UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE CENTRO DE ESTUDOS GERAIS

INSTITUTO DE BIOLOGIA PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA

MARCELO DO NASCIMENTO COSTA

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DE DERIVADOS

AMINOÁLCOOIS E DE DERIVADOS DO SISTEMA

TIENOPIRIDINA NA REPLICAÇÃO IN VITRO DO VÍRUS

HERPES SIMPLES TIPO 1

NITERÓI 2007

Programa de Neuroimunologia

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

CENTRO DE ESTUDOS GERAIS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

PROGRAMA DE NEUROIMUNOLOGIA

MARCELO DO NASCIMENTO COSTA

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DE DERIVADOS

AMINOÁLCOOIS E DE DERIVADOS DO SISTEMA

TIENOPIRIDINA NA REPLICAÇÃO IN VITRO DO VÍRUS

HERPES SIMPLES TIPO 1

Niterói

2007

ii

MARCELO DO NASCIMENTO COSTA

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DE DERIVADOS

AMINOÁLCOOIS E DE DERIVADOS DO SISTEMA TIENOPIRIDINA

NA REPLICAÇÃO IN VITRO DO VÍRUS HERPES SIMPLES TIPO 1

Trabalho desenvolvido no laboratório de Virologia Molecular do Departamento de

Biologia Celular e Molecular, Programa de Neuroimunologia, Instituto de Biologia

UFF.

Orientadora: Izabel Christina de Palmer Paixão Frugulhetti

Co-orientador: Davis Fernandes Ferreira

NITERÓI

2007

Dissertação de mestrado

submetida à Universidade Federal

Fluminense como requisito parcial

para obtenção do

grau de Mestre

em Neuroimunologia.

iii

C 387 Costa, Marcelo do Nascimento

Estudo do Mecanismo de Ação de Derivados

Aminoálcoois e de Derivados do Sistema Tienopiridina na

Replicação in vitro do Vírus Herpes Simples Tipo 1/Marcelo do

Nascimento Costa. Niterói: [s. n.], 2007.

88f.

Dissertação (Mestrado em Neuroimunologia)

Universidade Federal Fluminense, 2007.

1. Herpesvírus 1 Humano 2. Amino álcoois

3. Agentes Antivirais 4. Tienopiridina I. Título

CDD 616.52

iv

MARCELO DO NASCIMENTO COSTA

ESTUDO DO MECANISMO DE AÇÃO DE DERIVADOS

AMINOÁLCOOIS E DE DERIVADOS DO SISTEMA TIENOPIRIDINA

NA REPLICAÇÃO IN VITRO DO VÍRUS HERPES SIMPLES TIPO 1

Dissertação de mestrado submetida à Universidade Federal Fluminense como requisito parcial para obtenção do grau de

Mestre em Neuroimunologia

Niterói, 14 de março de 2007

BANCA EXAMINADORA

Dra. Helena Carla Castro Rangel UFF

Dra. Valéria Laneuville Teixeira UFF

Dr. Carlos Frederico Leite Fontes UFRJ

REVISORA E SUPLENTE

__________________________________________________________________ Dr. Elizabeth Giestal de Araújo

UFF

NITERÓI

2007

v

"O mais importante da vida não é a situação em que

estamos, mas a direção para a qual nos movemos .

Oliver W. Holmes

vi

AGRADECIMENTOS

Aos meus orientadores: Izabel Frugulhetti e Davis Fernandes pela orientação,

paciência e amizade;

Aos professores Sérgio Pinheiro e Alice Bernardino, do Departamento de Química

Orgânica da UFF, e aos seus respectivos alunos, Ronaldo Júnior e Luís Pinheiro,

pela colaboração que nos permitiu o desenvolvimento deste trabalho;

À professora Gerlinde Teixeira do Departamento de Imunologia da UFF e sua

aluna Valéria Garrido Martins pela colaboração com os experimentos in vivo;

Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Neuroimunologia pela grande

colaboração com a minha formação acadêmica;

Aos Professores Carlos Frederico Leite Fontes e Júlio Alberto Mignaco do Instituto

de Bioquímica Médica da UFRJ e a todos os seus alunos, pela ajuda nos

momentos de necessidade;

À banca desta dissertação por ter aceitado avaliar este trabalho;

À professora Elizabeth Giestal de Araújo pelo apoio e pela revisão desta

dissertação, e aos seus alunos pela amizade;

vii

À todos os colegas do curso de Pós-Graduação em Neuroimunologia;

À todos os meus amigos;

Aos amigos do Laboratório de Virologia Molecular da UFF, Luciano Sant'Anna,

Thiago Moreno Lopes e Souza, Juliana Lourenço Abrantes, Milene Dias Miranda,

Tamara Fogel, Diego Queiroz , Silmara Souza, Priscila Born, Felipe Mateini

e.Viveca;

Aos meus parentes;

À minha namorada Amanda Delvizio pelo carinho;

E a minha família (Emilson, Nely e Michele) por ter me dado apoio e todo suporte

necessário para o desenvolvimento desta dissertação.

viii

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS ______________________________________ xi

LISTA DE FIGURAS ___________________________________________ xv

LISTA DE TABELAS __________________________________________ xvii

RESUMO __________________________________________________ xviii

ABSTRACT _________________________________________________ xix

1. INTRODUÇÃO __________________________________________ 1

1.1. Histórico _________________________________________ 3

1.2. Família Herpesviridae _______________________________ 4

1.3. HSV-1 ___________________________________________ 5

1.4. Ciclo de Multiplicação do HSV-1 _______________________ 7

1.4.1. Adsorção, Penetração e Transporte Intracelular ______ 7

1.4.2. Etapa de Replicação ___________________________ 10

1.4.3. Latência ____________________________________ 17

1.5. Algumas das Principais Drogas Utilizadas no Tratamento

de Infecções por HSV-1 _________________________________ 19

1.5.1. Aciclovir e Valaciclovir _________________________ 19

1.5.2. Penciclovir e Fanciclovir ________________________ 21

1.5.3. Foscarnet ___________________________________ 23

1.5.4. Cidofovir ____________________________________ 23

1.6. Substâncias Testadas neste Trabalho __________________ 25

1.6.1. Derivados 1,4 aminoálcoois contendo anel 1,2,3

triazólico (ou Derivados Aminoálcoois) _________________ 25

ix

1.6.2. Derivados 4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridinas-5-

carbonitrilas (ou Derivados Tieno-Piridina) ______________ 30

2. OBJETIVOS ___________________________________________ 32

2.1. Objetivos Gerais ___________________________________ 32

2.2. Objetivos Específicos _______________________________ 32

3. MATERIAL E MÉTODOS _________________________________ 33

3.1. Células e Drogas __________________________________ 33

3.2. Ensaio para Avaliação da Citotoxicidade das Substâncias __ 34

3.3. Obtenção da DNA Polimerase de Células Vero _________ 35

3.4. Ensaio de Inibição da DNA Polimerase de Células Vero __ 35

3.5. Vírus ____________________________________________ 36

3.6. Ensaio de Redução da Placas Virais ___________________ 36

3.7. Ensaio de Inibição do Efeito Citopático _________________ 37

3.8. Ensaio de Inibição da Produção de Partículas Virais _______ 37

3.9. Efeito do Tratamento na Síntese Protéica

de Células Infectadas ___________________________________ 38

3.10. Obtenção da DNA Polimerase de HSV-1 _______________ 38

3.11. Ensaio de Inibição da DNA Polimerase de HSV-1 ________ 39

3.12. Estudo da Toxicidade in vivo ________________________ 39

4. RESULTADOS _________________________________________ 41

4.1. Avaliação da Citotoxicidade __________________________ 41

4.2. Ensaio de inibição da Atividade da DNA Polimerase

de Células Vero ______________________________________ 42

x

4.3. Avaliação da Atividade Antiviral _______________________ 43

4.4. Determinação do EC50 e do S.I. do Derivado 109 _________ 45

4.5. Ensaio de Inibição da Atividade da DNA Polimerase Viral ___ 46

4.6. Efeito do Derivado 109 na Síntese Protéica

de Células Infectadas ___________________________________ 47

4.7. Avaliação da Toxicidade in vivo do Composto 109 _________ 48

5. DISCUSSÃO ___________________________________________ 50

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _________________________ 58

xi

LISTA DE ABREVIATURAS

3-OS HS

Heparan Sulfato 3-O Sulfatada

µg/mL

Micrograma por Mililitro

Ci/mL

MicroCurie por Mililitro

µM

Micromolar

-TIF

Fator Indutor de Transcrição de Proteínas de Fase .

ACV

Aciclovir

AIDS

Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

ANP

Aciclonucleosídeo Fosfonatado

CC50

Citotoxicidade em 50%

CO2

Dióxido de Carbono

dATP

Deoxiadenosina Trifosfatada

dCTP

Deoxicitosina Trifosfatada

dGTP

Deoxiguanosina Trifosfatada

DMEM

Dubelcco´s Modified Eagle Medium

DMSO

Dimetilsulfóxido

DNA

Ácido Desoxirribonucléico

dNTP

Deoxinucleotídeos Trifosfatados

dTTP

Deoxitimidina Trifosfatada

DTT

Dithiothreitol

EBV

Vírus Epstein-Barr

xii

EC50

Concentração da Droga Capaz de Inibir em 50% a Replicação

Viral

EDTA

Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

g

Força da Gravidade

gB

Glicoproteína Viral B

gC

Glicoproteína Viral C

gD

Glicoproteína Viral D

gH

Glicoproteína Viral H

gL

Glicoproteína Viral L

GAG

Glicosaminoglicana

GTP

Guanosina Trifosfatada

HCF

Proteína Estabilizadora de Fator de Transcrição

HCl

Ácido Clorídrico

HCMV

Citomegalovírus Humano

HCV

Vírus da Hepatite C

HHV

Herpesvírus Humano

HIV

Vírus da Imunodeficiência Humana

HPMPC

Cidofovir

HVEM

Mediador da Entrada de Herpesvírus

HSV

Vírus Herpes Simples

ICP

Proteína de Célula Infectada

IMPDH

Desidrogenase de Inosina Monofosfatada

LAT

Transcritos Associados com a Latência

M

Molar

xiii

MgCl2

Cloreto de Magnésio

MHC

Complexo de Histocompatibilidade Principal

mM

Milimolar

MOI

Multiplicidade de Infecção

MTT

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbrometo

N

Normal

nm

Nanômetro

NNRTI

Inibidores Não Nucleosídicos da Transcriptase Reversa de HIV-1

h. p. i.

