, simulacije vzorčenja knjižnic
Slabosti:- slaba ločljivost pri analizi združb – po restrikciji ni možno
ugotoviti, kateri fragment pripada kateremu pomnožku - potrebno ugotoviti, katera restrikcijska endonukleaza loči
različne pomnožke v OTE, ki korelirajo s filogenetsko razvrstitvijo
- Veliko dela za analize velikega števila klonov- Z uporabo velikega števila restrikcijskih endonukleaz za analize
klonov se približujemo ločljivosti sekvenčne analize – razmislek, če ni vendar smotrneje direktno sekvencirati klone brez predhodne RFLP analize
25
Nabiralčeva krivulja
Skup
ine
OTE
Število pregledanih klonov
Naravna tlaObdelovana tla
Ocena števila OTE z estimatorjem Chao1
Naravna tla
Obdelovana tla
Stres et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70
Število vzorčenih klonov
Štev
ilo o
cenj
enih
OTE
26
PCR / ARISA – amplified ribosomal intergenic spacer analysis
Razdalje med geni za 16S in 23s rRNA se razlikujejo med vrstamiOmogoča tipizacijo mikrobnih združb na vrstnem nivoju
Prednosti:Boljša ločljivost od RFLP gena za 16S rRNAMožno uporabiti fluorescenčno označene začetne oligonukleotide kar ob uporabi sekvenatorja omogoča profiliranje mikrobnih združb v velikem številu vzorcev
Slabosti:Ločljivost in uporabnost omejuje majhno število sekvenc medgenskih regij in genov za 23S rRNA – selektivnost in specifičnost začetnih oligonukleotidovUporabno zgolj kot tipizacijska tehnika profiliranja mikrobnih združb (težavna identifikacija organizmov iz njihovih ARISA profilov)
Tipizacijske tehnike
27
Primer ločevanja fluorescentnih pomnožkov ARISA gelu ali na sekvenatorju in združevanje po podobnosti profilov
% podobnosti
Fluo
resc
enca
(re
lat.
flu
ores
. eno
te
Velikost fragmenta (bp)
28
rep-PCR: REP, BOX, ERIC-PCRTarča so repetitivni elementi v genomih mikroorganizmov
Sorodni genomi imajo podobno razporeditev elementov
Po pomnoževanju ločujemo različno velike produkte z gelsko elektroforezo
Tipizacijske tehnike
% podobnosti profili pomnožkov
29
Prednosti:- Enostavna tehnika- Visoka ločljivost- na nivoju sevov- Velika ponovljivost- Omogoča enostavno sledenje evolucije genoma v laboratorijskih
razmerah
Slabosti:- uporabnik določa pogoje pomnoževanja in ločevanja ter tako
posledično vpliva na rezultate, kar zmanjšuje primerljivost med ločenimi analizami
- Veliko dela pri analizah velikega števila sevov
- Neprimerna za analizo združb, ker je mikrobna DNA iz okolja fragmentirana (4-8 Mb v genomih, 10 Kb po izolaciji)
rep-PCR:
30
PCR / SSCP – single stranded conformation polymorphism
Po denaturaciji pomnožka PCR se vsaka stran DNA zvije v lastno sekundarno strukturo glede na sestavo sekvence.
Različne sekundarne strukture potujejo z različno hitrodtjo v akrilamidnem gelu.
