MECANISMOS TRANSDUCCIONALES DE INSULINA … · R pathway is required for insulin-stimulated GLUT4...
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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS MECANISMOS TRANSDUCCIONALES DE INSULINA EN EL CARDIOMIOCITO: PAPEL DEL CALCIO EN LA INCORPORACION DE GLUCOSA TESIS ENTREGADA A LA UNIVERSIDAD DE CHILE PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN BIOQUÍMICA POR ARIEL EDUARDO CONTRERAS FERRAT Directores de Tesis Prof. Dr. Sergio Lavandero Prof. Enrique Jaimovich 2010
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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
MECANISMOS TRANSDUCCIONALES DE INSULINA EN
EL CARDIOMIOCITO: PAPEL DEL CALCIO EN LA
INCORPORACION DE GLUCOSA
TESIS ENTREGADA A LA UNIVERSIDAD DE CHILE
PARA OPTAR AL GRADO DE
DOCTOR EN BIOQUÍMICA
POR
ARIEL EDUARDO CONTRERAS FERRAT
Directores de Tesis
Prof. Dr. Sergio Lavandero Prof. Enrique Jaimovich
2010
2
UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE DOCTORADO
Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas que la Tesis de Doctorado presentada por el candidato:
ARIEL EDUARDO CONTRERAS FERRAT
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito para optar al grado de Doctor en Bioquímica, en el examen de defensa de Tesis rendido el día _____________________ Directores de Tesis: Prof. Dr. Sergio Lavandero ___________________________ Prof. Enrique Jaimovich. ___________________________ Comisión Informante de Tesis: Dra. Maria Antonieta Valenzuela (Presidenta) ___________________________ Dra. Cecilia Vergara ___________________________ Dr. Juan Carlos Sáez ___________________________ Dr. Luis Valladares ___________________________
3
¡Oh amigos, dejemos esos tonos!
¡Entonemos cantos más agradables y llenos de alegría!
¡Alegría, hermoso destello de los dioses, hija del Elíseo!
¡Ebrios de entusiasmo entramos, diosa celestial, en tu santuario!
Tu hechizo une de nuevo lo que la acerba costumbre había separado; todos los hombres vuelven a ser hermanos
allí donde tu suave ala se posa.
Aquel que la suerte le ha concedido una amistad verdadera.
quien haya conquistado a una hermosa mujer ¡una su júbilo al nuestro!
Aún aquel que pueda llamar suya siquiera a un alma sobre la tierra.
Más quien ni siquiera esto haya logrado, ¡que se aleje llorando de esta hermandad!
Todos beben de alegría
en el seno de la Naturaleza. Los buenos, los malos,
siguen su camino de rosas. Nos dio besos, vino
y un amigo fiel hasta la muerte; Voluptuosidad le fue concedida al gusano
y al querubín la contemplación de Dios.
Gozosos como vuelan sus soles a través del formidable espacio celeste,
recorred así, amigos, vuestro camino, gozosos como el héroe hacia la victoria.
¡Abrazaos millones de criaturas!
¡Qué un beso una al mundo entero! Amigos, sobre la bóveda estrellada
Debe habitar un Padre amoroso. ¿Os postráis, millones de criaturas?
¿No presientes, oh mundo, a tu Creador? Búscalo más arriba de la bóveda celeste
¡Sobre las estrellas ha de habitar!
Friedrich Schiller / Ludwig van Beethoven, 7 de Mayo de 1824
4
AGRADECIMIENTOS
1. Agradezco a toda mi familia, en especial a mi madre Juany por su incansable y
hermosa labor.
2. Al profesor Sergio Lavandero por su acertada guía y su total confianza.
3. Al profesor Enrique Jaimovich por su incondicional apoyo y claras
observaciones.
4. A la profesora Amira Klip por la generosa ayuda internacional que siempre
brindó a nuestro trabajo.
5. A todo el Laboratorio de Transducción de Señales Moleculares por hacer del
trabajo siempre una experiencia festiva, motivadora y llena de aventuras.
6. A las fuerzas universales que junto a la materia dan origen a las exquisitas
pulsiones vitales.
Esta tesis de doctorado fue realizada en el Laboratorio de Transducción de Señales
Moleculares del Centro FONDAP de Estudios Moleculares de la Célula, Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas,
Universidad de Chile y contó con el financiamiento de los siguientes proyectos:
Proyecto FONDAP 15010006 (a E.J. y S.L.)
Proyecto FONDECYT 1080436 (a S.L.)
Proyecto MECESUP UCH0606 (a S.L.)
Beca CONICYT 2008 – 2009 (a A.C.F)
5
Esta tesis dio origen a las siguientes actividades y material de difusión:
Publicaciones:
Niu W, Bilan PJ, Ishikura S, Schertzer JD, Contreras-Ferrat A, Fu Z, Liu J,
Boguslavsky S, Foley KP, Liu Z, Li J, Chu G, Panakkezhum T, Lopaschuk GD,
Lavandero S, Yao Z, Klip A (2010). Contraction-related stimuli regulate GLUT4
traffic in C2C12-GLUT4myc skeletal muscle cells. Am J Physiol Endocrinol
Metab. 298:E1058-71
Contreras-Ferrat A, Toro B, Bravo R, Parra V, Vásquez C, Ibarra C, Mears D,
Chiong M, Jaimovich E, Klip A, Lavandero S. (2010). An inositol 1,4,5-
triphosphate-IP3R pathway is required for insulin-stimulated GLUT4 translocation
and glucose uptake in cardiomyocytes. Endocrinology (en revision).
Presentaciones a congresos internacionales:
Contreras-Ferrat A, Klip A, Jaimovich E, Lavandero S. PI3K/IP3/Ca2+ in insulin-
dependent glucose uptake in cardiomyocytes. 16th symposium on Ca2+-binding
proteins and Ca2+-function in health and disease, November, 16-20, 2009,
Pucón, Chile. Biol Res 42 (supp. A) pp. R-206.
Niu W, Bilan PJ, Contreras-Ferrat A, Ishikura S, Liu Z, Lavandero S, Klip A.
Carbachol increases cell surface GLUT4myc levels in C2C12 skeletal muscle
myotubes by a signaling mechanism that requires AMPK. FASEB Summer
conference series: AMPK in Sickness and Health from Molecule to Man. August
10-15 2008, Copenhagen, Denmark
Parra V, Contreras-Ferrat A, Morales C, Klip A, Jaimovich E, Lavandero S. The
role of intracellular Ca2+ in the metabolic actions of insulin in cultured
cardiomyocytes. 2009, Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology,
British Columbia, Canada.
6
Contreras-Ferrat A, Klip A, Lavandero S, Jaimovich E. Insulin stimulates
glucose uptake through IP3-dependent intracellular calcium release in rat
neonatal cardiac myocytes; 2008;USA; 52nd Annual Meeting of the Biophysical
Society and 16th IUPAB International Biophysics Congress.
Espinoza A, Ibarra C, Contreras-Ferrat A, Hidalgo C, Lavandero S, Jaimovich
E. Insulin and Insulin-like growth factor 1 elicit calcium release from intracellular
stores in both skeletal and cardiac muscle cells; 2006; España IV IberoAmerican
Congress of Biophysics (IACB); 1000;
Lavandero S, Ibarra C, Muñoz JP, Marambio P, Contreras-Ferrat A, Toro B,
Díaz J, Parra V. Signaling mechanisms of life and death in cardiac myocytes;
2006; CUBA; III International Symposium on Biochemistry and Molecular Biology
Presentaciones a congresos nacionales:
Contreras-Ferrat A, Ibarra C, Jaimovich E, Lavandero S; Insulina aumenta los
niveles de calcio en el cardiomiocito por distintos mecanismos transduccionales;
2006; Chile; XXVIII Congreso Sociedad de Farmacologia de Chile.
Ibarra C, Estrada M, Contreras A, Jaimovich E, Lavandero S; Participación de
fosfolipasas C; y en la regulación del calcio nuclear por IGF-1 en el
cardiomiocito; 2006; CHILE; XXVIII Congreso Sociedad de Farmacologia de
Chile.
Rojas-Rivera D, Díaz-Elizondo J, Parra V, Contreras A, Chiong M, Lavandero S;
Papel del calcio en la regulación de volumen del cardiomiocito frente a estrés
hiposmótico; 2006; Chile; XX Reunión Anual Sociedad de Biología Celular de
Chile.
7
Contreras AE, Klip A, Oyanedel N, Jaimovich E, Lavandero S; Insulina estimula
la incorporación de glucosa por liberación de Ca2+; 2007; Chile, XXI Reunión
Anual, Sociedad de Biología Celular de Chile.
Contreras-Ferrat A, Jaimovich E, Klip A, Lavandero S. Ca2+ media la
incorporación de glucosa estimulada por insulina en cardiomiocytos y
L6GLUT4myc; 2008; CHILE; XXXI Reunión Anual Sociedad de Bioquímica y
Biología Molecular de Chile. 23-26 Septiembre, Termas de Chillán.
Contreras-Ferrat A, Leiva A, Pivet D, Carrillo C, Jaimovich E, Klip A, Lavandero
S. Papel del receptor IP3/Ca2+ en la externalización de GLUT4 en células
musculares estimuladas por insulina; 2009; CHILE; XXII Reunión Anual
Sociedad de Biología Celular de Chile; 1-5 de Noviembre.
Pasantías en laboratorios internacionales:
Laboratorio de la Dra. Amira Klip, Cell Biology program, The Hospital for Sick
Children and University of Toronto, Toronto, ON, Canada. The Canadian Bureau
for International Education, on behalf of the Department of Foreign Affaire and
International Trade Canada (DFAIT). Colaboración entre Universidad de Toronto
(Research Institute, The Hospital for Sick Children) y la Universidad de Chile
(Laboratorio de Transducción de Señales). www.scholarships.gc.ca/gsep-
en.html. Marzo - Septiembre, 2008.
Laboratorio del Dr. E. Dale Abel, Program in Molecular Medicine, Division of
Endocrinology, Metabolism and Diabetes, University of Utah, School of Medicine,
UT, USA. Beca Mecesup, programa de Doctorado en Bioquímica, Universidad
de Chile. Febrero – Abril, 2010.
8
Laboratorio del Dr. Joseph Hill, Cardiology division, Department of Internal
Medicine, University of Texas, Southwestern Medical Center. Dallas, TX, USA.
Abril, 2010.
9
1 ÍNDICE GENERAL
1 ÍNDICE GENERAL .................................................................................................... 9
2 ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................. 12
3 RESUMEN .............................................................................................................. 15
4 ABSTRACT ............................................................................................................. 17
5 ABREVIATURAS ..................................................................................................... 18
6 INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 20
6.1 Insulina ............................................................................................................. 20
6.2 Receptor de insulina y su sistema de transducción ........................................... 20
6.3 Acción de insulina en el corazón de mamíferos ................................................ 24
6.4 Ca2+ un segundo mensajero con acciones pleiotrópicas en el cardiomiocito ..... 26
6.5 Diabetes ........................................................................................................... 30
6.6 Regulación del transporte de glucosa inducido por insulina .............................. 31
6.7 Participación de la vía dependiente e independiente de IRS en la regulación de
GLUT4 ....................................................................................................................... 34
7 HIPÓTESIS ............................................................................................................. 37
8 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................. 37
9 OBJETIVOS ESPECIFICOS ................................................................................... 37
10 MATERIALES Y METODOS ................................................................................... 38
10.1 Reactivos ........................................................................................................ 38
10.2 Cardiomiocitos neonatos ................................................................................. 38
10
10.3 Obtención de extractos proteicos de células ................................................... 39
10.4 Determinación de proteínas ............................................................................ 39
10.4.1 Método de Lowry ...................................................................................... 39
10.4.2 Método de Bradford .................................................................................. 40
10.5 Medición de los niveles intracelulares de Ca2+ ................................................ 40
10.6 Determinaciones del potencial de membrana ................................................. 41
10.7 Análisis de Western blot .................................................................................. 41
10.8 Transfecciones................................................................................................ 42
10.9 Inmunofluorescencia indirecta (IF) .................................................................. 42
10.10 Captación de glucosa.................................................................................... 43
10.11 Transducción de cardiomiocitos .................................................................... 44
10.12 Expresión de resultados y análisis estadístico .............................................. 44
11 RESULTADOS ........................................................................................................ 45
11.1 Caracterización del receptor de insulina en los cardiomiocitos ........................ 45
11.2 Insulina induce un incremento bifásico de los niveles [Ca2+]i en cardiomiocitos
de rata neonata ......................................................................................................... 50
11.3 La primera fase del incremento del [Ca2+]i depende del influjo de Ca2+ a través
del canal de Ca2+ tipo L sensible a voltaje y del canal de Ca2+ receptor de ryanodina 55
11.4 La segunda fase de aumento del [Ca2+]i inducido por insulina es mediado por la
liberación de Ca2+ desde canales IP3R. ..................................................................... 59
11.5 La segunda fase de aumento del [Ca2+]i inducida por insulina depende de la vía
de señalización proteína G heterotrimérica, fosfolipasa C y PI3K .............................. 62
11.6 La liberación de Ca2+ dependiente de IP3 se requiere para la captación de
glucosa y translocación de GLUT4 a la membrana plasmática en cardiomiocitos de
rata 68
11
12 DISCUSION ............................................................................................................ 85
12.1 Insulina y la regulación del Ca2+ citoplasmático en el cardiomiocito ............... 86
12.2 Participación de G y PI3K en la acción de insulina en cardiomiocito ........... 87
12.3 Participación de la liberación de Ca2+ vía IP3R en el transporte de glucosa
inducido por insulina y translocación de GLUT4 ........................................................ 88
13 CONCLUSIONES .................................................................................................... 93
14 REFERENCIAS ....................................................................................................... 95
12
2 ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Nodos criticos en la red de señalización de insulina. ...................................... 23
Figura 2. Sistemas de señalización im plicados en la regulación del Ca2+. .................... 28
Figura 3. Regulación del tráfico del GLUT4. .................................................................. 36
Figura 4. Inmunofluorescencia indirecta para el receptor de insulina en cardiomiocitos
de rata neonata. ............................................................................................................ 46
Figura 5. Inmunofluorescencia indirecta para GLUT4 en cardiomiocitos neonatos. ....... 47
Figura 6. Insulina estimula la fosforilación de Akt, PLC y ERK1/2 en cardiomiocitos
neonatos mantenidos en medio libre de Ca2+. ............................................................... 49
Figura 7. Movimientos basales de [Ca2+]i en cardiomiocitos neonatos mantenidos en
medio con Ca2+ y libre de Ca2+ extracelular. .................................................................. 50
Figura 8. Insulina aumenta los niveles intracelulares de Ca2+ en cardiomiocitos
mantenidos en medio con y sin Ca2+ de manera dependiente de la concentración. ...... 52
Figura 9. Insulina induce aumentos del [Ca2+]i dependiente de reservorios intracelulares
de Ca2+ y de activación de su receptor. ......................................................................... 54
Figura 10. Efecto de nifedipino en el aumento del [Ca2+]i inducido por insulina. ............ 55
Figura 11. Efecto de ryanodina en el aumento del [Ca2+]i inducido por insulina. ............ 57
Figura 12. Efecto de insulina en el potencial de membrana citoplasmática de
cardiomiocitos neonatos. ............................................................................................... 58
Figura 13. Disminunción de la masa del IP3R tipo 2 por siRNA en cardiomiocitos. ........ 58
Figura 14. Papel del IP3R en el aumento de [Ca2+]i inducido por insulina. ..................... 61
Figura 15. Participación de proteína G heterotrimérica en la señalización del receptor de
insulina. ......................................................................................................................... 63
Figura 16. Papel de PLC y PI3K en el aumento de [Ca2+]i inducido por insulina. ............ 64
13
Figura 17. Participación del sistema transduccional G/PI3K/PLC/IP3R/ en el aumento
del [Ca2+]i inducido por insulina en cardiomiocitos mantenidos en medio con Ca2+........ 66
Figura 18. Efecto de KCl en los cardiomiocitos preincubados con inhibidores del
aumento de [Ca2+]i dependiente de insulina. ................................................................. 66
Figura 19. Efecto de insulina en la captación de glucosa en cardiomiocitos de rata
neonata. ........................................................................................................................ 69
Figura 20. Efecto de nifedipino y ryanodina en el aumento de la captación de glucosa
dependiente de insulina en los cardiomiocitos neonatos. .............................................. 70
Figura 21. La captación de glucosa inducida por insulina es dependiente del [Ca2+]i, de
la activación de G/PLC/IP3R en cardiomiocitos. ......................................................... 71
Figura 22. Participación del IP3R tipo 2, PI3K y Akt en la captación de glucosa inducida
por insulina en cardiomiocitos neonatos. ....................................................................... 72
Figura 23. Efecto de la vía G/PI3K/PLC/IP3R en la captación de glucosa inducida por
insulina en cardiomiocitos mantenidos en medio con Ca2+. ........................................... 74
Figura 24. Efecto del aumento de [Ca2+]i inducido por insulina en la activación de Akt. . 75
Figura 25. Efecto de insulina sobre la exposición del epitope myc en cardiomiocitos
neonatos que expresan GLUT4-myce-GFP. ................................................................. 77
Figura 26. El aumento en la exposición de GLUT4 en la superficie celular depende del
[Ca2+]i, Akt e IP3R. ......................................................................................................... 79
Figura 27. Efecto del siRNA para el IP3R tipo 2 en la exposición del GLUT4 en superficie
celular inducida por insulina. ......................................................................................... 80
Figura 28. Efecto diferencial de xestospongina sobre el aumento de la exposición de
GLUT4 en la superficie celular inducida por IGF-1 y 2,4-DNP. ...................................... 81
Figura 29. Papel de PI3K en la externalización de GLUT4 inducida por insulina. ......... 83
Figura 30. Modelo propuesto. ........................................................................................ 84
14
15
3 RESUMEN
Tanto los niveles intracelulares de Ca2+ ([Ca2+]i) como el transporte de la glucosa son
fundamentales para la fisiología del cardiomiocito, sin embargo, aún no se ha
investigado la interrelación entre ambos eventos.