Horas Pós-Infecção

OCTs

Proteínas Reguladoras de Transcrição

PBS

Salina Tamponada com Fosfato

PFU

Unidades Formadoras de Placas virais

PMSF

Fenilmetilsulfonil Fluoreto

RDP

Ribavirina Difosfatada

RMP

Ribavirina Monofosfatada

RNA

Ácido Ribonucléico

RNAm

Ácido Ribonucléico Mensageiro

RPM

Rotações por Minuto

RTP

Ribavirina Trifosfatada

SDS

Dodecilsulfato de Sódio

SFB

Soro Fetal Bovino

SI

Índice de Seletividade

SSB

Proteína Ligadora de DNA Fita Simples

TAP

Transportador Associado com o Processamento do Antígeno

xiv

TCA

Ácido Tricloroacético

TGP

Transaminase Glutâmico-Pirúvica

TNF

Fator de Necrose Tumoral

TK

Timidina Cinase

UL

Segmento único longo do DNA do HSV

US

Segmento único curto do DNA do HSV

VP

Viral Protein

Vero

Células de Rim de Macaco Verde Africano

VHS

Virus Host Shut-off

VZV

Vírus da Varicela Zoster

xv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Infecção labial por HSV-1 ____________________________ 1

Figura 2

Eczema herpético (HSV-1) ___________________________ 1

Figura 3

Infecção de córnea por HSV __________________________ 2

Figura 4

Encefalite herpética _________________________________ 2

Figura 5

Eletromicrografia do HSV-1 ___________________________ 6

Figura 6

Diagrama representativo da estrutura do genoma

do HSV-1 _________________________________________ 7

Figura 7

Esquema representativo da entrada do HSV-1

na célula hospedeira ________________________________ 9

Figura 8

Formação do complexo de pré-iniciação _________________ 12

Figura 9

Modelo da replicação do DNA do HSV-1 _________________ 13

Figura 10

Esquema representativo da montagem do

nucleocapsídeo viral _________________________________ 16

Figura 11

Esquema representativo da liberação das partículas

virais de HSV-1 da célula hospedeira ___________________ 16

Figura 12

Latência e reativação do HSV-1 _______________________ 18

Figura 13

Fórmula estrutural do aciclovir e da guanosina ___________ 19

Figura 14

Mecanismo da ação antiviral do aciclovir ________________ 20

Figura 15

Fórmula estrutural do valaciclovir ______________________ 21

Figura 16

Fórmula estrutural do penciclovir ______________________ 22

Figura 17

Fórmula estrutural do fanciclovir _______________________ 22

Figura 18

Fórmula estrutural do foscarnet ________________________ 23

xvi

Figura 19

Fórmula estrutural do cidofovir ________________________ 24

Figura 20

Mecanismo da ação antiviral do cidofovir ________________ 25

Figura 21

Estrutura da ribavirina e de moléculas semelhantes ________ 28

Figura 22

Metabolismo das purinas em células humanas ____________ 28

Figura 23

Capacidade de pareamento promíscuo de bases

da ribavirina _______________________________________ 29

Figura 24

Derivados Aminoálcoois _____________________________ 29

Figura 25

Fórmula estrutural dos derivados

4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridinas-5-carbonitrilas __________ 31

Figura 26

Efeito dos derivados aminoálcoois na atividade da

enzima DNA polimerase de células Vero ______________ 43

Figura 27

Inibição da produção de partículas virais

pelo composto 109 _________________________________ 45

Figura 28

Efeito dos derivados aminoálcoois (50 M) na atividade

da enzima DNA polimerase viral _______________________ 46

Figura 29

Efeito do composto 109 (100 pM) na atividade

da enzima DNA polimerase viral _______________________ 47

Figura 30

Efeito do composto 109 na síntese protéica

de células infectadas ________________________________ 48

Figura 31

Avaliação da toxicidade in vivo do composto 109 __________ 49

xvii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

CC50 dos derivados Aminoálcoois ______________________ 42

Tabela 2

CC50 dos derivados do sistema Tienopiridina _____________ 42

Tabela 3

Inibição do efeito citopático causada

pelos derivados Aminoálcoois _________________________ 44

Tabela 4

Inibição do efeito citopático causada

pelos derivados do sistema Tienopiridina ________________ 45

xviii

RESUMO

A infecção pelo vírus herpes simples tipo-1 (HSV-1) pode causar várias

doenças, como infecções cutâneas, genitais e encefalites. O aciclovir é o

composto mais utilizado no tratamento destas infecções. Neste trabalho,

avaliamos o mecanismo de ação dos derivados aminoálcoois e dos derivados

Tienopiridina na replicação in vitro do vírus HSV-1 em células Vero. Os derivados

aminoálcoois com radical halogenado foram menos citotóxicos, porém inibiram

menos o efeito citopático do HSV-1. Nenhum deles inibiu a atividade da DNA

polimerase

de células Vero e nem da viral. Os derivados Tienopiridina

apresentaram valores de CC50 semelhantes entre si, mas a inibição do efeito

citopático viral variou de acordo com o radical e com sua posição. O mais

promissor foi o composto 109, que apresentou um EC50 de 100 pM, e, nesta

concentração, inibiu em torno de 50% a atividade da DNA polimerase do HSV-1.

Palavras-chave: HSV-1, agentes antivirais, Aminoálcoois e Tienopiridina.

xix

ABSTRACT

Virus infections by herpesvirus simplex type-1 may cause many diseases, as

cutaneous, genital infections and encephalitis. Acyclovir is the reference compound

used to treat these threats. In this work, we evaluated the mechanism of action of

aminoalcohols derivatives and thienopyridine derivatives in the HSV-1 in vitro

replication in Vero Cells. Aminoalcohols derivatives with halogenated radicals were

less cytotoxic, but they showed less inhibition of the cytopatic effect. In addition,

they didn t inhibit the activity of

cellular DNA polymerases and viral DNA

polymerases. The thienopyridine derivatives showed similar CC50 values, but the

inhibition of the cytopatic effect varied in agreement with the radical and with its

position. The best compound was the 109, that showed a value of EC50 of 100 pM,

and, in this concentration, it inhibited about 50% of the HSV-1 DNA polymerases

activities.

Key-words: HSV-1, antiviral agents, Aminoalcohols and Thienopyridine.

1

1) INTRODUÇÃO

Infecções causadas pelo vírus herpes simples (HSV) são comuns e podem

ser responsáveis por sérias complicações em pacientes imunodeprimidos (Morfin

& Thouvenot, 2003). Estas infecções podem variar em severidade desde infecções

subclínicas até aquelas que causam lesões permanentes podendo levar à morte

do indivíduo (Jones & Isaacs, 2004). O espectro das infecções por HSV em

humanos é vasto e inclui doença orofaríngea, infecções cutâneas, infecções

genitais, doença ocular e encefalites (Kimberlin, 2003) (Figuras 1, 2, 3 e 4).

Figura 1: Infecção labial por HSV-1

(http://www.ordinace.cz/clanek/opar-8211-herpes/).

Figura 2: Eczema herpético (HSV-1)

(http://www.contemporarypediatrics.com/contpeds/data/articlestandard/contpeds/312004/108010/k2

a041f4.jpg)

2

Figura 3: Infecção de córnea por HSV

(http://news.softpedia.com/news/Herpes-039-Secret-Way-of-Attacking-Cornea-Identified-

36682.shtml)

Figura 4: Encefalite herpética. Com contraste. Observa-se destruição praticamente total e seletiva

dos lobos temporais, deixando lacunas de aspecto acentuadamente hipodenso nas fossas médias,

preenchidas por líquor. Lesões com este aspecto e localização são altamente sugestivas de

seqüela de encefalite herpética por HSV-1. A meningoencefalite por HSV-2 é habitualmente mais

difusa (http://anatpat.unicamp.br/radherpes5.html).

3

1.1) Histórico

O vírus Herpes Simples tipo 1 (HSV-1), também conhecido como Herpesvírus

Humano tipo 1 (HHV-1), foi documentado pela primeira vez pelo médico grego

Hipócrates (460/377 a.C.), que o batizou de herpes (do latim herpin = rastejar,

reptil) devido ao aspecto das lesões causadas pelo vírus, como vesículas no trato

bucal, febre e ulcerações nos lábios. Todas estas manifestações caracterizavam a

doença Herpes febrilis, que foi descrita mais tarde por Heródoto (484/425 a.C.).

No entanto, somente no século XX, entre 1920 a 1960, foi demonstrado que os

isolados virais infectavam uma imensa gama de hospedeiros, como ratos,

camundongos, coelhos, cobaias e macacos. Além disso, também foi demonstrado

que este vírus poderia se multiplicar rapidamente em cultura de células

fibroblásticas, epiteliais, nervosas e ovos embrionados, levando à lise celular. Em

1968, os pesquisadores Nahmias e Dowdle classificaram o vírus herpes no gênero

Simplex e, com base em diferenças imunológicas, epidemiológicas e clínicas,

separaram este vírus em duas espécies diferentes, classificando-os em HSV-1 e

HSV-2 (Miranda et al., 2002). Contudo, desde a última reunião do International

Comitee for Viruses taxonomy (ICVT) o vírus herpes simples tipo 1 foi classificado

como pertencente à família Herpesviridae e à subfamília -herpesvirinae, devido

as suas características genômicas, sorológicas, do ciclo replicativo e da latência

(Miranda et al., 2002).

4

1.2) Família Herpesviridae

A família Herpesviridae compreende os vírus envelopados, que possuem

DNA dupla fita linear (Gilbert; Bestman-Smith & Boivin, 2002). Nesta família

encontram-se uma grande quantidade de vírus (havendo mais de 100 conhecidos)

capazes de infectar virtualmente todos os vertebrados, incluindo o homem

(Boehmer & Lehman, 1997). Os 8 herpesvírus humanos (HHV) são divididos em

três subfamílias: (1) a -herpesvirinae, onde encontramos o vírus herpes simples

tipo 1 (HSV-1), o vírus herpes simples tipo 2 (HSV-2) e o vírus da varicela zoster

(VZV); (2) a -herpesvirinae, onde encontramos o citomegalovírus humano

(HCMV), herpesvírus humano tipo 6 (HHV-6) e o herpesvírus humano tipo 7 (HHV-

7); e a -herpesvirinae, onde encontramos o vírus Epstein-Barr (EBV) e o

herpesvírus humano tipo 8 ( HHV-8) (Gilbert; Bestman-Smith & Boivin, 2002).

Apesar do HSV-1 ser classicamente conhecido como causador do herpes

labial e o HSV-2 como causador do herpes genital, podemos encontrar infecções

por HSV-2 no sítio labial e por HSV-1 no trato genital (Bhattarakosol et al., 2005).

O VZV é o causador da catapora em crianças e herpes zoster na reativação da

latência, e o EBV é associado com a mononucleose infecciosa e com o linfoma de

Burkitt. Além do mais, todas as infecções por herpesvírus humanos, até mesmo

aquelas que produzem preferivelmente infecções benignas em indivíduos normais,

podem causar doença grave em pacientes imunodeprimidos. Por exemplo,

pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) podem

apresentar lesões cutâneas herpéticas crônicas e/ou disseminadas, e podem ter

5

recorrências freqüentes de herpes zoster disseminada. A infecção por HCMV pode

causar retinite, sendo a causa mais comum de cegueira em pacientes aidéticos,

além de ser associado com morbidade e mortalidade significantes em transplantes

de órgãos sólidos ou em receptores de transplantes de medula óssea. E o HHV-8

pode causar o sarcoma de Karposi em pacientes aidéticos, sendo esta uma

efermidade classicamente associada com a AIDS (Boehmer & Lehman, 1997;

Gilbert; Bestman-Smith & Boivin, 2002).

