The Shortest Telomere, Not The Shortest Telomere, Not

Average Telomere Length, Is Average Telomere Length, Is

Critical for Cell ViabilityCritical for Cell Viability

and Chromosome Stabilityand Chromosome Stability

Michael T. Hemann, Margaret A. Strong,Ling-Yang Hao, and Carol W. Greider

Presentación: Cinalli, Alejandro

Holgado, María PíaSalvatierra, Damiana

Scazzina, Brenda

TelómerosTelómeros

• Son estructuras especializadas presentes en las terminaciones naturales de los cromosomas, que permiten la estabilidad cromosómica (Repetición TTAGGG)

• Mantienen su longitud por un equilibrio acortamiento-elongación.

¿Qué determina la pérdida de ¿Qué determina la pérdida de función telomérica?función telomérica?

En ausencia de telómeros con un

largo adecuado se observan fusiones

cromosómicas (final con final),

arresto del ciclo celular y apoptosis

en células germinales (infertilidad).

¿Qué dispara la respuesta ¿Qué dispara la respuesta celular?celular?

Dos hipótesis:

• El promedio de la longitud telomérica• El telómero más corto

OBJETIVOSOBJETIVOS

Determinar si la respuesta celular se

dispara por un promedio de longitud

telomérico bajo, o si se debe a la

presencia individual de telómeros

muy cortos.

Modelo animalModelo animal

• mTR = murine telomerase RNA (templado para la síntesis del telómero)

no presentan el RNA que sirve como templado

no tienen actividad telomerasa

Ratones mTR -/-

Inicialmente (G1) no presentan fenotipo, en generaciones más tardias (ej: G4) los telómeros son más cortos y hay eventos de fusión

Los telómeros cortos inician una rta celular en ratones mTR -/-

mTR-/- (G6)Telómeros cortos

mTR +/-X

mTR-/- (iF1) mTR+/- (iF1)

50% tel largos

50% tel cortos

TUNEL - TdT- mediated dUTP nick end labelling

ApoptosisDaño al DNA- roturas de cadenas por cortes con

endonucleasas

TdT transfiere dUTP biotinilado

Detección por streptoavidina-HRP

Incubación con DAB

mTR+/- y mTR-/- G3 no muestran infertilidad y sus niveles de apoptosis de

células germinales o fusión de cromosomas son los de un wild-type.

mTR-/- G6 es generalmente no fértil

•mTR-/- (iF1) presentó valores similares a los de un mTR-/- G6.

•mTR+/- (iF1) mostró los mismos resultados que un wild-type.

•Esto indica que el agregado de la telomerasa “rescató” a este fenotipo. Y que la respuesta celular

se debe a la presencia de telomeros cortos.

Elongación preferencial de Elongación preferencial de telómeros cortos en ratones telómeros cortos en ratones

mTR+/- (iF1)mTR+/- (iF1)

• Se comparó la distribución de longitudes de los telómeros de mTR+/- (iF1) y mTR-/- (iF1), con mTR+/-, mTR-/- G3 y mTR-/- G6 usando Q-FISH.

• La longitud del telómero esta representada como unidades teloméricas fluorescentes (TFUs).

• El resultado se expresó como distribución de frecuencias de TFUs.

Q-FISHQ-FISH

• Mide el largo individual de los telómeros

• Células arrestadas en metafase teñidas con

sonda fluorescente específica de telómeros.

• Tinción con DAPI para visualizar cromosomas.

• Medición cuantitativa de la señal fluorescente

para determinar largo de telómeros.

• Se ve un cambio significativo en el promedio entre mTR+/- y mTR-/- G3. Pero la diferencia fue mínima entre mTR -/- G3 y los mTR (iF1s).

• Entre mTR+/- (iF1) y mTR-/- (iF1) se vio una diferencia en el número de telomeros muy cortos.

• Esto mostraría que la función telomérica se restaura por la adición de repeticiones a los telómeros mas cortos y no por una elongación global.

La restitución de la actividad La restitución de la actividad de telomerasa ocurre de telomerasa ocurre

temprano en el desarrollotemprano en el desarrollo

Fibroblastos embrionarios (MEFs) de

ratones mTR -/- (iF1) y +/- (iF1) de

13,5 días de gestación.

% de terminaciones de telómeros sin

repeticiones teloméricas (signal

free ends)

Análisis citogenético:

número de fusiones por metafase

- Irradiar con Cs137 radiación beta y gamma- Medir % viabilidad con azul de tripan

Estudio de la sensibilidad a la radiación ionizante

La telomerasa restituye las La telomerasa restituye las repeticiones en los +/-repeticiones en los +/-

Probablemente la telomerasa sea dirigida específicamente a telómeros cortos y

disfuncionales

¿Reclutamiento por proteínas ausentes?

