Modelo de asfixia perinatal en cerdos recién nacidos

Curso CHEA “Animal de experimentación como reactivo biológico en

investigación, diagnóstico y control de fármacos”

Depto de Neonatología, Hospital de Clínicas, Facultad de Medicina

Dra. Fernanda Blasina, fblasina@gmail.com

Causas de mortalidad neonatal

Infection32%

Other5%

Congenital

Anomalies10%

Birth Asphyxia29%

Complications

of Prematurity

24%

Source: WHO 2001 estimates (based on

data collected around 1999)

Asfixia perinatal en países desarrollados:

-10% de los recién nacidos sufren asfixia leve a moderada

-1% sufre asfixia severa

Incidencia de 2 -4 por 1000 RN de término. Mortalidad de 20 – 50% en el periodo neonatal 25% de los que sobreviven presentan secuelas neurológicas

(retardo mental, parálisis cerebral, epilepsia, trastornos del aprendizaje).

Review Hypoxia-ischemia in the inmature brain. Susan J. Vannucci and Henrik Hagberg. April 2004

CHPR, 2005 la prevalencia fue de 14,5%. En ese año fue la cuarta causa de mortalidad infantil y

neonatal.

Daño hipóxico isquémico del recién nacido

Incidencia de muerte o daño neurológico severo: 2-3/1000 nac. vivos

en países desarrollados. Aumenta en países en vías de desarrollo

ENCEFALOPATÍA

Parálisis cerebral Retraso del desarrollo

TERAPIAS INEFICACES

MUERTE

Gunn and Gluckman, CLINICAL OBSTETRICS AND GYNECOLOGY

2005,Volume 50, Number 3, 636–651

Robertson et al, 2012

Susceptibilidad cerebro inmaduro

• Aumento sensibilidad a excitotoxicidad.

• Expresión máxima de receptores.

• Incompleta maduración de mecanismos inhibidores.

• Disminución de proteínas de unión al Ca+.

• Aumento sensibilidad radicales libres

Susceptibilidad cerebro inmaduro

• Susceptibilidad oligodendrocitos en desarrollo.

• Estado hiperexcitable e hipermetabólico.

• Pobre capacidad vasodilatadora en tejido nervioso.

Asfixia perinatal

Redistribución FSC Aumneto PA Hipoxia Hipercpnia

Acidosis

Aumento de FSC Pérdida

Autorregulación

Cae

PA

Hemorragia Cae

FSC

Isquemia

Lesión neuronal

primaria

Ventana

terapéutica

(horas)

Lesión neuronal

secundaria

Animal

models

Acute studies

n (%)

Chronic

studies n (%)

Total reviwed

Non-human

primate

14 (48) 15 (52) 29

Piglet 61(90) 7(10) 68

Fetal sheep

and newborn

lamb

54(87) 8(13) 62

Rodent 31(38) 51(62) 82

Dog 30 (100) 0 30

Others 17(81)

4(19) 21

TOTAL

Roohey et al, 1997

ACUTE STUDIES

Models (n) Metabolic n(%) Clinical n (%) Pathology n(%)

Non-H Primate

(14)

10 (34) 4(14) 6(20)

Piglet (61) 61(100) 2(3) 1(2)

Sheep (54) 51(94) 11(20) 4(7)

Rodent (31) 28(90) 4(13) 4(13)

Roohey et al, 1997

Anestésicos?

Sistémicos: Ketamina, Propofol

Inhalatorios:isofluorano, halotano, enfluorano

Considerar farmaconcinetica en cada especie y el efecto

sobre parámetros que se vayan a evaluar a nivel del

sistema nervioso central (ej: electroencefalograma).

Método de hipoxia-isquemia

asfixia isquemia

Primates 14 10 2

Cerditos 61 31 17

Oveja 54 42 0

Roedores 31 15 1

Perros 17

Duración?

Tracey et al, 2006

EDAD???

Fetal

Neonatal

Piglet: 3 de mediana

(0-30)

TERM

HUMAN

newborn

Roohey et al, 1997

GRADO de DESARROLLO ENCEFÄLICO????

Clancy et al, 2001

Predicen 95 eventos neurogenéticos en 9 especies

diferentes

Factores que modulan severidad del daño

Glicemia

Temperatura

Ginsberg et al, 1989

DIFERENCIAS ENTRE GÉNERO MASCULINO O FERMENINO??

Dev Med Child Neurol. 2007 Jan;49(1):74-8. Links

Sex and the pathogenesis of cerebral palsy.

Johnston MV,

Hagberg H.