En esta tesis se investigó si insulina regula los niveles [Ca2+]i en el cardiomiocito, el
mecanismo que participa y su papel en el transporte de glucosa vía GLUT4. Con este
objetivo, cultivos primarios de cardiomiocitos de rata se preincubaron con la sonda
fluorescente para Ca2+ FLUO3-AM y se visualizaron los cambios en los niveles de Ca2+
por microscopia confocal. Las vías transduccionales que regulan los movimientos
intracelulares de Ca2+ se intervinieron selectivamente con inhibidores químicos y
herramientas genéticas. La captación de glucosa se evaluó utilizando [3H]-2-
desoxiglucosa y los niveles de GLUT4 en la superficie celular se cuantificaron en
cardiomiocitos no-permeabilizados transfectados con el plasmidio GLUT4-myc-eGFP.
Los resultados mostraron que insulina indujo un rápido y transitorio aumento del [Ca2+]i
en dos componentes. Los bloqueadores del canal L de Ca2+ nifedipino y del
canal/receptor intracelular ryanodina sólo previnieron el primer componente
componente. el segundo componente se redujo con: a) inhibidores selectivos del
receptor de inositol-1,4,5-trifosfato: xestospongina C y 2 amino-etoxidifenilborato
(2APB), b) disminución de la masa del receptor de IP3 vía siRNA y c) por transducción
de un péptido inhibidor de señalización de las subunidades β de la proteína G (βark).
La captación de glucosa inducida por insulina fue prevenida por el quelante del Ca2+
intracelular BAPTA-AM, 2 APB y βark, pero no por nifedipino ni ryanodina. De manera
16
similar, la exposición del GLUT4-myc-eGFP en la membrana celular inducida por
insulina fue inhibida por BAPTA-AM y xestospongina C, pero no por nifedipino. Sin
embargo, este proceso también requirió la activación de PI3K y Akt para la segunda
fase de liberación del [Ca2+]i y para la translocación del GLUT4. La transfección de un
dominante negativo de PI3K inhibió parcialmente la exposición de GLUT4-myc-eGFP.
En conclusión, insulina aumentó los niveles de [Ca2+]i vía IP3R en cultivos primarios de
cardiomiocitos, regulando la captación de glucosa vía GLUT4. Esta nueva vía de
señalización de insulina podría influenciar al metabolismo cardiaco en el miocardio
adulto y estar modificada en condiciones metabólicas como son la obesidad, resistencia
a insulina y diabetes.
17
4 ABSTRACT
Intracellular calcium levels ([Ca2+]i) and glucose uptake are central to cardiomyocyte
physiology, yet connections between them have not been studied. We investigated here
whether insulin regulates [Ca2+]i in cultured cardiomyocytes, the participating
mechanisms, and their influence on glucose uptake via glucose transporter 4 (GLUT4).
Cultured neonatal rat cardiomyocytes were preloaded with the Ca2+ fluorescent dye
FLUO3-AM and visualized by confocal microscopy. Ca2+ transport pathways were
selectively targeted by chemical and molecular inhibition. Glucose uptake was assessed
using [3H]2-deoxyglucose and surface GLUT4 levels were quantified in non-
permeabilized cardiomyocytes transfected with GLUT4-myc-eGFP.
Insulin stimulated a fast, two-component, transient increase in [Ca2+]i. Nifedipine and
ryanodine prevented only the first component. The second one was reduced by inositol-
1,4,5-trisphosphate (IP3)-receptor selective inhibitors (xestospongin C, 2 amino-
ethoxydiphenylborate), by type 2 IP3-receptor knockdown via siRNA, or by transfected
G peptidic inhibitor ARKct. Insulin-stimulated glucose uptake was prevented by
BAPTA-AM, 2-amino-ethoxydiphenylborate and ARK-ct, but not by nifedipine or
ryanodine. Similarly, insulin-dependent exofacial exposure of GLUT4-myc-eGFP was
inhibited by BAPTA-AM and xestospongin C but not by nifedipine. Phosphatidylinositol
3-kinase (PI3K) and Akt were also required for the second phase of Ca2+-release and
GLUT4 translocation. Transfected dominant-negative PI3K inhibited the latter.
In conclusion, in primary neonatal cardiomyocytes, insulin induces an important
component of Ca2+ release via IP3-receptor. This component signals to glucose uptake
via GLUT4, revealing a so far unrealized contribution of IP3-sensitive Ca2+ stores to
insulin action. This pathway may influence cardiac metabolism in conditions yet to be
explored in adult myocardium.
18
5 ABREVIATURAS
A260 = Absorbancia a 260 nm
Adβark-ct = Adenovirus que expresa carboxilo terminal del péptido βark
AdGFP = Adenovirus que expresa GFP
AdLacZ = Adenovirus que expresa -galactosidasa
AdVacío = Adenaovirus vacío
ADP = Adenosina bifosfato
AS160 = Sustrato de Akt de 160 kilo Dalton
ATP = Adenosina trifosfato
-MHC = Cadena pesada de la -miosina
BSA = Seroalbúmina de bovino
[Ca2+]i = Calcio intracelular
CCTL = Canal de Ca2+ tipo L sensible a voltaje
CICR = Liberación de Ca2+ inducido por Ca2+
Cr = Creatina
DMEM = Medio Dulbecco modificado de Eagle
DNA = Ácido desoxirribonucléico
DNP = 2,4-dinitrofenol
DTT = Ditiotreitol
EDTA = Ácido etilendiaminotetraacético
EGTA = Ácido etilén glicol-bis(2-aminoetileter)-N,N,N’,N’-tetraacético
FBS = Suero fetal bovino
FITC = Fluoresceína isotiocianato
g = Gramo
GFP = Proteína fluorescente verde
GSV = Vesícula almacenadora de GLUT4
h = Hora
HEPES = Ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N’-(2-etanosulfónico)
IAM = Infarto agudo al miocardio
IGF-1 = Factor de crecimiento análogo a insulina
IP3 = inositol-1,4,5-trifosfato
IP3R = Receptor de IP3
19
IRS = Primer sustrato del receptor de insulina
kDa = Kilo dalton
mA = Miliamperes
MOI = Multiplicidad de infección
mg = Milígramo
µg = Microgramo
min = Minuto
mL = Mililitro
µL = Microlitro
mRNA = RNA mensajero
NADH = Nicotinamida adenina dinucleótido reducido
NES = Señal de exportación nuclear
NFAT = Factor nuclear de células T activadas
NLS = Secuencia de localización nuclear
PBS = Amortiguador fosfato salino
PCr = Fosfocreatina
PIP2 = Fosfatidil inositol difosfato
PIP3 = Fosfatidil inositol trifosfato
PKA = Proteína kinasa A
PMSF = Fenilmetanosulfonil fluoruro
PTPs = Proteínas tirosina fosfatasas
PTX = Toxina pertussis
RHR = Región de homología a Rel
RNA = Ácido ribonucleico
ROI = Región óptica de interés
rpm = Revoluciones por minuto
RyR = Receptor de ryanodina
SDS = Dodecil sulfato de sodio
siRNA = RNA interferente pequeño
SEM = Error estándar de la media
TfR = Receptor de transferrina
V = Volt
VAMP = Proteína asociada a la membrana de vesículas.
20
6 INTRODUCCIÓN
6.1 Insulina
La Insulina es una hormona peptídica sintetizada por las células beta del
páncreas endocrino y secretada a la circulación en respuesta a aumentos en los niveles
de glucosa circulante a través de un mecanismo que involucra el transportador de
glucosa (GLUT-2), razón ATP/ADP, K+, Ca2+, entre otros (1). El mRNA de insulina se
traduce en el retículo endoplasmático de las células del páncreas como pre-
proinsulina y durante su transito por el aparato de Golgi se procesa en su extremo
amino-terminal, generando proinsulina. En las vesículas de secreción se almacena
insulina y péptido C en cantidades equimolares. La insulina biológicamente activa
consta de dos cadenas peptídicas unidas por tres puentes disúlfuro. Las cadenas A y B,
de 21 y 30 residuos de aminoácidos, respectivamente, están unidas por dos puentes
disúlfuro. También hay un puente disúlfuro entre las cisteinas 6 y 11 de la cadena A,
formando una estructura final de 51 aminoácidos con una masa molecular de
5,8 kDa (2). La concentración de insulina en el plasma varía entre 0,01 y 12 nM,
dependiendo si la determinación se efectúa antes o después de la ingesta de alimentos.
La insulina tiene una vida media de 5 min, lo que permite un efectivo control de su
concentración plasmática regulando finamente su bioactividad en diferentes tejidos y
tipos celulares (3).
6.2 Receptor de insulina y su sistema de transducción
El receptor de insulina (RI) pertenece a la superfamilia de receptores de
transmembrana con actividad tirosina kinasa intrínseca. A diferencia de los otros
21
integrantes monoméricos de esta familia, el receptor de insulina es un heterodímero de
la forma ()2, unido por puentes disúlfuro. La subunidad , de 135 kDa, está orientada
hacia el espacio extracelular y está encargada de censar los niveles circulantes de
insulina. En cambio la subunidad , de 95 kDa, contiene una porción extracelular, una
región de transmembrana y un dominio intracelular con actividad tirosina kinasa (4). La
unión de insulina a su receptor induce un cambio conformacional de la proteína que
permite la transfosforilación de las subunidades , proporcionándoles la actividad
tirosina kinasa intrínseca y produciendo finalmente la activación de su cascada de
transducción de señales. Poco se conoce acerca de las modificaciones post-
traduccionales que presenta el receptor de insulina, aunque evidencias en adipocitos
3T3-L1 y otros tipos celulares han descrito que la N-glicosilación del receptor depende
de la concentración de glucosa externa y que los diferentes niveles de glicosilaciones
del receptor serían importantes para la interacción con insulina y para su
bioactividad (5).
Los efectos de insulina en las células blanco están mediados por una compleja y
altamente integrada red de transducción de señales que controla diversos procesos
celulares. El RI activado fosforila a los sustratos 1,2,3 y 4 del receptor de insulina
(IRS-1, -2, -3 y -4), una proteína adaptadora asociada a la activación de dos principales
vías transduccionales: la fosfatidilinositol 3-kinasa (PI3K) clase I/proteína kinasa B (PKB,
también conocida con la sigla Akt) y la cascada Ras-Raf-MEK-ERK. Ambas vías son
responsables de las acciones metabólicas de insulina, regulando la expresión de genes
relacionados al metabolismo, crecimiento y diferenciación celular (6). Se han
desarrollado modelos de nodos de transducción que han ayudado a entender las
múltiples y complejas interacciones de insulina en los diferentes sistemas. Un nodo
22
crítico es un punto en una red de transducción de señales que es esencial para la
función biológica gatillada por la interacción ligando-receptor, la cual ofrece divergencias
para el entrecruzamiento de rutas y permite controlar finamente la respuesta obtenida.
Para el receptor de insulina se han descrito tres nodos críticos en su sistema
transduccional; las proteínas IRS, PI3K y PKB (Figura 1) (7). El primer nodo de
transducción (IRSs) es activado fundamentalmente por el propio RI, desencadenando la
unión y activación de efectores proteicos río abajo. Mas aún, tanto el RI como IRS-1
comparten el mismo mecanismo de regulación: son activados por fosforilación en
residuos de tirosina y son regulados negativamente por proteínas tirosina fosfatasas
(PTPs) y por fosforilación en residuos de serina (8, 9). La PI3K es la enzima
constituyente del segundo nodo crítico. Ella está formada por dos subunidades, una
regulatoria y otra catalítica, cada una de las cuales presenta distintas isoformas (9). La
activación de la subunidad catalítica depende de la interacción de dos dominios SH2 de
la subunidad regulatoria con dos motivos específicos tipo fosfotirosina de la proteína
IRS. De esta manera la proteína activa cataliza la formación de fosfoinositido 3-fosfato
(PIP3), a partir de fosfoinositido 2-fosfato. Así, proteínas que contengan dominios de
homología tipo pleckstrina (PH), aumentarán su probabilidad de interacción con la
superficie interna de la membrana plasmática para desencadenar su acción (10). El
último nodo crítico de transducción descrito para la acción de insulina es PKB, una
proteína serina/treonina kinasa ubicada río abajo de PI3K. Esta enzima media varias de
las acciones metabólicas de insulina a través de la fosforilación de un amplio rango de
sustratos incluyendo, otras proteínas kinasas, proteínas de señalización y factores
transcripcionales (11). El último nodo crítico de transducción descrito para la acción de
insulina es Akt. Esta kinasa media varias de las acciones metabólicas de insulina a
través de la fosforilación de un amplio rango de sustratos incluyendo, otras proteínas
23
kinasas, proteínas de señalización y factores transcripcionales (11). Los sistemas de
señalización IR/IRS, PI3K y Akt son llamados nodos críticos porque existen sólidas
evidencias in vivo e in vitro que los vinculan con los principales efectos de insulina en
una amplia variedad de modelos (7). Sin embargo, esto no descarta que, en
determinados casos, otras proteínas transduccionales reguladas por insulina puedan
también actuar como nodos críticos, como ocurre por ejemplo con las familias de las
PKCs, Rho GTPasa, Ras, p38-MAPK, entre otras (12).