1.3) HSV-1

Como todos os herpesvírus, o HSV-1 é um vírus envelopado, que possui

genoma de DNA dupla fita linear dentro de um capsídeo icosaédrico que consiste

de 162 capsômeros (Kimberlin, 2003, p. 83). O nucleocapsídeo é circundado por

um tegumento protéico, que é composto majoritariamente pela proteína ICP5, e

também pelas proteínas VHS e -TIF, e por um envelope, onde estão inseridas

glicoporteínas codificadas pelo próprio vírus (Metttenleiter, 2004). O capsídeo

mede cerca de 100nm e a partícula viral completa do HSV-1 mede cerca de

150nm (Flakow, 1996) (Figura 5).

6

Figura 5: Eletromicrografia do HSV-1

(http://darwin.bio.uci.edu/~faculty/wagner/hsv2f.html).

O genoma consiste de dois segmentos de DNA covalentemente ligados,

designados de L (longo) e S (curto). Cada segmento consiste de uma seqüência

única flanqueada por repetições invertidas. Adicionalmente, os componentes

únicos L e S (UL e US, respectivamente) podem inverter um em relação ao outro,

criando quatro tipos diferentes de moléculas de DNA que diferem somente na

orientação das suas seqüências de DNA. Cada um dos quatro isômeros é

igualmente virulento na célula hospedeira (Kimberlim, 2003; Whitley & Roizman,

2001) (Figura 6). Após a infecção, o genoma viral linear circulariza-se e a

replicação do DNA é iniciada em um sítio denominado origem de replicação. A

eliminação da necessidade de um mecanismo especializado para replicar a

extremidade cromossômica é uma clara vantagem desta circularização (Boehmer

& Lehman, 1997).

7

Figura 6: Diagrama representativo da estrutura do genoma do HSV-1. As posições das repetições

a, b e c nas repetições terminais (TRL e TRS) e nas repetições internas (IRL e IRS), e as posições

das origens de replicação do DNA (oriL e oriS) estão sendo indicadas. A posição e a direção da

transcrição dos sete genes essenciais são indicados pelas setas. A área aumentada mostra a

composição da seqüência a, consistindo de repetições diretas (DR) 1, 2 e 3, e dos domínios únicos

(U) b e c. Abreviações: U, único; t, terminal; n, número variável de cópias; , orientação invertida; L,

longo; S, curto Sem escala (Boehmer & Lehman, 1997, p. 349).

1.4) Ciclo de Multiplicação do HSV-1

1.4.1) Adsorção, penetração e transporte intracelular

As etapas iniciais do ciclo de multiplicação do HSV-1 compreendem a

adsorção e a fusão. As cadeias de glicosaminoglicanas (GAGs) na superfície

celular, dentre as quais podemos ressaltar as heparan sulfato, fornecem sítios de

adsorção, uma vez que podem interagir com as glicoproteínas B e C do envelope

do HSV-1 (Scanlan et al., 2005) (Figura 7a). De acordo com o modelo atual para a

entrada do HSV-1, as heparans sulfato possuem um papel importante na

aderência das glicoproteínas virais C (gC) e B (gB) na superfície da célula alvo

(Tiwari et al., 2005, p. 930). Após isso, ocorre a ligação da glicoproteína viral D

8

(gD) com um de seus receptores da superfície celular (Figura 7b), que em

associação com outras 3 glicoproteínas: gB e o complexo gH/gL, leva a fusão do

envelope viral com a membrana plasmática da célula alvo (Figura 7c). Vários

receptores celulares para a gD do HSV-1 são conhecidos. Estes incluem o

herpesvirus entry mediator (HVEM), que é um membro da família do receptor do

fator de necrose tumoral (TNF), 2 membros da família de receptores da nectina, e

uma isoforma modificada da heparan sulfato: a heparan sulfato 3-O sulfatada (3-

OS HS). As modificações enzimáticas nas heparans sulfato para gerar as 3-OS

HS são catalisadas pela enzima sulfotransferase 3-O. O 3-OS HS é um receptor

de gD diferente das outras duas proteínas receptoras, porque ele é um

polissacarídeo que contém resíduos sulfatados específicos e atua como um

receptor para a adsorção assim como para a fusão, durante a entrada do HSV-1

(Tiwari et al., 2005; Scanlan et al., 2005). Estes receptores são expressos em

diferentes células e tecidos, determinando um importante papel na definição da

preferência viral para invadir células e tecidos específicos (Tiwari et al., 2005). Por

exemplo, o HVEM é expresso em muitos tecidos humanos fetais e adultos,

incluindo pulmão, fígado, rim, e tecidos linfóides (Tiwari et al., 2005) Por outro

lado, o receptor da nectina-1 é extensivamente expresso em células humanas de

origem epitelial e neuronal, assim como na córnea humana, enquanto o receptor

da nectina-2 é amplamente expresso em muitos tecidos humanos, mas com

somente uma expressão limitada em células neuronais e em queratinócitos. Já o

receptor não protéico 3-OS HS é expresso em muitas linhagens de células

humanas, como células neuronais e endoteliais (Tiwari et al., 2005).

9

Figura 7: Esquema representativo da entrada do HSV-1 na célula hospedeira

(http://darwin.bio.uci.edu/~faculty/wagner/hsv4f.html).

Em seguida, o nucleocapsídeo nú (desenvelopado) é transportado para o

núcleo da célula, sendo que proteínas do tegumento parecem ainda estarem

associadas com o capsídeo. Depois que o nucleocapsídeo alcança os poros do

núcleo, o DNA viral é translocado no nucleoplasma (Garner, 2003). A proteína do

tegumento denominada VHS (virus host shutoff), produto do gene UL41,

permanece no citoplasma e interage com uma proteína celular para degradar

(a)

(b)

(c)

(d)

10

RNAm do hospedeiro logo após a infecção. A -TIF (VP16), outra proteína do

tegumento, é liberada no núcleo juntamente com o DNA viral e regula a expressão

de genes (como será visto mais adiante) (Whitley & Roizman, 2001) (Figura 7d).

1.4.2) Etapa de Replicação

O ciclo lítico do HSV-1 envolve a expressão de três conjuntos de genes

virais: Imediatamente iniciais ou de fase , iniciais ou de fase

e tardios ou de

fase

(Hancock, Corcoran & Smiley, 2006). Na fase

são produzidas

principalmente proteínas que regulam a replicação viral, na fase

são produzidas

proteínas que sintetizam e empacotam o DNA viral, e na fase

são produzidas

proteínas que, em sua maioria, constituem o vírion (Whitley & Roizman, 2001). A

fase

tem início quando a proteína do tegumento viral, -TIF, se liga aos fatores

celulares HCF e OCT-1, e o complexo resultante (denominado complexo de pré-

iniciação) associa-se a seqüências alvo específicas nos promotores dos genes de

fase , situados no genoma viral (Hancock, Corcoran & Smiley, 2006) (Figura 8).

Então, inicia-se a produção de proteínas de fase . O HSV-1 codifica 5 genes de

fase : as proteínas de célula infectada 0, 4, 22, 27 e 47 (ICP0, ICP4, ICP22,

ICP27 e ICP47, respectivamente) (Quinn; Dalziel & Nash, 2000) A ICP0, atua

como um transativador promíscuo de genes, estimulando a expressão de genes

do HSV pertencentes a todas as três classes temporais (fases ,

e ) durante a

infecção lítica (Hancock, Corcoran & Smiley, 2006). A ICP4 é uma proteína

ligadora de DNA que interage com fatores de transcrição para ativar a transcrição

11

da maioria dos genes de fase

e , e reprimir a transcrição de certos genes de

fase

(Olesky, 2005). Mesmo não sendo essencial para a replicação do HSV-1

em cultura, a ICP22 é necessária para uma expressão eficiente de genes de fase

, assim como um subconjunto de genes de fase

(O Toole et al., 2003). A ICP27

reprime a expressão de certas proteínas de fase

e , e induz a expressão de

proteínas de fase

(Olesky, 2005). A ICP27 também contribui para a diminuição

na expressão de genes celulares pela inibição do processamento do pré-RNAm

(Lindberg & Kreivi, 2002). A ICP47 se liga às proteínas transportadoras TAP1 ou

TAP2 e as impede de transportar peptídeos para o retículo endoplasmático, para o

acoplamento ao MHC de classe I (Whitley & Roizman, 2001). As proteínas de fase

incluem as enzimas que são necessárias para a replicação do genoma viral:

DNA polimerase (complexo UL30/UL42); timidina cinase (TK); proteína ligadora de

DNA fita simples (SSB), também conhecidas como ICP8; DNA helicase-primase;

proteína ligadora de origem (proteína UL9); e aquelas envolvidas no metabolismo

de nucleotídeos (Figura 9). Homólogos destas enzimas são encontrados

virtualmente em todos os herpesvírus. O programa temporal de expressão dos

genes termina com o aparecimento das proteínas de fase , que constituem as

proteínas estruturais da partícula viral (Boehmer e Lehman, 1997).

12

Figura 8: Formação do complexo de pré-iniciação (Wysocka & Herr, 2003, p. 295).

13

14

Figura 9: Modelo da replicação do DNA do HSV-1. 1-3: Sucessiva ligação, giro e distorção de oriS

pela proteína UL9. I, II e A+T representam os sítios de reconhecimento da proteína UL9 (os Boxes

I e II, e a região A+T, respectivamente). As setas convergentes indicam a orientação relativa dos

Boxes I e II. As setas divergentes indicam a transcrição dos promotores de ICP4 e de ICP22/47. 4:

Ligação de ICP8 com a proteína UL9 e o DNA distorcido. 5: Desenrolamento do DNA, dependente

de ATP, que gera fitas de DNA cobertas por ICP8. 6A: Recrutamento da DNA helicase-primase

15

(UL8-5/52) pela proteína UL9, seguida pela síntese do primer (linha curvada) e dissociação da

proteína UL9. 6B: Recrutamento da DNA polimerase -primase (Pol -Primase) pela proteína UL9,

seguida pela síntese do primer (linha curvada) e pelo alongamento, e a dissociação da proteína

UL9 e da DNA polimerase -primase. 7: Desenrolamento da bolha de replicação e inserção do

primer na fita atrasada pela DNA helicase-primase. Síntese de DNA na fita de leitura e na fita

atrasada promovida pela DNA polimerase do HSV-1 (Pol/UL42). As setas indicam a direção da

translocação das proteínas envolvidas no processo (Bohemer & Lehman, 1997, p. 360-361).