¿Reclutamiento por proteínas que reconocen telómeros disfuncionales?

Existe una distribución no Existe una distribución no azarosa de las fusiones entre azarosa de las fusiones entre cromosomas en una línea de cromosomas en una línea de

ratones mTR -/-ratones mTR -/-

• SKY (Spectral Karyotype- Cariotipo espectral en colores)

• Q-FISH(Quantitative fluorescence in situ hybridization)

SKYSKY

- Análisis de todos los cromosomas de un organismo simultáneamente, cada uno de ellos se encuentra marcado con un color diferente

- La discriminación por el color se consigue por medio del análisis espectral de las señales fluorescentes

- Se usan sondas de DNA fluorescentes que emiten entre los 200 y 700 nm

SKY – Fusión de cromosomas 19 por los brazos P

Tinción con DAPI (4',6-diamino-2-

phenylindole)

SKY (Spectrl Karyotype) en esplenocitos de mTR -/-

Cromosoma 19: 12 de 14

Cromosoma 5: 10 de 14

Cromosomas 3, 9, 10 e Y: sin eventos de fusión

Los cromosomas que frecuentemente están involucrados en fusiones son los

de telómeros más cortos

Metafases de mTR-/- G6 Q-FISH

Para determinar qué telómeros no emitían señal

SKYPara determinar la identidad

de los cromosomas

Los cromosomas que frecuentemente están involucrados en fusiones son los

de telómeros más cortos

Análisisestadístico

Un cromosoma con extremo libre de señal tiene mayor probabilidad de fusión que un cromosoma conteniendo repeticiones

teloméricas

Los cromosomas que frecuentemente están involucrados en fusiones son los

de telómeros más cortos

El telómero más corto es el más propenso a perder función y sufrir fusión con otro telómero

cortoEsto sugiere que es necesaria la presencia de dos

telómeros cortos para que se dé un evento de fusión en la célula

Estudios en células humanas

El telómero en 17p es

normalmente más corto que

los otros

El cromosoma 17 podría estar involucrado más frecuentemente en

rearreglos

La ubicación de p53 en 17p contribuiría a la frecuente pérdida de p53 en los tumores humanos

No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones

mTR-/- G5-G6

Repeticiones satélite

Repeticiones satélite

Repeticiones teloméricas

Estudios previos

No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones

mTR-/- G5-G6Clonado por PCR de la zona de la fusión

Wild-type mTR-/- G5-G6

No se generaron productos específicos

Se generaronproductos específicos

SecuenciaciónLa unión consistía en 2 pequeñas secuencias

satélite fusionadas directamente

No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones

mTR-/- G5-G6Ninguna unión mostró

secuencias de repetición telomérica

Todas mostraron secuenciasde microhomología

Características de eventos de fusióndados por mecanismos NHEJ

(non-homologous end joining)

No hay secuencia telomérica presente en las uniones de la fusión en ratones

mTR-/- G5-G6FISH

Sonda específica para repeticiones

satélite pequeñas de ratón

Todas las fusiones

mostraron una señal

disminuida en relación a satélites normales

Una línea independiente de ratones mTR -/- presenta diferentes telómeros

cortos y diferentes fusiones cromosómicas.

• Cada línea se establece por eventos al azar durante la fertilización inicial.

• La distribución de telómeros cortos vs las fusiones observadas no fue azarosa,

¿ocurre lo mismo en otras líneas?

Linea 2

El resultado es una distribución no azarosa de longitudes teloméricas respecto de las fusiones pero los

cromosomas cortos involucrados son distintos.

Las longitudes teloméricas en ratones wild-type no son

cromosoma específicas.

• SKY y Q-FISH: distribución de las longitudes teloméricas para cromosomas individuales.

• Análisis estadístico: comparación entre la distribución longitudes de cada telómero y las demás distribuciones para el resto de los cromosomas.

No hay ningún final cromosómico que tenga una distribución de longitudes teloméricas cortas más reproducible que otros

telómeros en ratones wild-type.

Conclusión:

• No es la longitud promedio de los

telómeros la que gatilla la respuesta

celular, sino la presencia de

telómeros individuales con longitudes

muy cortas.

•La presencia de telomerasa

rescata los fenotipos con

telómeros disfuncionales.

• El rol esencial de la telomerasa no

sería el mantenimiento del promedio

del largo de los telómeros, sino el

mantenimiento de la función de los

mismos, cuando alcanzan un largo

mínimo crítico.

• No hay telómeros que presenten

tendencia a ser más cortos, pero

sí los telómeros más cortos

originan fusiones cromosómicas

(final con final).