Tipizacijske tehnike
31
Prednosti:- Enostavna- Možna uporaba fluorescečno označenih oligonukleotidov in ločevanja
na sekvenatorju
Slabosti:- precejšnja variabilnost metode pri analizi velikega števila vzorcev, saj je
ločljivost odvisna od:-vsakokratne sestave gela – varabilnost med geli- hitrosti, s katero uporabnih po denaturaciji ohladi vzorec DNA- časa ohlajevanja,- temperature hladilnega medija
SSCP – single stranded conformation polymorphism
32
Tipizacijske tehnikePCR / DGGE/TGGE
- Ločevanje na osnovi denaturacije in tvorbe sekundarnih struktur pomnožkov v gradientu kemičnega denaturanta ali temperature
- GC-spona na enem od začetnih oligonukleotidov onemogoča popolen razplet dvoverižne DNA
- Izrezovanje posameznih pomnožkov in sekvenciranje fragmentov
- Identifikacija pripadnosti klonov ali izolatov posameznim fragmentom v profilu združbe
Vzorci iz okolja A B C
33
Prednosti- ponovljiva analiza velikega števila vzorcev ob uporabi eksternih
markerjev na gelih, ki omogočajo normalizacijo potovanja fragmentov med geli
- Omogoča primerjavo potovanja izbranih fragmentov s celotno združbo
- Pregled klonov in ločevanje v skupine OTE
Slabosti- dolgotrajna priprava gelov in njihovega barvanja - dolgotrajno ločevanje na gelih (do 20h)- Potrebno optimiziranje najboljših pogojev ločevanja (% in
gradient denaturanta ali temperature)- Razlike v ločevanju fragmentov zaradi minimalnih razlik v
sestavi gelov in robnih pogojev (čas priprave gela, izsuševanje, zunanja temperaturna nihanja)
- Nekateri geni se ne ločujejo dobro- Kvaliteta rezultatov je odvisna od kvalitete barvanja in
zajemanja slike gela
PCR / DGGE/TGGE
34
PCR / T-RFLP
--Predstavlja kompromis med Predstavlja kompromis med filogenetskofilogenetskoresolucijo in analizo velikega števila vzorcev.resolucijo in analizo velikega števila vzorcev.
--Algoritmi omogočajo identifikacijo posameznih Algoritmi omogočajo identifikacijo posameznih pikov v profilih iz podatkovnih baz pikov v profilih iz podatkovnih baz sekvencsekvenc tudi že tudi že za nekatere funkcionalne gene.za nekatere funkcionalne gene.
-- V tem trenutku najbolj uporabljana V tem trenutku najbolj uporabljana tipizacijska tipizacijska metoda v mikrobni ekologiji (bakterije, metoda v mikrobni ekologiji (bakterije, arheje arheje in in glive, glive, protozojiprotozoji))
Tipizacijske tehnike
35
Shema T-RFLP
Izolacija skupne mikrobne DNA
PCR s fluorescentno označenimi oligonukleotidi
Restrikcija
Ločevanje fragmentov na sekvenatorju
Odkrivanje fluorescentno označenih fragmentov
Fluo
resc
enca
http://rdp8.cme.msu.edu/html/t-rflp_jul02.html
36
Profili
Primer profilov T-RFLP različnih vzorcev
Puščici označujeta:
A: mesta pojavljanja signala neodstranjenihzačetnih oligonukleotidov in produktov ,,primer-dimer’’
B: nerazrezanih Pomnožkov PCR
A
B
37
Prednosti:
- Visoka ločljivost
- Ponovljivost – analiza na sekvenatorjih
- Standardizirane kapilare in polnila – manjša variabilnost med analizami
- Analiza velikega števila vzorcev
- Uporaba internih standardov – možnost normalizacije vsake proge glede na standard – primerljivost med posameznimi analizami
- Dobro poznavanje delovanja tehnike, njenih slabosti in omejitev
PCR / T-RFLP
38
Pomanjkljivosti:- potrebno je odstraniti signal začetnih oligonukleotidov – pri
pripravi ali pri analizi
- nepopoln razrez z endonukleazo – vsi fragmenti niso zajeti v analizi
- fantomski piki – posledica enoverižne nepopolno pomnožene DNA
- zamik T-RFLP (,,T-RFLP drift’’):
- Je razlika med dejansko in ugotovljeno velikostjo fragmenta
- Je posledica razlik v potovanju enako dolgih fragmentov zaradi deleža purinov
- Je posledica razlik v potovanju fragmentov in standardov zaradi razlik v fluorokromih (standard in vzorec sta označena z različnima fluorokromoma)
- nujna je korelacija med empirično določeno velikostjo fragmenta ter velikostjo fragmenta določeno iz sekvence, če želimo iz profilov identificirati organizme, ki naj bi jim posamezni fragmenti pripadali
PCR / T-RFLP
39Prava dolžina fragmenta T-RF (bp)
Zam
ik T
-RF
(bp)
Primer ugotavljanja zamika T-RFLP in definiranja korekcije
Na sekvenatorju določena velikost fragmenta se od prave dolžine razlikuje za
40
Zamik T-RFLP in definiranje korekcije
41
PCR / Analiza vzorcev tipizacijskih tehnik
Normalizacija glede na interni / eksterni standardOdstranjevanje ozadjaPrepoznavanje pikov od ozadja
Binarne matrike prisotnosti / odsotnosti pomnožkovDenzitometrična analiza slike- relativna zastopanost posameznega pomnožka v združbi glede na celokupno fluorescenco oziroma gostoto fragmentov
Izračun dendrogramov podobnosti vzorcev, PCA, FA, ...:Statistica, SPSS, BioNumerics, ...