Após a montagem das partículas virais no núcleo da célula hospedeira

(Figura 10), o nucleocapsídeo viral é envelopado, através da fusão com a

membrana nuclear interna, havendo o aumento de vírus envelopados no espaço

perinuclear. Para que as partículas virais possam ser liberadas do núcleo da célula

hospedeira ocorre a fusão do envelope viral com a membrana nuclear externa,

havendo uma acumulação de capsídeos sem envelope no citoplasma. Os

capsídeos são então re-envelopados por vesículas derivadas do complexo de

Golgi. Esta última etapa pode estar sendo mediada por interações entre proteínas

do tegumento viral e porções citoplasmáticas de glicoproteínas virais, que já

estariam inseridas nas vesículas derivadas do Golgi (Melancon et al., 2004)

(Figura 11).

16

Figura 10: Esquema representativo da montagem do nucleocapsídeo viral

(http://darwin.bio.uci.edu/~faculty/wagner/hsv4f.html).

Figura 11: Esquema representativo da liberação das partículas virais de HSV-1 da célula

hospedeira (http://darwin.bio.uci.edu/~faculty/wagner/hsv4f.html).

17

1.4.3) Latência

Após a infecção e replicação local nas mucosas, o HSV-1 pode alcançar o

terminal nervoso. O vírus é conduzido por transporte axonal retrógrado para os

corpos das células nervosas, resultando muito freqüentemente em uma infecção

latente destes neurônios. O padrão temporal de expressão genética não é

observada em células infectadas latentemente, onde a expressão genética viral

restringe-se aos transcritos associados com a latência (LATs) (Quinn; Dalziel &

Nash, 2000). Os principais sítios de latência no homem são os gânglios trigêmios

e dorsais, e uma variedade de estímulos (tais como estresse físico ou emocional,

febre, luz ultravioleta, e lesão tecidual) pode resultar na reativação de vírus

latentes. Estes vírus, então, retornam pelos axônios, produzindo um novo ciclo de

infecção produtiva no sítio da infecção inicial ou próximo deste sítio, podendo

resultar no reaparecimento da doença (Quinn; Dalziel & Nash, 2000; Kimberlin,

2003; Kimberlin & Whitley, 2005) (Figura 12).

18

Figura 12: Latência e reativação do HSV-1. a) Translocação do DNA viral para o núcleo da célula

epitelial; b) Transporte axonal retrógrado; c) Transporte axonal anterógrado

(http://www-ermm.cbcu.cam.ac.uk/03006987h.htm).

Durante o período de latência o HSV-1 associa-se a histonas, formando um

DNA epissomal. Além disso, a latência ocorre principalmente no sistema nervoso

onde há uma maior expressão do fator nuclear OCT-2 em relação a isoforma

OCT-1, que é expressa principalmente em outros tecidos. Na maioria dos tecidos

a proteína do tegumento viral -TIF interage preferencialmente com a proteína

OCT-1. Esta ligação é estabilizada pelo fator HCF proporcionando a formação do

complexo de pré-iniciação junto ao TATA Box do genoma do HSV-1, iniciando a

transcrição de genes de fase alfa e conseqüente infecção produtiva (Preston,

2000).

19

1.5) Algumas das Principais Drogas Utilizadas no Tratamento de Infecções

por HSV-1

1.5.1) Aciclovir e Valaciclovir

O aciclovir (ACV) (Figura 13) é um análogo da deoxiguanosina que atinge

especificamente células infectadas pelo vírus herpes. Isto ocorre porque a primeira

fosforilação que ele sofre é catalisada pela timidina cinase viral. Depois, as

cinases celulares executam as fosforilações subseqüentes, produzindo o aciclovir

trifosfatado, que é a forma biologicamente ativa, atuando como um inibidor

competitivo da DNA polimerase viral (Bredy & Bernstein, 2004; Morfin &

Thouvenot, 2003; Gilbert; Bestman-Smith & Boivin, 2002; De Clercq, 2004). Após

a incorporação do aciclovir trifosfatado na cadeia de DNA, ele atua como um

terminador de cadeia pela ausência do grupo 3 -hidroxil que permitiria o

alongamento da cadeia de DNA (Gilbert, Bestman-Smith & Boivin, 2002) (Figura

14).

Figura 13: Fórmula estrutural do aciclovir e da guanosina

(http://www.geocities.com/gdh5n1/h5n1_9.html).

20

Figura 14: Mecanismo da ação antiviral do aciclovir (ACV). O ACV atua nas DNA polimerases

virais, tal como a DNA polimerase dos herpesvírus. Antes que ele possa interferir com a síntese de

DNA viral, ele necessita ser fosforilado intracelularmente, em três passos, até a forma trifosfatada.

A primeira fosforilação é executada pela timidina cinase codificada pelo HSV, e, portanto,

ocorrendo em células infectadas (De Clercq, 2004, p. 125).

O valaciclovir (Figura 15) é um éster L-valina do aciclovir que atua como uma

pró-droga oral do mesmo. Desse modo, o valaciclovir é absorvido e convertido a

aciclovir no fígado (Bredy & Bernstein, 2004; De Clercq, 2004).

21

Figura 15: Fórmula estrutural do valaciclovir (De Clercq, 2004, p. 125).

1.5.2) Penciclovir e Fanciclovir

O penciclovir (Figura 16) é um análogo da deoxiguanosina e o seu

mecanismo de ação é similar ao do aciclovir. Embora o penciclovir trifosfatado

seja 100 vezes menos potente na inibição da DNA polimerase viral do que o

aciclovir trifosfatado, alcança altas concentrações intracelulares e tem vida longa

nas células infectadas pelo HSV (Bredy & Bernstein, 2004; Gilbert; Bestman-Smith

& Boivin, 2002).

22

Figura 16: Fórmula estrutural do penciclovir (De Clercq, 2004, p. 126).

O fanciclovir (Figura 17) é um éster diacetil do penciclovir que atua como uma

pró-droga oral do mesmo. É bem absorvido no trato gastrointestinal (70%) e a sua

conversão em penciclovir ocorre através da hidrólise de dois grupos acetil e de

uma oxidação na posição 6 (Bredy & Bernstein, 2004; De Clercq, 2004).

Figura 17: Fórmula estrutural do fanciclovir (De Clercq, 2004, p. 126).

23

1.5.3) Foscarnet

O foscarnet (Figura 18) inibe diretamente a DNA polimerase viral e não

necessita ser fosforilado pela timidina cinase viral (Bredy & Bernstein, 2004). O

foscarnet é um análogo do pirofosfato que interfere com a ligação do pirofosfato

(difosfato) com seu sítio de ligação na DNA polimerase viral, durante o processo

de polimerização do DNA (De Clercq, 2004). A inibição da replicação viral é

conseqüência da prevenção da clivagem do pirofosfato do deoxinucleotídeo

trifosfatado, resultando em uma incapacidade de alongar o DNA (Whitley, 2002). A

significante toxicidade limita seu uso contra o HSV somente no caso de infecções

por cepas resistentes ao aciclovir (Bredy & Bernstein, 2004).

Figura 18: Fórmula estrutural do foscarnet (De Clercq, 2004, p. 128).

1.5.4) Cidofovir

O cidofovir (Figura 19), um análogo da citidina, é um aciclonucleosídeo

fosfonatado (ANP) que deve ser fosforilado para sua forma difosfatada por cinases

da célula hospedeira para exercer sua atividade antiviral. O cidofovir difosfatado

inibe seletivamente a DNA polimerase viral, agindo como um terminador de cadeia

24

(Bredy & Bernstein, 2004; De Clercq, 2004; Gilbert; Bestman-Smith & Boivin,

2002) (Figura 20). O cidofovir apresenta uma substancial nefrotoxicidade quando

admininstrado pela via intravenosa e o seu no tratamento de infecções por HSV é

restrito às infecções por cepas resistentes ao aciclovir e ao foscarnet (Bredy &

Bernstein, 2004).

Figura 19: Fórmula estrutural do cidofovir (De Clercq, 2004, p. 128).

25

Figura 20: Mecanismo da ação antiviral do cidofovir (HPMPC). O HPMPC necessita ser

fosforilado, em dois passos, até a forma difosforiladapara, para que ele possa atuar como um

terminador de cadeia (De Clercq, 2004, p. 129).

1.6) Substâncias Testadas neste Trabalho

1.6.1) Derivados 1,4 aminoálcoois contendo anel 1,2,3 triazólico (ou

Derivados Aminoálcoois)

Os derivados aminoálcoois (Figura 24) foram sintetizados tomando como

base um análogo nucleosídico da purina denominado 1- -D-ribofuranosyl-1,2,4-

triazole-3-carboxamide (ribavirina) (Figura 21). A estrutura da ribavirina não é tão

semelhante aos nucleosídeos naturais. Entretanto, ela é similar a estrutura do

26

AICAR, um precursor biossintético das purinas. O AICAR monofosfatado na

posição 5 é um intermediário na síntese de novo de nucleotídeos purínicos.

Quando o anel triazólico está aderido à ribose, a ribavirina parece um análogo

ribonucleosídico, e não um análogo deoxiribonucleosídico. A estrutura do anel

triazólico da ribavirina é muito similar à nicotinamida, que é um componente das

coenzimas envolvidos com várias desidrogenases, como a nicotinamida adenina

dinucleotídeo (NAD) e a nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP). Os

derivados aminoálcoois possuem um anel triazólico em sua estrutura, assim como

a ribavirina. A ribavirina foi primeiramente sintetizada em 1972 (Parker, 2005),

sendo o primeiro nucleosídeo antiviral sintético de amplo espectro (Graci &

Camerom, 2002). Atualmente, a ribavirina tem sido utilizada clinicamente em

combinação com o interferon-

no tratamento de infecções pelo vírus da hepatite

C (HCV) e como monoterapia para o tratamento de infecções pelo vírus da febre

Lassa e pelo vírus sincicial respiratório (Graci & Camerom, 2002). A ribavirina é

admininstrada como um nucleosídeo. Uma vez na célula, é rapidamente

convertida à ribavirina monofosfatada (RMP) pela cinase de adenosina.

Fosforilações seqüenciais levam à formação e acumulação de ribavirina

trifosfatada (RTP) (Graci & Camerom, 2002).

