Microscopia Confocal: Teoria e técnica
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 1
Microscopia Confocal: Teoria e técnica
• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 2
Práticas
• Microscopia de transmissão• Microscopia de fluorescência wide-field• Microscopia confocal
BibliografiaLakowicz, J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2nd Edition. 1999. Kluver
Academic/Plenum Publishers, New York.Lichtman, J.W., Conchello, J-A. Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2(12):910-
919, 2005.Conchello, J-A., Lichtman, J.W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods, 2(12):920-931/
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 3
Microscopia Confocal: Teoria e técnica
• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.
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Ondas mecânicas em um meio elástico
Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 4
Meio:Massa (inércia)Elasticidade
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 5
Energia Radiante – Radiação eletromagnética.
Carregam energias elétrica e magnética
Propriedades do meio de propagação:•Armazenar energia elétrica (capacitância)•Armazenar enérgia magnética•(indutância)
VácuoPermitividade F/mPermeabilidade H/m 1-
0
ms1
c 8
0
1003 με
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 6
Energia Radiante – Radiação eletromagnética.
s
km
s
mc
c
000.300459.792.299
Velocidade da onda
Frequência (ciclos por s, Hz)
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 7
Espectro da radiação eletromagnética
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 8
Onda: Refração
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 9
Fóton
JhE
Hzc
m
sJh
azulazulfóton
azulazul
azul
19,
14
9
34
1007,4*
10*143,6
10488
1062606896,6
photon is the quantum of the electromagnetic interaction and the basic "unit" of light and all other forms of electromagnetic radiation and is also the force carrier for the electromagnetic force.
νEfóton
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 10
Microscopia Confocal: Teoria e técnica
• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 11
Interação radiação EM-matéria: reflexão
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 12
Interação radiação EM-matéria: refração
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 13
Interação radiação EM-matéria: difração
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 14
Luminescência – Fluorescência e fosforescência
0térmicaemis1
1exc0
SEνS
SνS
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 15
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 16
Luminescência – Fluorescência e fosforescência
Diagrama de Jablonski
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 17
Fluoróforos de interesse em Biologia
Fluoresceína
Rodamina
Quinina
Acridina
exc
250nm
350nm
em =450nm
exc=530nm
em=556nm
exc=490nm
em=514nm
exc=495nm
em=526nm
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 18
Fontes de “luz”: Laser x HBO
Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente (fase relativa constante), em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de
onda definido (monocromático)
Espectro do He-Ne laser
Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp)
Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation)
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 19
Microscopia Confocal: Teoria e técnica
• 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética– Natureza da radiação eletromagnética– Espectro eletromagnético.– Natureza dual: onda/partícula
• 2. Fluorescência.– Interação radiação eletromagnética-matéria.– Luminescência: fluorescência e fosforescência.– Fluorescência: Diagrama de Jablonski.– Fluoróforos.
• 3. Microscopia de transmissão• 4. Microscopia de fluorescência “wide-field”• 5. Microscopia confocal • 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão.
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 20
Dimensões na Biologia
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 21
Microscopia - Objetivas
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 22
Abertura numérica e aumento
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 23
Resolução
1,51n
sinnΝΑ
1
θ
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 24
Difração limita a resolução – Airy disks
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 25
Resolução e refração do meio
1,51n
sinnΝΑ
1
θ
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 26
Resolução51,11
)sin(*
n
nAN
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 27
Aumento e Resolução
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 28
Microscopia de luz refletida
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 29
Microscopia de luz transmitida
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 30
Iluminaçao – Sistema Köhler
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 31
Técnicas especiais: Contraste por Interferência DiferencialDIC
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 32
Técnicas especiais: Contraste por Interferência DiferencialDIC
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 33
Imagem de Fluorescência em Microscopia “Wide Field”
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 34
Fluorescência
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 35
Microscopia de fluorescência “wide field”
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 36
Imagem de Fluorescência em “Wide Field”“Filter Cube”
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 37
Imagem de Fluorescência
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 38
Microscópio de epifluorescência “Wide Field”
UV Filter Cube set #487902 (Exciter Filter: G 365, Beam Splitter: FT 395, Barrier Filter: LP
420). This cube is used to visualize UV-excitable fluors like DAPI.
Blue Filter Cube set #487910 (Exciter Filter: BP 450-490, Beam Splitter: FT 510, Barrier Filter: BP 515-565). Fluorescein, GFP and Oregon Green can be visualized using this filter set.
Green Filter Cube set #487915 (Exciter Filter: BP 546±12, Beam Splitter: FT 580,
Barrier Filter: LP 590). Green-excitable fluors like rhodamine and Cy3 can be visualized using
this filter set.
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 39
Espectro da HBO
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Microscopia confocal, 2011 A. C. Cassola 40
Zeiss Axiovert 100 M
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 41
Microscópio Confocal
Microscópio de fluorescência a laser com iluminação puntiforme
Microscópico de varredura
Fatiamento óptico produz qualidade de imagem superior à da epifluorescência
Resolução no eixo Z
Resolução temporal reduzida.
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 42
Microscópio Confocal: aplicaçoes
As que demandam resoluçao espacial XYZ
Investigação de colocalização de moléculas que possam ser identificadas por indicadores fluorescentes
Análise da interação entre moléculas (FRET)
Análise da migraçao de moléculas (FRAP)
etc
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 43
Microscopia confocal
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 44
Princípio da Microscopia confocal
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 45
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 46
Imagem multiespectral
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 47
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 48
Resoluções lateral e axial
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 49
Resolução e “Airy pattern”
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 50
Compromissos
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 51
![Page 52: Microscopia Confocal: Teoria e técnica](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062305/56814fa2550346895dbd5fba/html5/thumbnails/52.jpg)
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 52
Aplicações do microscópio confocal
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 53
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 54
Espectros das FP
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 55
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Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 56
![Page 57: Microscopia Confocal: Teoria e técnica](https://reader036.fdocuments.in/reader036/viewer/2022062305/56814fa2550346895dbd5fba/html5/thumbnails/57.jpg)
Microscopia confocal, 2010 A. C. Cassola 57
Inclusões
• Análise espectral – META (lambda stack - AOTF)• Proteínas fluorescentes
(http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/pps99.cryst.bbk.ac.uk/projects/gmocz/index.htm)