Figura 1. Nodos criticos en la red de señalización de insulina. Los nodos críticos forman una importante parte de la red de señalización rio abajo del
receptor de insulina. Las rutas de señalización activadas por citokinas interfieren con la
señalización de insulina (flechas naranjas). Los tres nodos criticos en la transducción de
insulina son IRS1-4 (cajas azules), PI3K (cajas verdes) y Akt (cajas rosadas). Efectores
intermediarios, asi como moduladores de los nodos mensionados, se muestran
relacionados con sus efectos finales. Figura extraída de Tanigucci et al. (2006). (7)
24
6.3 Acción de insulina en el corazón de mamíferos
Las patologías cardiovasculares representan la principal causa de mortalidad y
morbilidad en nuestro país, por esta razón existe gran interés en investigarlas, a fin de
conocer sus mecanismos fisiopatológicos y encontrar nuevos y mejores blancos
terapéuticos.
El corazón está formado principalmente por dos tipos celulares estrechamente
vinculados. Los cardiomiocitos dan cuenta de la función contráctil de este órgano y
corresponden al 33% del número total de células mientras que los fibroblastos cardiacos
actúan modelando la matriz extracelular (MEC) cardiaca y dan cuenta del 66% restante
del número de células (13). Los cardiomiocitos son células altamente especializadas
que inmediatamente después del nacimiento cesan de dividirse y experimentan una
diferenciación acelerada que concluye en aproximadamente 10 días (14). Los
fibroblastos tienen la capacidad de proliferar en respuesta a estímulos tróficos,
mecánicos y de estrés tisular y sintetizan los componentes de la MEC tales como
colágeno, fibronectinas y laminina entre otros (15).
Los principales órganos blancos de acción de la insulina en mamíferos son el
músculo esquelético, tejido adiposo y el hígado, sitios donde se regula el metabolismo
intermediario para la mantención de la homeostasis sistémica. Sin embargo hay otros
tejidos, incluyendo el corazón, que expresan el RI (16). Considerando la importancia de
insulina en sus principales tejidos blancos, y la gran cantidad de investigaciones en
torno a estos modelos celulares, es necesario conocer las acciones de insulina en el
corazón, la musculatura lisa vascular y el sistema nervioso central, para llegar a obtener
un mayor y mejor conocimiento de su señalización en estos sistemas. Mas aún, el
25
receptor de insulina se ha logrado detectar en una amplia gama de células
especializadas en donde su rol aún no está del todo claro (17). Debido a que el corazón
es una bomba que está en constante funcionamiento, posee una gran demanda
energética de ácidos grasos y glucosa, presenta una cantidad importante de
mitocondrias que efectúan el metabolismo oxidativo aeróbico y que movilizan al Ca2+
constantemente para su actividad contráctil, se requiere determinar con exactitud el rol
de insulina en el cardiomiocito.
La insulina permite el ingreso indirecto de sustratos metabólicos al corazón, los
que juegan un importante papel en el balance energético de los cardiomiocitos, a través
de su acción en el tejido adiposo, músculo esquelético y tejido hepático (18). Por otro
lado, algunos de los efectos directos de insulina sobre el corazón son: transporte de
glucosa a través del transportador para glucosa GLUT4, metabolismo del glicógeno,
oxidación del piruvato, regulación de glicólisis, metabolismo de ácidos grasos y
regulación de la expresión de proteínas del miocardio (18). Se ha descrito que insulina
aumenta la expresión de GLUT1 y 4, 6-fosfofructokinasa-1 (PFK1), 6-fosfofructokinasa-
2 (PFK2), glicógeno sintasa y piruvato deshidrogenada, pero disminuye la de glicógeno
fosfatasa y lipasas sensibles a hormonas (18). Sin embargo, insulina también posee
otros efectos indirectos como es la regulación de la perfusión cardiaca a través del
aumento de la producción de óxido nítrico en el endotelio vascular (19, 20). Ratones
knockout para el RI en cardiomiocitos presentan una notable disminución del tamaño
del corazón con persistencia de patrones de expresión génica fetal y alteraciones
metabólicas tales como incremento de la glicólisis y disminución en la oxidación de
ácidos grasos, condición característica de corazones inmaduros (21).
26
Las lteraciones en la disponibilidad de insulina o en su ruta de señalización
activan una serie procesos fisiopatológicos, incluyendo cambios en la función
metabólica asociados a resistencia a la insulina, obesidad, hipertensión arterial,
hipertrofia cardiaca así como cardiomiopatías en diabetes tipos I y II (22). La captación
basal de glucosa aumenta en los corazones de pacientes hipertensos y en animales con
hipertrofia cardiaca. Sin embargo, la captación de glucosa en respuesta a insulina
disminuye en corazones hipertrofiados de ratas espontáneamente hipertensas (23).
Estos datos indican que la captación de glucosa basal o independiente a la insulina está
acelerada, posiblemente en forma compensatoria y que la captación de glucosa
dependiente de insulina está afectada en corazones expuestos a sobrecarga de
presión, deteriorando el normal funcionamiento metabólico dependiente de glucosa (24).
Por otra parte, modelos experimentales de resistencia a la insulina presentan un
patrón de fosforilación alterado de IRS-1, potenciando la fosforilación en residuos de
serina por sobre la fosforilación en residuos de tirosina, lo que funciona como un
verdadero interruptor que apaga la señal transduccional dependiente del receptor de
insulina y de la activación de sus blancos moleculares río abajo (25).
6.4 Ca2+ un segundo mensajero con acciones pleiotrópicas en el cardiomiocito
El Ca2+ es un mensajero intracelular altamente versátil que opera en amplios
rangos temporales, regulando diferentes procesos celulares (26). Liberaciones rápidas
de Ca2+ regulan procesos relacionados con respuestas puntuales y focalizadas (s-s),
mientras que las respuestas a largo plazo son controladas por liberaciones transitorias y
repetitivas del Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) a lo largo del tiempo (min-hrs), describiendo
27
pulsos tipo “código” según la frecuencia y amplitud de la señal (27). Los cardiomiocitos
cumplen un papel activo en la función cardiaca pues son las células encargadas de la
contracción del tejido que le permiten bombear la sangre hacia todo el organismo,
siendo este proceso dependiente del Ca2+. Sin embargo, el [Ca2+i también regula
procesos celulares rápidos como exocitosis de neurotransmisores, contracción muscular
y la transducción de señales, además de procesos lentos como la expresión génica o la
síntesis proteica, hipertrofia y desarrollo tisular (26).
El acoplamiento excitación-contracción cardiaco es el proceso que relaciona la
excitación eléctrica del cardiomiocito, determinada por despolarización de la membrana
del túbulo T, con la contracción muscular mediada por las proteínas contráctiles actina y
miosina. El Ca2+
es el encargado de iniciar, mantener y regular ambos procesos (28).
Durante la despolarización del túbulo T, los cambios del potencial de membrana en los
cardiomiocitos son sensados por los canales de Ca2+
dependientes de voltaje tipo L,
sensibles a dihidropiridinas (DHPR). Con la despolarización, los canales de Ca2+
tipo L
se abren permitiendo la entrada de Ca2+
a la célula. El Ca2+
que entra actúa como
agonista sobre los canales de Ca2+ sensibles a ryanodina (RyR) ubicados en la
membrana del retículo sarcoplásmico. La activación de los RyR gatilla su apertura,
permitiendo que el Ca2+ almacenado en el retículo sarcoplásmico salga hacia el
citoplasma, este proceso se conoce como liberación de Ca2+ inducida por calcio (CIRC,
del inglés: calcium-induced calcium release) (29). El Ca2+ liberado puede activar a otro
RyR, aumentando la concentración intracelular de Ca2+, de tal forma que pueda unirse a
la troponina C. Esta proteína inhibe la interacción entre actina y miosina en un medio
con poco Ca2+, pero esta inhibición cesa en condiciones de altos niveles de calcio y la
actina se combina con la miosina, utilizando ATP mediante una ATPasa dependiente de
28
Ca2+. La energía liberada por este proceso es transformada en trabajo mecánico, que
resulta en el acortamiento de las miofobrillas y la contracción cardiaca (30).
Figura 2. Sistemas de señalización im plicados en la regulación del Ca2+.
Varios segundos mensajeros o moduladores de señalización puedes producir liberación
de Ca2+ desde reservorios intracelulares dependientes del deceptor de inositol 1,4,5-
trifosfato (IP3R) o del receptor de ryanodina (RyR), ambos canales de Ca2+ de la
membrana del reticulo sarco-endoplasmático. La generación del inositol 1,4,5-trifosfato
se origina a través de diferentes isoformas de fosfolipasa C (PLC) activada por
diferentes agonistas tal como se indica en la figura. Un influjo de Ca2+ desde el
extracelular, activa y produce la apertura del RyR, el que a su vez libera Ca2+
relacionado con el proceso de excitación–contracción muscular. Otros componentes
moleculares como ADP ribosa ciclica o nicotinamin-adenin dinucleótido fosfato pueden
modular la liberación de Ca2+, actuando sobre la bomba Ca2+-ATPasa del reticulo
sarcoendoplasmático (SRCA) u otros canales de sistemas membranosos intracelulares.
Adaptado de Berridge (2003). (26)
29
Hace aproximadamente 25 años atrás se vinculó por primera vez defectos en la
contractibilidad cardiaca y animales diabéticos libres de injurias vasculares. En este
sentido, los estudios de Sonnenblinck et al. fueron claves para lograr describir
anormalidades en la función contráctil presentes en animales diabéticos (31). Este
trabajo fue pionero en proveer un sólido marco de estudio racional para un largo número
de publicaciones posteriores que secuencialmente fueron confirmando la estrecha
relación entre déficit de insulina y un deficiente funcionamiento cardiaco. Se ha
relacionado al Ca2+ participante en la función contráctil con la diabetes
farmacológicamente inducida, así como también alteraciones de las rutas de transporte
de Ca2+ en cardiomiopatía diabética y señalización mediada por calcio (32). Sin
embargo, no se conoce una relación entre insulina y Ca2+ en cardiomiocitos ni
tampoco los mecanismos de transducción de señales implicados.
La utilización de sondas fluorescentes indicadoras de Ca2+ en cardiomiocitos
aislados han provisto valiosa información acerca de mecanismos moleculares
implicados en el proceso contráctil. Usando estas herramientas experimentales se ha
observado que la contracción del cardiomiocito está deteriorada en corazones
diabéticos (33). El acortamiento celular durante la contracción, la velocidad de
contracción (-dL/dt) y la velocidad de relajación en la contracción (+dL/dt) son más bajas
en cardiomiocitos provenientes de corazones diabéticos, mientras que el tiempo que
tardan en alcanzar el máximo de contracción está significativamente aumentado (34).
Finalmente, las corrientes de Ca2+ y K+, la actividad de la bomba intercambiadora de
Na+/Ca2+, SERCA y la función mitocondrial, también están afectadas en cardiomiocitos
provenientes de corazones diabéticos (35). En resumen, varios estudios muestran que
la función de los principales organelos que manejan Ca2+ están disminuidas en
30
cardiomiocitos de corazones diabéticos, lo que causaría alteraciones en la movilización
del [Ca2+]i y disfunción en los sistemas de señalización dependientes de [Ca2+]i.
Diferentes sistemas de segundos mensajeros involucrados en el acoplamiento
excitación-contracción también podrían estar alterados, generando deterioro metabólico.
6.5 Diabetes
Según estadísticas epidemiológicas, la obesidad y los trastornos metabólicos
asociados se han incrementado drásticamente en las décadas recientes, constituyendo
una seria amenaza para la salud pública y para el futuro de la población mundial. La
Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que más de 10 mil millones de adultos
se encuentran actualmente con sobrepeso, siendo 300 millones de ellos francamente
obesos. Las proyecciones en relación a la prevalencia global de diabetes tipo 2, indican
que se alcanzarán los 300 millones de casos en el año 2025 (36).
La diabetes tipo 2 es producto de un defecto en la sensibilidad que presentan los
tejidos a insulina y que posteriormente genera un deterioro en su secreción. Insulina
mantiene la homeostasis de la glucosa aumentando la captación de azúcar en las
células musculares y los adipocitos, proceso que está drásticamente disminuido en
pacientes diabéticos. La glucosa es la molécula que proporciona la energía necesaria
para la vida en todas las células eucarióticas conocidas. En humanos, el principal
consumidor de glucosa en condiciones basales es el cerebro, acaparando el 80% de su
metabolismo, sin embargo, en condiciones de actividad física promedio, el músculo
esquelético utiliza el 50% del consumo total de glucosa. El azúcar ingresa a las diversas
células a través de ciertas proteínas de transmembranas denominadas transportadores
31
de glucosa (GLUTs), que pertenecen a una familia de proteínas de 12 dominios de
transmembrana y contiene 13 miembros conocidos que pueden dividirse en 3 grupos
según sus características estructurales (37).
6.6 Regulación del transporte de glucosa inducido por insulina
Los GLUTs actúan como transportadores que movilizan glucosa a favor de la
gradiente quimica a través de la membrana plasmática. En mamíferos, estos
transportadores facilitativos se diferencian por su distribución tisular, propiedades
cinéticas y por su localización intracelular (38, 39). Muchos tejidos, como por ejemplo el
cerebro, tienen un requerimiento constitutivamente alto de glucosa y evolutivamente han
sido provistos de transportadores que se expresan continuamente en la superficie
celular (como los GLUT1 y GLUT3). Al contrario, ciertos tejidos, como músculos y
adipocitos, han adquirido una alta especialización en relación a los sistemas de
transporte de glucosa, pudiendo regular muy rápidamente la velocidad del transporte
entre 10 y 40 veces por minuto en respuesta a la exposición de ciertos estímulos (40).
Este mecanismo es indispensable en el ejercicio, ya que la demanda metabólica del
músculo esquelético puede incrementarse más de 100 veces y es fundamental durante
los períodos de absorción de nutrientes, ya que facilita el rápido almacenamiento de
glucosa en músculos, higado y tejido adiposo, lo que previene las grandes fluctuaciones
en los niveles de azúcar circulante.
Desde que el gen para GLUT4 se clonó en 1989, numerosos estudios se han
focalizado en determinar los mecanismos moleculares básicos involucrados en la
regulación de su actividad, ya sea por estímulos de insulina, estímulos contráctiles o por
32
estrés osmótico, llegando a ser en la actualidad un importante campo de investigación
en una gran cantidad de modelos (41). En condiciones basales, el GLUT4 se encuentra
en un ciclo hacia y desde la membrana plasmática a través de una lenta exocitosis y
una rápida endocitosis (41-43). Diversas aproximaciones microscópicas han localizado
al GLUT4 en estructuras túbulo-vesiculares, en la región perinuclear y en diferentes
zonas del citoplasma celular (44, 45). La fracción del GLUT4 ubicado en la región
perinuclear, colocaliza parcialmente con marcadores de retículo endoplásmico (ERC), el
complejo de Golgi y la red del trans-Golgi (TGN) (46, 47). Dado el comportamiento
dinámico del GLUT4, no es fácil determinar por análisis microscópico si los
compartimientos perinucleares, citoplasmáticos u otros, son los facilitadores del
transporte de glucosa sensibles a insulina. Posteriores estudios que utilizaron la
eliminación química de los compartimentos que contienen al receptor de transferrina
(TfR), usando TfR unido a peroxidasa (48, 49) identificaron consistentemente dos
poblaciones de GLUT4: uno vinculado a TfR, el cual es un marcador de
compartimientos de retículo endoplasmático (ERC), y otro que se encuentra alejado de
ahí (no-ERC pool). Actualmente existe consenso en relación a que insulina moviliza
GLUT4 desde el pool independiente de ERC, el cual ha sido conocido como el
compartimiento especializado en GLUT4 o como el compartimiento que almacena las
vesículas sensibles a insulina cargadas con GLUT4 (GSV).