Enquanto.a ribavirina apresenta atividade antiviral em laboratório contra uma

ampla variedade de vírus de DNA e de RNA, o seu mecanismo de ação ainda é

discutido (Graci & Camerom, 2002). A RMP tem se mostrado como um inibidor da

desidrogenase de inosina monofosfatada (IMPDH), uma enzima celular necessária

para a síntese de novo da guanosina trifosfatada (GTP) (Figura 22). Visto que o

27

GTP é necessário para a transcrição, tradução e/ou replicação de todos os vírus,

pequenas reduções no pool de GTP celular poderiam resultar no amplo espectro

da atividade antiviral da ribavirina (Graci & Camerom, 2002). Além do mais, com

alguns vírus, a atividade antiviral da ribavirina é prevenida (pelo menos

parcialmente) pela administração de guanosina. Entretanto, com outros vírus (RSV

e vírus da vaccínia) isto não acontece (Parker, 2005). Então, outros mecanismos

de ação para a ribavirina têm sido propostos. Recentemente, numerosos

pesquisadores têm sugerido que o tratamento com ribavirina induz mutações no

genoma viral de RNA. Estes pesquisadores têm observado que a aumentada

freqüência de mutações resulta na produção de genomas defeituosos. Isto

ocorreria porque a ribavirina poderia parear com a citidina e com a uridina (Parker,

2005) (Figura 23). Contudo, o uso terapêutico da ribavirina é limitado pela sua

toxicidade, que consiste principalmente de anemia, visto que ela pode acumular-

se nas células vermelhas do sangue, causando hemólise, e de teratogenicidade

(Di Stefano et al, 1997; Grancher et al, 2004).

28

Figura 21.: Estrutura da ribavirina e de moléculas semelhantes (Parker, 2005, p. 166).

Figura 22.: Metabolismo das purinas em células humanas. A inibição da IMP desidrogenase

resulta na inibição da produção de GTP e de dGTP. Abreviações: RR, ribonucleotídeo redutase;

APRT, adenina fosforibosiltrasnferase; Ado kinase, quinase de adenosina; HGPRT,

hipoxantina/guanina fosforibosiltrasnferase; PNP, fosforilase de nucleosídeos de purina (Parker,

2005, p. 166).

29

Figura 23.: Capacidade de pareamento promíscuo de bases da ribavirina. Abreviações: R, ribose

(Graci & Camerom, 2002, p. 176).

Os derivados aminoálcoois testados foram: 1) (2S,3S)-6,6-Dimetil-3-(2 -fenil-

2 H-[1,2,3]triazol-4 -ilmetil)-biciclo[3.1.1]heptan-2-ol (ADNHR); 2) (2S,3S)-6,6-

Dimetil-3-(1 -fenil-1 H-[1,2,3]triazol-4 -ilmetil)-biciclo[3.1.1]heptan-2-ol (ADLEHR); 3)

(2S,3S)-3-[1 -(3 -clorofenil)-1 H-[1,2,3]triazol-4 -ilmetil]-6,6-Dimetil- biciclo[3.1.1]

heptan-2-ol (ADClHR); 4) (2S, 3S)-3-[1 -(4 -fluorofenil)-1 H-[1,2,3]triazol-4 -ilmetil]-

6,6-Dimetil- biciclo[3.1.1] heptan-2-ol (ADFHR). Estas substâncias foram

sintetizadas no Departamento de Química Orgânica da UFF pelo aluno Ronaldo C.

S. Júnior, orientado pelo professor Sérgio Pinheiro.

OH

N

N

N

NN

N

OH

NN

N

OH Cl

OH

FNN

N

ADClHR

ADFHRADLEHR

ADNHR

Figura 24: Derivados Aminoálcoois.

30

1.6.2) Derivados 4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridinas-5-carbonitrilas (ou

Derivados do Sistema Tienopiridina).

Desde a descoberta dos derivados 4-anilino-1H-pirazolo[3,4-b]piridina como

uma nova classe de inibidores não nucleosídicos da transcriptase reversa do HIV-

1 (NNRTI) (Bernardino et al., 1996), vários estudos têm sido feitos a fim de

investigar o relacionamento da estrutura com a atividade destes moléculas e,

assim, potencializar sua antividade antiviral (Azevedo et al., 2002a; Azevedo et al,

2002b; Bernardino et al., 1996). Então, a síntese das novas 4-

(fenilamino)tieno[2,3-b]piridinas ocorreu pela reação nucleofílica do 5-carboetoxi-4-

clorotieno[2,3-b]piridina com diferentes anilinas. Desse modo, é esperado que as

substâncias obtidas possam reter o potencial antiviral em comparação aos

derivados pirazolo-piridina parentes.

Além disso, diversas atividades, inclusive atividades biológicas, já foram

descritas para moléculas com o sistema Tienopiridina ou com estruturas

relacionadas. Estas substâncias já foram descritas sendo utilizadas como corantes

(Ho, 2005), atuando na prevenção da arteriosclerose (Suzuki et al., 2001), no

sistema cardiovascular; (McCort, et al., 2001), como anti-inflamatórios (Cardoso et

al., 2002), no tratamento da asma (Cardoso et al., 2002), na prevenção do

reumatismo e da artrite (Beaton et al., 2001), tendo atividade antiprotozoária

(Mello et al., 2004), antitumoral (Hayakawa et al., 2004; Munchhof et al., 2004),

anticonvulsivante (Amano et al., 2004), antibacteriana (Lohray et al., 2004) e

antiviral (Hartline, et al., 2005).

Os derivados do sistema Tienopiridina (Figura 25) (Tabela 1) testados foram:

31

1) 4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (101);

2) 4-(2 -metil-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (102)

3) 4-(4 -metil-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (104);

4) 4-(2 -carboxi-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (105);

5) 4-(3 -nitro-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (109);

6) 4-(4 -nitro-fenilamino)tiieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (110);

7) 4-(3 -flúor-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (112);

8) 4-(4 -flúor-fenilamino)tiieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (113);

9) 4-(4 -bromo-fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-carbonitrila (119).

Estas substâncias também foram sintetizadas no Departamento de Química

Orgânica da UFF pelo aluno Luis Pinheiro, orientado pela professora Alice

Bernardino.

S

NH

CN

S

NH

CN

CH2OH

S

NH

CN

F

S

NH

CN

CH3

S

NH

CN

NO2

S

NH

CN

F

S

NH

CN

CH3

S

NH

CN

O2N

S

NH

CN

Br

102 104101

105 109 110

112 113 119

Figura 25: Fórmula estrutural dos derivados 4-(fenilamino)tieno[2,3-b]piridinas-5-carbonitrilas.

32

2) OBJETIVOS

2.1) Objetivos Gerais

Como as drogas utilizadas no combate a infecção por HSV-1 podem causar

efeitos colaterais e, devido ao surgimento de cepas de HSV-1 resistentes aos

drogas de referência, como o aciclovir, nosso objetivo é encontrar novas

moléculas com atividade anti-HSV-1, baixa citoxicidade e caracterizar o

mecanismo de ação das substâncias mais promissoras.

2.2) Objetivos Específicos

Avaliar a citotoxicidade das substâncias, determinando seu valor de CC50,

através dos ensaios de exclusão do corante vital Azul de Trypan ou de

redução mitocondrial do sal de tetrazolium (MTT). Para algumas substâncias,

também foi avaliado seu efeito na atividade da DNA polimerase

de células

Vero;

Avaliar o potencial antiviral das substâncias através do ensaio de inibição do

efeito citopático viral e do ensaio de inibição da produção de partículas virais;

Determinar o índice de seletividade in vitro da substância mais promissora;

Determinar o possível alvo de ação das substâncias no ciclo replicativo do

HSV-1, avaliando seu efeito na síntese protéica de células infectadas e na

atividade da DNA polimerase viral;

Estudar a citotoxicidade in vivo das substâncias mais promissoras, avaliando

seus efeitos nos níveis de glicose, ácido úrico, uréia e TGP.

33

3) MATERIAL E MÉTODOS

3.1) Células e Drogas

Foram utilizadas células VERO, que são culturas contínuas de fibroblastos de

rim de macaco verde africano (Cercopithecus aethiops). Estas células foram

cultivadas em DMEM (Dulbecco's modified Eagle s medium) contendo 5% de soro

fetal bovino (SFB), 100U/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina e

2,5 g/mL de anfotericina B (fungizona). As culturas foram mantidas a 37ºC em

atmosfera com 5% de CO2. Durante a passagem, as células foram tratadas com

PBS-1X/EDTA (Reagen) e tripsina 0,25% (GIBCO).

Neste trabalho foram testadas substâncias de duas classes: Derivados

aminoálcoois e derivados do sistema Tienopiridina. Todas as substâncias foram

sintetizadas no Departamento de Química Orgânica da Universidade Federal

Fluminense, diluídas em Dimetilsulfóxido (DMSO) 100% e estocadas a 4ºC nas

concentrações de 50mM. Durante os testes, as substâncias foram diluídas em

DMEM com soro.

Foram testados neste trabalho 4 derivados aminoálcoois: ADNHR, ADLEHR,

ADClHR e ADFHR, e 9 derivados do sistema Tienopiridina: 101, 102, 104, 105,

109, 110, 112, 113 e 119.

34

3.2) Ensaio para Avaliação da Citotoxicidade das Substâncias

A citotoxicidade foi avaliada por dois métodos:

a) Ensaio de Exclusão do Corante Vital Azul de Trypan

No primeiro método, células Vero foram cultivadas em placas de 24 poços

em uma densidade de 4 x 104 células/poço Em alguns poços, as células foram

mantidas em contato com os derivados testados em diferentes concentrações e

em outros, nenhuma substância foi adicionada (grupo controle), permanecendo

assim por 72h a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2. Após este período, as

células foram tratadas com PBS/EDTA, tripsinizadas e coradas com Azul de

Trypan a 0,04% em PBS. Assim, a viabilidade celular foi calculada e, depois,

comparamos a viabilidade dos poços tratados com a dos poços controle. A

fórmula utilizada para o cálculo da viabilidade celular foi o seguinte:

b) Ensaio de Redução Mitocondrial do Sal de Tetrazolium (MTT)

No segundo método, células Vero foram mantidas em placas de 96 poços em

uma densidade de 1 x 104 células/poço. Em alguns poços, as células foram

mantidas em contato com os derivados em diferentes concentrações e em outros,

nenhum derivado foi adicionado (grupo controle), permanecendo por 72h a 37ºC

em atmosfera com 5% de CO2. Após esse período, foi adicionado MTT a 5mg/mL.

Viabilidade (%) = No

de Células Viáveis x 100

No

de Células Totais

35

Após 4h de incubação a 37ºC foi adicionado 100 L da solução de 10% de SDS,

0,01N de HCl e após 24h os poços foram analisados em leitor de Elisa a 540 e

620nm. Os resultados foram analisados comparando a absorbância dos poços

tratados com os controles (Mosmann, 1983).

3.3) Obtenção da DNA Polimerase de Células Vero

Um extrato não purificado foi obtido a partir de células Vero não infectadas.

Estas células foram lisadas com um tampão específico contendo 0,25 mM fosfato

de potássio (pH 7,2), 10mM de 2-mercaptoetanol, 1mM EDTA, 0,5% Triton-X-100,

20% de glicerol e 0,5 mM de PMSF. Em seguida, as células foram sonicadas 8X

por 15 segundos e o conteúdo foi centrifugado a 12.000 rpm (Sorvall RCS. 5B) por

10 min a 4ºC (Knopf, 1979).

