Manual y Protocolos Del Area Biologia Molecualr Humana

LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR HUMANA

PROTOCOLOS

EXTRACCIN DE DNA DE SANGRE PERIFERICA

Kit a usar: Wizard Genomic DNA purification kit de la marca PromegaTipo de muestras: Sangre tomada con anticoagulante EDTA o Heparina congelada a - 80 C.1. Descongelar la sangre a 37C por 10 minutos (plancha calentadora), o dejar que se descongele a temperatura ambiente.2. Colocar 900ul de Cell Lysis Solution para 300 ul de muestra.3. Mezclar e incubar a 37C por 10 minutos en la plancha calentadora (agitar durante el transcurso del tiempo)

4. Centrifugar a 13000rpm por 50 segundos.

5. Remover y descartar el sobrenadante.6. Colocar nuevamente 500 ul de Cell Lysis Solution y repetir los pasos del 3 al 5 (repetir este paso hasta obtener un pellet blanquecino).7. Adicionar 300ul de Nuclei Lysis Solution.8. Mezclar con la pipeta hasta resuspender el pellet, e incubar por 1 hora a 37C en la plancha calentadora.9. Volver a adicionar 100ul de Nuclei Lysis Solution y repetir la incubacin.10. Adicionar RNase Solution 1,5 ul, invertir de 2-5 veces , incubar por 15min, y llevar enfriar a temperatura ambiente

11. Adicionar 130ul de Protein Precipitation Solution, y mezclar vigorosamente (Debe observarse la formacin de grumos)

12. Centrifugar a 13000 rpm por 3 minutos (Se debe observar pellet caf obscuro)

13. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo que contenga 300ul de isopropanol fri. (Se debe observar la formacin de la hebra de DNA)

14. Centrifugar a 13000 rpm por 2 minutos y descartar el sobrenadante.15. Adicionar un volumen de 200ul de etanol al 70% e invertir para facilitar el lavado.16. Centrifugar a 13000 rpm por 2 minutos y descartar el sobrenadante.17. Dejar a temperatura ambiente el tubo abierto pero cubierto con parafina (hacerle unos pequeos agujeros) hasta que se evapor completamente el etanol o utilizando la plancha calentadora por aproximadamente 15 a 20 minutos.

18. Rehidratar con un volumen mximo de 50ul de DNA rehydration Solution (segn el tamao observado de la hebra de DNA en el paso 13), invertir suavemente, re suspender el pellet complementa e incubar por una hora a 65C o dejarlo toda la noche a 4C.

Fuente:

Modificado del manual que viene con el kit: Promega Wizard Genomic DNA purification kit.EXTRACCIN DE DNA DE LINFOCITOS

Kit a usar: Wizard Genomic DNA purification kit de la marca Promega

Tipo de muestras: Linfocitos congelados a -4 C, aislados con FICOLL de una muestras extrada con Heparina o EDTA 1. Descongelar la sangre a 37C por 10 minutos (plancha calentadora) o dejar que se descongele a temperatura ambiente.2. Colocar 900ul de Cell Lysis Solution para 300 ul de muestra, mezclar suavemente.3. Mezclar e incubar a 37C por 10 minutos en la plancha calentadora (agitar durante el transcurso del tiempo, 5-6 veces)

4. Centrifugar a 13000rpm por 45 segundos.

5. Descartar el sobrenadante (nos debe quedar un pellet blanquecino, tratar de dejar un volumen menor de20ul)

6. Adicionar 300ul de Nuclei Lysis Solution

7. Mezclar con la pipeta e incubar por 1 hora a 37C en la plancha calentadora.8. Adicionar RNase Solution 1,5 ul, invertir de 2-5 veces, incubar por 15min, y llevar enfriar a temperatura ambiente.

9. Adicionar 130ul de Protein Precipitation Solution.10. Mezclar vigorosamente (debe observarse la formacin de grumos).11. Centrifugar a 13000 rpm por 3 minutos (Se debe observar pellet caf obscuro)

12. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo que contenga 300ul de isopropanol fri. (Se debe observar la formacin de la hebra de DNA)

