8/14/2019 Misuse of Pcr Tibs

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T IBS 1 5 - N O V E M B E R 1 9 9 0

L E T T E R S

M is u s e o f P C RP o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( PC R ) s e e m ss e t t o b e c o m e a u n i v e r s a l t e c h n i q u e i nD N A a n a l y s i s a n d m a n i p u l a t i o n . I n v e n t e df o r t a s k s n o t m a n a g e a b l e b y o t h e r m e a n s ,P CR w a s p r o m p t l y a p p l i e d t o m a k es t a n d a r d p r o c e d u r e s e a s i e r a n d q u ic k e r.N o w i t i s e v e n u s e d t o f a c i l i t a t e tr i v i a lt a s k s s u c h a s w h o l e g e n o m i c D NAi s o l a t i o n a n d s u b c l o n i n g . H o w e v e r , t h es p e e d a n d v e r s a t i l i t y o f t h e n e wt e c h n i q u e h a s i t s pr i c e : t h e p o l y m e r a s em a k e s e r r o r s , a m p l i f i e s t h e m a n di n t r o d u c e s n e w e r r o r s i n e a c h c y c l e ( f o rT a q p o l y m e r a s e m o s t l y A . T t o G .Ct r a n s i t i o n s ) , r e s u l t i n g i n e v i t a b l y i n0 .3 -- 0. 8% a c c u m u l a t e d m u t a t i o n s a f t e r t h eu s u a l 2 0 - 3 0 c y c l e s 1,2. I n a d d i t i o n t og e n e r a t i n g p o i n t m u t a t i o n s , P CR is k n o w nt o p r o m o t e f o r m a t i o n o f a r t i f ic i a lr e c o m b i n a n t s b y c o - a m p l i f y i n g d i f f e r e n tD N A f r a g m e n t s 3,4 . T h e h i g h e r r o r r a t ed o e s n o h a r m w h e n t h e w h o l e p r o d u c t i sa n a l y s e d o n a g e l, u s e d a s a h y b r i d i z a t i o np r o b e o r e v e n s e q u e n c e d . T h e d a n g e rb e g i n s w i t h c l o n i n g o f P C R p r o d u c t s , b yw h i c h a r a n d o m l y p i c k e d f r a g m e n t f r o mt h e m i x t u r e o f m u t a n t s i s c o n s e r v e d . O n l ya m i n o r i t y o f r e s e a r c h e r s r e c o g n i z e s t h isc r i t i c a l p o i n t a n d k e e p s i n m i n d t h e i n i ti a lP C R a m p l i f i c a t i o n t h r o u g h t h e w h o l e ' li f e-s p a n ' o f t h e r e c o m b i n a n t c l o n e . I t m a yl a t e r b e s e q u e n c e d , p e r h a p s i n a n o t h e rl a b o r a t o r y , a n d i f t h e m u t a g e n i c P C Rt r e a t m e n t i s n o t c l e a r l y i n d i c a t e d , t h es e q u e n c e w i ll b e s u b m i t t e d t o a d a t a b a s ew i t h o u t a n y w a r n i n g n o t e . T h ec o n s e q u e n c e s c o u l d b e f a ta l .C o m p a r i s o n s o f a l l e l e s c o n f e r r i n gd i f fe r e n t p h e n o t y p e s w i t h t h e i r w i l d - t y p ec o u n t e r p a r t , f o r i n s t a n c e , w i ll b e t o t a l l ym i s i n t e r p r e t e d . A p o l l u t e d . s e q u e n c e i n ad a t a b a s e m a y m i s l e a d g e n e r a t i o n s ofr e s e a r c h e r s .