3.4) Ensaio de Inibição da DNA Polimerase de Células Vero

Com a finalidade de avaliarmos a citotoxicidade das substâncias frente à

enzima DNA polimerase celular , a reação enzimática foi realizada por 30 min a

37ºC em um tampão específico. Este tampão continha, contendo 50 mM Tris-HCl

(pH 8,0), 8 mM de cloreto de magnésio, 0,5 mM DTT, 0,1 mM de dATP, 0,1 mM de

dGTP, 0,1 mM de dCTP, [3H] dTTP (0,5 Ci/nmol), 25 g de DNA ativado (DNA de

esperma de salmão) e a substância testada na concentração de 50 M em um

volume final de 100 L. No final da reação, foi adicionado TCA 10%, e, então, as

36

amostras foram filtradas em filtros de fibra de vidro GF/C (Whatman) previamente

lavados com TCA 10%, e a radioatividade incorporada foi determinada por

cintilação de fase líquida (Knopf, 1979).

3.5) Vírus

As partículas virais (cepa AR-29, resistente ao aciclovir, gentilmente cedida

pela professora Márcia Wigg da Universidade Federal do Rio de Janeiro) foram

diluídas em meio DMEM sem soro e multiplicadas em células Vero, utilizando-se

uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 (Lagrota et al., 1994; Esquenazi et al.,

2002). Após 24h pós-infecção (p.i.), as células foram lisadas por ciclos de

congelamento e descongelamento. O conteúdo foi centrifugado a 400x g por

20min a 4ºC e o título viral foi dosado pelo ensaio de redução de placas virais

(Kuo et al., 2001).

3.6) Ensaio de Redução de Placa Virais

Para determinarmos o título viral, células Vero, mantidas em placas de 6

poços em uma densidade de 3x105 células/poço, foram infectadas com diferentes

diluições de HSV-1 por 1h a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2. Após este

período, o inóculo viral foi retirado e as monocamadas cobertas com DMEM com

5% de soro fetal bovino e 1% de Metilcelulose (Fluka) (meio para ensaio de

redução de placas virais). Após 72h as monocamadas de células foram fixadas

com 10% de formaldeído e coradas com 0,1% de cristal violeta. Em seguida as

37

placas virais foram contadas e o título do vírus foi determinado de acordo com o

número de placas virais (PFU/mL).

3.7) Ensaio de Inibição do Efeito Citopático

A avaliação da inibição do efeito citopático viral pelas substâncias foi

realizada em células Vero, mantidas em placas de 96 poços (1 x 104 células/poço)

e infectadas com diferentes diluições de HSV-1 durante 1h a 37ºC em atmosfera

com 5% de CO2. Após este período, o inóculo viral foi retirado e as células foram

tratadas com as substâncias nas concentrações de 50 M. Após 72h, o título viral

foi determinado na presença e na ausência dos derivados. Ao comparar o título do

grupo controle (células infectadas apenas) com o do grupo tratado (células

infectadas e tratadas), determinamos a porcentagem de inibição do efeito

citopático viral causado pelas substâncias testadas (Reed & Muench, 1938).

3.8) Ensaio de Inibição da Produção de Partículas Virais

Células Vero, mantidas em placas de 24 poços em uma densidade de 1 x 105

células/poço, foram infectadas com HSV-1 utilizando-se MOI de 1 por 1h a 37ºC

em atmosfera com 5% de CO2. Após esse período as células foram tratadas com

diferentes concentrações dos derivados em DMEM contendo 5% de SFB. As

células foram lisadas por 3 ciclos de congelamento e descongelamento 20h p.i. O

sobrenadante foi titulado pelo ensaio de inibição do efeito citopático.

38

3.9) Efeito do Tratamento na Síntese Protéica de Células Infectadas

Células foram mantidas em garrafas de cultura de 25 cm2 (2 x 106 células) e

infectadas ou não com HSV-1 com MOI de 1 por 1h a 37ºC. Em seguida, o vírus

residual foi lavado e as células foram incubadas na presença ou ausência de do

derivado 109 na concentração de 50 M. Após 4h de infecção foi adicionado [35S]-

Metionina (50 Ci/mL) e mantido por 2h quando as culturas foram lisadas com T

(Tris-HCl (pH 6,8) 1M; azul de bromofenol 0,02%; -mercaptoetanol 5%; SDS

10%; glicerol 10%).

Para que fosse realizada a mensuração da radiação por cintilação de fase

líquida, as amostras foram tratadas com TCA 10% e filtradas em filtros de fibra de

vidro (Whatman) GF/A.

3.10) Obtenção da DNA Polimerase de HSV-1

Células Vero foram infectadas com MOI de 5 por 12h em atmosfera com 5%

de CO2. Após esse período foi adicionado um tampão específico (0,25 mM fosfato

de potássio (pH 7,2), 10mM de 2-mercaptoetanol, 1mM EDTA, 0,5% Triton-X-100,

20% de glicerol e 0,5 mM de PMSF), as células foram sonicadas 8X por 15

segundos e o conteúdo foi centrifugado a 12.000 rpm (Sorvall RCS. 5B) por 10

min a 4ºC (Knopf, 1979).

39

3.11) Ensaio de Inibição da DNA Polimerase de HSV-1

A reação enzimática foi realizada por 30 min a 37ºC em um volume final de

100 L, contendo 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 mM DTT, 8 mM MgCl2, 100 mM

sulfato de amônia, 0,1 mM dNTP, sendo [3H]-dTTP (0,5 Ci/nmol) e 25 g de DNA

de esperma de salmão desnaturado. Os derivados aminoálcoois foram testados

na concentração de 50 M e o derivado 109 na concentração de 0,1 nM. Após

esse período a reação foi interrompida pela adição de TCA 10%. As amostras

foram filtradas em filtros de fibra de vidro GF/C (Whatman) previamente lavados

com TCA 10%, e a radioatividade incorporada foi determinada por cintilação de

fase líquida (Knopf, 1979).

3.12) Estudo da Toxicidade in vivo

Foram injetados 250 L do derivado 109 na concentração de 2mg/mL em

cada animal (ficando em uma concentração final em torno de 300 M/g), sendo

que nos controles foram injetados 250 L de DMSO 1%, e avaliada a sua influência

nos níveis sangüíneos de glicose, uréia, ácido úrico e de transaminase glutâmico-

pirúvica (TCP).

Para a dosagem dos níveis destas substâncias, camundongos foram

sangrados pela região retro-orbital anteriormente e após o tratamento, e a amostra

de sangue ficou em repouso por 2h, sendo, posteriormente, centrifugada à 1500

r.p.m. por 10 minutos. No caso específico da avaliação dos níveis de glicose,

40

também foi adicionado o anticoagulante fluoreto de potássio. Todos os

camundongos utilizados eram fêmeas, da linhagem Balb/c, com 20 a 25g de peso

e 2 meses de idade.

A quantificação da glicose, da uréia, do ácido úrico e do TCP foi feita com kits

(Gold Analisa Diagnóstica) específicos para cada um, por método enzimático

colorimétrico. Este experimento foi realizado no Departamento de Imunologia da

UFF pela aluna Valéria Garrido Martins, orientada pelas professoras Izabel

Frugulhetti e Gerlinde Teixeira.

A análise estatística dos dados foi feita utilizando o programa Excel, para

Windows. A significância dos dados foi determinada através do teste t de Student.

Utilizamos um intervalo de confiança de 95%; logo, valores de P < 0,05 foram

considerados significativos.

41

4) RESULTADOS

4.1) Avaliação da Citotoxicidade

A citotoxicidade foi definida por Nardone (1977) como sendo o conjunto de

alterações da homeostase celular que leva a uma série de modificações que

interferem na capacidade adaptativa das células, bem como na sobrevivência,

multiplicação e realização de suas funções metabólicas. A intensidade da lesão

celular depende de vários fatores, tais como a concentração do material testado, o

tempo de exposição, o tipo de célula, a capacidade da substância em penetrar na

célula, entre outras (Hu & Hsiung, 1989).

Para avaliar a citotoxicidade das substâncias testadas, utilizamos os ensaios

de exclusão do corante vital Azul de Trypan ou da redução mitocondrial do sal de

tetrazolium (MTT). Por meio destes métodos, buscamos a concentração das

substâncias necessária para inibir em 50% a viabilidade de células Vero (CC50).

Foi observado que entre os derivados aminoálcoois, as moléculas que

apresentavam radicais halogenados foram as que exibiram menores

citotoxicidades. A molécula que apresentava radical cloro (ADClHR) e a que

apresentava o radical flúor (ADFHR) apresentaram valores de CC50 > 200 M e

>300 M, respectivamente (Tabela 1).

42

Tabela 1: CC50 dos derivados aminoálcoois.

Derivados Aminoálcoois CC50 ( M)

ADNHR >75ADLEHR <200

ADClHR >200

ADFHR >300

Em relação aos derivados do sistema Tienopiridina, foi observado que, em

geral, todos os valores de CC50 destas substâncias foram bastante próximos entre

si. Vale ressaltar que dentre estas moléculas, aquela sem substituição no anel

fenilamino (derivado 101) exibiu a menor citotoxicidade, apresentando um valor de

CC50 >300 M (Tabela 2).

Tabela 2: CC50 dos derivados do sistema Tienopiridina.

Derivados Tieno-Piridina Radical CC50 ( M)

101 R = H >300104 R = p-CH3 <300

109 R = m-NO2 <300

110 R = p-NO2 <300

112 R = m-F <300113 R = p-F <300119 R = p-Br <700

4.2) Ensaio de inibição da Atividade da DNA Polimerase de Células Vero

As DNA polimerases são enzimas fundamentais que participam do processo

de replicação do DNA (Holmberg, Henry & Romesberg, 2005). A inibição da

atividade destas enzimas poderia ser um possível mecanismo de citotoxicidade

43

das substâncias testadas. Sendo assim, avaliamos a influência dos derivados na

atividade da enzima DNA polimerase

celular, isoladas de células Vero. Foi

observado que nenhum dos derivados aminoálcoois inibiu a atividade desta

enzima (Figura 26).

Efeito dos Aminoálcoois na DNA Polimerase Alfa de Células Vero

0,0

25,0

50,0

75,0

100,0

125,0

150,0

ADNHR ADLEHR ADClHR ADFHR Controle

C.

P.

M (

% d

o C

on

tro

le)

Figura 26: Efeito dos derivados aminoálcoois na atividade da enzima DNA polimerase

de

células Vero. Os resultados foram expressos em % do controle desvio padrão da média (n = 3).

4.3) Avaliação da Atividade Antiviral

Para avaliar se as substâncias estudadas apresentavam potencial antiviral,

foi utilizado o teste de inibição do efeito citopático viral (Reed & Muench, 1938).

