MENSAJE BIOQUÍMICO - Taller de Actualización...

Memoria del 44º Taller de Actualización Bioquímica, Facultad de Medicina; UNAM

Evolución de los genomas mitocondriales: transferencia

natural y artificial de genes mitocondriales al núcleo

Evolution of mitochondrial genomes (natural and artificial transfer of mitochondrial genes to the nucleus)

González Halphen, Diego1*; Vázquez-Acevedo, Miriam1; Vega-deLuna, Félix1 y

Rubalcava-Gracia, Diana1.

1. Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular; UNAM. *Correspondencia. Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

Apdo. Postal 70242, Coyoacán, Ciudad de México. Tel: +52(55)56225620, [email protected]

Versión electrónica en http://tab.facmed.unam.mx

MENSAJE BIOQUÍMICO Mens. Bioquim. 41 (2017) 116-126

Resumen Las mitocondrias llevan a cabo diversas funciones metabólicas, entre la que destaca la fosforilación oxidativa. Estos organelos tienen su propio material genético y se han descrito múltiples mutaciones y ablaciones en el DNA mitocondrial humano que dan lugar a diversas patologías. Se piensa que estos organelos se originaron a partir de un evento endosimbiótico que se estableció hace unos 1800 millones de años entre un arqueón (hospedero) y una alfa-proteobacteria (huésped). A lo largo de la evolución, las mitocondrias transfirieron una gran cantidad de genes al núcleo; este fenómeno de migración aún no ha concluido. Lo anterior ha dado lugar a genomas mitocondriales pequeños con un número limitado de genes. Se ha propuesto que en general, los genes que han permanecido en los genomas mitocondriales codifican proteínas de membrana muy hidrofóbicas, con dos o más cruces transmembranales. En este escrito se analiza tanto la migración natural de genes mitocondriales al núcleo, así como la migración artificial, es decir, aquella manipulada por técnicas de ingeniería genética. Se dan ejemplos de esta migración artificial, o expresión alotópica, haciendo énfasis en su importancia en el desarrollo de terapias génicas que puedan revertir las alteraciones mitocondriales. Palabras clave: mitocondrias, expresión alotópica, miopatías mitocondriales, migración de genes.

Abstract Mitochondria carry out diverse metabolic functions, including oxidative phosphorylation. These organelles contain their own genetic material, and multiple mutations and deletions that give rise to human syndromes have been found in mitochondrial DNAs. These organelles originated from an endosymbiotic event that occurred around 1800 million years ago between an archaeon (the host) and an alpha-proteobacterium. Along evolutionary history, mitochondria have transferred a large number of genes to the nucleus, a phenomenon that is still ongoing. Thus, mitochondrial genomes are highly reduced and contain only a limited set of genes. In general, the genes that have remained in the mitochondrial DNA are those encoding highly hydrophobic membrane proteins with two or more transmembrane stretches. Here, we review both the natural migration of mitochondrial genes to the nucleus and the artificial migration that may be achieved by genetic engineering. Examples of this artificial migration or allotopic expression are given, stressing their importance for the development of gene therapies directed towards restoring mitochondrial function. Keywords: Mitochondria, allotopic expression, mitochondrial myopathies, gene transfer.

González-Halphen, et al. Mens. Bioquim. 41 (2017): 116 - 126

© 2017 Mensaje Bioquímico. Todos los derechos reservados. ISSN-0188-137X Comité Editorial: Cárdenas Monroy, C.A.; González Andrade, M.; Lara Lemus, R.; Martínez González, J.J.; Molina Jijón, E.; Torres

Durán, P.V. Publicado por el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina; UNAM.

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Las mitocondrias

Las mitocondrias son organelos eucariotas delimitados por dos membranas: una membrana externa y una interna con múltiples invaginaciones denominadas crestas mitocondriales. En las crestas se alojan los complejos de la fosforilación oxidativa. El espacio que separa a las dos membranas se denomina espacio intermembranal, mientras que la matriz mitocondrial es el espacio interior rodeado por la membrana interna [1]. En las mitocondrias se lleva a cabo una parte importante del metabolismo celular que incluye el ciclo de Krebs, la síntesis de ácidos grasos, la síntesis de grupos hemo y de centros fierro-azufre. Asimismo, las mitocondrias están involucradas en la regulación del metabolismo, el control del ciclo celular, el envejecimiento y la muerte celular programada [2]. Sin embargo, su función primordial es la producción de energía química en forma de ATP, a través de la fosforilación oxidativa. Este proceso acopla, por medio de un gradiente electroquímico, la respiración (mediada por los complejos I a IV) con la síntesis de ATP (llevada a cabo por la ATP sintasa o complejo V) [3].