Algunos estudios recientes han modificado conceptualmente la definición de la
naturaleza bioquímica de los GSV. La aminopeptidasa que responde a insulina (IRAP)
es co-segregada con GLUT4 y posee una distribución similar en membrana
citoplasmática. Aunque IRAP podría regular la retención y/o el secuestro de las
vesículas con GLUT4 (50), no identifica un pool especializado de GLUT4, sólo lo
33
distribuye a través de dichos compartimientos (51). Un marcador selectivo de GSV
podría ser la proteína de membrana asociada a vesículas (VAMP2) unida a receptores
proteicos (v-SNARE) que son requeridos para la fusión de GLUT4 con la membrana
citoplasmática en respuesta a insulina y no en su dinámica basal. VAMP2 se encuentra
sólo en una subpoblación de vesículas con GLUT4, que muestran una segregación
lejana al TfR (46, 52). Mas aún, estímulos como el estrés hiperosmótico y el factor de
crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) no lograron que VAMP2 incrementara los
niveles de GLUT4 en la superficie celular, la que fue dependiente de v-SNARE y
VAMP7 (53, 54). Futuros trabajos podrían confirmar si GSV constituye un
compartimiento preformado de VAMP2 y GLUT4 o si las vesículas con GLUT4
adquieren VAMP2 durante la translocación a la membrana plasmática por estímulos de
insulina.
Existen nuevos antecedentes que GGA (proteína de unión a Arf-, localizada en
el Golgi, se requiere para direccionar el transportador GLUT4 recién formado desde el
TGN hacia el GSV (55). GGA interacciona con sortilina, proteína del TGN y de la
membrana del endosoma, necesaria y suficiente para la formación de pequeñas
vesículas enriquecidas en GLUT4 (56). La coexpresión de sortilina y GLUT4 marcado
con un epitope myc en adipocitos 3T3-L1, generó vesículas cargadas con
transportadores. Contrariamente, la reducción de sortilina endógena a través de RNA de
interferencia (RNAi), impidió la formación de vesículas cargadas con transportador de
glucosa en adipocitos 3T3-L1. Nuevos estudios son necesarios para determinar qué
otras características de GSV permiten la formación de vesículas cargadas con GLUT4 y
el enriquecimiento de VAMP2 en respuesta a insulina.
34
6.7 Participación de la vía dependiente e independiente de IRS en la regulación de GLUT4
Existen al menos dos rutas de señalización que participan mancomunadamente
en la destinación de GLUT4 a la membrana citoplasmática. Una es la vía dependiente
de PI3K/Akt (57) y la otra depende de Cbl-CAP-CrkII-C3G-TC10 (58). La vía de PI3K
requiere la fosforilación de IRS-1 y posterior reclutamiento de PI3K para la formación de
PIP3, el cual a su vez activa a la kinasa dependiente de fosfoinositidos (PDK1) y a la
proteína kinasa B (Akt) que terminan por activar a las isoformas atípicas de la proteína
kinasa C (aPKC/). Finalmente esta ruta de señalización permite el transito de las
vesículas sensibles a insulina que contienen al GLUT4 (GSV) desde los
compartimientos intracelulares hacia la superficie celular (59). Últimamente se ha
descrito que el sustrato de Akt de 160kd (AS160) participa en el transporte de glucosa
gracias a su dominio activador de la GTPasa Rab (GAP) (60). Al ser fosforilado por Akt,
AS160 se inactiva produciendo una permanencia del estado activado de Rab y el
consecuente fomento de la incorporación de glucosa (61). Por otro lado, la vía de
transducción Cbl-CAP-CrkII-C3G-TC10 es la segunda ruta para la translocación de
GLUT4 a la membrana citoplasmática. Cuando Cbl se fosforila, el complejo Cbl-CAP-
CrkII-C3G transloca a los microdominios de la superficie (balsas lipídicas) donde se
encuentra TC10. La proteína C3G funciona como un factor intercambiador de
nucleótidos de guanina (GEF) para TC10, resultando en el intercambio de GDP por
GTP. Dado que TC10 es una GTPasa pequeña de la familia Rho, es capaz de modificar
el citoesqueleto de actina y así incidir positivamente en el aumento de la captación de
glucosa, tras estímulos de insulina (Figura 3) (62).
35
La transactivación entre receptores tipo tirosina kinasa y acoplados a proteína G
aporta una mayor complejidad a estos sistemas de transducción. Hace
aproximadamente 15 años atrás, Nishimoto et al. mostraron que toxina pertussis (TXP)
bloqueó tanto los aumentos de Ca2+ como la síntesis de DNA inducidas por el factor de
crecimiento análogo a insulina tipo 1 (IGF-1) en células Balb/c 3T3, describiendo por
primera vez la participación de una proteína G sensible a TXP en la acción de IGF-1
(63). Más tarde se demostró que TXP actuaría como antagonista de los efectos
mitogénicos de IGF-1, pero no de los efectos metabólicos de insulina, atribuyéndose a
que IGF-1 mediaría sus efectos a través de proteína Gi, mientras que insulina lo haría a
través de un tipo Gq/11 (64).
36
Figura 3. Regulación del tráfico del GLUT4. (A) Etapas de la exocitosis de GLUT4 inducido por insulina. Las vesículas son transportadas a la periferia celular por citoesqueleto de tubulina, son mantenidas en la cercania de la membrana citoplasmática por remodelación de la actina cortical, luego son unidas a la membrana por complejos proteicos y finalmente fusionadas. (B) se resumen todas las rutas que producen una ganancia del GLUT4 en la superficie celular por estimulos de insulina la vía de IRS-1 se bifurca en dos brazos, uno hacia la activación de Akt/AS160 y el otro que involucra a PKC atipicas que producen remodelamiento de actina por activación de Rac. Hilal et al. (2008) (65).
37
7 HIPÓTESIS
En base a los antecedentes mostrados anteriormente se propone que:
Insulina estimula la incorporación de glucosa en el cardiomiocito por un mecanismo que
involucra liberación de calcio desde reservorios intracelulares y que depende de la
activación selectiva y complementaria de las vías PI3K/PLC/IP3 y PI3/Akt.
8 OBJETIVO GENERAL
Estudiar la participación del calcio en la incorporación de glucosa inducida por insulina
en cultivos primarios de cardiomiocitos de rata.
9 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Estudiar la distribución subcelular y activación de los elementos claves del
sistema transduccional de receptor de insulina en cardiomiocitos
neonatos/adultos
2. Determinar el mecanismo transduccional mediante el cual insulina aumenta los
niveles intracelulares de calcio en los cardiomiocitos neonatos/adultos
3. Evaluar la participación de las vías RI/IRS-1/PI3K/Akt y IR/G
/PI3K/PLC/IP3/Ca2+ en la captación de glucosa inducida por insulina en
cardiomiocitos adultos/neonatos
38
10 MATERIALES Y METODOS
10.1 Reactivos
Los siguientes reactivos se adquirieron en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO,
EEUU): medio Hank´s, medio DMEM, medio M199, SDS, pancreatina, gelatina, Tritón
X-100, 5-bromo-2´-deoxiuridina, L-lactato, EDTA, EGTA, NaVO4, PMSF, glicerol, DTT,
Tween-20, azul de tripán, ácido pirúvico, azul de bromofenol, reactivo de Folin
Ciocalteau, pancreatina y anticuerpo monoclonal anti-beta-actina. De Merck (Darmstadt,
Alemania) se obtuvieron: NaOH, HCl, Na2CO3, Na2HPO4, CuSO4•5H2O, tatrato
dipotásico, NaF, pirofosfato de sodio, Tritón X-100, MgCl2, 2-propanol, formaldehído
37%. De Amresco (Solo, OH, EEUU): NaCl, leupeptina, aprotinina, HEPES sal sódica,
Tris base, acrilamida, bisacrilamida, CsCl. De Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU) se
adquirieron: Trizol, Tripsina-EDTA 10x y colagenasa tipo II. De Molecular Probes
(actualmente subsidiaria de Invitrogen) se obtuvieron fluo3-acetoximetilester
(FLUO3-AM), BAPTA-AM, Alexa fluor 488 anti-rabbit, Cy3 anti-mouse. De Winkler
(Santiago, Chile) se obtuvieron: KCl, 2-mercaptoetanol, TEMED, BSA, sacarosa. De
Calbiochem (La Jolla, CA, EEUU) se adquirieron: anti-IgG conejo, anti-IgG ratón. De
Calbiochem se obtuvo genisteina, LY-294002, U-73122, 2-APB, tapsigargina. Suero
fetal de bovino (FBS) y suero de ternera (FCS) se adquirieron de Hyclone (EEUU). Los
anticuerpos anti p-Akt y Akt se adquirieron a Cell Signaling. Otros reactivos: reactivo de
Bradford (BioRad, EEUU), Dako (Dako Cytomation, CA, EEUU), western Lightning se
adquirió en PerKinElmer Life Sciences, Inc (Boston, EEUU).
10.2 Cardiomiocitos neonatos
Los cardiomiocitos se obtuvieron a partir de ratas Sprague-Dawley de 2 a 3 días,
como se describe en Foncea et all (66). Las células se sembraron a una densidad final
39
de 1,4 x 103/mm2 sobre placas de Petri (35, 60 ó 100 mm) cubiertas con gelatina al 2%.
Para los estudios de inmunofluorescencia, las células se sembraron sobre cubreobjetos de
vidrio de 12 mm de diámetro, cubiertos con gelatina y puestos en placas de 24 pocillos.
Después de la obtención, los cardiomiocitos se incubaron por 24 h en medio con suero
(DMEM:M199=4:1, 10 % FBS). Luego, los cultivos se privaron de suero y se mantuvieron
por otras 24 h en medio de mantención (DMEM:M199=4:1). Finalmente, las células se
incubaron en medio de mantención.
10.3 Obtención de extractos proteicos de células
Una vez finalizado el período de estimulación, los cardiomiocitos se lisaron en
100 µL de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 20 mM
NaF, 1 mM pirofosfato de Na, 1 mM NaVO4, 140 mM NaCl y 1 mM PMSF), que contenía
10% v/v glicerol, 1 µg/mL leupeptina, 1 µg/mL aprotinina y 1% v/v Tritón X-100. Luego
las muestras se centrifugaron a 12.000 x g por 10 min 4 ºC y se determinó la
concentración de proteínas por el método de Bradford. Las fracciones solubles se
mezclaron con 0,33 volúmenes de tampón desnaturante 4x (25 mM Tris-HCl pH 7,5,
32% v/v glicerol, 20% 2-mercaptoetanol, 9,2% SDS, 0,02% azul de bromofenol) y se
incubaron por 5 min a 95ºC para el posterior análisis por Western blot.
10.4 Determinación de proteínas
10.4.1 Método de Lowry
Se utilizó una variante del micrométodo de Lowry en presencia de
detergentes (67). Brevemente, se preparó el reactivo A mezclando partes iguales de
una solución de cobre-tartrato-carbonato [preparado por mezcla de 50 mL de 0,2% p/v
CuSO4•5H2O y 0,4% p/v tartrato dipotásico con 50 mL de 20% p/v Na2CO3, 10% SDS y
40
0,8N NaOH; y el reactivo B diluyendo 1 volumen del reactivo de Folin Ciocalteau con 5
volúmenes de agua nanopura. En un tubo Eppendorf se mezcló 5 L de muestra de
proteínas con 400 µL de agua nanopura, 400 µL de reactivo A y 200 µL de reactivo B.
se incubó a 40ºC por 30 min y la absorbancia se determinó a 750 nm. Como estándar
de proteínas se utilizó BSA.
10.4.2 Método de Bradford
Se mezclaron 5 µL de muestra con 200 µL de reactivo de Bradford (Bio-Rad
protein assay) y 795 µL de agua. Las muestras se leyeron a 595 nm. Como estándar
para realizar la curva de calibración se utilizó BSA (68).
10.5 Medición de los niveles intracelulares de Ca2+
Los cardiomiocitos neonatos de rata se cultivaron en cubreobjetos de vidrio
precubiertos con gelatina a una densidad de 1 x 106 células/mm2. Los cardiomiocitos se
preincubaron con Fluo3-AM por 30 min en un medio Krebs con Ca2+ (140 mM NaCl, 5
mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 1 g/mL glucosa), se lavaron con
medio Krebs con Ca2+ y luego se montaron en un microscopio confocal invertido (Carl
Zeiss Axiovert 135 M-LSM Microsystems). Las imágenes fluorescentes se recolectaron
cada 0.985 s con una configuración para Fluo3-AM, excitación 488 nm; emisión 526 nm.
En cada imagen obtenida se determinó los niveles de fluorescencia en regiones de
interés (ROI) de células individuales. Los valores se expresaron como ΔF/Fo, donde ΔF
corresponde a F-Fo, y Fo a la fluorescencia basal (69).
41
10.6 Determinaciones del potencial de membrana
El potencial de membrana se registró desde cultivos primarios de cardiomiocitos
de rata neonata usando la configucación de parche perforado en célula única. Los
electrodos para el parche fueron formados desde un delgado capilar de vidrio
borosilicato usando un puller horizontal y llenados con (en mM): 120 ácido glucónico de
K+, 20 KCl, 8 NaCl, 1 MgCl2, 10 Hepes y 240 mg/mL de anfoterisina B (pH 7.4,
resistencia pipeta 2.5 mW). Los experimentos se desarrollaron con las células
incubadas en una solución que contiene (mM): 145 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 2,5 CaCl2, 10
Hepes, 5,6 Glucosa, pH 7,4. El electrodo se selló en la membrana de los cardiomiocitos
con succión suave y la medición de potencial de membrana comenzó cuando la
anfotericina B en la pipeta pudo perforar la membrana bajo el parche a una resistencia
40 mW (usualmente despues de 5-15 min). El potencial de membrana se registró
usando un amplificador EPC-7 (HEKA) y un sistema de adquisición Digidata 1200B
(Axon Instruments), a una velocidad de adquisición de 200 muestras/seg. La insulina se
agregó directamente a la solución en la camara de cultivo, luego de un registro basal de
3 min.
10.7 Análisis de Western blot
En todos los Western blots, las proteínas se resolvieron en geles en gradiente de
poliacrilamida entre 5 al 12% p/v con SDS. El resto de las electroforesis de proteínas se
realizaron en geles al 12% p/v de poliacrilamida-SDS. Las proteínas se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa de 0,2 m a voltaje constante (100 V por 1,5 h).
Posteriormente, las membranas se bloquearon con leche descremada al 3% p/v en
42
TBS-T (25 mM Tris pH 7,4, 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1% v/v Tween-20) por 1 h y se
incubaron con el primer anticuerpo (anti-p-Akt 1:1.000; anti Akt 1:1.000, β-actina
1:1.000). Luego de lavar las membranas, se incuban con un segundo anticuerpo anti
IgG de conejo o ratón, conjugado a peroxidasa de rabanito, para ambos anticuerpos
secundarios se usó la dilución 1:5.000. La unión específica se detectó mediante
quimioluminiscencia (ECL), utilizando película BioMax MR.
10.8 Transfecciones
Los cardiomiocitos se transfectaron con 2µg de las construcciónes plasmidiales
que codifican para GLUT4-myc-eGFP (70), PI3Kγ wt, PI3Kγ KD, PI3Kγ-myr, Akt-myr
(donados por Dr. TR Jackson, University of Newcastle, UK) o cadena liviana de toxina
tetanica (TeTx) (71) usando 2 µL/mL de lipofectamineTM2000 (Invitrogen). En estas
condiciones, la eficiencia de transfección fue de un 7%. El mRNA del receptor de IP3
tipo 2 se eliminó usando 100 nM de una mezcla de 4 diferentes siRNA (Thermo
Scientific) transfectados con 1µL/mL de DharmaFECTTM(Thermo Scientific). Un siRNA
para la proteina no relacionada emerin (Sigma-Proligo) se utilizó como control. Las
células tratadas con los plasmidios y con los siRNA se incubaron por 24 y 72 h,
respectivamente, antes de comenzar los experimentos.