Efeito citopático é o conjunto das modificações provocadas pelas partículas virais

nas células hospedeiras. A maioria dos vírus provoca modificações celulares

específicas e possíveis de se observar ao microscópio. No caso do HSV, o efeito

citopático se expressa pelo aparecimento de células arredondadas, brilhantes,

44

freqüentemente ligadas umas às outras por prolongamentos citoplasmáticos,

formando focos de infecção. Esses focos têm aspecto característico de cachos de

uva, que se estendem pelo tapete celular, desorganizando-o (Girard & Hirth,

1989).

Com relação aos derivados aminoálcoois, os melhores resultados foram

obtidos com as moléculas sem a inserção de radicais halogenados. O ADNHR e o

ADLEHR, que não possuem tais radicais, apresentaram inibições do efeito

citopático maiores que 90%. Por outro lado, a molécula ADClHR, que apresentava

a inserção de um radical cloro, apresentou uma inibição do efeito citopático um

pouco inferior, atingindo cerca de 75% (Tabela 3).

Tabela 3: Inibição do efeito citopático causada pelos derivados aminoálcoois (n = 3).

Derivados Aminoálcoois Inibição (%) Desvio Padrão ( )ADNHR 94 1,7ADLEHR 92 2,6ADClHR 75 6,0

Com relação aos derivados do sistema Tienopiridina, a inibição do efeito

citopático viral variou bastante de acordo com os radicais e sua posição (Tabela

4). Dentre os derivados deste sistema, o derivado 109, com radical nitro na

posição meta, foi o que melhor inibiu o efeito citopático viral, atingindo 99% de

inibição. Além do mais, a posição deste radical foi crítica para este efeito, visto que

o derivado 110, com este mesmo radical, porém na posição para, não apresentou

inibição do efeito citopático viral.

45

Tabela 4: Inibição do efeito citopático causada pelos derivados do sistema Tienopiridina (n = 2-3).

* Aumentou os títulos virais, portanto apresentou inibição de 0%.

Derivados Tienopiridina Radical Inibição (%) Desvio Padrão ( )101 R = H 79 6,2

102 R = o-CH3 66 7,0

104 R = p-CH3 9 5,7

105 R = o-H3CO 71 4,4

109 R = m-NO2 99 0,7

110 R = p-NO2 0 *112 R = m-F 35 7,1113 R = p-F 82 4,4119 R = p-Br 78 3,6

4.4) Determinação do EC50 e do S.I. do Derivado 109

Através da triagem feita inicialmente, o derivado 109 mostrou-se o mais

promissor, e, por isso, continuamos o estudo desta substância. Para determinar,

então, a concentração efetiva desta molécula capaz de inibir 50% da produção de

partículas virais (EC50), foi realizada regressão não-linear a partir de uma curva

com várias concentrações do derivado 109. Foi observada uma inibição da

replicação do HSV-1 de maneira dose-dependente, atingindo valor de EC50 em

torno de 100pM (Figura 27).

y = 5,6011Ln(x) + 97,593

0

25

50

75

100

0,001 0,01 0,1 1

Concentração do Composto 109 (uM)

Inib

ição

da

Pro

du

ção

de

Par

tícu

las

Vir

ais

(%)

Figura 27: Inibição da produção de partículas virais pelo derivado 109 (n = 2).

46

Com base nos valores de CC50 e EC50, foi calculado o valor do índice de

seletividade (S.I.), que representa o grau de segurança para a utilização de uma

substância in vitro . Este parâmetro farmacológico foi calculado através da razão

entre o CC50 e o EC50 da substância. O derivado 109 apresentou seu S.I. em torno

de 3 x 106, enquanto que o do aciclovir é da ordem de 103.

4.5) Ensaio de Inibição da Atividade da DNA Polimerase Viral

Para isto, utilizamos a DNA polimerase do HSV-1 obtida a partir do extrato de

células Vero infectadas. Para evitar a ocorrência de atividades inespecíficas

derivadas de possíveis DNA polimerases celulares contaminantes, foi adicionado

ao meio de reação 100mM de sulfato de amônio.

Os resultados apresentados na figura 28 mostraram que não houve inibição

da atividade enzimática por nenhum dos derivados aminoálcoois na concentração

de droga testada (50 M).

Efeito dos Aminoálcoois na DNA Polimerase de HSV-1

0,0

25,0

50,0

75,0

100,0

125,0

150,0

ADNHR ADLEHR ADClHR ADFHR Controle

C.

P.

M (

% d

o C

on

tro

le)

Figura 28: Efeito dos derivados aminoálcoois (50 M) na atividade da enzima DNA polimerase

viral. Os resultados foram expressos em % do controle desvio padrão da média (n = 3).

47

Dentre os derivados do sistema Tienopiridina, testamos a substância mais

promissora, o derivado 109, na concentração do seu EC50 (100 pM). Podemos

destacar que houve uma inibição da atividade enzimática em torno de 50%,

indicando que este deve ser o principal alvo da ação do derivado 109 (figura 29).

Efeito do Composto 109 na DNA Polimerase de HSV-1

0

25

50

75

100

125

150

Composto 109 Controle

C.

P.

M.

(% d

o C

on

tro

le)

Figura 29: Efeito do derivado 109 (100 pM) na atividade da enzima DNA polimerase viral. Os

resultados foram expressos em % do controle

desvio padrão da média (n = 2).

4.6) Efeito do Derivado 109 na Síntese Protéica de Células Infectadas

Estudos realizados primeiramente na década de 70 mostraram que o vírus

Herpes é capaz de provocar uma inibição da síntese de macromoléculas da célula

hospedeira (Fenwick & Walker, 1978). Então, neste experimento avaliamos se o

derivado mais promissor, o 109, seria capaz de reverter a inibição da síntese de

proteínas de células Vero causada pelo vírus através de pulso de [35S]-Metionina.

As células Vero foram divididas em quatro grupos: controle (Figura 30 - C),

infectado (Figura 30 - I), controle tratado (Figura 30 - CT) e infectadas e tratadas

48

(Figura 30 - IT). Como era esperado, houve uma inibição da síntese protéica de

células infectadas com HSV-1 (Figura 30 - I). Apesar da inibição da síntese

protéica celular induzida pelo derivado 109 (Figura 30 - C e CT), o tratamento das

células infectadas com este derivado na concentração de 50 M aumentou em

torno de quatro vezes (Figura 30 - IT) a síntese protéica total em comparação ao

infectado não tratado (Figura 30 - I).

Incorporação com Metionina

0

50

100

C CT I ITCP

M (

% d

o C

on

tro

le)

Figura 30: Efeito do derivado 109 na síntese protéica de células infectadas. Os resultados foram

expressos em % do controle desvio padrão da média (n = 3).

4.7) Avaliação da Toxicidade in vivo do Derivado 109

A toxicidade in vivo do derivado 109 foi avaliada em relação aos seguintes

parâmetros bioquímicos: níveis de glicose, ácido úrico, uréia e transaminase

glutâmico-pirúvica (TGP) no sangue de camundongos, uma vez que a dosagem

destas substâncias pode dar informações importantes sobre possíveis alterações

metabólicas que possam estar sendo induzidas pela administração das

substâncias testadas.

49

Glicose

0

30

60

90

120

150

180

0 1 2 3 4 5 6 7 8Animais

Co

nce

ntr

ação

(m

g/d

L)

Antes

Depois

Ácido Úrico

012345678

0 1 2 3 4 5 6 7 8Animais

Co

nce

ntr

ação

(m

g/d

L)

Antes

Depois

Uréia

0

20

40

60

80

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Animais

Con

cent

raçã

o (m

g/dL

)

Antes

DepoisTGP

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8Animais

Co

nce

ntr

ação

(U/L

)

AntesDepois

Figura 31: Avaliação da toxicidade in vivo do derivado 109 (300 M/g). Foram dosados no sangue

de camundongos antes e depois do tratamento os (a) níveis de glicose, (b) níveis de acido úrico,

(c) níveis de uréia e os (d) níveis de TGP. Os pontos azuis representam a dosagem antes do

tratamento e os pontos rosa a dosagem após o tratamento. Nos animais 7 e 8 foi administrado

apenas DMSO.

Observamos que, na concentração testada (em torno de 300 M/g), o

derivado 109 levou a aumentos significativos dos níveis de glicose, TGP e de

uréia, em relação aos animais não tratados. O único parâmetro que não se

comportou deste modo foram os níveis de ácido úrico (Figura 31). Entretanto, esta

dose utilizada foi bem maior que o valor de seu EC50 e, mesmo assim, não foi letal

para os camundongos, visto que nenhum dos animais morreu como resultado do

tratamento.

(a) (b)

(c) (d)

50

5) Discussão

A grande incidência de doenças causadas por vírus acomete uma parcela

significativa da população humana mundial. Sendo assim, estudos que visam o

controle de propagação e manifestação de tais doenças, além da inativação

destes patógenos, seriam de grande interesse, incluindo os estudos relacionados

com o desenvolvimento de novos fármacos com este tipo de atividade. Contudo,

em contraste com a enorme quantidade de fármacos antibacterianos e

antifúngicos, o atual arsenal terapêutico antiviral compreende em torno de 40

fármacos, sendo a maioria destes utilizados no tratamento de infecções pelo HIV

(De Clercq, 2004). Uma das principais razões para a falta de sucesso no

desenvolvimento de fármacos antivirais é a natureza dos vírus, os quais possuem

uma estrutura extremamente simples e um sistema enzimático bastante restrito,

sendo totalmente dependentes dos processos metabólicos celulares para sua

multiplicação. Assim, agentes que inibem a replicação viral, em geral, também

exibem certo grau de toxicidade às células hospedeiras (White & Fenner, 1994).

O bioisosterismo consiste em uma maneira racional de se obter novas

moléculas que possam apresentar atividade biológica, utilizando como modelo

uma substância com estrutura e atividade biológica conhecida, e, a partir daí,

sintetizar e avaliar novos análogos estruturais da droga conhecida.

Desse modo, os derivados aminoálcoois foram sintetizados tomando como

base a ribavirina, que é um nucleosídeo antiviral sintético de amplo espectro. Os

derivados aminoálcoois possuem um anel triazólico, que também está presente na

51

ribavirina. A ribavirina inibe a replicação de vários vírus de DNA e de RNA,

incluindo ortomixo-, paramixo-, arena-, bunia-, herpes-, adeno-, pox, e retrovírus

(Gilbert & Knight, 1986; Huggins, 1989). A ribavirina possui um anel triazólico

ligado a uma ribose, mimetizando um ribonucleosídeo. Então, numerosos

pesquisadores têm encontrado recentemente que o tratamento com a ribavirina

induz mutações em genomas de vírus de RNA, visto que é capaz de parear tanto

com a citidina, quanto com a uridina (Parker, 2005; Graci & Cameron, 2002).