Las mitocondrias tienen su propio material genético. En la matriz mitocondrial existen varias copias de DNA (DNAmt), que pueden ser lineales o circulares de acuerdo con la especie y cuyo tamaño y contenido de genes también es variable. Sin embargo, la mayoría de los organismos conservan en su DNAmt genes que codifican RNAs ribosomales, RNAs de transferencia, y un conjunto de proteínas. En general, la mayoría de estas proteínas son subunidades de algún complejo de la fosforilación oxidativa [4]. El humano, por ejemplo, posee un DNAmt circular de 16.8 kb que codifica para 13 proteínas: 7 subunidades del complejo I (Nad1, Nad2, Nad3, Nad4, Nad4L, Nad5 Y Nad6), tres subunidades de la citocromo c oxidasa (Cox1, Cox2 y Cox3), el citocromo b del complejo III (Cob) y dos subunidades de la ATP sintasa (Atp6 y Atp8). El genoma mitocondrial también codifica los RNAs necesarios para la traducción de proteínas (RNAs ribosomales 12S y 16S y 22 RNAs de transferencia) [5]. El resto de las más de 1500 proteínas mitocondriales [6] están codificadas en el genoma nuclear, son sintetizadas en el citosol y son importadas al organelo a través de una maquinaria constituida por receptores y translocadores, en particular, los complejos translocadores de membrana externa e interna TOM-TIM [7]. Así, la mitocondria importa más

del 99% de las proteínas que requiere para funcionar. Muchas de las proteínas que ingresan a la mitocondria contienen un código postal (MTS, secuencia de localización mitocondrial por sus siglas en inglés), es decir, una presecuencia de 20 a 40 aminoácidos (aa), capaz de formar una alfa-hélice anfifílica, que es reconocida por los sistemas de importación TOM-TIM. Cuando las mitocondrias funcionan mal

Se han descrito un grupo de patologías humanas causadas por alteraciones en la fosforilación oxidativa que dan lugar a una capacidad disminuida de síntesis de ATP. Las encefalomiopatías mitocondriales pueden ser causadas por mutaciones en el DNAmt o en el DNA nuclear. Estas enfermedades afectan principalmente al cerebro, a los músculos y al sistema endocrino, es decir, órganos y tejidos con una alta demanda energética. Las manifestaciones clínicas son muy variadas y pueden incluir debilidad muscular, intolerancia al ejercicio, ceguera, retraso mental, demencia y disfunción renal. Las mutaciones en el DNAmt también se han relacionado con otras enfermedades como la diabetes, la obesidad, alteraciones cardiovasculares y el cáncer [2]. Hasta la fecha, se han descrito varias ablaciones y duplicaciones en los genomas mitocondriales y más de 150 mutaciones puntuales en el DNAmt relacionadas con padecimientos humanos [8]. Estudios epidemiológicos, han demostrado que 1 de cada 6,000 individuos podría presentar mutaciones patogénicas en el DNAmt [9]. Como cada mitocondria posee múltiples copias de su DNA y cada célula contiene cientos o miles de mitocondrias, la aparición de síntomas claros de una enfermedad mitocondrial está directamente relacionadas con la proporción de DNAmt mutante. En general, para que se manifiesten los síntomas, la mutación debe estar presente en al menos el 90% de la población de DNAmt [10].

Hasta la fecha no existe un tratamiento para las enfermedades mitocondriales, excepto en aquellos casos en los que la mutación en el DNAmt se encuentra localizada en un órgano en particular y resulta posible llevar a cabo un trasplante. También existen alternativas interesantes de prevención. El primero es simplemente llevar a cabo un diagnóstico preventivo, que le permitirá a una pareja decidir tener o no hijos. La segunda es la de los bebés de “tres padres”, o bien, la transferencia del complejo huso acromático, una tecnología basada en el intercambio de material




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genético y en técnicas de fertilización in vitro, que evitan que una mutación mitocondrial se herede [11]. Esencialmente, se toman óvulos de una mujer donante (con mitocondrias sanas, sin mutaciones) y de la mujer con mutaciones en el DNAmt (la madre que desea tener un hijo sano). Se elimina todo el material genético nuclear presente en el óvulo de la donante. Por otra parte, también se retira el huso acromático de la futura madre con mutaciones mitocondriales y se transfiere al óvulo de la donante. De esta manera se generan óvulos “reconstruidos” que carecen del DNAmt mutado y que solamente contienen el material genético nuclear de la madre (intacto) y el material genético mitocondrial de la donante (intacto). El óvulo reconstruido se fertiliza in vitro y se permite el desarrollo de la embriogénesis hasta el momento en que pueda implantarse en el útero materno. De ahí procede un embarazo normal que dará lugar a un bebé sano, que tendrá el 49.9% del material genético cromosómico del padre, el 49.9% del material genético cromosómico de la madre y únicamente el 0.2% del material genético (el DNA mitocondrial) de la donante. Por lo tanto, no es estrictamente cierto que el bebé sea producto de “tres padres”, aunque si representa un mosaico genético de tres personas. El resto de los tratamientos están dirigidos a mitigar los síntomas e incluyen el ejercicio físico y el tratamiento farmacológico. En general, se considera que todos estos tratamientos son paliativos, ya que pueden aliviar los síntomas, pero no curar la enfermedad. La ausencia de tratamientos efectivos para las enfermedades mitocondriales, ha llevado a buscar estrategias que involucran una terapia génica [12]. Aquí describiremos una de dichas estrategias, denominada expresión alotópica. Ante la dificultad de introducir material genético a las mitocondrias y de poder integrar una copia silvestre del gen mutante en cada mitocondria, se ha planteado la posibilidad de expresar genes mitocondriales desde el núcleo, permitir que la proteína se sintetice en el citosol y aprovechar la maquinaria de importación mitocondrial para que dicha proteína se internalice en la mitocondria y se ensamble de forma correcta en su complejo correspondiente, restaurando así su función [13]. Origen evolutivo de las mitocondrias