10.9 Inmunofluorescencia indirecta (IF)
Los cardiomiocitos neonatos se sembraron en cubreobjetos de vidrio como ya se
mencionó anteriormente. Los cardiomiocitos adultos, 1 x 106, se sembraron en placas
de 6 pocillos sobre cubreobjetos pretratados con laminina (5 µg/mL). Transcurrido el
43
periodo de estimulación, las células se fijaron con formaldehído (4% p/v en PBS,
20 min), se permeabilizaron (en caso de ser requerido, PBS 0,3% v/v Tritón X-100,
30 min) y se bloquearon (3% p/v BSA en PBS, 1 h). Este procedimiento se realizó sobre
hielo a 4°C con lavados entre cada paso, utilizando PBS frio. Posteriormente, las células
se incubaron con el primer anticuerpo, según corresponda. anti-receptor de insulina
cadena α (1:400), anti-receptor de insulina cadena β (1:400), anti-caveolina-3 (1:400) o
anti-myc (1:300) diluidos en PBS-2% BSA, se lavaron y se incubaron con el segundo
anticuerpo IgG de conejo o ratón según corresponda conjugados a Alexa 488, Alexa
543, FITC o Cy3 (1:400), diluidos en PBS 2% BSA y protegidos de la luz. Finalmente, a
los cubreobjetos se les agregó 10 µL de medio de montaje anto apagamiento (DAKO)
para extender el tiempo de decaimiento del fluoróforo. Las muestras así tratadas se
observaron en microscopio confocal. La determinación del epitope myc en la superficie
celular y su relación con la cantidad total de eGFP se determinó como se indica en (70).
10.10 Captación de glucosa
Los cardiomiocitos se lavaron dos veces con el tampón salino HEPES que
contenía 2 mM CaCl2 ó 2 mM EGTA, según corresponda a experimentos realizados en
presencia o ausencia de Ca2+ extracelular, y mantenidos en estas condiciones por una
hora. Los inhibidores se agregaron durante los últimos 30 min y la insulina durante los
últimos 10 min. La transducción adenoviral se realizó 24 h antes del experimento como
se indicó anteriormente. La captación de glucosa se midió usando 10 µM
[3H]-2-deoxiglucosa (72).
44
10.11 Transducción de cardiomiocitos
Las placas de 35 mm con 1 x 106 cardiomiocitos, se transdujeron con distintas
multiplicidades de infección (MOI) del adenovirus βark-ct (Adβark-ct). Como control se
utilizó un adenovirus que expresa -galactosidasa (Ad LacZ) o adenovirus vacío
(AdVacío). Como reportero de transducción se utilizó un adenovirus que expresa la
proteína fluorescente verde GFP (AdGFP). Las células se incubaron por 48 h a 37ºC en
cámara humidificada 5% CO2/95% aire. Adenovirus Empty, GFP y βark-ct fueron
gentilmente donados por el Dr. WJ. Koch, Duke University, Durham, NC. El Adβark-ct
expresa una porción aminoterminal de la kinasa del receptor β-adrenérgico que une
subunidades de proteína G heterotrimérica (G), actuando como un inhibidor
dominante negativo de la señalización G (73). La eficiencia de transducción
empleando adenovirus fue superior al 95%, monitorizado con AdGFP.
10.12 Expresión de resultados y análisis estadístico
Los resultados presentados corresponden al promedio ± SD del número de
experimentos independientes indicados. En algunos casos las figuras o imágenes
corresponden a resultados representativos de cada grupo de experimentos repetidos al
menos 3 veces en forma independiente. La significancia estadística de los datos se
realizó mediante prueba t y en algunos casos prueba ANOVA. Se consideró como límite
de significancia estadística, valores de p<0,05. El análisis estadístico se realizó
mediante ANOVA, y la comparación entre grupos se realizó usando el test de Tukey.
45
11 RESULTADOS
11.1 Caracterización del receptor de insulina en los cardiomiocitos
Los cardiomiocitos de rata neonata se fijaron y permeabilizaron para la
inmunodetección del receptor de insulina. Los resultados muestran que 2 diferentes
anticuerpos contra la subunidad β del receptor de insulina presentan una total
colocalización, indicando que la distribución del receptor es peri-nuclear, citosólica y de
membrana citoplasmática en cardiomiocitos neonatos (Figura 4A). La fracción del
receptor de insulina que permanece en membrana citoplasmática se detectó a través de
co-inmunofluorescencia indirecta usando el marcador de membrana citoplasmática
caveolina-3. Los cardiomiocitos neonatos mostraron una colocalización equivalente al
33 ± 6,3% (Figura 4B). Se decidió inmunodetectar al receptor de insulina en
cardiomiocitos neonatos debido a que no se ha descrito con suficiente claridad su
distribución subcelular. La fuerte marca en la zona perinuclear podría estar relacionada
con síntesis proteica o con alguna estructura especializada presente en este tipo
celular.
46
Figura 4. Inmunofluorescencia indirecta para el receptor de insulina en cardiomiocitos de rata neonata. Los cardiomiocitos se fijaron permeabilizaron y trataron tal como se indica en Materiales
y Métodos. (A) Inmunodetección del receptor de insulina a través de 2 diferentes
anticuerpos diseñados contra la sub-unidad del receptor de insulina. (B)
Colocalización del receptor de insulina con una proteína marcadora de membrana
citoplasmática caveolina-3. El estudio de colocalización se realizó a través de análisis
de los coeficientes de Pearson. Las imágenes son representativas de 5 experimentos
independientes. Las barras corresponden a 20 m.
La distribución del transportador del GLUT4 endógeno dependiente de insulina
se determinó en cardiomiocitos neonatos. El GLUT4 se encuentra distribuido en la
región perinuclear y citoplasma celular. En presencia de insulina 10 nM por 10 min, el
GLUT4 no parece orientarse hacia otros compartimientos, tal y como se esperaría,
permaneciendo en las áreas anteriormente descritas con una pequeña tendencia a
desplegarse de la región perinuclear (Figura 5).
47
Figura 5. Inmunofluorescencia indirecta para GLUT4 en cardiomiocitos neonatos. Los cardiomiocitos se trataron tal como se indica en Materiales y Métodos. La figura
muestra la distribución de los transportadores de glucosa GLUT4 en condiciones
basales y bajo estímulo de insulina 10 nM por 10 min. Los cuadrantes de la izquierda
muestran las imágenes sin procesamiento y a la derecha después de realizar
deconvoluciones iterativas. Las imágenes son representativas de 3 experimentos
independientes. Las barras corresponden a 20 m.
48
Al inmunolocalizar la forma activada (serina 473) de Akt en cardiomiocitos
neonato mantenidos en medio libre de Ca2+, se aprecia un aumento significativo desde
los 5 min post estímulo de insulina 10 nM con un máximo a los 10 min (Figura 6A-B).
Por otro lado, la inmunodetección de fosfolipasa C gamma (PLCγ) fosforilada, reveló
una activación muy rápida con un máximo a los 30 seg post estímulo de insulina 10 nM
(Figura 6C-D). La activación de la proteína ERK1/2 se produce rápidamente al estimular
los cardiomiocitos con insulina 10 nM, alcanzando un máximo a los 5 min tanto para
ERK1 como para ERK2. En estas mismas muestras se inmunodetectó el receptor de
insulina (Figura 6F-H).
49
Figura 6. Insulina estimula la fosforilación de Akt, PLC y ERK1/2 en cardiomiocitos neonatos mantenidos en medio libre de Ca2+. (A) Imágenes representativas correspondientes a inmunofluorescencia indirecta para p-
Akt473 y su análisis densitométrico en (B). La misma estrategia se utilizó para detectar la
activación de PLC tal como se muestra en (C) con su respectivo análisis densitométrico
(D). (E) Imagen representativa del análisis Western blot para detectar la activación de
ERK1/2, insulina induce un aumento de la fosforilación de ERK1/2 independiente del
Ca2+ extracelular (F). (G) Detección del receptor de insulina en cada muestra (M1-M3).
Los valores corresponden al promedio desviación estándar. *p0,05 ó **p0,01 vs en
control de un total de 4 experimentos independientes.
50
11.2 Insulina induce un incremento bifásico de los niveles [Ca2+]i en cardiomiocitos de rata neonata
Los cambios en los niveles de [Ca2+]i se determinaron en cardiomiocitos
neonatos preincubados con la sonda fluorescente para Ca2+ FLUO3-AM. Los
cardiomiocitos quiescentes mantenidos en medio con Ca2+ mostraron intensidades de
fluorescencia basal de 2415 [F/F]x100 (n=10) relativo a los registros correspondientes
a los primeros 10 seg. Por otro lado, en medio libre de Ca2+, la fluorescencia de [Ca2+]i
registrada fue de 71 [ΔF/F]x100 (n=10) (Figura 7). Estos valores corresponden a la
máxima intensidad de fluorescencia alcanzada durante 5 min de registro.
Figura 7. Movimientos basales de [Ca2+]i en cardiomiocitos neonatos mantenidos en medio con Ca2+ y libre de Ca2+ extracelular. Los cardiomiocitos se privaron de suero por 24 h, se incubaron con la sonda para Ca2+
FLUO3-AM y se registró la fluorescencia en microscopio confocal de barrido láser cada
0,985 seg. La figura muestra el comportamiento de los cardiomiocitos mantenidos en
medio con Ca2+ (A) o en medio libre de Ca2+ (B). El resumen de la máxima intensidad
de fluorescencia registrada durante los 5 min se muestra en (C).
51
Cardiomiocitos mantenidos en medio con o sin Ca2+ se estimularon con
diferentes concentraciones de insulina. Se observaron aumentos de los niveles de
[Ca2+]i de manera dosis dependiente (Figura 8). En medio con Ca2+, el aumento del
[Ca2+]i presentó una cinética rápida con un máximo al primer seg post-estimulo de
insulina correspondiente a 22423 [ΔF/F]x100 (n=4) y que se prolongó por 26 5 seg,
mientras que en cardiomiocitos mantenidos en medio sin Ca2+ la máxima intensidad de
fluorescencia fue de 219 38 [ΔF/F]x100 (n=4) con un retraso de 7,8 1,4 seg
post-estimulo de insulina y que alcanzó una duración de 75 6 seg (Figura 8A-B).
Para caracterizar la relación dosis-respuesta, los cardiomiocitos se incubaron
con concentraciones crecientes de insulina en medio con Ca2+ y libre de Ca2+
(Figura 8C). Insulina a la concentración 0,01 nM no aumentó el [Ca2+]i , mientras que
de 0,1 a 1 nM indujo una respuesta máxima en aproximadamente el 80% de los
cardiomiocitos analizados. Insulina a altas concentraciones (1 M) incrementó los
niveles de [Ca2+]i en prácticamente todas las células analizadas, aunque con perfiles
cinéticos diferentes a los registrados con concentraciones menores de insulina,
posiblemente por activación inespecífica de otras rutas de señalización. Para todos los
siguientes experimentos se escogió insulina 10 nM pues esta concentración es cercana
a valores fisiológicos que se relacionan con especificidad y que genera respuesta más
del 80% de los cardiomiocitos analizados.
En la mayoría de los casos la magnitud del aumento en el [Ca2+]i fue
comparativamente más pequeña que los producidos durante un latido normal de los
cardiomiocitos, por lo que no se espera que este efecto de insulina pudiera alterar la
52
función contráctil.
Figura 8. Insulina aumenta los niveles intracelulares de Ca2+ en cardiomiocitos mantenidos en medio con y sin Ca2+ de manera dependiente de la concentración.
Los cardiomiocitos se privaron por 24 h de suero y se preincubaron con FLUO3-AM por
30 min. Efecto de insulina en cardiomiocitos neonatos mantenidos en medio con Ca2+
(A) o en medio libre de Ca2+ (B). (C) Resumen de un amplio rango de concentraciones
de insulina utilizadas. Insulina 1 nM aumentó el [Ca2+]i en más del 70% de los
cardiomiocitos analizados. Las figuras son representativas de, al menos,
7 experimentos independientes. La adición de insulina está indicada con una flecha.
*p0,05 ó **p0,01 vs el control (basal). Los valores corresponden al promedio la
desviación estándar.
53
Para confirmar que insulina causa un aumento del [Ca2+]i por liberación desde
reservorios intracelulares, los cardiomiocitos neonatos se trataron con tapsigargina (un
inhibidor de la bomba Ca2+ ATPasa del retículo sarco-endoplasmámico, SERCA). En
ausencia de Ca2+ extracelular, tapsigargina indujo un rápido aumento del [Ca2+]i.
Subsecuentes adiciones de cafeína (un activador del canal de Ca2+ receptor de
ryanodina) e insulina no indujeron un aumento del [Ca2+]i (Figura 9A). Estos resultados
indican que el aumento de [Ca2+]i inducido por insulina en cardiomiocitos mantenidos en
medio libre de Ca2+ es debido principalmente a una liberación de Ca2+ desde reservorios
intracelulares sensibles a tapsigargina. Para comprobar si el efecto de insulina fue a
través de la activación de su receptor, los cardiomiocitos se preincubaron con genisteina
(un inhibidor del receptor con actividad tirosina kinasa). Genisteina bloqueó el
incremento del [Ca2+]i inducida por insulina en cardiomiocitos mantenidos en medio con
Ca2+ y libre de Ca2+ (Figura 9B,C). Estos datos sugieren que el incremento del [Ca2+]i
inducido por insulina depende de la activación de su receptor.
54
Figura 9. Insulina induce aumentos del [Ca2+]i dependiente de reservorios intracelulares de Ca2+ y de activación de su receptor. Los cardiomiocitos se preincubaron con FLUO3-AM y se registraron los niveles de [Ca2+]i. (A) Efecto de cafeína (5 mM) e insulina (10 nM) en cardiomiocitos neonatos mantenidos en medio libre de Ca2+ y depletados de Ca2+ intracelular por tapsigargina
(100 M). El pre-tratamiento con genisteina (100 M) inhibió el aumento del [Ca2+]i inducido por insulina en ambas condiciones de Ca2+ extracelular (B,C). La adición de insulina se muestra por la flecha.
55
11.3 La primera fase del incremento del [Ca2+]i depende del influjo de Ca2+ a través del canal de Ca2+ tipo L sensible a voltaje y del canal de Ca2+ receptor de ryanodina
Para investigar el mecanismo por el cual insulina aumenta rápidamente los
niveles intracelulares de Ca2+, los cardiomiocitos neonatos se preincubaron con
nifedipino 1 μM, un bloqueador específico del canal de Ca2+ tipo L sensible a voltaje
(CCTL) a bajas concentraciones. Este tratamiento inhibió la primera componente rápida
de aumento del [Ca2+]i en cardiomiocitos neonatos estimulados con insulina y
mantenidos en medio con Ca2+ (Figura 10A). Al contrario, el aumento de [Ca2+]i inducido
por insulina en medio libre de Ca2+ fue insensible al tratamiento con nifedipino
(Figura 10B), confirmando la participación de, al menos, dos fases de incremento del
[Ca2+]i dependientes de un influjo y una liberación de Ca2+.
Figura 10. Efecto de nifedipino en el aumento del [Ca2+]i inducido por insulina. Los cardiomiocitos se preincubaron con FLUO3-AM por 30 min y preincubados por 5
min con nifedipino (1 M). Efecto de nifedipino en medio con Ca2+ (A) o libre de Ca2+
(B). El resultado es representativo de, al menos, 4 experimentos independientes. La
adición de insulina se muestra con una flecha.