42
Primer dendrogramov podobnosti profilov T-RFLP
43
Pomanjkljivosti skupine tipizacijskih tehnik na osnovi PCR:
- Vse napake pridobljene pri pomnoževanju v PCR
- En mikroorganizem več različnih pomnožkov
- Pomnožki iz več mikroogranizmov se ločujejo enako
- Zaznavanje dominantnih skupin (ki predstavljajo več kot 1-5% združbe)
- Zaznavanje odvisno od specifičnost začetnih oligonukleotidov
- Kompromis med filogenetsko ločljivostjo in analizo številnih vzorcev.
44
PCR / Kloniranje in sekvenciranjePrednosti:
- Nudi najvišjo stopnjo resolucije.- Težavna za analize velikega števila vzorcev.- Omogoča statistične analize podobnosti sekvenc in modeliranje
Pomanjkljivosti:- Vse napake pridobljene pri pomnoževanju v PCR- V vektor spravimo le del pomnožkov- Vključevanje v vektor ni neselektiven proces (ni nujno naključen)- Transformacija celic s konstruktom je lahko različno uspešna za posamezne knjižnice- Pri majhnem številu kolonij izbor transformant ni nujno naključen
Analiza klonov z RFLP – definicija skupin OTU in grupiranje klonovz DGGE – povezava med klonom in fragmentom nagelus T-RFLP – povezava med sekvenco klona/izolata in pikom elektroferograma
45
Analiza in statistika knjižnic klonov
- Zaradi velikega števila sekvenc je nujna uporaba statističnih in matematičnih pristopov za ugotavljanje statistične signifikantnostiugotovitev (npr. s programi kot so Arlequin, EstimateS, DOTUR, Libshuff, S-Libshuff)
- Uporaba parametrični in neparametričnih estimatorjev raznolikosti, s katerimi z uporabo modelov ocenjujemo končno raznolikost sekvencv vzorcih.
Obnovi poznavanje razlike med homologijo in podobnostjo sekvenc !
46
- Parametrični estimatorjimerilo količine informacije (entropije) v sistemu in so tudi merilo za težavnost napovedi identitete naslednje posamezne z vzorčenjem pridobljene OTE
- Neparametrični estimatorjiizvirajo iz “označi – izpusti – ponovno ujemi” statistike (ang. mark - release - recapture), ki jo uporabljajo za ocenjevanje velikosti živalskih populacij. Neparametrični estimatorjiugotavljajo delež vrste ali OTE, ki je bila opažena že prej, s tistimi, ki so opažene prvikrat. V zelo raznoliki združbi bo verjetnost, da bi opisali isto vrsto dvakrat, zelo nizka in večina vrst bo imela le po enega predstavnika v vzorcu.
47
Nabiralčeva krivulja (,,Accumulation / Collector’s –curve’’)
Schloss and Handelsman, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 1501-1506
Definicija OTE:če je homologija dveh sekvenc večja od teh arbitrarno (taksonomija!!)definiranih mej, potem pripadata isti OTE
Za vsako novo sekvenco ugotovimo, ali spada v že prej opaženo OTE ali ne
Število pregledanih sekvenc
Štev
ilo o
paže
nih
OTE
48
,,Rarefaction’’: ponavljano vzorčenje nabiralčeve krivulje – povprečna nabiralčeva krivulja
- če se 95% intervali zaupanja ne prekrivajo, je razlika statistično pomembna
Hughes et al. 2001, Appl. Envir. Microbiol. 67: 4399-4406.
Število pregledanih sekvenc ali klonov
Štev
ilo o
paže
nih
OTE
49
Osnovni indeksi raznolikosti, ki jih lahko izračunamo iz definiranih OTE klonov ali sekvenc knjižnic:
Shannon-ov: H = -Σ(pi)(log2pi), kjer je p delež edinstvenega RFLP profila ali sekvence glede na vsoto vseh različnih profilov ali sekvenc v knjižnici (Magurran, 1988).
Enakomernost: E = H / Hmax and Hmax = log2 (S).
Pokritost knjižnice (C) kot mera zajete raznolikosti (Good, 1958):C= 1-n / N, kjer je n število enkrat samkrat odkritih klonov ali
sekvenc v knjižnici in N je skupno število pregledanih klonov ali sekvenc.