Se piensa que las mitocondrias se originaron en un evento endosimbiótico [14], hace alrededor de 1800 millones de años, cuando una alfa-proteobacteria fue engullida sin ser destruida por otra célula, estableciéndose así una relación

simbiótica. Es claro que fue una alfa-proteobacteria el organismo que dio origen a las mitocondrias; todos los análisis filogenéticos realizados con secuencias de DNA mitocondrial y con secuencias de alfa-proteobacterias muestran una alta similitud entre ambos grupos y un parentesco indudable [15]. Todavía no es claro con qué subgrupo de alfa-proteobacterias estaba relacionado el ancestro que dio origen a la mitocondria, pero se han propuesto que podría haber pertenecido al grupo de las Rhodospirillales, de las Rickettsiales o de las bacterias metilotróficas [16]. Más difícil aún es inferir quien fue el ancestro que engulló a la alfa-proteobacteria y que fungió como hospedero. Durante mucho tiempo se postuló que se trataba de un proto-eucarionte, es decir, una especie de amiba con núcleo y con muchas otras características de una célula eucarionte, pero carente de mitocondrias [17]. Actualmente, se sabe que no existen en realidad organismos eucariontes que no hayan contenido mitocondrias. Todas las ramas de los eucariontes tienen mitocondrias, o bien organelos derivados de las mitocondrias, como son los hidrogenosomas y los mitosomas. Simplemente, algunas ramas de los eucariontes perdieron a las mitocondrias como tal, pero aún mantienen un organelo remanente relacionado con ellas. Se ha descrito un sólo eucarionte sin organelo remanente de la mitocondria, pero aún él también contuvo mitocondrias alguna vez [18]. Entonces, ¿quién fue el hospedero en el evento endosimbiótico que dio origen a las mitocondrias? De acuerdo con la hipótesis de Martin y Muller un arqueón, es decir, un procarionte del dominio de las Archaeas [19]. Se postula que se trató de un arqueón anaeróbico, dependiente de hidrógeno como fuente de energía y estrictamente autotrófico, probablemente un ancestro de la actual familia de las Lokiarchaeota [20]. Por su parte, el ancestro de la alfa-proteobacteria era un organismo capaz de respirar y de producir hidrógeno como producto de deshecho. La dependencia de hidrógeno del hospedero fue la presión selectiva que favoreció el evento endosimbiótico. Este proceso dio origen a los eucariontes y a la gran diversidad de vida en la tierra. Se cree que este fenómeno ocurrió una sola vez durante la evolución de forma exitosa. Una vez establecida la endosimbiosis, ésta fue seguida de una migración masiva de genes hacia el núcleo y de una pérdida significativa de genes redundantes. Posteriormente, ha ocurrido una transferencia más moderada que aún parece estar en curso [21]. Esta migración masiva de genes, en un periodo tan largo de tiempo (1800 millones de




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años), ha dado lugar a que los genomas mitocondriales sean, en general, extremadamente pequeños. La gran diversidad de genomas mitocondriales

Los genomas mitocondriales varían entre las diferentes especies tanto en forma y en tamaño, así como en el contenido de genes y en la disposición de los mismos. Como ya se mencionó, en todos los DNAmt se encuentran genes para RNAs ribosomales, RNAs de transferencia (excepto en Plasmodium falciparum), algunas proteínas de los complejos de la fosforilación oxidativa y un conjunto variable de proteínas involucradas en la síntesis de proteínas y en otros procesos.