56
Existen dos formas de liberación de Ca2+ desde el retículo sarco-endoplasmático
bien descritas, una es mediada por el canal de Ca2+ receptor de ryanodina (RyR) y el
otro por un canal de Ca2+ activado por inositol 3-fosfato (IP3R). El RyR está relacionado
con el proceso de contracción muscular a través de un mecanismo que se conoce con
el nombre de acoplamiento excitación-contracción del tipo CICR (del inglés “Calcium
Induced Calcium Release”) (74). En células preincubadas con ryanodina (50 μM) y
puestas en medio con Ca2+, la máxima intensidad de fluorescencia alcanzada por
estímulos de insulina fue menor y retrasada respecto a la condición control (Figura
11A). Estos resultados sugieren que la primera fase de aumento del [Ca2+]i inducido por
insulina depende tanto de la entrada de Ca2+ a través del CCTL como de la liberación
de Ca2+ desde reservorios intracelulares sensibles al alcaloide vegetal ryanodina. Es
relevante destacar que ryanodina no modificó el aumento de [Ca2+]i inducido por insulina
en medio libre de Ca2+ (Figura 11B).
57
Figura 11. Efecto de ryanodina en el aumento del [Ca2+]i inducido por insulina.
Los cardiomiocitos se preincubaron con FLUO3-AM por 30 min y con ryanodina (50 M)
por 1 h. Efecto de ryanodina en medio con Ca2+ (A) o libre de Ca2+ (B). El resultado es
representativo de, al menos, 4 experimentos independientes. La adición de insulina se
señala con una flecha.
Para determinar el posible papel de la despolarización de la membrana
citoplasmática en el aumento del [Ca2+]i inducido por insulina en el cardiomiocito, se
determinó el potencial de membrana desde células individuales usando un método de
registro en parche perforado. En condiciones basales, la mayoría de los cardiomiocitos
registrados dispararon potenciales de acción simples o compuestos de variada
frecuencia y duración desde un potencial de reposo hiperpolarizado (Figura 12A-B). Las
células restantes despliegan un potencial hiperpolarizado estable, disparando algunos
pocos potenciales de acción (Figura 12C). Insulina indujo una despolarización transitoria
de los cardiomiocitos, después del cual el potencial de membrana retornó a sus niveles
basales (Figura 12D). Esta respuesta no fue un artefacto causado por disrupción
mecánica de la preparación durante la adición del estímulo ya que cuando se agregó el
58
vehículo solo no se observó respuesta. Estos resultados apoyan la idea que la
componente rápida de aumento de [Ca2+]i inducida por insulina, sensible a nifedipino, se
produce por un influjo de Ca2+ a través del CCTL sensible a voltaje, después de la
despolarización de la membrana plasmática.
Figura 12. Efecto de insulina en el potencial de membrana citoplasmática de cardiomiocitos neonatos.
El potencial de membrana se determinó tal como se indica en Materiales y Métodos. El
panel A muestra espigas simples de despolarización de membrana plasmática
espontánea. Panel B muestra potenciales compuestos mientras que en el panel C se
ilustran células con baja actividad basal. El panel D muestra efecto de insulina (10 nM)
en el potencial de membrana. Estas determinaciones son representativas de, al menos,
4 experimentos independientes con mas de 10 células analizadas en cada ocasión.
59
11.4 La segunda fase de aumento del [Ca2+]i inducido por insulina es mediado por la liberación de Ca2+ desde canales IP3R.
Hasta el momento se deduce que la segunda fase de aumento del [Ca2+]i en el
citoplasma celular es dependiente de una liberación de Ca2+ desde reservorios
intracelulares independientes del RyR. Para determinar si la liberación de Ca2+ es
dependiente del IP3R, se utilizó un RNA interferente pequeño (siRNA) para el IP3R
tipo 2 así como dos inhibidores bien caracterizados 2 amino-aminoietoxidifenilborato
(2-APB) y xestospongina C (69). La disminución de la masa del IP3R tipo 2 inducida por
el siRNA fue superior al 90% a las 72 h post-transfección (Figura 13).
Figura 13. Disminunción de la masa del IP3R tipo 2 por siRNA en cardiomiocitos. (A) Imágenes representativas de los niveles de la proteína en células controles y tratadas con el siRNA. (B) Análisis densitométrico de las bandas relativizadas por
actina. *p0,05 ó **p0,01 vs control. Este experimento se repitió en 4 oportunidades diferentes.
60
Insulina no indujo un aumento del [Ca2+]i en cardiomiocitos con baja cantidad de
IP3R tipo 2 y mantenidos en medio libre de Ca2+ (Figura 14A). En la misma dirección,
cardiomiocitos preincubados con 2-APB o xestospongina C fueron insensibles al
aumento del [Ca2+]i inducido por insulina (Figura 14B,C). Estos datos en su conjunto
indican que la liberación de Ca2+ desde reservorios intracelulares es, principalmente, a
través del IP3R tipo 2. El quelante de Ca2+ intracelular BAPTA-AM también inhibió
completamente el aumento del [Ca2+]i inducido por insulina (Figura 14D).
61
Figura 14. Papel del IP3R en el aumento de [Ca2+]i inducido por insulina. Los cardiomiocitos se preincubaron con FLUO3-AM por 30 min en presencia de
inhibidores del IP3R, 2-APB (20 M) (A) y xestospongina C (100 M) (B). En (C) los
cardiomiocitos se transfectaron con un siRNA (100 nM) contra el IP3R tipo 2. Después
de 48 h, las células se preincubaron con FLUO3-AM y se registró los cambios inducidos
por insulina en el microscopio. (D) Efecto de BAPTA-AM (50 M) en el aumento de
[Ca2+]i inducido por insulina. Las figuras son representativas de 4 experimentos
independientes. La adición de insulina se indica con una flecha.
62
11.5 La segunda fase de aumento del [Ca2+]i inducida por insulina depende de la vía de señalización proteína G heterotrimérica, fosfolipasa C y PI3K
La ruta canónica de activación del IP3R se inicia por la activación de receptores
de superficie acoplado a proteína G heterotrimérica, donde a su vez las subunidades
de la proteína G activan diferentes efectores río debajo de la señalización, incluyendo a
PLC. Esta ultima enzima genera al agonista IP3 que se une y abre al IP3R en el retículo
sarco-endoplásmico. Para estudiar si este u otro mecanismo alternativo opera en la
segunda fase del aumento del [Ca2+]i inducido por insulina se investigó el efecto de
inhibidores de las subunidades de proteína G así como de la PLC. La expresión de
βark-ct (un péptido inhibidor de señalización vía subunidades ) eliminó efectivamente
el incremento transitorio del [Ca2+]i inducido por insulina en cardiomiocitos mantenidos
en medio libre de Ca2+ (Figura 15A), Sin embargo, Toxina Pertussis (un inhibidor de
proteína Gi/o) solo logró inhibir parcialmente el aumento de [Ca2+]i inducido por insulina
(Figura 15B). Estas observaciones sugieren que las subunidades disociada de una
subunidad juega un papel critico en el aumento del [Ca2+]i inducido por insulina y que
estas subunidades de proteína G provienen de una diferente a Gi/o.
63
Figura 15. Participación de proteína G heterotrimérica en la señalización del receptor de insulina.
(A) Los cardiomiocitos se transducieron con un adenovirus que expresa al péptido ark-
ct por 24 h y luego se preincubaron con FLUO3-AM por 30 min. (B) Los cardiomiocitos
se preincubaron por 1 h con toxina pertussis (1 mg/mL). El resultado es representativo
de, al menos, 4 experimentos independientes. La adición de insulina se muestra con
una flecha.
Para determinar si en el aumento del [Ca2+]i inducido por insulina participa la
activación de PLC, se trataron los cardiomiocitos precargados con FLUO-3AM con
U-73122 10 μM (un inhibidor de PLC) y luego se estimularon con insulina. Bajo estas
condiciones, la segunda fase del aumento del [Ca2+]i inducido por insulina fue
totalmente eliminada (Figura 16A), respaldando la participación de PLC en esta
respuesta. Los resultados de la Figura 13 revelan una nueva vía de señalización que
comienza en el receptor de insulina y continúa con la activación de una proteína G
64
putativa, la cual, junto con la activación de PLC contribuiría a la apertura del IP3R. Dado
que insulina clásicamente activa a PI3K, se estudió si esta enzima participa en el
incremento del [Ca2+]i dependiente de insulina. La segunda fase del aumento del [Ca2+]i
inducida por insulina fue completamente bloqueada en células pretratadas con
LY-294002 (Figura 16B), dejando al descubierto la posibilidad que este efecto sea
debido a la inhibición de PI3K, un conocido activador río arriba de PLC (75).
Figura 16. Papel de PLC y PI3K en el aumento de [Ca2+]i inducido por insulina. Los cardiomiocitos se preincubaron con FLUO3-AM por 30 min junto con U-73122
(50 M) en (A) y con LY-294002 (50 M) en (B). El resultado es representativo de 4
experimentos independientes. La adición de insulina se indica con una flecha.
Todos estos experimentos se realizaron en presencia y ausencia de Ca2+. Para
una sencilla lectura de los datos se han mostrado principalmente los resultados
realizados en medio libre de Ca2+. La figura 17, resume los experimentos desarrollados
en medio con Ca2+, en donde se aprecia la inhibición de la segunda componente del
65
aumento del [Ca2+]i inducida por insulina, mientras que la primera componente rápida
dependiente del CCTL y del RyR aún continúan operativas.
66
Figura 17. Participación del sistema transduccional G/PI3K/PLC/IP3R/ en el aumento del [Ca2+]i inducido por insulina en cardiomiocitos mantenidos en medio con Ca2+.
(A) Los cardiomiocitos se transducieron con un adenovirus que expresa al péptidos
ark-ct, por 24 h y luego se preincubaron con FLUO3-AM por 30 min. (B) Los
cardiomiocitos se preincubaron por 1 h con Toxina Pertussis (1 mg/mL). Las células se
preincubaron con FLUO3-AM por 30 min junto con LY-294002 (50 M) (C) y con
U-73122 (50 M) (D). El efecto de inhibidores del IP3R, 2-APB (20 M) y xestospongina
C (100 M) se muestran en los paneles E y F, respectivamente. (G) Los cardiomiocitos
se transfectaron con un siRNA (100 nM) contra el IP3R tipo 2. Después de 48 h, las
células se preincubaron con FLUO3-AM y los cambios de fluorescencia inducidos por
insulina se registraron en el microscopio. (H) Efecto de BAPTA-AM (50 M) en el
aumento de [Ca2+]i inducido por insulina. Las figuras son representativas de
4 experimentos independientes. La adición de insulina se indica con una flecha.
Para investigar si una señal paralela, no relacionada con insulina, continúa
operativa en presencia de los inhibidores de las rutas de señalización, se estudió la
despolarización de membrana en el acoplamiento excitación-contracción inducida por
KCl (50 mM) en cardiomiocitos mantenidos en medio con Ca2+. Las células
preincubadas por 30 min con LY-294002, U-73122 o xestospongina C se trataron con
KCl. En todas las condiciones, KCl indujo un rápido aumento del [Ca2+]i y mostró
oscilaciones de Ca2+relacionadas a una respuesta de tipo excitación-contracción
(Figura 18A-C). Estos resultados sugieren que señalizaciones intracelulares no
relacionadas están perfectamente operativas cuando las señales de Ca2+ inducida por
insulina están bloqueadas.
67
Figura 18. Efecto de KCl en los cardiomiocitos preincubados con inhibidores del aumento de [Ca2+]i dependiente de insulina. Los cardiomiocitos se
preincubaron con FLUO3-AM por
30 min junto con los inhibidores
señalados en presencia de Ca2+
extracelular. Efecto del KCl (50
mM) sobre células preincubadas
con LY-294002 (50 M) (A),
U-73122 (B) o xestospongina C
(C). Los resultados son
representativos de 4
experimentos independientes. La
adición de insulina (10 nM) se
señala con una flecha.
68
11.6 La liberación de Ca2+ dependiente de IP3 se requiere para la captación de glucosa y translocación de GLUT4 a la membrana plasmática en cardiomiocitos de rata
Tanto en adipocitos 3T3-L1 como en músculo esquelético está descrito que el
aumento del [Ca2+]i juega un importante papel en la captación de glucosa inducida por
insulina (76, 77). Sin embargo, el mecanismo mediante el cual ocurre tal efecto
permanece poco explorado. En el presente trabajo se estudió el efecto del Ca2+ en la
captación de glucosa inducida por insulina en los cardiomiocitos. La captación de
[3H]-2-desoxiglucosa aumentó significativamente en los cardiomiocitos neonatos
incubados en medio con Ca2+ y libre de Ca2+. La captación de glucosa aumentó durante
los primeros minutos de estimulación con insulina, alcanzando valores de 3,2 ± 0,2 y
3,5 ± 0,3 veces sobre el control en presencia y ausencia de Ca2+ extracelular,
respectivamente (Figura 19). Citocalasina B, un inhibidor no selectivo de la captación de
glucosa, redujo drásticamente la incorporación de glucosa en cardiomiocitos
mantenidos en ambas condiciones de Ca2+ extracelular (Figura 19), confirmando que el
efecto es a través de los transportadores de glucosa GLUT. Indinavir (100 µM), un
bloqueador especifico del transporte de glucosa a través de GLUT4), inhibió la
captación de glucosa dependiente de insulina hasta valores basales (Figura 19),
sugiriendo que el GLUT4 es el transportador predominante que media el efecto de
insulina en cardiomiocitos neonatos.
69
Figura 19. Efecto de insulina en la captación de glucosa en cardiomiocitos de rata neonata. El ensayo de pulso y caza de 3H-2DG se realizó tal como se describe en Materiales y
Métodos. Citocalasina B (10 M) inhibe el transporte de glucosa a través de GLUTs.
Indinavir (100 M) inhibe el transporte de glucosa por interacción específica con GLUT4.
**p0,01 vs basal, ††p<0,01 vs insulina. Figura representativa de 5 experimentos
independientes. Los valores corresponden a promedio desviación estándar.
Ninguno de los inhibidores de la primera componente de aumento del [Ca2+]i
inducida por insulina afectó la captación de glucosa ya sea en medio con o sin Ca2+
(Figura 20). Estos resultados indican que el influjo de Ca2+ a través del CCTL y la
70
posterior liberación de Ca2+ desde reservorios intracelulares dependientes del RyR no
participan en la captación de glucosa inducida por insulina.
Figura 20. Efecto de nifedipino y ryanodina en el aumento de la captación de glucosa dependiente de insulina en los cardiomiocitos neonatos. El ensayo de pulso y caza de 3H-2DG se realizó tal como se describe en Materiales y
Métodos. Nifedipino (1 M) inhibe el CCTL y no mostró ningún efecto. Ryanodina (50
M) inhibe el RyR y al igual que nifedipino no produjo efecto sobre la captación de
glucosa inducida por insulina. **p0,01 vs basal. Figura representativa de 5
experimentos independientes. Los valores corresponden al promedio desviación
estándar.
71
Por otro lado, la captación de glucosa inducida por insulina fue completamente
inhibida por Adβark-ct en cardiomiocitos mantenidos en medio libre de Ca2+, mientras
que Toxina Pertussis no tuvo efecto alguno (Figura 21A). El quelante intracelular
BAPTA-AM, el inhibidor de PLC y el bloqueador del IP3R inhibieron la incorporación de
glucosa inducida por insulina (Figura 21B).
Figura 21. La captación de glucosa inducida por insulina es dependiente del
[Ca2+]i, de la activación de G/PLC/IP3R en cardiomiocitos. (A) Cardiomiocitos preincubados por 1 h con toxina pertussis (1 mg/mL) y transducidos
con Adark-ct por 24 h. (B) Efecto de BAPTA-AM (50 M), U-73122 (50 M) y 2-APB
(20 M). Los resultados son representativos de 4 experimentos independientes.