13. Centrifugar a 13000 rpm por 2minutos y descartar el sobrenadante.14. Adicionar un volumen de 200ul de etanol al 70% e invertir para facilitar el lavado.15. Centrifugar a 13000 rpm por 2 minutos y descartar el sobrenadante.16. Dejar a temperatura ambiente el tubo abierto pero cubierto con parafina (hacerle unos pequeos agujeros) hasta que se evapor completamente el etanol o utilizando la plancha calentadora por aproximadamente 15 a 20 minutos.17. Rehidratar con un volumen mximo de 50ul de DNA rehydration Solution (segn el tamao observado de la hebra de DNA en el paso 12), invertir suavemente hasta que se rompa completamente el pellet del DNA e incubar por una hora a 65C o dejarlo toda la noche a 4C.Fuente:

Modificado del manual que viene con el kit: Promega Wizard Genomic DNA purification kit

EXTRACCIN DE DNA DE ALTO PESO MOLECULAR DE ALICUOTAS DE SANGRE CONGELADOSTipo de muestras: Sangre recin tomada o que no ha sido congelada a -80C por un periodo muy prolongado (que no haya sufrido un proceso de hemolisis).Antes de iniciar precalentar el bao mara a 65C

1. Colectar 4mL de sangre entera en Vacutainer con 100L de EDTA o Heparina al 15%. Congelar a -80C, o trabajar ese momento la muestra2. Descongelar la muestra para que est a TA (temperatura ambiente) una hora de procesarse

3. Aadir 4mL de solucin TKM1

4. Aadir 125L de IGEPAL CA-630 para lisar las clulas. Mezclar vigorosamente por inversin varias veces.

5. Centrifugar a 2 500rpm por 15 minutos a TA

6. Desechar el sobrenadante (SBN), procurando eliminarlo todo y quedarse con el botn nuclear

7. Lavar el botn con 5mL de la solucin TKM1 (vrtex). Calentar 20 s, no mas, a 65C para facilitar la resuspensin. Volver a centrifugar como en el paso 7.

8. Repetir los pasos 8, 9 y 8

9. Resuspender el botn completamente en 800L de la solucin TKM2 y transferirlo a un Eppendorf

10. Aadir 50L de SDS al 10% y mezclar la suspensin pipetiando hasta que se vea homogneo.

11. Incubar 8 min a 65C

12. Aadir 300L de NaCl 6 M y mezclar por inversin

13. Centrifugar 10 min a 13000 RPM en micro centrifuga

14. Recuperar el SBN, el cual contiene el DNA, en 2 Eppendorf de 2mL, por iguales (560L). Desechar el botn (de protenas precipitadas).

15. Agregar 1mL de etanol al 100% a -20C e invertir el tubo despacio varias veces hasta que el DNA se precipite.

16. Centrifugar 10 min a 13000 RPM a 4C (refrigeradora).

17. Eliminar el sobre nadante (SBN)

18. Agregar 1mL de etanol al 70% y repetir pasos 18 y 19 y dar vrtex

19. Dejar secar a TA (esperar hasta que se evapore el etanol)

20. Resuspender el botn de DNA en 200L de buffer TE, dar vrtex por 10 segundos, incubar a 65C por 15 min

21. Guardar a -80C -4C

Fuente: Modificado del Protocolo de Extraccin de DNA de Alto Peso Molecular de Sangre Total -Laboratorio de Biomdica de la UNAM-Mxico.

PROTOCOLO PARA EXTRACCIN DE ADN A PARTIR DE SANGRE CONGELADA.

Tipo de muestras: Sangre congelada a -80C, tambin sirve para muestras hemolisadas.

1. Descongelar la muestra de sangre en bao de agua a temperatura ambiente y transferir a un tubo de centrfuga.

Volmenes de Sangre: 5 ml y 2 ml2. Adicionar un volumen igual de PBS (phosphate-buffered saline) a temperatura ambiente y con la pipeta homogeneizar suavemente la muestra.

Volmenes de SangreVolmenes de PBS

5 ml5 ml

2 ml2 ml

3. Centrifugar por 15 min a temperatura ambiente

Volmenes de SangreRPM

5 ml4.000

2 ml4.000

4. Eliminar el sobrenadante y dependiendo del volumen de sangre, adicionar PBS y homogenizar suavemente. Luego adicionar medio volumen de H2O destilada estril y homogenizar con la pipeta hasta que todo se haya lisado.