En cuanto al contenido génico, se puede encontrar un espectro amplio de genomas mitocondriales en la naturaleza. El DNAmt (69 kb) del flagelado Reclinomonas americana [22], ‘la mitocondria que el tiempo olvidó’ [23] se asemeja a un genoma bacteriano muy reducido en tamaño. Este DNAmt codifica 24 proteínas que participan en la fosforilación oxidativa más un conjunto de 38 proteínas adicionales involucradas en la transcripción, traducción, importación de proteínas y en su maduración. Recientemente, se ha encontrado que otro flagelado de la misma familia, Andalucia godoyi, tiene un genoma mitocondrial de 67.6 kb con dos genes más que Reclinomonas: rpl35 (que codifica una proteína del mitoribosoma) y cox15 (que codifica una proteína involucrada en el ensamblaje de la citocromo oxidasa) [24]. Hoy por hoy, Andalucia tiene el récord de tener el DNAmt con el mayor número de genes funcionales conocidos. Es por esto que los genomas mitocondriales de los flagelados jacóbidos son los que teóricamente más se asemejan al posible genoma de la proto-mitocondria. En el otro extremo del espectro, encontramos a un DNAmt extremadamente pequeño (de solamente 6 kb), que pertenece al parásito apicomplejo P. falciparum. Este genoma mitocondrial contiene únicamente 5 genes de los cuales 3 codifican componentes de la cadena respiratoria: el citocromo b (Cob) del complejo bc1 y las subunidades Cox1 y Cox3 de la citocromo oxidasa [25]. Los genes cob y cox1 están presentes en absolutamente todos los genomas mitocondriales que se conocen a la fecha. Sus productos génicos son proteínas altamente hidrofóbicas con varios cruces transmembranales que son componentes

indispensables de complejos translocadores de protones [26]. Migración natural de genes mitocondriales al núcleo

Después de establecida la endosimbiosis, hubo una migración paulatina de genes de la proto-mitocondria al núcleo [27]. Esta transferencia de material genético se llevó a cabo por DNAs o RNAs que de alguna manera escaparon del organelo [28]. En levadura, se ha estimado que actualmente la transferencia de genes de la mitocondria al núcleo ocurre 100 veces más frecuentemente que el proceso contrario [29]. Esto sugiere que existe un flujo unidireccional de material genético de los organelos al núcleo. Los fragmentos transferidos (de RNA o DNA) pueden ir desde 31 bases [29] hasta 620 kilobases, como en el caso de Arabidopsis thaliana, donde se ha encontrado una copia entera del DNAmt insertada en el genoma nuclear [31].

La transferencia continua de material genético

del organelo al núcleo lleva a pensar que eventualmente todas las secuencias codificantes en la mitocondria se perderán totalmente [32]. Sin embargo, esto es poco probable, porque esta transferencia no siempre es exitosa ya que muchos genes que migran al núcleo no se establecen adecuadamente en un cromosoma y nunca se vuelven funcionales. En muchísimas especies animales se han encontrado copias de genes mitocondriales que son pseudogenes [33]. Estos pseudogenes parecen ser fósiles moleculares de DNAs mitocondriales que migraron al núcleo pero que nunca se activaron ni se convirtieron en genes funcionales [34]. Por lo tanto, se predice que para que una mitocondria sea capaz de llevar a cabo la fosforilación oxidativa, deberá codificar en su genoma algunas proteínas de membrana altamente hidrofóbicas.

La migración de genes mitocondriales al

núcleo es un proceso evolutivo que aún está ocurriendo [35]. Ejemplo de ello es la presencia de genes que codifican la subunidad 9 de la ATP sintasa (Atp9), tanto en la mitocondria como en el núcleo del hongo Neurospora crassa [36] o la subunidad dos de la citocromo c oxidasa (Cox2), en plantas leguminosas [37]. La relocalización de genes mitocondriales en el núcleo requiere de varios pasos [38] siendo los más importantes los que se mencionan a continuación. i) La transferencia de uno de los genes (como DNA o como RNA) al núcleo, mientras que una copia




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activa del mismo gen es retenida en la mitocondria. ii) Activación del gen nuclear al adquirir secuencias promotoras, sitios de unión a los ribosomas, secuencias de poliadenilación y secuencias que codifiquen para una presecuencia mitocondrial. Estos cambios estructurales pueden estar acompañados de cambios en el uso de codones y en la adquisición de intrones. Esta migración de genes al núcleo implica que, por algún periodo de tiempo, deben coexistir dos copias funcionales del mismo gen, una en la mitocondria y otra en el núcleo, tal como se ha descrito en el caso de las leguminosas [39]. iii) Inactivación del gen mitocondrial, como lo sucedido en el caso de la proteína ribosomal S14 del arroz, donde el gen nuclear se expresa mientras que el gen mitocondrial ya ha dejado de ser funcional y se encuentra interrumpido por codones de paro [40]. Al final de este proceso migratorio, probablemente el gen mitocondrial se eliminará del todo. Sin embargo, también es posible que la copia nuclear sea la que se inactive, resultando en la retención del gen en la mitocondria y la aparición de un pseudogene en el núcleo [41] (ver Figura 1).

Figura 1. Migración de genes mitocondriales al núcleo. El esquema muestra la transferencia de un gen mitocondrial al núcleo y sus posibles destinos. A) El gen se encuentra en su sitio original, el genoma mitocondrial. B) Una copia del gen mitocondrial se inserta en algún cromosoma nuclear. Ambas copias pueden coexistir. C) La transferencia al núcleo es exitosa, se activa la copia nuclear y se inactiva el gen mitocondrial, convirtiéndose en un pseudogene. D) El gen mitocondrial eventualmente desaparece. E) La copia que migró al núcleo se inserta, pero nunca se activa y queda como un pseudogene. F) La copia del gen que migró al núcleo eventualmente desaparece y solo permanece el gen mitocondrial original.