W h a t s h o u l d w e d o a b o u t t h i s h o r r o r ?N o o n e h a s t o r e n o u n c e P C R, b u t w es h o u l d b e a w a r e t h a t a c l o n e o b t a i n e d b yP C R is n o t a f u l l - v a l u e c l o n e e q u i v a l e n t t oc l a s s i c a l c l o n i n g p r o d u c t s , s i m p l yb e c a u s e a m p l i f i c a t i o n o f D N A in vitro isf i v e t o s e v e n o r d e r s o f m a g n i t u d e l e s sa c c u r a t e t h a n r e p l i c a ti o n o f p l a s m i d s a n dp h a g e s i n E. coil I n a g r e e m e n t w i t hF o r d h a m - S k e l t o n a n d c o - w o r k e r s 5,n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f a P CR c l o n es h o u l d b e r e g a r d e d o n l y a s a c o n f i r m a t i o no f it s i d e n t i t y a s a p r o b e f o r s c r e e n i n gD N A l i b r a r i e s , n o t a s a n a u t h e n t i c g e n es e q u e n c e . I f t h e P C R p r o d u c t i s t o b ec l o n e d a n d t h e s e q u e n c e i s i m p o r t a n t ,T a q p o l y m e r a s e c a n b e r e p l a c e d b y T 4D NA p o l y m e r a s e ~ , w h i c h m a k e s l e s s

e r r o r s d u e t o i t s p r o o f - r e a d i n g a c t i v it y .S e v e r al i n d e p e n d e n t c l o n e s m u s t b es e q u e n c e d i n a n y c a s e . I f t h e i n i t ia l D N Am a t e r i a l c o n s i s t s o f o n l y a f e w m o l e c u l e so r i f i t is h i g h l y d a m a g e d ( a n c i e n ts a m p l e s ) , t h e s e c l o n e s s h o u l dp r e f e r e n t i a l l y o r i g i n a t e f r o m d i f f e re n t P C Rr e a c t i o n s, s i n c e m u t a t i o n s i n t r o d u c e d i nt h e f i r s t fe w c y c l e s w i l l b e f o u n d i n t h eg r e a t f r a c t i o n o f m o l e c u l e s a t t h e e n d .

T h e r e a r e t a s k s w h i c h c a n n o t b ec a r r i e d o u t i n a n y o t h e r w a y t h a n b y P CR .B u t t h e b e n e f i t s o f PC R s h o u l d b ec a r e fu l l y w e i g h e d a g a i n s t i t s d r a w b a c k sw h e n i t s p r o d u c t i s to b e c l o n e d . T h e u s eo f PC R t o a m p l i f y g e n o m i c f r a g m e n t s f o rc l o n i n g in c a s e s w h e r e s u f f i c i e n t a m o u n t so f D NA c a n b e e a s i l y i s o l a t e d , t o a m p l i f ys e q u e n c e s f r om a s t a n d a r d c D NA l i b r a r y( i n s t e a d o f a m p l i f y i n g a n d s c r e e n i n g t h el i b r a r y ) o r e v e n t o f a c i l i t a t e s u b c l o n i n g ( ! )b e t w e e n r e c o m b i n a n t p h a g e s a n dp l a s m i d s 7 i s h a r d l y b e n e f i c i a l to a n y o n ee l s e th a n t o c o m p a n i e s p r o d u c i n g P C Rk i ts a n d t e m p e r a t u r e c y c l e r s.

D a v i e s a n d P u g s l e y c o m p l a i n t h a t w ea r e i n d a n g e r o f b e c o m i n g a ' k i tg e n e r a t i o n ' o f b i o l o g i s t s w h o f a il t ou n d e r s t a n d t h e s i m p l e s t p r i n c ip l e s o f t h et e c h n i q u e s t h e y u s e , s i n c e c o m m e r c i a lk i t s ( i n s t r u c t i o n l e a f l e t i n c l u d e d )g u a r a n t e e s u c c e s s w i t h o u t t h i n k i n g . I s t h em i s u s e o f P C R t e c h n o l o g y a m a n i f e s t a t i o no f t h i s p h e n o m e n o n ? T h e e d i t o r o f o n e o ft h e P C R B i b l e s s e e m s t o a d m i t i t q u i t ef r an k l y. H e s a y s a b o u t m o l e c u l a r b i o lo g y 9 :

I t s spec tacu la r success over the las t30 yea rs suggests that significant prog resscan be m ade even in the absence o f anes tab l i shed theo re t ica l founda t ion . ..Given the ease and simp licity of PCRamplification, i t can b e said to allow theprac t ice o f m olecu la r b io logy w i thou t aperm i t .