Povprečna taksonomska oddaljenost (Dmean) med vsemi pari sekvenc. Dmean = 2 Σ d(i,j) / S (S + 1), kjer je d(i,j)= (1-homologija DNA med sekvencama klonov i in j) in S je skupno število uporabljenih klonov.
50
- Kdaj pregledati še več klonov?
- Primerjava velikih skupin sekvenc med sabo v eni številki –indeksi raznolikosti
- Primerjave knjižnic med sabo - ugotavljanje signifikantnosti razlik med knjižnicami sekvenc
- Primer:
Statistične analize knjižnic
51
Iz porazdelitve klonov/sekvenc v OTE, z neparametričnim estimatorjem Chao1 ocenite končno število različnih OTE v vaših vzorcih in izračunate pripadajoče 95% intervale zaupanja
Število pregledanih sekvenc ali klonov
Štev
ilo o
cenj
enih
O
TE
Hughes et al. 2001, Appl. Envir. Microbiol. 67: 4399-4406.
52
Prikaz povprečnih vrednosti 95% intervalov zaupanja Chao1 estimatorja s prejšnje strani in najboljši fit (negativna exponencialna funkcija) nanje ponazarjata, koliko klonov bi bilo potrebno pregledati, da bi zaznali statistično signifikantne razlike med knjižnicama
Število pregledanih sekvenc ali klonov
Razp
on 9
5% in
terv
alov
zau
panj
a Hughes et al. 2001, Appl. Envir. Microbiol. 67: 4399-4406.
53
Real-Time PCR – PCR v realnem časutrije osnovni pristopi:
1. Taq Man sonda 2. Syber Green I –interkalacija v dvoverižno DNA
3. Hairpin loop –škorpijonska sonda
denaturacija
naleganjesonde
podaljševanje
Polimeraza pri podaljševanju s svojo eksonukleazno aktivnostjo razgradi sondo in loči fluorokrom od požiralca njegove svetlobe -fluorescenca
54CT1CT2 CT3
DNA izolirana iz okolja:inhibitorji – pomnoževanje DNA – razpiranje vijačnic v času kratkih
ciklov- specifičnost- fluorescenca – odkloni Ct- učinkovitost pomnoževanja- disociacijske krivulje – specifičnost pomnoževanja
55
Real Time PCR:16S rRNAgospodinjski genifunkcionalni geni
Število kopij gena na genom in kdaj so razlike signifikantne?
56
iii. Metagenomika
57
- Izolacija DNA iz okolja
- Fragmentacija v fragmente velikosti ~40.000 bp-150.000 bp
- Kloniranje v BAC – bacterial artificial chromosomes
- Hibridizacija posameznih klonov in lociranje genov za16S rRNA
- Analiza navzgor in navzdol lociranih genov
Metagenomika:
58
Prednosti:- Neodvisna od PCR - Povezava filogenije z raznolikostjo strukturnih genov – velika
funkcionalna raznolikost v populaciji fragmentov z identičnimi geni za 16S rRNA – nivo sevov
- Ekspresija genov na fragmentih v gostitelju – identifikacija novih genov, identifikacija funkcije neznanih genov v sekvenciranih genomih
- Uporaba mikročipov ali pretočne citometrije omogoča hitro sortiranje klonov z BAC po skupinah sekvenc
- Velik potencial za odkrivanje novih genov in aktivnih spojin
Slabosti:- drag in kompleksen pristop, ki ga uporabljajo velike raziskovalne
skupine,- podobne težave (z naključnostjo), kot pri kloniranju,
Metagenomika:
59
iv. Direktna rekonstrukcija genomov iz okolja
- Še korak naprej od metagenomike.
- Klonirani fragmenti so velikosti ~3000 bp so podvrženi sekvenciranju do 10x pokritosti.
- Rekonstrukcija genomov iz okoljske DNA.