La transferencia de genes mitocondriales al núcleo podría conferir una ventaja selectiva, ya que en algunos organismos los genes nucleares exhiben una menor tasa de mutación [42]. Esto no aplica para los hongos, donde la tasa de mutación de los genes mitocondriales y nucleares es casi la misma, ni para plantas, donde los genes nucleares mutan a una tasa más alta que los mitocondriales [43]. La transferencia de genes de los organelos al núcleo, podría disminuir la acumulación de mutaciones deletéreas, ya que los genes se están transfiriendo de un genoma que se replica de forma predominantemente asexual, a uno que lo hace de forma sexual [44].

En algas clorofíceas como Chlamydomonas

reinhardtii o Polytomella parva, los genes atp6, atp8, cox2, cox3, nad3 y nad4L no están presentes en el genoma mitocondrial. Se ha demostrado que todos estos genes han migrado naturalmente al núcleo en estas algas [45]. También se encontró que la subunidad Cox2 está codificada por dos genes nucleares separados, que fueron denominados cox2a y cox2b. El gen cox2a codifica la proteína Cox2A, que corresponde a la mitad amino-terminal de la proteína Cox2 clásica y contiene a los dos cruces transmembranales de la proteína. El gen cox2b codifica a la proteína Cox2B, equivalente a la mitad carboxilo-terminal de una subunidad Cox2 ortodoxa. Lo anterior indica que, durante la evolución, el gen mitocondrial cox2 se fragmentó en los genes cox2a y cox2b y que luego éstos migraron independientemente al núcleo, insertándose en cromosomas diferentes. Sus productos proteicos correspondientes se importan independientemente a la mitocondria y se ensamblan en el complejo de la citocromo oxidasa [46]. El gen atp6, que codifica a la subunidad Atp6 (subunidad a), un componente esencial del sector Fo de la F1Fo-ATP sintasa, también migró al núcleo en las algas clorofíceas [47]. Finalmente, los genes nad3 y nad4L, que codifican subunidades del complejo I, también han sido relocalizados al genoma nuclear de estas algas [48]. Parece ser entonces, que muchos genes que se encuentran presentes en los genomas mitocondriales clásicos, han migrado al núcleo en las algas clorofíceas. En particular, llaman la atención los genes cox3 y atp6, los cuales codifican proteínas muy hidrofóbicas, con 7 y 4 cruces transmembranales respectivamente.




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Migración artificial de genes mitocondriales al núcleo: la expresión alotópica

En 1990 Popot y de Vitry propusieron que la hidrofobicidad de una proteína era el factor determinante para que ésta pueda o no internalizarse exitosamente en la mitocondria [49]. En levaduras, estudios llevados a cabo con diversas construcciones del gen cob (codificando para el citocromo b), demostraron que la importación de polipéptidos a la mitocondria no depende estrictamente del número de cruces transmembranales que tenga la proteína, sino que está más bien relacionado con dos parámetros fisicoquímicos: la hidrofobicidad máxima de un cruce transmembranal (17 aa) y la mesohidrofobicidad, es decir, hidrofobicidad media de una región de la proteína que podría incluir hasta 3 cruces transmembranales (60-80 aa) [50]. Todas las proteínas de algas clorofíceas que mencionamos anteriormente Cox2A, Cox3 y Atp6, exhiben estos parámetros de hidrofobicidad reducida que les permite ingresar a la mitocondria. Las mitocondrias importan muchas otras proteínas de membrana con múltiples cruces transmembranales, como lo es el translocador de adenín nucleótidos. Sin embargo, estos translocadores parecen seguir las mismas reglas de baja hidrofobicidad y mesohidrofobicidad [50]. Además, estos translocadores se insertan en la membrana interna mitocondrial utilizando un camino diferente, mediado por el complejo Tim22. Este sistema de importación es diferente al que siguen las proteínas que tienen una MTS, que son internalizadas a través del complejo Tim23 [7].