Volmenes de SangreVolmenes de PBSVolmenes de H2O destilada estril

5 ml5 ml2,5 ml

2 ml2 ml1 ml

5. Centrigufar por 15 min a temperatura ambiente.

Volmenes de SangreRPM

5 ml4.000

2 ml4.000

6. Remover por aspiracin el sobrenadante, el cual contiene clulas rojas lisadas.

7. Resuspender el pellet con la pipeta en buffer de lisis TKM1.

Volmenes de SangreTKM1

5 ml5 ml

2 ml2 ml

8. Aadir IGEPAL CA-630 para lisar las clulas, mezclar vigorosamente por inversin varias veces.

Volmenes de SangreIGEPAL CA-630

5 ml125 ul

2 ml50 ul

9. Centrifugar a 3.000 rpm por 10 min a temperatura ambiente

10. Desechar por completo el sobrenadante y quedarse con el botn nuclear.

11. Lavar el botn con TKM1 y repetir los pasos 9 y 10


5 ml5 ml

2 ml2 ml

12. Resuspender el botn completamente en TKM2, y transferirlo a un tubo eppendorf de 2 o 1,5 ml.


5 ml800 ul

2 ml320 ul

13. Aadir SDS al 10% y mezclar la suspensin pipeteando hasta que se vea homogneo.

Volmenes de SangreSDS 10%

5 ml50 ul

2 ml20 ul

14. Incubar 8 min a 65C en el bao maria.

15. Aadir ClNa 5 M y mezclar por inversin, dividir en dos eppendorf dependiendo del volumen obtenido.

Volmenes de SangreClNa 5M

5 ml300 ul

2 ml120 ul

16. Centrifugar 10 min a 13.000 rpm en microcentrifuga.

17. Recuperar el sobrenadante el cual contiene el DNA

18. Agregar (2 volmenes) de etanol 99.9% a -20C, tratando de que se formen dos ligeras capas y luego suavemente invertir el tubo varias veces hasta que el DNA se precipite.

19. Centrifugar 5 min a 12.000 rpm a 4C.

20. Elimar el sobrenadante sin llevarse el DNA.

21. Agregar (200 ul) de etanol al 70% y centrifugar 5 min a 12.000 rpm a 4C.

22. Elimar el sobrenadante lo ms que sea posible, dejar evaporar el etanol por completo

23. Resuspender el DNA en un volumen de TE-Buffer, dependiendo del tamao del DNA precipitado, se puede partir con 20 ul.

24. Almacenar el DNA en congelacin.

Fuente:

Modificado del Protocolo de Extraccin de DNA de Alto Peso Molecular de Sangre Total -Laboratorio de Biomdica de la UNAM-Mxico.Molecular Cloning.

EXTRACCIN DE DNA DE ALTO PESO MOLECULAR DE ALICUOTAS DE SANGRE CONGELADOS

Material por muestra: 760L de solucin de TKM1, 60L Solucin TKM2, 9 L IGEPAL CA-630, 4L SDS al 10%, 22.5L NaCl 6 M, 200L etanol al 100%, 400L buffer TE, 1 tubo cnico 15mL, Eppendorfs

1. Colectar 4mL de sangre entera en Vacutainer con 100L de EDTA o Heparina al 15%, distribuir en alcuotas de 300ul, y congelar a -80C.

2. Descongelar la muestra para que est a TA (temperatura ambiente) a la hora de procesarla

3. Adicionar 300ul de PBS (phosphate-buffered saline) que debe estar a temperatura ambiente, y homogenizar suavemente con la pipeta

4. Centrifugar a 6000 rpm por 15 min a temperatura ambiente

5. Eliminar el sobrenadante, agregar 300ul de PBS, homogenizar suavemente.

6. Adicionar 150ul de H2O destilada estril y homogenizar con la pipeta hasta que todo se haya lisado

7. Centrifugar a 6000 rpm por 15 min a temperatura ambiente

8. Resuspender el pellet en 300L de solucin TKM1

9. Aadir 9L de IGEPAL CA-630 para lisar las clulas (para facilitar la succin cortar la punta). Mezclar vigorosamente por inversin varias veces.

10. Centrifugar a 6000rpm por 10 minutos a TA


12. Lavar el botn con 300L de la solucin TKM1 (vrtex). Calentar 20 s, no ms, a 65C (para facilitar la resuspensin). Volver repetir los pasos 10 y 11.13. Resuspender el botn completamente en 60L de la solucin TKM2.14. Aadir 4L de SDS al 10% y mezclar la suspensin pipeteando hasta que se vea homogneo.