Kennedy Krieger Institute and the Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore,

Maryland, USA. Johnston@kennedykrieger.org

Cerebral palsy (CP) and related developmental disorders are more common in males than in

females, but the reasons for this disparity are uncertain. Males born very preterm also

appear to be more vulnerable to white matter injury and intraventricular hemorrhage than

females. Experimental studies in adult animals and data from adult patients with stroke

indicate that sex hormones such as estrogens provide protection against hypoxic-ischemic

injury, and the neonatal brain is also influenced by these hormones. However, hormonal

influences on the fetus and neonates are substantially different from those on adults. Recent

data from neonatal rodents subjected to hypoxia-ischemia also demonstrate differences

between males and females. Knockout of the gene for poly (ADP-ribose) polymerase (PARP-

1), a major step in the cascade of injury, protected male but not female mouse pups from

hypoxic-ischemic injury. Other reports demonstrated major differences between male and

female neurons grown separately in cell culture, suggesting that sex differences in the fetal

or neonatal period result from intrinsic differences in cell death pathways. This new

information indicates that there are important neurobiological differences between males and

females with respect to their response to brain injuries. This information is relevant to

understanding the pathogenesis of CP as well as to the design of future clinical trials of

potential neuroprotective strategies.

Modelo de asfixia perinatal en cerdos recién nacidos

-Similitud anatómica, fisiológica y genética con

seres humanos (K.N. Kuzmuk and L.B. Schook, 2011)

-Tecnología utilizada a nivel clínico es útil en

este modelo.

Por qué cerdos?

IMPORTANCIA DE CONTAR CON ÁREA

DE INVESTICACIÓN ADJUNTA AL ÁREA

ASISTENCIAL CLÍNICA: oportunidad de

medicina traslacional

Reproducción de situaciones clínicas.

Generación de situaciones que reproducen patologías en forma experimental.

Desarrollo de modelos animales diversos.

Entrenamiento y manejo de situaciones complejas

Laboratorio

METODOLOGÍA

Cerdos recién nacidos, 1500 - 2000 g, menores de 2 días, proveniente de granja local.

Ketamina 20 mg/k/dose I/M

Termocuna y vía venosa periférica

Aporte de fluídos con suero glucosado al 5% (70 ml/k/día)

Anestesia intravenosa total con midazolam +

ketamina + fentanyl

Electrocardiografía,

pulsioximetría,

temperatura.

Vía aérea por

traqueostomía, tubo

endotraqueal de

tamaño adecuado.

Cateterización de arteria femoral para medida de la presión arterial.

Catetherización de la arteria pulmonar por medio de toracotomía para su monitorización invasiva.

Estabilización hemodinámica y metabólica

Tiempo de preparación total 1 hora.

Monitor:

* Electrocardiograma

*Frecuencia cardiaca

*Presión arterial sistémica

*Presión arterial pulmonar

*Saturación de oxígeno

Data digitalization ECG

SatO2

SAP

PAP

Monitoreo de Función Cerebrl (MFC)

MFC o electroencefalograma de amplitud integrada

Patrones de MFC

Normal: Lim sup> 10 mcv. Lim inf > 5 mcv. Ciclos de actividad normal.

Moderado: Lim sup> 10 mcv. Lim inf< 5 mcv.

Severo: Lim sup < 10 mcv. Lim inf < 5 mcv. Pediatrics 1999;103;1263-1271

OBJETIVOS

•Desarrollo de un modelo de asfixia perinatal controlado

por la tolerancia fisiológica individual.

•Estudiar la respuesta hemodinámica, electroencefálica,

equilibrio ácido-base y variables hematimétricas

durante las primeras horas.

•Evaluar la actividad mitocondrial, anatomía patológica,

integridad de proteínas, ADN y ARN encefálicas.

Generación de hipoxia en modelo experimental:

-Se mantiene FiO2 de 0,08 durante un período que permita al

menos 17 minutos de MFC por debajo de 7uV, FC por encima de

80lpm y presión arterial media por encima de 20mmHg.

-Al caer la hemodinamia hasta los umbrales indicados reanimación

con FiO2 1 por 30 minutos, luego FiO2 0,21 según tolerancia

-FC se eleva en respuesta a la hipoxia y desciende cuando la

reserva miocárdica se limita, muestra estabilidad luego de la

reanimación.