La expresión alotópica se considera una de las opciones más viables para el tratamiento genético de las enfermedades causadas por mutaciones en el DNAmt, ya que hay técnicas establecidas para introducir material genético en el núcleo celular y la proteína resultante llegaría a todas las mitocondrias presentes en la célula afectada [51]. El gen que se pretende expresar alotópicamente debe ser modificado de tal manera que sea capaz de expresarse desde el núcleo (Figura 2). En primer lugar, se debe tener en cuenta que en los humanos el código genético y el uso de codones mitocondriales son diferentes a los nucleares, por ejemplo, el codón UAG que codifica para triptófano de acuerdo con el código genético mitocondrial es interpretado como un codón de paro por el código genético nuclear. Por lo tanto, el gen mitocondrial debe recodificarse para que su RNA mensajero correspondiente sea traducido

correctamente por los ribosomas citosólicos. Después de ser sintetizada, la proteína debe dirigirse hacia la mitocondria e introducirse al organelo, por lo que tiene que contar con una secuencia señal en el extremo amino (MTS), la cual funciona como un código postal que es reconocido por la maquinaria de importación mitocondrial que internalizará a la proteína. La mayoría de las proteínas mitocondriales codificadas en el núcleo tienen MTSs de 20 a 40 aa que forman una alfa hélice anfipática. Después de que el precursor llega hasta la matriz mitocondrial, la MTS es removida por una proteasa específica, generándose la proteína madura. La expresión alotópica se ha intentado experimentalmente en varios sistemas biológicos, siendo los más importantes la levadura, las plantas y las células de mamífero.

Figura 2. Expresión alotópica. Un gen mitocondrial contiene una mutación (X) que altera a una subunidad participante en la fosforilación oxidativa. La producción de ATP es deficiente. La proteína mitocondrial se expresa alotópicamente desde un gen nuclear y se sintetiza en el citosol con una MTS. La proteína ingresa a la mitocondria, se ensambla en el complejo que le corresponde y se restaura la función mitocondrial. La expresión alotópica en levadura

La primera vez que se reportó una estrategia exitosa para compensar mutaciones en el DNAmt, fue en el trabajo de Banroques y colaboradores [52], quienes expresaron una madurasa de RNA, una proteína soluble que se encuentra en la matriz mitocondrial y que está codificada en un intrón del gen mitocondrial cob. La madurasa procesa al mRNA de la subunidad I de la citocromo c oxidasa (Cox1). Para lograr la importación de la madurasa, ésta se fusionó a la MTS de la subunidad Atp9 de la ATP sintasa de Neurospora crassa. Cuando la proteína se expresó en cepas de S. cerevisiae incapaces de crecer en medios de cultivo respiratorios por contener una ablación en la región del DNAmt que codifica para la




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madurasa, la proteína sintetizada en el citosol fue capaz de complementar y restaurar el fenotipo silvestre a las levaduras mutantes.

El término expresión alotópica, se acuñó al

demostrarse experimentalmente que la subunidad Atp8 (o subunidad A6L, una proteína integral de membrana) de la ATP sintasa fusionada a la MTS de la subunidad Atp9 de N. crassa, podía expresarse desde el citosol [53]. Así, se logró la complementación del metabolismo aeróbico de una cepa de S. cerevisiae que tenía el gen atp8 mitocondrial interrumpido [54]. También se demostró, inmunoprecipitando a la ATP sintasa mitocondrial, que la proteína Atp8 expresada desde el citosol, se había integrado funcionalmente en su complejo mitocondrial [55]. Estos trabajos aportaron evidencia bioquímica y funcional de que la expresión alotópica era factible y con ello sentaron la semilla para el desarrollo eventual de tratamientos para las enfermedades mitocondriales.

También se ha logrado la expresión alotópica

en una cepa de levadura que tenía el gen cox2 mitocondrial interrumpido y que por lo tanto era incapaz de crecer con sustratos respiratorios. Como se muestra en la Figura 3, normalmente la proteína Cox2 está codificada en el DNAmt y se sintetiza en ribosomas mitocondriales, para posteriormente integrarse de manera co-traduccional a la membrana interna mitocondrial. Para lograr su expresión alotópica, la proteína Cox2 se fusionó a la MTS de la proteína Oxa1 (42 aa) y se expresó desde un vector que contenía un promotor fuerte. En los primeros experimentos, después de transformar levaduras, no se pudo observar una recuperación del fenotipo respiratorio. Al llevar a cabo un ciclo de mutagénesis al azar sobre el gen cox2 y transformando de nuevo a las levaduras con los genes cox2 mutantes, se observó que ciertas mutantes recuperaban hasta un 30% de la tasa de consumo de oxígeno con respecto a la de la cepa silvestre. Al secuenciar las proteínas mutantes, se encontró que la substitución de un solo residuo (triptófano 56 por arginina), era suficiente para reducir la hidrofobicidad del primer cruce transmembranal de la proteína Cox2 y permitir su internalización en la mitocondria [56] (ver Figura 4). Trabajos bioquímicos posteriores, demostraron

que la menor tasa respiratoria de las levaduras que expresan alotópicamente al gen cox2 mutante, se debe a que se ensambla únicamente el 60% de la citocromo oxidasa y no el 100% como sucede en la cepa silvestre [57]. La expresión alotópica en plantas