- Potreben je hkraten razvoj bioinformatike, statistike in računalništva
60
Prednosti:-Neodvisna od PCR- Identifikacija genov, promotorjev, regulatornih faktorjev, ...- Identifikacija rastnih potreb za izolacijo v čisti kulturi.- Identifikacija funkcije neznanih genov z njihovo komplementacijo in ekspresijo v gostitelju – biotehnološki in medicinski pomen.- Osnova za identifikacijo metabolne mreže znotraj celic neznanih in nekultiviranih mikroorganizmov - rekonstrukcija celih genomov in njihovih metabolnih poti
-Ekspresija genov na fragmentih v gostitelju – identifikacija novih genov, identifikacija funkcije neznanih genov v sekvenciranih genomih
-Študij evolucije genomov sorodnih organizmov in klonalnosti populacij
Direktna rekonstrukcija genomov iz okolja
61
Slabosti:- Kompleksen, zahteven (tehnično in analitsko) in drag pristop- Težav pri kloniranju fragmentov v vektor niste izključili- Vseh fragmentov DNA niste klonirali - Vseh fragmentov niste sekvencirali z dovoljšnjo pokritostjo- Velikega števila genomov ni moč zapreti zaradi repetitivnih
elementov in insercijskih sekvenc, ki onemogočajo nedvoumno povezovanje posameznih sekvenc v celoto
Direktna rekonstrukcija genomov iz okolja
62
vi. Metabolne in mikrobne mreže - funkcionalna genomika
- Trenutno je dostopnih več kot 250 mikrobnih genomov.
- Molekularni podatki o genih, proteinih in metabolnih poteh nam omogočajo raziskovanje obnašanja celic.
- Iz sekvenc skušamo rekonstruirati metabolne procese in genetske mreže znotraj organizma:
kvalitativno (kateri geni so vpleteni)kvantitativno (regulacija, kinetika reakcij)
63
- Za izdelavo samostojnega računalniškega metabolnega modela posameznega mikroorganizma se uporablja modeliranje in simulacije na osnovi eksperimentalnih podatkov:
* ekspresije genov v čistih kulturah (mikročipi, Real Time PCR), * poteka encimskih reakcij, * fizikalno kemijski parametriov okolja in odzivov organizmov
nanje.
- Povezovanje posameznih metabolnih modelov v mikrobne mreže in ugotavljanje odnosov med organizmi služi razumevanju delovanja združb in njihovih odzivov na dejavnike okolja in druge stresne faktorje.
64
FIZIOLOGIJA
65
Trenutno poznavanje bakterijske taksonomije:
- Več kot 40% bakterijskih skupin nima kultiviranega predstavnika
- Nekatere skupine so dominantne v okolju in predstavljajo lahko 50% ali več mikrobne biomase
- Popolno nepoznavanje fiziologije teh mikroorganizmov in njihove vloge v okolju
- Potreba po izolaciji mikroorganizmov iz teh skupin v čiste kulture
66
Funkcionalna zasičenost mikrobnih združb – ,,functional redundancy ‘’: Filogenetsko nesorodni bakterijski izolati rastejo na istem gojišču!
Primer: hitrost rasti bakterijskih populacij -v visokogorju dominirajo hitrorastočepopulacije
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
Incubation time (h)
Mea
n pl
ate
coun
t (%
)
Izolati, sevi različnih vrst se pojavijo po različnih časih inkubacije
visokogorje
Čas inkubacije (h) Čas inkubacije (tedni)
Povp
rečn
o št
evilo
CFU
(%
ko
nčne
ga š
tevi
la)
travnik
67
Porazdelitev genov v E.coli :Transporterji 500Regulatorji 500RNA 115Struktura 200Faktorji 25Encimi 1300Neznani 1800 (predvidevanje, da kodira encime ~1200 encimov1300+1200 = 2500 genov ~5000 tipov genomov na g tal
(DNA-DNA reasociacija)
2500 genov / organizem * 5000 tipov organizmov = 1.25 * 107 genov na g tal za delovanje ekosistema
Če je potrebnih 10 genov / funkcijoČe je potrebnih 50 genov / funkcijoČe je potrebnih 100 genov / funkcijo
1.25 * 106
2.5 * 105 možnih edinstvenih1.25 * 105 procesov g tal
Ocena števila možnih funkcij (procesov) v tleh:
68
Vsak organizem opravlja neko določeno število funkcij.
V okolje je veliko različnih organizmov (npr.: 108 / g tal, od tega 5000 različnih tipov genomov).
Če nekateri izginejo iz ekosistema, obstaja velika verjetnost, da jih drugi funkcionalno nadomestijo.
Degenerativnost in kompleksnost zagotavljata združbam stabilnostin s tem obstojnost ekosistemov.
Združbe morajo biti degenerativni in kompleksni sistemi.