**p0,01 vs basal, ††p < 0,01 vs insulina. Los valores corresponden al promedio
desviación estándar.
La disminución de la masa del IP3R por acción del siRNA produjo una
disminución significativa de la captación de glucosa inducida por insulina de
72
aproximadamente el 50%. El siRNA no relacionado utilizado como control no produjo
diferencias (Figura 22A). La inhibición de PI3K y de Akt, dos proteínas claves en el
sistema de transducción río abajo del receptor de insulina, disminuyeron totalmente la
incorporación de glucosa inducida por insulina en cardiomiocitos neonatos (Figura 22B).
Figura 22. Participación del IP3R tipo 2, PI3K y Akt en la captación de glucosa inducida por insulina en cardiomiocitos neonatos.
(A) Cardiomiocitos transfectados con el siRNA (100 nM) para el IP3R tipo 2 por 72 h o
con un siRNA no relacionado por el mismo periodo de tiempo. (B) Efecto del LY-294002
(50 M) y Akti1/2 (10 M). Los resultados son representativos de 4 experimentos
independientes. **p0,01 vs basal, ††p<0,01 ó †p<0,05 vs insulina. Los valores
corresponden al promedio desviación estándar.
Resultados similares se obtuvieron en cardiomiocitos neonatos mantenidos en
medio con Ca2+ (Figura 23). Estos resultados sugieren que la captación de glucosa
73
depende de una vía de señalización que involucra a G, PLC, IP3R tipo2 y Ca2+.Estos
resultados en su conjunto sugieren que la señal dependiente de la liberación de Ca2+ es
fundamental en la captación de glucosa inducida por insulina en los cardiomiocitos
neonatos. Esta respuesta requiere a PI3K y a su blanco río abajo Akt en adipocitos y
músculo esquelético. Nuestros resultados muestran que también es necesario en el
músculo cardiaco y colectivamente estos datos indican que el efecto de insulina sobre la
captación de glucosa en cardiomiocitos depende de dos vías de señalización: G-PLC-
IP3R2- Ca2+ y PI3K-Akt. Por ello se investigó si el aumento del [Ca2+]i inducido por
insulina podría influenciar la activación de la proteína kinasa Akt. En efecto, aunque
insulina incrementó la fosforilación de Akt en el aminoácido Ser473 en cardiomiocitos
mantenidos en ambas condiciones de Ca2+ extracelular, el pretratamiento con U-73122
y BAPTA-AM disminuyeron el efecto de insulina en medio libre de Ca2+ (Figura 24A).
Más aún, el inhibidor del IP3R, 2-APB, inhibió el efecto de Insulina sobre la activación de
Akt (Figura 24B). Estos datos revelan que la segunda fase de incremento del [Ca2+]i
inducido por insulina se requiere para la activación de Akt, así como también requiere
de la clásica activación de PI3K (registrada usando LY-294002).
74
Figura 23. Efecto de la vía G/PI3K/PLC/IP3R en la captación de glucosa inducida por insulina en cardiomiocitos mantenidos en medio con Ca2+. (A) Cardiomiocitos preincubados por 1 h con Toxina Pertussis (1 mg/mL) o transducidos
con Adark-ct por 24 h. (B) Efecto de BAPTA-AM (50 M), U-73122 (50 M) y 2-APB
(20 M). (C) Cardiomiocitos transfectados con el siRNA (100 nM) para el IP3R tipo 2 por
72 h o con un siRNA no relacionado por el mismo periodo de tiempo. (D) Efecto del LY-
294002 (50 M) y Akti1/2 (10 M). Los resultados son representativos de 4
experimentos independientes. **p0,01vs basal. ††p<0.01, †p0,05 vs insulina. Los
valores corresponden al promedio desviación estándar.
75
Figura 24. Efecto del aumento de [Ca2+]i inducido por insulina en la activación de Akt. Los cardiomiocitos se trataron con insulina 10 nM en medio con Ca2+ o libre de este ión.
Luego se prepararon extractos celulares y se analizó la fosforilación de Akt por Western
blot tal como se indica en Materiales y Métodos. (A) Efecto de U-73122 (50 M) y
BAPTA-AM (50 M). (B) Efecto de 2-APB (20 M) y LY-294002 (50 M). La figura es
representativa de 3 experimentos independientes.
76
Para complementar los resultados de los experimentos de captación de glucosa
inducida por insulina se estudió de translocación del transportador GLUT4 desde
reservorios intracelulares hacia la superficie celular. Estos experimentos ayudan a
comprender mejor los mecanismos involucrados en el proceso mediante el cual insulina
ejerce su efecto en la captación de glucosa. Para evaluar la participación del [Ca2+]i en
el proceso de exposición del GLUT4 en la superficie celular, los cardiomiocitos se
transfectados transitoriamente con una construcción plasmidial que codifica para la
proteína quimérica GLUT4 con un epitope myc en el primer loop extracelular y una
proteína fluorescente verde en la región carboxilo terminal (GLUT4-myc-eGFP). En
estas células, insulina incrementó de 2 a 3 veces comparada con el control la cantidad
de GLUT4myc en la superficie celular en cardiomiocitos mantenidos en medio libre de
Ca2+ (Figura 25A-B). Para demostrar que la exposición del myc en la superficie celular
inducida por insulina depende de los mecanismos clásicos de fusión de las vesículas
que almacenan GLUT4 (GSV) con la membrana plasmática, se exploró el papel de
VAMP-2, una conocida v-SNARE de las GSV. La cotransfección de GLUT4-myc-eGFP
con un DNA circular que codifica para la cadena liviana de la toxina tetánica (TeTx, que
hidroliza a VAMP-2) se realizó en cardiomiocitos neonatos. La TeTx inhibió por
completo el aumento del myc en la superficie celular inducido por insulina y también se
aprecia una tendencia hacia la disminución en condiciones basales (Figura 25A-B).
77
Figura 25. Efecto de insulina sobre la exposición del epitope myc en cardiomiocitos neonatos que expresan GLUT4-myce-GFP. Las células se transfectaron transitoriamente con GLUT4-myc-eGFP o co-transfectados
con la cadena liviana de la toxina tetánica por 24 h y luego se estimularon con insulina
10 nM por 10 min en medio libre de Ca2+. (A) Imágenes representativas de la detección
del epitope myc en cardiomiocitos no permeabilizados inducida por insulina y el efecto
de la toxina tetánica. (B) Análisis densitométrico correspondiente. La figura es
representativa de 4 experimentos independientes **p0,01 vs basal, ††p<0,01 vs
insulina. Los valores corresponden al promedio desviación estándar.
78
En cardiomiocitos no permeabilizados y mantenidos en medio libre de Ca2+,
insulina indujo un significativo aumento en la exposición del epitope myc en la superficie
celular. Nifedipino no produjo cambios mientras que ryanodina solo disminuyó
parcialmente la exposición del epitope myc desde 0,95 ± 0,04 a 0,70 ± 0,07
(normalizado según la relación Cy3:eGFP) (Figura 26A). Al contrario, una notable
reducción en la ganancia del epitope myc tras el estímulo de insulina se observó al
preincubar los cardiomiocitos con BAPTA-AM, Akti1/2 o con el bloqueador del IP3R
xestospongina C (Figura 26A).
79
Figura 26. El aumento en la exposición de GLUT4 en la superficie celular depende del [Ca2+]i, Akt e IP3R. Las células se transfectaron transitoriamente con GLUT4myceGFP por 24 h y
estimuladas con insulina 10 nM por 10 min en medio libre de Ca2+. (A) Imágenes
representativas de la detección del epitope myc en la superficie de cardiomiocitos no
permeabilizados inducida por insulina y el efecto de nifedipino (1 M), ryanodina (50
M), BAPTA-AM (50 M), Akti1/2 (10 M) y xestospongina C (100 M). (B) Análisis
densitométrico correspondiente. La figura es representativa de 4 experimentos
independientes **p0,01 vs basal. ††p<0,01, †p0,05 vs insulina.
La reducción de la masa del IP3R tipo 2 mediante un siRNA también disminuyó
significativamente la exposición del epitope myc en la superficie celular (Figura 27).
Estas observaciones en su conjunto apoyan fuertemente la idea que el Ca2+ liberado
desde reservorios intracelulares dependientes del IP3R por estímulos de insulina
80
participan en la translocación y/o fusión con la membrana plasmática de las vesículas
cargadas con GLUT4 en cardiomiocitos de rata neonata.
Figura 27. Efecto del siRNA para el IP3R tipo 2 en la exposición del GLUT4 en superficie celular inducida por insulina. Las células se cotransfectaron con GLUT4myceGFP y el siRNA para el IP3R tipo 2 por
72 h. Luego las células se estimularon con insulina 10 nM por 10 min en medio libre de
Ca2+. (A) Imágenes representativas de la detección del epitope myc en la superficie de
cardiomiocitos no permeabilizados inducida por insulina y el efecto del siRNA para el
IP3R tipo 2 (100 nM), utilizando como control un siRNA no relacionado. (B) Análisis
densitométrico correspondiente. La figura es representativa de 4 experimentos
independientes **p0,01 vs basal. †p0,05 vs insulina. Los valores corresponden al
promedio desviación estándar.
Para determinar si este mecanismo es específico para la señalización de
insulina, se investigó el efecto de IGF-1 y 2,4-DNP en la exposición del epitope myc en
cardiomiocitos neonatos. IGF-1 (10 nM) indujo un pequeño incremento en la exposición
del epitope myc hacia el extracelular que fue completamente inhibido por xestospongina
C (Figura 28A). Por otro lado, 2,4-DNP aumentó la exposición del epitope myc pero este
81
incremento no fue afectado por el pretratamiento de los cardiomiocitos con
xestospongina C y mantenidos en medio libre de Ca2+ (Figura 28B). Estos resultados
sugieren que la liberación de Ca2+ vía IP3R implicada en la translocación de GLUT4 no
es un mecanismo compartido por cualquier estímulo.
Figura 28. Efecto diferencial de xestospongina sobre el aumento de la exposición de GLUT4 en la superficie celular inducida por IGF-1 y 2,4-DNP. Las células se transfectaron con GLUT4myceGFP por 24 h. (A) Efecto de IGF-1 10 nM
por 10 min sobre el aumento del GLUT4 en la superficie celular e inhibición por
xestospongina C (100 m). (B) Aumento del GLUT4 en la superficie celular inducida por
2,4-DNP (5 mM) que no fue afectado por xestospongina C. La figura es representativa
de 4 experimentos independientes **p0,01, *p0,05 vs basal. †p0,05, ††p0,01 vs
insulina. ‡‡p0,01 vs insulina más 2,4-DNP. Los valores corresponden al promedio
desviación estándar.
Finalmente, la participación de subunidad de proteína G heterotrimérica en la
segunda fase de aumento de [Ca2+]i y de la captación de glucosa inducida por insulina,
sugirió el rol de PI3K en estos procesos. Para comprobar esta idea, los cardiomiocitos
82
neonatos se cotransfectaron con los plasmidios GLUT4-myc-eGFP y la forma silvestre
(WT) o incapaz de fosforilar fosfoinositidos (Kinase death, KD) o una forma miristoilada
(myr) de PI3K. La forma inactiva de PI3K (KD) disminuyó significativamente la
exposición del epitope myc en la superficie celular, mientras que la sobrexpresión de la
forma silvestre no tuvo ningún efecto (Figura 29). Más aún, la forma miristoilada de
PI3K causó un pequeño incremento en la exposición basal del epitope, aunque no fue
significativo, y no produjo ningún efecto sobre la exposición del myc inducido por
insulina. Como control positivo, se utilizó myr-Akt (una forma de Akt siempre presente
en la cara interna de la membrana citoplasmática), la que aumentó la exposición del
epitope myc en la superficie celular de manera independiente de insulina, como se
esperaba (Figura 29). Estos datos sugieren la participación de PI3K en los mecanismos
de translocación e inserción de GLUT4 en la membrana citoplasmática por estímulos de
insulina.
83
Figura 29. Papel de PI3K en la externalización de GLUT4 inducida por insulina. Las células se cotransfectaron con los plasmidios GLUT4myceGFP o con alguna de las
siguientes construcciones plasmidiales por 24 h. La figura muestra que el efecto de
insulina 10 nM por 10 min sobre el aumento del GLUT4 en la superficie celular y el
papel de PI3K WT (A), PI3K KD (B), PI3K-myr (C) y Akt-myr (D). La figura es
representativa de 4 experimentos independientes **p 0,01 ó *p 0,05 vs control basal. †p 0,05 vs basal cotransfección. ¶p 0,05 vs insulina. Los valores corresponden al
promedio desviación estándar.
84
Figura 30. Modelo propuesto. Insulina se une a su receptor y produce un aumento del [Ca2+]i de manera bifásica. La
primera componente de la señal se produce por activación del CCTL, entrada de Ca2+
desde el medio extracelular y activación del canal de Ca2+ receptor de ryanodina con
posterior salida de Ca2+ desde el retículo sarco-endoplásmico. La segunda componente
de liberación de Ca2+ involucra una activación de proteína G heterotrimérica no-
inhibitoria y las subunidades G, las cuales activan a la proteína kinasa de lípidos PI3K
para generar PIP3 a partir de PIP2. Esta es una fuerte señal de reclutamiento del
dominio de homología a pleckstrina presente en PLC, lo que provoca su unión con la
cara interna de la membrana citoplasmática. Luego PLC transforma el PIP2 en IP3 y
diacilglicerol. El IP3 activa al IP3R, lo que genera una liberación de Ca2+ desde el retículo
sarco-endoplásmico. Este Ca2+ está involucrado en el tráfico de vesículas con GLUT4
y/o en su fusión con la membrana plasmática lo que finalmente produce aumento de la
captación de glucosa.
85
12 DISCUSION
En este trabajo se muestra por primera vez que insulina induce un rápido
aumento de los niveles de [Ca2+]i en cultivos primarios de cardiomiocitos de rata
neonata. Esta señal transitoria de Ca2+ contiene dos componentes, uno rápido (1
segundo) que depende principalmente de una entrada de Ca2+ desde el medio
extracelular y otro componente más lento que depende de la liberación de Ca2+ desde
reservorios intracelulares hacia el citoplasma. Este segundo componente puede ser
estudiado en cardiomiocitos mantenidos en medio libre de Ca2+. La segunda fase de
aumento del [Ca2+]i inducido por insulina requiere de una vía señalización que
comprende a las subunidades de una proteína G heterotrimérica, PI3K, PLC y del
canal de Ca2+ receptor de IP3 tipo 2. La ruta se activaría secuencialmente en una
cadena lineal de eventos tal como resume la Figura 30. Sin embargo esta vía también
podría interaccionar con otras vías transduccionales como observamos en nuestro caso
con la proteína kinasa Akt. También en esta tesis se demostró que esta nueva ruta
transduccional tiene implicancias funcionales importantes en la acción de insulina sobre
el cardiomiocito dado que regula la translocación de GLUT4 y la captación de glucosa.