-Posibilidad de evaluar terapias neuroprotectoras: quercetina

nanosomal

Modelo de Hipoxia Neonatal

FiO2 8%

Parámetros críticos para reanimación: MFC, PAM, FC

Tiempo 0 Tiempo 1 Tiempo 2 Tiempo 3

Tiempo (horas)

0 1

10 uV

7 uV

5 uV

2

Gasometrías cada 30 minutos

Gasometrías cada 10 minutos

M F

C

Quercetina

09/12/10

21/12/10

23/12/10

30/12/10

26/10/10

11/11/10

ECG

SatO2

Presión art. sistémica

Presión art. pulmonar

Monitorización de presión arterial pulmonar

Presión arterial sistémica, frecuencia cardiaca,

Gasto cardiaco, saturación, gasometría

1/10/08

QUERCETIN 25mg/kg

Capacidad neuroprotectora in vivo en cerdos recién nacidos ante la hipoxia

Evaluación

•Hemodinamia sistémica y pulmonar

•Equilibrio ácido base y metabolismo

•Encefálico: monitoreo de función cerebral

•Imagenología (Resonancia, PET)

•FiO2 8% hasta descenso de MFC debajo de 7uV durante 40 min con ligadura carotídea

•Presión arterial sistémica degajo de 20mmHg o

•frecuencia cardiaca debajo de 80 cpm

Evaluación del daño provocado por la hipoxia y uso de

agentes neuroprotectores.

A nivel sistémico

Equilibrio ácido base y metabolismo en sangre

Parámetros ventilatorios durante el experimento y variación de los

mismos según estado del animal

Estabilidad hemodinámica y necesidad de aporte inotrópico

A nivel cerebral

MFC durante todo el experimento. Se revierte daño?

Eutanasia con KCl:

Evaluación de perfil genético: ADN, ARN y proteínas

Evaluación anatomopatológica (en cerdos de 3 días)

Evaluación de actividad mitocondrial por reducción de sales de tetrazolio

Se les realizará un primer estudio de imagenología funcional cerebral PET a través

de la administración de [18F] FDG con el fin de determinar el grado de captación de

glucosa de las distintas regiones del SNC y de realizar estudios comparativos entre

los distintos grupos pre y post hipoxia.

Luego de realizada la hipoxia en estos cerdos, se vigilará la recuperación anestésica

y una vez extubados y con ventilación espontánea serán trasladados al bioterio de

Facultad de Medicina o al HC según su condición.

En este grupo de animales, tras 72 hs de sobrevida, se realizará evaluación

metabólica (glicemia), comportamental y monitoreo de función cerebral diarios y a las

72 hs se realizará una resonancia nuclear magnética y un segundo estudio PET con

[18F] FDG a los efectos de valorar la captación del glucosa por el tejido nervioso al

cabo de tres días de la hipoxia, con o sin tratamiento.

0:00:00 1:12:00 2:24:00 3:36:00 4:48:00 6:00:00 7:12:00 8:24:00 9:36:00

HIPOXIA

HIPOXIA Y QUERCETINA 10 mg/kg

HIPOXIA Y QUERCETINA 20 mgkg

Duración hipoxia y posthipoxia

duración hipoxia período posthipoxia

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

Satu

raci

ón

de

O2

de

Hb

(%

) Hipoxia+Quercetina 10 mg/kg

Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg

Hipoxia

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

FiO

2

FiO2 durante Hipoxia y quercetina, 8 hs

Hipoxia

Hipoxia y Quercetina 10 mgkg

Hipoxia y Quercetina 20 mgkg

0

100

200

300

400

500

pO

2

Presión parcial de O2 durante Hipoxia y quercetina, 8 hs Hipoxia

Hipoxia y Quercetina 10 mgkg

Hipoxia y Quercetina 20 mgkg

0

20

40

60

80

100

120

PAS

sist

ólic

a (m

mH

g)

Presión Arterial Sistémica sistólica

Hipoxia

Hipoxia y Quercetina 10 mgkg

Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg

38 38,5

39 39,5

40 40,5

tem

pe

ratu

ra (

ºC)

Temperatura Hipoxia y Quercetina 10 mgkg

Hipoxia

Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg

0,000

20,000

40,000

60,000

80,000

100,000

120,000

140,000

160,000

180,000

Glicemia Hipoxia y Quercetina 10 mgkg Hipoxia

Hipoxia y Quercetina 20 mg/kg

-5

0

5

10

15

20

25

30

Am

plit

ud

inte

grat

ed

EEG

(u

V)

Cerebral function monitor post reanimatio (superior margin) hypoxia

Brains after hypoxia Controls

2hs survival 12 hs survival Sham Absolute

Brains after hypoxia Controls

2hs survival 12 hs survival Sham Absolute

-Se incuba un hemisferio cerebral por 30 minutos a 37ºC en solución

conteniendo TTC

- Luego de mantiene 12hs hasta pasaje a formol para fotografía y

posterior medida del daño

Muchas gracias por su

atención!!