69
- Možnost spremljanja preko 500 encimskih reakcij v ekosistemu: substratno inducirana respiracija, mineralizacija C in N, dehidrogenazna aktivnost, hitinazna aktivnost, nitrifikacijska in denitrifikacijska potencialna aktivnost, ...
- Ugotavljanje limitnih faktorjev v ekosistemu: Odziv aktivnosti združbe na komplementacijo okolja (npr.: denitrifikacija - vir ogljika, vir dušikovih oksidov, oboje, pH>6, anoksični pogoji,
2. Mapiranje odziva mikrobnih združb na parametre okolja (razpon):temperatura, voda, pH, tekstura, gostota, ...parcialni tlaki plinov (kisik, ogljikov dioksid, metan, vodik,...), osvetljenost, c(substrat-i), c(produkt-i), c(inhibitor-ji), c(elektr. akceptorjev),.. stresni dejavniki,Vmax, Km...quorum sensing in razgradnja signalov, ...
3. Ugotavljanje rastnih pogojev, izolacija in karakterizacijamikroorganizmov v laboratorijskih razmerah
Fiziologija združb:
1.
70
1. Profiliranje metabolnih funkcij na nivoju združbe v odvisnosti od različnih faktorjev:
BIOLOG: - mikrotitrska plošča s substrati- inokulacija z vodnim ekstraktom (suspenzijo) originalnega
vzorca – le del združbe- spremljanje porabe substratov preko motnosti in spremembe
pH (metabolizem) skozi čas (do 2-3 tedne) – inkubacijska tehnika !!
Prednosti:- hitro in enostavno metabolno profiliranje velikega števila vzorcev- standardizirani testi- uporaba dostopne tehnologije
Slabosti:- inokulum predstavlja le del združbe (ki se lažje loči od matriksa)- inkubacija v suspenziji – spremenjeni rastni pogoji- inkubacijska tehnika – omogoča prenamnoževanje heterotrofov- zapleteno tolmačenje rezultatov(večkratno odčitavanje med inkubacijo)
71
CLPP:- ,,community level physiological profiling’’ – mapiranje fiziološkega odgovora združbe s substratno inducirano respiracijo.- plinotesne steklene inkubacijske posode, v katerih inkubiramo vzorce z dodanimi substrati- spremljamo respiracijo z meritvami CO2 na plinskem kromatografu
Prednosti:- uporaba celega vzorca pri analizi (ne suspenzije z ekstrahiranimi
celicami)- enostavna, poceni (potrebujete klasičen plinski kromatograf)- veliko število substratov – identifikacija tistih, ki pokažejo razlike
med vzorci
Slabosti:- inkubacijska tehnika (4h)- veliko dela pri velikem številu vzorcev- težko opraviti vse analize naenkrat
72
Primer metabolnega profiliranjaM
aksi
mal
na h
itros
t re
spira
cije
(ug
CO2-
C /
g h)
73
MicroResp – miniaturizirana oblika CLPP
Mikrotitrska plošča vsebuje indikatorski gel, katerega obarvanost se spreminja v odvisnosti od pH= f(CO2).Globoka mikrotitrska plošča vsebuje
različne substrate in vzorce talPred in po inkubaciji se odčita
OD600 nm detekcijske plošče in iz razlike izračuna odziv na substrat
Prednosti:- enake kot pri CLPP- velika hitrost analize
Slabosti:- inkubacijska tehnika (4h)- majhni vzorci – heterogenost
vzorcev lahko moteča
74
N2O emission rates
0,01
0,1
1
10
100
-30 -20 -10 0 10 20 30
Temperature (oC)
log
N 2O
-N /
g h
123456
2. Mapiranje odziva različnih združb na parametre okolja:
Aktivnost sintetiziranih encimov pri različnih temperaturah –identifikacija funkcioanlnih razlik med združbami
vzorciOdziv 1
Odziv 2
75
- Evolucijski algoritmi za razvoj gojišč – adaptivni programi s parametri :
(i) kemijska sestava gojišč(ii) delež vzgojenih tarčnih organizmov – čim več tarčnih
organizmov, (iii) raznolikost tarčnih organizmov – da medij ni selektiven
zgolj za eno skupino
Progresivno in kontrolirano izboljševanje gojišč skozi generacije
3. Ugotavljanje rastnih pogojev mikroorganizmov v laboratorijskih razmerah:
76
Novejši pristopi pri izolaciji mikroorganizmov:
- rastni faktorji: mikronutrienti, vitamini, derivati obveščevalnih molekul (HSL), cAMP,
- čas in pogoji inkubacije – 4 mesece, vlažnost, sestava atmosfere, razredčena mineralna gojišča, postopna subkultivacija,
- enkapsulacija celic v kapljice gela in gojenje v gradientu nutrientov, ločevanje kapljic z mikrokolonijami s pretočno citometrijo
- inkubacija v gelu enkapsuliranih celic v in-situ okoljih,
- mikrotitrske plošče z gradienti nutrientov, inkubirane pri različnih definiranih pogojih
77
Zakaj kultivacija?