16. Aadir 22.5L de NaCl 6 M y mezclar por inversin

17. Centrifugar 10 min a 13000 RPM en microcentrfuga

18. Recuperar el SBN, el cual contiene el DNA, en 1 Eppendorf de 2mL. Desechar el botn (de protenas precipitadas).

NOTA: en caso de encontrarse una coloracin amarillenta en el sobrenadante tratar de recoger la hebra de DNA y transportarla a otro Eppendorf

19. Agregar 200L de etanol al 100% a -20C e invertir el tubo despacio varias veces hasta que el DNA se precipite.


21. Eliminar el sobre nadante (SBN) utilizando la pipeta para evitar que se pierda el pellet22. Agregar 200L de etanol al 70% dar vrtex y repetir pasos 20 y 2123. Dejar secar a TA (esperar hasta que se evapore el etanol)


NOTA: tener en cuenta el tamao de la hebra de DNA para la resuspensin con buffer TE, dependiendo el volumen de la misma con la cantidad de DNA observado.


EXTRACCIN DE DNA DE ALTO PESO MOLECULAR DE ALICUOTAS DE LINFOCITOS CONGELADOS

Bao mara a 65 C

Material por muestra: 760L de solucin de TKM1, 60L Solucin TKM2, 9 L IGEPAL CA-630, 4L SDS al 10%, 22.5L NaCl 6 M, 200L etanol al 100%, 400L buffer TE, 1 tubo cnico 15mL, Eppendorfs

1. Colectar 4mL de sangre entera en Vacutainer con 100L de EDTA o Heparina al 15%. Y realizar la extraccin de los linfocitos con ficoll. Tomar los linfocitos y distribuirlos en alcuotas de 300ul.

2. Descongelar la muestra para que est a TA (temperatura ambiente) a la hora de procesarse

3. Aadir 300L de solucin TKM1

4. Aadir 9L de IGEPAL CA-630 para lisar las clulas. Mezclar vigorosamente por inversin varias veces.

5. Centrifugar a 6000rpm por 10 minutos a TA


7. Lavar el botn con 300L de la solucin TKM1 (vrtex). Calentar 20 s, no ms, a 65C para facilitar la resuspensin. Volver a centrifugar como en el paso 5.

8. Repetir los pasos 6 Y 7

9. Resuspender el botn completamente en 60L de la solucin TKM2 y transferirlo a otro Eppendorf

10. Aadir 4L de SDS al 10% y mezclar la suspensin pipetiando hasta que se vea homogneo.


12. Aadir 22.5L de NaCl 6 M y mezclar por inversin

13. Centrifugar 10 min a 13000 RPM en microcentrfuga

14. Recuperar el SBN, el cual contiene el DNA, en 1 Eppendorf de 2mL. Desechar el botn (de protenas precipitadas).

15. NOTA: en caso de encontrarse una coloracin amarillenta en el sobrenadante tratar de recoger la hebra de DNA y transportarla a otro Eppendorf

16. Agregar 200L de etanol al 100% a -20C e invertir el tubo despacio varias veces hasta que el DNA se precipite.


18. Eliminar el sobre nadante (SBN)

19. Agregar 200L de etanol al 70% dar vrtex y repetir pasos 16 y 17

20. Dejar secar a TA (esperar hasta que se evapore el etanol)


22. NOTA: tener en cuenta el tamao de la hebra de DNA para la resuspensin con buffer TE, dependiendo el volumen de la misma con la cantidad de DNA observado.

23. Guardar a -80C -4C Fuente:Modificado del Protocolo de Extraccin de DNA de Alto Peso Molecular de Sangre Total -Laboratorio de Biomdica de la UNAM-Mxico.

PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA LA EXTRACCIN DE DNA DE ALTO PESO MOLECULAR DE MUESTRAS CONGELADAS

Peso molecular

Tris, pH 7,6, 0,5 M 121.14g/mol

KCl 0,5 M74.56g/mol

0,5M95.21g/mol

0,1 M372.29g/mol

NaCl 5 M58.44g/mol

Solucin TKM1Solucin TKM2SDS 10%Buffer TE

Stock250mL50mL20mL50mL

Tris0,5M5ml1ml0.0605g

KCl0,5M5ml1ml

0,5M5ml1ml

0,1M5ml1ml0.0372g

NaCl5M-4,02ml

H2O destilada y desionizadaAforar a 250mlAforar a 50ml

SDS2 g

Fuente:

Modificado del Protocolo de Extraccin de DNA de Alto Peso Molecular de Sangre Total -Laboratorio de Biomdica de la UNAM-Mxico.