La subunidad 2 de la citocromo c oxidasa (Cox2), generalmente está codificada en el genoma mitocondrial, sin embargo, en las plantas leguminosas puede estar en el genoma mitocondrial, en el genoma nuclear o incluso en ambos genomas, dependiendo de la especie. En el caso particular de la soya, el gen cox2 está en el genoma nuclear, mientras que el genoma mitocondrial posee un remanente del gen cox2 que no se expresa de forma funcional. La proteína Cox2 codificada en el núcleo posee una MTS muy larga, de 136 aminoácidos, que solamente es procesada por las mitocondrias de soya. La versión nuclear de esta proteína tiene 25 aminoácidos diferentes a lo largo de su secuencia con respecto a la versión mitocondrial y algunos de estos residuos disminuyen la hidrofobicidad del primer cruce transmembranal. Se mostró que la MTS de la Cox2 nuclear de soya, era incapaz por si sola de importar in vitro a la versión mitocondrial de Cox2, sin embargo, al sustituir dos aminoácidos hidrofóbicos en el primer cruce transmembranal por otros más hidrofílicos, se logró la importación in vitro de la versión mitocondrial de Cox2 unida a la MTS de la Cox2 nuclear [58].

Otra expresión alotópica exitosa se llevó a

cabo con una mutante de la planta de tabaco Nicotiana sylvestris que mostraba un crecimiento pobre y anormalidades en las hojas y flores. La mutante contenía el gen mitocondrial nad7 interrumpido y era incapaz de sintetizar la subunidad Nad7 correspondiente, por lo que el complejo I mitocondrial no se ensamblaba correctamente. Se logró la expresión alotópica de la proteína Nad7 con la MTS de la enzima formato deshidrogenasa de papa y se observó que las plantas transfectadas recuperaron el fenotipo silvestre. Además, se demostró que el complejo I recuperaba su actividad y que la subunidad Nad7 expresada alotópicamente se encontraba integrada al complejo I mitocondrial [59].




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Figura 3. Biogénesis de la subunidad COX2 codificada en el genoma mitocondrial. El gen cox2 mitocondrial se transcribe y se traduce en la matriz mitocondrial. La cadena naciente se inserta cotraduccionalmente en la membrana interna mitocondrial, en un proceso mediado por la proteína translocadora Oxa1. En el extremo amino de la proteína Cox2 hay un péptido señal que es reconocido por Oxa1 y que permite la translocación de la proteína. La proteasa Imp, situada en el espacio intermembranal, corta a dicho péptido y da lugar a la subunidad Cox2 madura, la cual se ensambla en el complejo IV. El segundo cruce transmembranal de Cox2W56R es insertado por el complejo Cox18 (no mostrado), dejando así a la proteína insertada en la membrana interna con la topología correcta (ambos extremos expuestos hacia el espacio intermembranal). Expresión alotópica en cultivos celulares (células de mamífero)

La expresión alotópica se ha intentado también en varias líneas celulares de mamífero, así como en cíbridos homoplásmicos mutantes en algún gen mitocondrial. Los cíbridos homoplásmicos con mutaciones en el DNAmt que se han usado para evaluar la expresión alotópica de genes mitocondriales humanos. Estos cíbridos son fusiones celulares de una línea celular humana y de fibroblastos de un paciente, de tal manera que se trata de una línea celular inmortalizada que lleva consigo mitocondrias con una mutación determinada. Son homoplásmicos, porque todas las mitocondrias llevan consigo la misma mutación en el gen. Se usaron cíbridos homoplásmicos con la mutación T8993G en el gen mitocondrial atp6, que codifica a la subunidad a (Atp6) de la ATP sintasa (complejo V) [60]. Se expresó alotópicamente una versión nuclear de la subunidad Atp6 mitocondrial silvestre fusionada a la MTS de la subunidad Atp9 y a la MTS de la subunidad Cox18 de la citocromo c oxidasa (61 y

25 aa respectivamente). Las proteínas expresadas alotópicamente, fueron capaces de integrarse en el complejo de la ATP sintasa y de aumentar la capacidad de síntesis de ATP de las células transfectadas. Trabajos posteriores, utilizando los mismos sistemas celulares, pusieron en duda los resultados anteriores, ya que se demostró que la subunidad ATP6 si es capaz de ingresar a la mitocondria, pero que no se ensambla funcionalmente en el complejo de la ATP sintasa [61].

Se ha intentado la expresión alotópica del gen

atp6 tanto en cíbridos como en células CHO [62]. En este caso, se fusionó a la proteína Atp6 a la MTS de 32 aminoácidos de descarboxilasa de ornitina. Además, se utilizó una versión mutante de ATP6, la cual es resistente al inhibidor oligomicina. La proteína resultante se dirige a la mitocondria, ya que las células CHO transfectadas son capaces de resistir concentraciones de oligomicina hasta 1000 veces por arriba de lo que pueden resistir las células no transfectadas. Sin embargo, esta expresión alotópica fue incapaz de




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restaurar la actividad de la ATP sintasa en mitocondrias conteniendo mutaciones en el gen ATP6. Recientemente, se ha utilizado una línea de cíbridos conteniendo una mutación puntual en el gen mitocondrial atp8 que causa que la proteína ATP8 no se exprese y que la subunidad ATP6 se exprese en muy bajas cantidades. En este sistema,

la ATP sintasa (complejo V) no es funcional. Se encontró que la expresión simultánea desde el núcleo de dos genes de la ATP sintasa, atp6 y atp8, llevó a la expresión estable de ambas proteínas Atp8 y Atp6 y también a su integración en el complejo V mitocondrial, restaurándose completamente la función de la ATP sintasa [63].