Povezava: gibljivost mikrobov – učikovitost predatorjev-> funkcija ekosistema (npr. mineralizacija organskih snovi)
Povezava: mobilni genetski elementi – prilagodljivost, raznolikost in funkcionalne sposobnosti združb (npr. Rezistence na antibiotike)
Povezava: regulacija celic – neprestano spreminjajoče se okolje, ki žene odgovor mikrobnih združb na okoljske spremembe
78Rekonstruirano filogenetsko drevo bakterij.
79
FIZIOLOGIJA IN MOLEKULARNA BIOLOGIJA
80
1. MICA + FISH – microautoradiography + FISH 2. SIP – stable isotope probing3. BrdU – bromo deoxy uridine4. Redčitve mikrobnih združb
5. Dolgotrajni ekološki eksperimenti
81
1. MICA + FISH = microautoradiography + FISH =MAR+ FISH
Specifičen radioaktivno označen substrat: 14C, 15N Kratkotrajna inkubacija (15 min –8h)Aktivne celice privzamejo označen substrat in ga presnovijo v celične komponenteCelice postanejo radioaktivno označeneFiksacija celic
FISH-> filogenetska uvrstitev celicMICA -> katere in koliko od označenih celic s FISH je aktivnih in je presnovilo določen substrat Iz primerjave dveh slik (FISH in MICA) istega vzorca sklepamo oraznolikosti in funkcionalnosti mikrobnih združb
82
Prednosti:- hkratna identifikacija filogenetskih odnosov in aktivnosti (odziva
na dodan substrat)
Slabosti:- inkubacijska tehnika- nujna je definirana analiza slike – (intenzitete + signalov)- potrebno je zelo kvalitetno zajemanje podatkov in visok
standard mikroskopije
- težave FISH - težave MICA – bledenje signala
microautoradiography + FISH
83
2. SIP – ,,stable isotope probing’’ – vgradnja stabilnih izotopov
Specifičen s težjim izotopom označen substrat: 13C Kratkotrajna inkubacija (4-24h) v definiranih pogojihAktivne celice privzamejo označen substrat in ga presnovijo v celične komponenteAktivne (rastoče) celice vsebujejo proteine, lipide in DNA z vgrajenim težjim izotopom
Izolacija DNAS 13C obogateno DNA ločimo od 12C DNA z ultracentrifugiranjem v gradientu gostote. Frakcije analiziramo s klasičnimi molekularnimi metodami.
13C PLFA – slabša resolucija od analize DNA.
84
Prednosti:- omogoča identifikacijo aktivnih populacij v združbi
Slabosti:- pri gradientnem centrifugiranju se označena DNA loči od
neoznačene, med obema zgostitvenima conama pa obstaja gradient. Analizirati je potrebno celoten razpon gradienta med neoznačeno in označeno DNA.
- Inkubacijska tehnika
- Napake metod pri analizi DNA
SIP – ,,stable isotope probing’’ – vgradnja stabilnih izotopov
85
3. BrdU – bromo deoksi uridin
Uridin Analog timina
86
BrdU ni izotopska metoda
Kratkotrajna (~8 h) inkubacija BrdU + specifičen substrat (kontrola, glukoza, aromatske spojine, KNO3 ...)