Nuestros hallazgos también revelan una nueva conexión entre la liberación de Ca2+
dependiente de IP3R y la acción de insulina en cardiomiocitos. La intersección entre el
Ca2+ y la vía de señalización canónica de insulina PI3K-Akt puede ocurrir en diferentes
niveles, incluyendo la activación de Akt dependiente de Ca2+, y el papel del Ca2+
liberado por insulina en tráfico vesicular y/o en fusión de las vesículas con la membrana
86
plasmática (Figura 30). Estas conclusiones serán analizadas, discutidas y ampliadas a
continuación:
12.1 Insulina y la regulación del Ca2+ citoplasmático en el cardiomiocito
El debate del papel del [Ca2+]i en la transducción de insulina se ha centrado en la
dificultad para detectar cambios en los niveles de este catión en respuesta a la
hormona. Las sondas usadas para detectar aumentos del [Ca2+]i por estímulos de
insulina en adipocitos 3T3-L1 (78), L6 diferenciadas a miotubos (79) y en músculo
esquelético (80) no han logrado detectar efecto alguno. Sin embargo, insulina indujo
una señal transitoria del [Ca2+]i asociada a la membrana plasmática usando un censor
específico (FIP18) (80). En este trabajo mostramos que FLUO3-AM, una sonda con un
mayor rango dinámico que la sonda indo-1, claramente detectó aumentos del [Ca2+]i
inducido por insulina en cardiomiocitos neonatos. Estos resultados sugieren que los
cambios del [Ca2+]i detectados en cardiomiocitos podrían ser más pronunciados que en
otros tipos celulares y que FLUO3-AM puede revelar cambios del [Ca2+]i más
eficientemente que otras sondas. La primera fase del aumento del [Ca2+]i inducida por
insulina en cardiomiocitos involucra un influjo de Ca2+ a través del CCTL ya que fue
totalmente inhibida usando medio extracelular libre de Ca2+ o el bloqueador del CCTL,
nifedipino. Por otro lado, la inhibición de la fase rápida inducida por insulina que se logró
con altas concentraciones de ryanodina, sugieren también la participación de un
mecanismo tipo liberación de Ca2+ inducida por Ca2+, según la lógica que una entrada
de Ca2+ a través del CCTL activa al RyR, el cual a su vez puede liberar Ca2+ desde el
87
retículo sarco-endoplásmico. Este mecanismo participa en la contracción normal del
músculo cardiaco y produce, comparativamente, mayores elevaciones del [Ca2+]i. Los
cambios en los niveles de [Ca2+]i inducidos por insulina fueron claramente insuficientes
para gatillar una contracción de los cardiomiocitos. En el corazón, el IP3 es generado a
través de la acción de diferentes PLCs sobre el PI4,5-P2 (81, 82). Algunos agonistas
neurohumorales (acetilcolina, endotelinas, catecolaminas y prostaglandinas) activan a la
PLC dependiente de proteína Gq (83, 84). Al contrario, purinas o angiotensina II
estimulan a una PLC dependiente de tirosina kinasa (82, 85). El IP3 induce una
liberación lenta de Ca2+ desde preparaciones vesiculares y activa la contracción en
músculo de rata y preparaciones de corazón de pollo (86). En la rata adulta,
cardiomiocitos ventriculares (87) y auriculares (88) expresan principalmente el IP3R tipo
2, sin embargo, cardiomiocitos neonatos logran expresar las tres isoformas del IP3R con
diferentes localizaciones subcelulares (69). El aumento del [Ca2+]i inducido por insulina
aquí registrado fue inhibido por la expresión de ARK-ct, LY294002 y por la disminución
del IP3R tipo 2 mediante siRNA, lo que sugiere la participación de las subunidades de
proteína G heterotrimérica así como de la activación de PI3K y del IP3R tipo 2.
12.2 Participación de G y PI3K en la acción de insulina en cardiomiocito
En relación al mecanismo transduccional clásico de insulina, esta hormona
peptídica se une a su receptor y activa a la PI3K clase I (subunidades catalíticas
p110 y ) a través de la unión de la subunidad regulatoria p85 a la proteína sustrato
del receptor de insulina (IRS), un mecanismo independiente de la acción de proteína G.
88
Sin embargo, las subunidades de proteína G heterotrimérica puede activar a PI3K
por interacción directa con dos dominios de la subunidad catalítica p110 (89). Durante
hipertrofia por sobrecarga de presión en ratones, la PI3K es activada por un proceso
dependiente de proteína G (90). PI3K es fundamental en la regulación purinergica de
los aumentos de [Ca2+]i en cardiomiocitos de rata, donde LY-294002 previno la
translocación de PLC a la membrana plasmática y la generación de IP3 (91). Por
analogía, pensamos que insulina podría activar a PI3K (p110) a través de las
subunidades de proteína G heterotrimérica. En esta misma línea, p110 se asocia
físicamente con Gq/11 fosforilado en fibroblastos que sobrexpresan el receptor de
insulina (64). Este antecedente puede explicar la inhibición del aumento de [Ca2+]i
inducido por insulina y la translocación de GLUT4 causada por el inhibidor de PI3K
LY-294002 así como la inhibición de la translocación de GLUT4 por PI3K KD (inactiva).
12.3 Participación de la liberación de Ca2+ vía IP3R en el transporte de glucosa inducido por insulina y translocación de GLUT4
En el presente trabajo se demostró que insulina aumenta el transporte de
glucosa en cardiomiocitos neonatos mantenidos en medio con Ca2+ o libre de Ca2+,
sugiriendo que el efecto de insulina es independiente de la presencia de Ca2+ en el
medio extracelular. El Ca2+ extracelular tampoco regula la captación de glucosa en
corazones aislados (92). Mientras que en este estudio especulan que el Ca2+
citoplasmático no contribuiría a la regulación del transporte de glucosa en corazones
aislados, nuestros resultados indican claramente que se requiere de un aumento en el
89
[Ca2+]i para la captación de glucosa inducida por insulina en cardiomiocitos y que este
efecto es independiente del acoplamiento excitación-contracción.
La participación del [Ca2+]i en la estimulación del transporte de glucosa inducida por
insulina ha sido debatida en estudios utilizando cultivos primarios de adipocitos, células
L6 diferenciadas a miotubos y músculo esquelético (76, 77, 79). Los primeros estudios
en adipocitos de rata mostraron que cambiando el Ca2+ extracelular, existía una ventana
de [Ca2+]i que garantizaba la captación de glucosa inducida por insulina (93) y que más
allá de un estrecho valor entre 140-270 nM, el [Ca2+]i correlacionaba con la resistencia a
insulina (94). En adipocitos 3T3-L1, así como lo aquí mostrado en cardiomiocitos,
BAPTA-AM reduce la activación de Akt y la ganancia de GLUT4 en la superficie
celular (76, 95). Sin embargo, ninguno de estos estudios determinó directamente si la
hormona induce aumentos los niveles intracelulares de [Ca2+]i o simplemente que se
requiere ciertos niveles umbrales de [Ca2+]i. Ambos trabajos desarrollados en adipocitos
muestran que la activación de Akt es dependiente del [Ca2+]i a similitud de lo observado
en nuestro estudio en cardiomiocitos. Worrall & Olefsky (95) propusieron que el [Ca2+]i
tiene un efecto negativo en la señalización cercana al receptor de insulina y una
componente positiva sobre la señalización más distal como es el caso de Akt.
Whitehead et al (76) además propusieron dos posibles componentes positivas para el
[Ca2+]i en el sistema de señalización de insulina, basado en el uso de BAPTA-AM y de
ionóforos, permitiendo la translocación y fusión con la membrana citoplasmática,
respectivamente, de las vesículas con GLUT4, lo cual se determinó por la comparación
de los niveles de GLUT4 asociado a la membrana plasmática a través de la exposición
de HA-GLUT4 hacia el medio. Estos investigadores han especulado acerca de las
90
potenciales moléculas afectadas en el proceso y que poseen un atractivo blanco de
regulación por [Ca2+]i. Este estudio también describe que BAPTA-AM directamente
inhibe el transporte de glucosa en adipocitos, consistente con la alta susceptibilidad de
GLUT4 de ser inhibido por una amplia variedad de agentes químicos, sin embargo, esto
no invalida el efecto de BAPTA-AM sobre el tráfico de GLUT4. Al contrario, un quelante
de [Ca2+]i menos efectivo (Quin2-AM), no reduce el transporte de glucosa en miotubos
L6 o adipocitos 3T3-L1 (78, 79). Dantroleno, un inhibidor de la liberación de Ca2+ desde
el retículo sarco-endoplásmico a través del RyR, no previno la translocación de GLUT4
en miotubos L6 que expresan de manera estable la quimera GLUT4myc (96).
Finalmente, en músculo esquelético de rata, GLUT4 coprecipita con el canal TRPC3 y la
disminución del TRPC3 por siRNA disminuye la captación de glucosa dependiente de
insulina (97), sugiriendo que en músculo esquelético este canal se requiere para la
captación de glucosa inducida por insulina. Todos estos antecedentes invitan a estudiar
una respuesta especifica de Ca2+ inducida por insulina y a realizar una exploración en
profundidad del origen y el mecanismo de esta regulación mediada por Ca2+. En nuestro
estudio se observó que el Ca2+ es liberado desde endomembranas a través del IP3R y
proponemos un mecanismo de transducción que explica su liberación. Este mecanismo
podría ser único para cardiomiocitos o podría estar operativo en una amplia variedad de
sistemas, futuros trabajos en cada tejido sensible a insulina podrían dar respuesta a
estas posibilidades. En este trabajo también se mostró que IGF-1 y 2,4-DNP
aumentan los niveles de GLUT4 en la membrana citoplasmática de los cardiomiocitos,
independiente de la presencia de Ca2+ extracelular. En estas condiciones, el
pretratamiento con xestospongina C inhibe sólo el efecto de IGF-1. Nuestro Laboratorio
91
previamente ha demostrado que IGF-1 también induce aumentos del [Ca2+]i en
cardiomiocitos neonatos pero con claras diferencias en la amplitud, frecuencia, duración
y localización subcelular (69). Los antecedentes recién expuestos muestran una
conexión entre la liberación de Ca2+ desde reservorios dependientes del IP3R y la
translocación del GLUT4, pero este mecanismo no es compartido por todos los
estímulos que producen aumento del GLUT4 en la superficie celular.
En particular, la interacción entre liberación de Ca2+ inducida por insulina, a
través del IP3R, y la movilización de GLUT4 es contribución importante y nueva en esta
tesis. Más aún nuestro estudio proporciona una explicación para la documentada
contribución de Gq/11 endógeno en la translocación de GLUT4 inducida por insulina en
adipocitos 3T3-L1 (64) además de la emulación de este proceso observada por acción
de una forma constitutivamente activa de Gq (Q209L-Gq) que actúa por un
mecanismo dependiente de PI3K (98).
Las observaciones en adipocitos, músculo esquelético y cardiomiocitos llevan a
preguntarse ¿Cuál es papel preciso del [Ca2+]i en la translocación de GLUT4? La
regulación por Ca2+ de Akt demostrada en nuestro trabajo y también por James et
al (76) puede ser un importante punto de acción. Adicionalmente, el Ca2+ puede regular
la fusión de vesículas, potencialmente a través de la interacción con moléculas
funcionalmente parecidas a sinaptotagmina (99). Además, el [Ca2+]i puede participar en
la regulación del tráfico de GLUT4 dependiente de calmodulina kinasa II (71, 76).
Estudios futuros podrían revelar la acción molecular del [Ca2+]i y si el IP3R implicado en
este estudio está directamente presente en vesículas de GLUT4 para de esta manera
entregar aumentos del [Ca2+]i en la intima proximidad de las membranas.
92
El Ca2+ es un segundo mensajero extremadamente versátil, con la capacidad de
regular diferentes procesos celulares, entre los que destacan para este trabajo, la
movilización de vesículas, el aumento en la translocación y en el transporte de glucosa
inducido por insulina. La intensidad de las señales de Ca2+ en el citoplasma celular, su
frecuencia y localización subcelular, son importantes factores a considerar en relación a
su papel como segundo mensajero. Dentro de los procesos que podrían estar siendo
regulados por la liberación de Ca2+ inducida por insulina destaca la activación de Akt y
movilización de vesículas, aquí estudiadas, además de otros posibles blancos regulados
por Ca2+ como la dinámica de polimerización/despolimerización del citoesqueleto de
actina cortical y estructura de proteínas claves en los procesos de interacción y fusión
de membranas.
En resumen, insulina induce un aumento transitorio del [Ca2+]i en el
cardiomiocito de rata y el Ca2+ liberado desde reservorios dependientes de IP3R es un
importante regulador fisiologico de la estimulación del transporte de glucosa vía GLUT4.
Estas nuevas observaciones sugieren una conexión entre la homeostasis del [Ca2+]i y el
metabolismo cardiaco, potenciando el concepto de que alteraciones en la regulación del
[Ca2+]i, comunes en cardiomiopatias, podrían afectar la capacidad del cardiomiocito para
manejar la disponibilidad de nutrientes. Como el consumo de glucosa es fundamental
para procurar disponibilidad energética en condiciones de isquemia e hipoxia, la
desregulación de los flujos de Ca2+ podría ser crítica en el corazón insuficiente. Tal
escenario podria ser clave en cardiomiopatías acompañadas de resistencia a la insulina
y diabetes mellitus tipo II.
93
13 CONCLUSIONES
Dado que:
Insulina aumenta los niveles de [Ca2+]i de manera dependiente de la
concentración en cultivos primarios de cardiomiocitos de rata mantenidos en
medio con Ca2+ o libre de Ca2+.
La acción de insulina sobre los niveles intracelulares de Ca2+ en el cardiomiocito
depende de la activación de su receptor con actividad tirosina kinasa intrínseca.
El perfil cinético del aumento del [Ca2+]i dependiente de insulina presenta dos
componentes: uno rápido y otro más lento y retrasado del primero.
El componente rápido de aumento del Ca2+ intracelular depende de la activación
del canal de calcio tipo L en la membrana plasmática y del receptor/canal de
ryanodina en el retículo sarcoplásmico.
Insulina induce una rápida despolarización de la membrana plasmática en los
cultivos primarios de cardiomiocitos.
La componente lenta del aumento de Ca2+ inducido por insulina depende de las
subunidades una proteína G heterotrimérica, PI3K y PLC.
La liberación de Ca2+ inducida por insulina se produce por activación del IP3R
tipo 2.
La liberación de Ca2+ inducida por insulina participa en la activación de Akt por
fosforilación.
El transporte de glucosa inducido por insulina es independiente del aumento
rápido del [Ca2+]i y dependiente de la liberación de Ca2+ desde reservorios
intracelulares vía IP3R tipo 2.
El aumento en la externalización del GLUT4 en la membrana plasmática
dependiente de insulina requiere de la proteína SNARE VAMP-2.
El aumento de los niveles intracelulares de Ca2+ dependiente del IP3R e insulina
participa en la externalización de GLUT4 y captación de glucosa en el
cardiomiocito.
94
IGF-1 y 2,4-DNP estimulan la exposición del GLUT4 en la membrana plasmática
del cardiomiocito, efecto que es prevenido por el bloqueo del IP3R sólo en el
caso del IGF-1.
El efecto de insulina sobre la externalización del GLUT4 en la membrana
plasmática fue parcialmente inhibido por la expresión de la PI3K inactiva.
Se concluye que la translocación del transportador GLUT4 y la captación de glucosa
inducida por insulina en cardiomiocitos de rata neonata requieren de la liberación de
Ca2+ desde reservorios intracelulares dependientes del receptor de IP3, a través de un
mecanismo que involucra a PI3K/PLC/IP3. Además, el aumento del Ca2+ intracelular
inducido por insulina es necesario para la activación de Akt y muy posiblemente sea
necesario para el anclaje y posterior fusión entre las vesículas que contienen al
transportador de glucosa y la membrana plasmática del cardiomiocito neonato. Se
necesitan nuevos estudios para determinar si la desregulación de este mecanismo es o
no un factor que opera en la patogenia de múltiples condiciones fisiopatológicas que
afectan el funcionamiento del corazón, como por ejemplo, la hipertrofia cardiaca,
procesos de tipo isquémico o cardiomiopatia diabética.
95
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