Entretanto, a atividade antiviral da ribavirina não é observada somente em vírus

com genoma de RNA. Desse modo, já é bem documentado que o tratamento de

células com ribavirina resulta na inibição da Desidrogenase de Inosina

Monofosfatada (IMPDH), visto que a RMP compete com o IMP (o substrato natural

da IMPDH), diminuindo os níveis intracelulares de GTP. A diminuição da

quantidade destes nucleotídeos certamente interferiria com a replicação viral, visto

que os vírus, assim como as células hospedeiras, são dependentes do GTP e do

dGTP para a replicação do material genético. Então, é provável que a inibição da

IMP desidrogenase seja responsável pela toxicidade da ribavirina em células

humanas e, também, por sua atividade antiviral de amplo espectro. Este

desequilíbrio no pool de nucleotídeos poderia fazer com que a polimerase viral

substituísse o GTP por nucleotídeos alternativos (ATP, UTP ou CTP), mas para

que a inibição da IMPDH seja um alvo antiviral efetivo, a replicação viral teria que

ser mais sensível ao declínio dos níveis intracelulares de GTP do que as células

hospedeiras (Parker, 2005).

Os derivados do sistema Tienopiridina também foram sintetizados explorando

52

este conceito de bioisosterismo para o planejamento de moléculas bioativas.

Foram observadas características estruturais de dois derivados do sistema

Pirazolopiridina que apresentaram atividade antiviral (Bernardino et al., 1996),

onde um deles apresentou atividade antiviral frente à enzima Transcriptase

Reversa do HIV-1 e o outro frente ao vírus Vaccínia (Azevedo et al. 2002). O

grupo fenilamino presente nessas moléculas na posição C-4 foi mantido, e por

bioisosterismo de anel entre os anéis pirazol e tiofeno foi proposta a síntese de

alguns derivados do sistema Tienopiridina: os 4-(Fenilamino)tieno[2,3-b]piridina-5-

carbonitrilas, que incluem todos o derivados do sistema Tienopiridina presentes

neste trabalho. O sistema Tienopiridina está presente em substâncias que

apresentam atividade antiviral, já tendo sido descritas moléculas que inibem o

vírus HSV-1 (Hartline et al., 2005; Pinheiro et al., 2004) e que apresentam

atividade frente ao HIV-1 (Bellarosa et al.,1996).

Isto faz com que tanto os derivados aminoálcoois aqui testados, quanto os

derivados do sistema Tienopiridina presentes neste trabalho sejam substâncias

promissoras, que necessitam de uma avaliação biológica para verificar a

existência de um possível potencial antiviral. Os requisitos essenciais para um

fármaco antiviral são sua eficácia e o mínimo de toxicidade às células hospedeiras

(Vanden-Berghe, Vlietinck & Van-Hoof, 1986). Assim, a relação entre os efeitos

farmacológicos e tóxicos de uma substância é um requisito importante quando se

está verificando sua aplicabilidade como agente terapêutico (Melo, 2000).

Nossos resultados demonstraram que em relação aos derivados

aminoálcoois, as moléculas halogenadas se mostraram menos citotóxicas em

53

relação àquelas não halogenadas (Tabela 2). Porém, as moléculas halogenadas

apresentaram valores menores de inibição do efeito citopático do HSV-1, sendo

menos efetivas contra este vírus (Tabela 4). Já os derivados do sistema

Tienopiridina apresentaram, em geral, valores de citotoxicidade bem semelhantes,

sendo que o derivado sem substituinte no anel fenilamino (derivado 101) foi o que

apresentou o valor de CC50 mais promissor (Tabela 3). Contudo, a atividade

antiviral não teve relação direta com os diferentes radicais presentes, variando

bastante de acordo com o radical inserido, assim como com a sua posição na

molécula (Tabela 5). Por exemplo, comparando a atividade antiviral do derivado

110, que possui o radical nitro na posição para, com o derivado 109, que possui o

radical nitro na posição meta, podemos observar uma variação de zero até

aproximadamente 100% de inibição do efeito citopático, respectivamente. Mas

quando comparamos os derivados 112 e 113, radical flúor nas posições meta e

para, respectivamente, é observado o inverso. O derivado com radical flúor na

posição meta não apresentou uma atividade antiviral significativa, enquanto o que

apresenta o radical na posição para exibe uma melhor atividade. Isto demonstra

que a atividade não tem correlação com a posição do radical.

Como as células eucarióticas possuem um repertório de DNA polimerases,

onde há pelo menos três DNA polimerases envolvidas com a replicação ( ,

e ),

uma DNA polimerase mitocondrial ( ), e pelo menos doze tipos de DNA

polimerases com função de reparo ( , , , , , , , , , ,

e REV1) (Kuriyama

et al., 2005) e sabendo que a DNA polimerase

é uma enzima essencial para a

replicação do DNA e, subseqüentemente, para a divisão celular (Kamisuki et al.,

54

2004), foi avaliado o efeito dos derivados aminoálcoois na atividade da DNA

polimerase

de células Vero. Observamos que nenhuma destas moléculas inibiu

a atividade desta enzima, não sendo esta uma forma de citotoxicidade destas

substâncias (Figura 26).

Devido ao fato do derivado 109 ter se mostrado bastante promissor durante a

triagem inicial das substâncias, foi dada continuidade ao estudo deste derivado,

visando a elucidação do seu mecanismo de ação. Esta molécula apresentou um

valor de CC50 menor do que 300 M, enquanto que o do aciclovir, que é uma das

drogas mais utilizadas no combate à infecção pelo HSV, é quase três vezes maior

(860 M). Contudo, o EC50 do aciclovir em M.O.I. de 1 é 1,2 M, enquanto que o

do derivado 109 é em torno de 100 pM (Figura 27). Desse modo, o derivado 109

apresenta um S.I. em M.O.I. de 1 em torno de 3 x 106, enquanto que o do aciclovir

é da ordem de 103, ou seja, em torno de 3 logs menor do que o do derivado 109,

mostrando o potencial antiviral desta substância, frente a replicação do HSV-1.

Como o HSV-1 codifica grande parte das proteínas necessárias para a sua

replicação lítica, incluindo sua DNA polimerase (complexo UL30/UL42) (Lin &

Ricciard, 2000) e também pelo fato de esta enzima desempenhar um papel vital

na replicação do HSV-1, sendo alvo de mais de 90% das drogas em uso clínico

(Naesens and De Clercq, 2001), avaliamos o efeito dos derivados na atividade da

DNA polimerase do HSV-1. Nenhum dos derivados Aminoálcoois, testados na

concentração de 50 M, foi capaz de inibir a atividade desta enzima de forma

significativa (Figura 28), enquanto que o derivado do sistema Tienopiridina mais

promissor, o derivado 109, inibiu cerca de 50%, quando testado na concentração

55

de 100 pM, ou seja, a concentração igual ao valor de seu EC50 (Figura 29).

Então, nenhum dos derivados aminoálcoois testados teve efeito na atividade

da DNA polimerase

de células Vero, assim como na atividade da DNA

polimerase de HSV-1. Isto sugere que a atividade antiviral destes derivados não é

resultante de uma ação sobre a atividade de DNA polimerases e que estas

substâncias não apresentam citotoxicidade pela inibição da atividade da DNA

polimerase

celular. Porém, percebemos que o derivado 109, assim como seu

precursor, apresentam a capacidade de inibir a atividade de polimerases do tipo B,

sabendo que seu precursor é um inibidor não nucleosídico da atividade da enzima

transcriptase reversa do HIV-1 (NNRTI). Além disso, percebe-se uma correlação

de praticamente 100% entre o EC50 e a inibição da atividade enzimática, pois foi

visto que, na concentração de 100 pM, o derivado inibe 50% da produção de

partículas virais (EC50) e que, nesta mesma concentração, o derivado inibe

também em 50% a atividade da DNA polimerase de HSV-1, demonstrando que

esta enzima é o alvo da ação desta molécula.

Sabendo que o HSV é capaz de provocar uma diminuição da síntese de

macromoléculas da célula hospedeira (Fenwick & Walker, 1978), também foi

estudado o efeito do derivado 109 (50 M) na síntese de proteínas de células

controle e infectadas. Observou-se que o tratamento foi capaz de aumentar a

síntese protéica das células infectadas em torno de quatro vezes, quando

comparado com a síntese protéica das células infectadas não tratadas. Também

foi observado que, nesta concentração, o tratamento causou uma redução da

síntese protéica celular (Figura 30). É importante ressaltar que a concentração

56

utilizada neste experimento foi maior do que a concentração mais efetiva desta

substância, ou seja, seu EC50.

Finalmente, analisamos os efeitos do derivado 109 in vivo sobre os níveis de

TGP, glicose, ácido úrico e uréia. A TGP é uma enzima encontrada

predominantemente no fígado, em concentração moderada nos rins e em menor

quantidade no coração e nos músculos esqueléticos. Na célula hepática, o TGP

localiza-se no citoplasma (90%) e na mitocôndria (10%). A glicose é a principal

fonte de carboidrato do organismo e sua concentração sérica está intimamente

ligada à ação da insulina. O ácido úrico é um metabólito do catabolismo de

purinas, ácidos nucléicos e nucleoproteínas. Já a uréia é produzida a partir da

deaminação de aminoácidos. Em três parâmetros analisados (níveis de glicose,

TGP e uréia) houve alterações em seus respectivos níveis no soro de

camundongos tratados, sendo observada uma tendência a elevação dos níveis

destas substâncias. Somente os níveis do ácido úrico não se alteraram de forma

significativa (Figura 31). Porém, a dose utilizada, que foi bem maior que o seu

valor de EC50, não foi letal para os camundongos, não havendo morte de nenhum

dos animais. É importante ressaltar que a quantidade de animais testados ainda é

baixa e que a quantidade de droga necessária in vitro para levar a uma reposta é

muito baixa, sendo necessário determinar a quantidade terapêutica da substância

necessária in vivo e observar se, nesta concentração, o mesmo padrão

permanece.

Nossos resultados mostraram que o derivado 109 estaria atuando inibindo a

atividade da DNA polimerase do HSV-1, que é uma proteína de fase , essencial

57

para replicação do DNA viral. Conseqüentemente haveria um número menor de

genomas virais sintetizados, resultando em uma inibição da fase gama, da

automontagem viral e do seu brotamento, visto que as etapas da replicação do

HSV-1 ocorrem em cascata. Conseqüentemente, haveria uma redução dos títulos

virais e da dispersão viral para outras células. Um outro aspecto importante destes

dados é que tanto o aciclovir quanto o derivado 109 têm o mesmo alvo, a DNA

polimerase do HSV-1. Considerando o fato do aciclovir ser um análogo

nucleosídico, ao contrário do derivado 109, surge a possibilidade de que eles

estejam inibindo a mesma enzima, porém, atuando em pontos distintos. Desse

modo, poderíamos cogitar a possibilidade de uso conjunto destas substâncias,

visando um efeito terapêutico aditivo ou sinergístico.

Então, devido ao constante surgimento de cepas resistentes às drogas em

uso clínico, e ao fato de muitas destas drogas apresentarem efeitos colaterais, é

de extrema importância esta busca por novos fármacos com boa atividade antiviral

e com baixa citotoxicidade.

58

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