Aktivne celice privzamejo BrdU in jo vgradijo v novo DNA
Z BrdU obogateno DNA se od ostale loči s protitelesi
Frakcije analiziramo s klasičnimi molekularnimi metodami
87
Prednost BrdU:- Lahko se omejimo na skupine, ki specifično odgovarjajo na
določene dražljaje iz okolja- enostavnejša in cenejša od SIP in MICA+FISH- Komercialni kiti za ločevanje označenih celic od neoznačenih
Slabosti:- inkubacijska tehnika- Napake metod pri analizi DNA
88
Težave teh treh metod:
1. Vzorec inkubiramo s substratom-> selektivna aktivacija celic s substratom
2. Drugačne koncentracije substrata kot v naravnih pogojih->selektivna aktivacija/inaktivacija celic s substratom
3. Mikroorganizmi lahko ločujejo med različnimi izotopi istega elementa
4. Nekateri ne privzemajo BrdU
89
4. Redčitve in ponovna rast redčenih mikrobnih združb(,,dilution – regrowth analysis’’)
MPN: spremljanje procesa v odvisnosti od redčitve
- splošna združba- amonifikacija- nitrifikacija- denitrifikacija- mineralizacija žvepla- sulfatna respiracija- ...
90
Priprava redčitevInokulacija posameznih redčitev v sterilno originalno okolje (z gama žarki sterilizirana tla, filtrirana morska voda) ali laboratorijsko eksperimentalno okolje.Inkubacija - ponovna rast in kolonizacija okolja, eksperimentiranje s pogoji rasti
Pregled funkcionalnih karakteristik redčenih in ponovno zraslih združb – množica možnih fizioloških meritev (npr. SIR, potencialna denitrifikacijska aktivnost)Pregled raznolikosti mikrobnih združb (bogatost in enakomernost)
Funkcija:SIR, potencialne aktivnosti talnih encimov, ...
Inkubacija in rekolonizacija okolja
Raznolikost: T-RFLP, DGGE, kloniranje, ...
91
Združba srednje raznolikosti(vsak opravlja več funkcij)
B
Združba z visoko raznolikostjo(vsak opravlja malo ali le eno od funkcij)
Združba z nizko raznolikostjo(vsi znajo vse)
Redčenje združbe Začetna združba
Primer: Pregled funkcionalnih karakteristik redčenih in ponovno zraslih združb
A
C
92
A – visoka raznolikost:z vsakim redčenjem se izgubi ena ali več majhnih populacij in z njimi njim lastne funkcije. Zelo hitro zmanjševanje funkcionalnega potenciala združbe. Velika občutljivost na stresne dejavnike.
B – srednja raznolikost:z redčenjem se postopoma izgubljajo posamezne manj zastopane populacije in njim lastne funkcije. Nekatere od teh funkcij lahko še vedno opravljajo tudi druge populacije.
C – nizka raznolikost: redčenje in ponovna rast v seriji redčitev ne spremenita funkcionalnega (metabolnega) potenciala združbe do popolne razredčitve združbe. Dokler je prisoten en sam predstavnik, je končni rezultat med redčitvami enak.
93
5. Dolgotrajni ekološki eksperimenti
Eksperimentalne postaje: polja, reaktorji, akvariji, morske točke,
Kontrolirani (npr.: obdelava tal, dodajanje nutrientov, spreminjanje rastlinskega pokrova)
Dolgotrajne meritve fizikalnih, kemijskih in bioloških lastnosti okolja -> spremljanje časovne in prostorske variabilnosti procesov
Možnost korelacije (mikrobnih in drugih) združb s procesi ekosistema in dejavniki okolja
Idealna mesta za vzorčenje reprezentativnih vzorcev
94
Prihodnost:
Integriran pristop k raziskovanju mikrobnih združb: FIZIOLOGIJA + MOLEKULARNA BIOLOGIJA
Potreben je povdarek na interakcijah fizikalnih, kemijskih in bioloških procesov, da bi lahko razumeli funkcionalne lastnosti,evolucijo in dinamiko ekosistema.
Potrebne so številne in različne metode analiz, številna vzorčenja v času in prostoru, ter modeliranje ekoloških dejavnikov - znotraj ene raziskave.
Kompleksnost interakcij in skala meritev sta največji oviri na poti k razumevanju povezave med funkcijo in filogenijo združb ter parametri okolja, saj ni vedno mogoče izmeriti kritične komponente okolja, ali pa vsaj ne na pravi skali.
Standardizacija metodologij ter statistična analiza rezultatov sta ključni postavki za testiranje hipotez in primerljivost rezultatov.
95
96
Naše razumevanje je dobro, ko lahkopravilno napovemo obnašanje sistema.
Danes smo še daleč od tega cilja.
Imamo pa bistveno več orodij kot kdaj koli prej. In čas je, da jih začnemo uporabljati pametno z vsemi njihovimi omejitvami.