Figura 4. Biogénesis de la subunidad Cox2W56R expresada alotópicamente. El gen mitocondrial modificado para su expresión desde el núcleo se transcribe y se traduce en ribosomas citosólicos. El precursor Cox2W56R contiene una MTS y también un péptido señal. La proteína es internalizada por el sistema TOM-TIM de tal manera que el primer cruce transmembranal de la proteína es translocado hasta exponerse a la matriz mitocondrial donde la MTS es cortada por la proteasa MPP. Esta translocación probablemente se lleva a cabo muy lentamente y por lo tanto ineficientemente. El segundo cruce transmembranal es liberado lateralmente por el translocador Tim23. Finalmente, el primer cruce transmembranal es translocado por el sistema Oxa1 y el péptido señal es cortado por la proteasa Imp en el espacio intermembranal. Lo anterior da lugar a una menor acumulación de la subunidad Cox2W56R madura (60% con respecto a la cepa silvestre) la cual se ensambla en el complejo IV. De esta manera, la proteína expresada alotópicamente, adquiere finalmente la misma topología que la proteína Cox2 de origen mitocondrial (Figura 3).

También se ha estudiado la expresión alotópica del gen nad4, el cual codifica para la subunidad Nad4 del complejo I mitocondrial [64]. Utilizando cíbridos homoplásmicos con la mutación G11778A, la cual da lugar al cambio de la arginina 340 por histidina. Esta mutación se ha asociado con el 50% de los casos de LHON (Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber) en el mundo [65]. Los pacientes con LHON presentan pérdida de la visión en ambos ojos por atrofia del nervio óptico. Los autores hicieron una construcción que expresaba a la proteína Nad4 mitocondrial fusionada a la MTS (61 aa) de la

subunidad Atp9 y a un epítope FLAG en el extremo carboxilo terminal para su detección con anticuerpos. Mediante microscopía confocal, mostraron que la proteína Nad4 con la MTS de Atp9 se internalizó en la mitocondria y le dio a los cíbridos mutantes la capacidad de crecer en medios respiratorios e incrementar su síntesis de ATP.

Más recientemente, se les administró a ratas

adultas con síndrome mitocondrial un vector viral que contenía el gen Nad4 humano. La presencia de esta proteína humana en el modelo en rata con LHON previno la degeneración de células de la




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retina y preservó la función del complejo I mitocondrial. También se demostró que la proteína humana se importa eficientemente al interior de la mitocondria y que se ensambla en el complejo I. Este ejemplo de expresión alotópica en un modelo de rata, abre las puertas para una eventual aplicación de una terapia génica similar

en pacientes [66]. Actualmente existen estudios clínicos en curso que utilizan la expresión de la proteína Nad4 para tratar la ceguera de pacientes con LHON en China [67], EEUU [68] y Francia [69]. De ser exitosos, estos estudios permitirán hacer realidad la posibilidad de curar algunas enfermedades mitocondriales humanas [70].

Agradecimientos

Se agradece cumplidamente el apoyo otorgado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

(donativos 239219 y 245486) y por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA-UNAM IN 203114) para llevar a cabo los proyectos de investigación de nuestro grupo.

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DR. DIEGO GONZALEZ HALPHEN

Estudió Ingeniería Bioquímica en la Escuela

Nacional de Ciencias Biológicas del IPN y obtuvo la Maestría y el Doctorado en Ciencias (especialidad Bioquímica) en el CINVESTAV del IPN. Llevó a cabo una estancia postdoctoral en la

Universidad de Oregón y una estancia sabática en la Universidad de California (Riverside). Desde 1988 es investigador independiente en el Instituto de Fisiología Celular de la UNAM y actualmente Investigador Titular C del Departamento de Genética Molecular y nivel III del SNI. Su área de especialidad es la bioquímica y la genética molecular de los complejos mitocondriales.

Cuenta con 62 publicaciones en el área de su

especialidad y 2163 citas a sus trabajos. Ha impartido durante los últimos 7 años el curso “Biología estructural de las membranas celulares” en diversos posgrados de la UNAM. Sus colaboradores en la UNAM y coautores de este artículo son la Técnica Académica Titular C Miriam Vázquez Acevedo (Instituto de Fisiología Celular), la estudiante avanzada de doctorado en el Programa de Ciencias Biomédicas Diana Rubalcava Gracia Medrano y el estudiante avanzado de maestría en el Programa de Ciencias Bioquímicas Félix Vega de Luna.

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