L e t u s h o p e t h a t h e i s w r o n g a n d t h a t ,e v e n t u a l l y , i n t e l li g e n t a p p l i c a t i o n w i l ls u c c e d e s e d u c t i v e , u n c r i t i c a l u t i l i z a t i o no f t h i s p o w e r f u l t e c h n i q u e .References1 Keoha vong, P. and Thi l ly, W. G. (1989) Proc .Na t l Acad. Sc i . USA 8 6 , 9 2 5 3 - 9 2 5 72 Belyavsky, A., Vinogrado va, T. and R ajewsky, K.(1989) Nuc le i c A c ids Res . 8 , 2 9 1 9 - 2 9 3 23 Meye rhans, A., Vartanian, J-P. and W ain-Hobson,S. (1990) Nuc le i c A c ids Res . 1 8 , 1 6 8 7 - 1 6 9 14 Shuldinger, A. R., Nirula, A. and Ro th, J. (1989)Nuc le i c A c ids Res . 17 , 44095 Fordham -Skel ton, A. P., Yarwood, A. and Croy,R. D. R. (1990) Mol . G en. Genet. 221,1 3 4 - 1 3 86 Keoha vong, P., Kat, A. G., Cariel lo, N. F. andThilly, W. G. (1988) D N A 7 , 6 3 - 7 07 Herrmann, J . , Lee , P. , Saya , H. and Nakaj ima,M. (1990) BioTechnictues 8 , 3 7 6 - 3 8 08 Davies, J. and Pu gsley, A. (1990) TrendsBiochem. Sc i . 15 , 1379 Erl ich, H. A. (1990) in PCR Technology (Erl ich,

H. A., ed.), p. 5, Stockton PressP E T R K A R L O V S K YAbtei lung for Molekulare Gen etik der Gesel lschaftfor St rah len- und Umw el tforschung,Gr isebachst rasse 6, D-3400 Goet t ingen, Germany.

E r r o r s in r e p r e s e n t in gp r o t e in a n d n u c l e ic a c i ds t r u c t u r e sI n h i s r e c e n t T e x t b o o k E r r o r a r t i c l e ,E d i s o n I i m p l ie s t h a t t h e r e p r e s e n t a t i o n o f~ - s h e e t s t r u c t u r e s d r a w n w i t h D -a m i n oa c i d r e s id u e s , r a t h e r t h a n t h e n a t u r a lL - a m in o a c i d r e s i d u e s , i s a n e r r o r t h a t h a sl a i n u n d i s c o v e r e d f o r 29 y e a r s . T h i s i s n o ts o !

D a y a n d R i t t e r d i s c u s s e d t h i s ' m i s t a k e 'i n a p a p e r p u b l i s h e d i n 1 9 67 2. T h e i r p a p e ra l s o g i v e s e x a m p l e s o f e r r o r s i n t h er e p r e s e n t a t i o n o f th e s e n s e o f DN A a n dp r o t e i n h e l i ce s , an d d e s c r i b e s s i m p l e

w a y s o f d i s t i n g u i s h i n g r i g h t - a n d l e ft -h a n d e d h e l i c a l f o r m s . A s t h e y p o i n t o u t ,t h e s e d i a g r a m s a r e n o t n e c e s s a r i ly' w r o n g ' , b u t i t is u n f o r t u n a t e t h a t m a n yt e x t b o o k s d o n o t p r e s e n t t h e s e s t r u c t u r e sa s t h e y a p p e a r i n n a t u r e.

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G E R A L D I N E E . IN D G EStockport Col lege of Technology, StockportSK1 3UQ , UK.

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