Molecular Cloning.

PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN MEDIANTE AXYGEN

Kit a usar: AxyPrep Genomic DNA Miniprep Kit de la marca AXYGENTipo de muestras: Muestras extradas con Heparina o EDTA, que pueden ser: sangre congelada a - 80 C, linfocitos congelados, o sangre recin tomada.1. Colocar 500 ul de Buffer AP1 a un microtubo de 1.5 ml. Cuando se trabaje con sangre coagulada se recomiendo calentar por 5minutos a 50C el Buffer AP1

2. Aadir 250 ul de sangre entera o linfocitos, dar vortex a velocidad mxima durante 10 segundos.

3. Aadir 100ul de buffer AP2, dar vortex a velocidad mxima por 10 segundos.

4. Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente.

5. Colocar una minicolumna en un microtubo de 2ml. Pipetear el sobrenadante obtenido en el paso 4 en la minicolumna. Centrifugar a 6000rpm por 1 minuto.

6. Desechar el lquido filtrado, coloque la minicolumna en el microtubo, aadir 700ul de Buffer W1A en la minicolumna y dejar reposar a temperatura ambiente por 2 minutos. Centrifugar a 6000rpm por 1 minuto.

7. Desechar el lquido filtrado, coloque la minicolumna en el microtubo, aadir 800ul de Buffer W2 a la minicolumna y centrifugar a 12000 rpm por 1 minuto.

8. Desechar el lquido filtrado, coloque la minicolumna en el microtubo, aadir 500ul de Buffer W2 a la minicolumna y centrifugar a 12000 rpm por 1 minuto.

9. Desechar el lquido filtrado, colocar la minicolumna en el microtubo. Centrifugara 12000 rpm por 1 minuto.

10. Colocar la minicolumna en un microtubo de 1.5ml limpio. Aadir de 60 a 100ul de Buffer TE a la minicolumna, dejar reposar a temperatura ambiente por 1 minuto, centrifugar a 12,000 rpm por 1 minuto y desechar la minicolumna.

Nota: El Precalentamiento del Buffer TE a 65C, generalmente mejorar la elucin.

Fuente:

Tomado del manual que viene con el kit: AxyPrep Genomic DNA Miniprep Kit

EXTRACCIN DE DNA- INVITROGEN

Kit a usar: PureLink Genomic DNA kits de la marca Invitrogen

Tipo de muestras: Muestras extradas con Heparina o EDTA, que pueden ser: sangre congelada a - 80 C, linfocitos congelados, o sangre recin tomada.

Precalentar el bao mara a 55C

1. Colocar 200L de la muestra en un tubo de 1.5 mL, para muestras con un volumen menor a 200L ajustar el volumen con PBS.2. Aadir 20L de Proteinase K. 3. Aadir 20L de RNasa A a la muestra, dar vrtex y encubar a temperatura ambiente (TA) por 2 minutos.4. Aadir 200L de PurelinkTM Genomic Lysis/ Binding Buffer y dar vrtex para obtener una solucin homognea.

5. Encubar a 55C por 10 minutos

6. Aadir 200L de etanol al 100% (grado molecular) para la lisis. Dar vrtex por 5 segundos.

7. Transferir la solucin anterior en una mini columna.8. Centrifugar la columna a 10 000 rpm por 1 minuto a TA.9. Descartar el tubo colector con el lquido filtrado y aadir 500L de Wash Buffer 1 en la columna.

10. Centrifugar a TA en 10 000 rpm por 1 minuto y descartar el tubo colector con el lquido filtrado.

11. Aadir 500L de Wash Buffer 2 en la columna.

12. Centrifugar a 13 400 rpm por 3 minutos a TA, eliminar el tubo colecto y colocar un tubo de 1.5mL.13. 1 Elucin: Aadir 100L de PurelinkTM Genomic Elution Buffer. 14. Encubar a TA por 1 minuto

15. Centrifugar la columna a 13 400 rpm por 1 minuto a TA (el lquido filtrado contiene el DNA)

16. 2 Elucin: para recuperar ms DNA aadir 25L de PurelinkTM Genomic Elution Buffer. 17. Encubar a TA por 1 minuto

18. Centrifugar a 13 400 rpm por 1.5 minutos a TA.


Nota:

No dar vrtex por un tiempo mayor a 5 segundos

Evitar congelar y descongelar las muestras (se degrada el DNA)

Fuente:Tomado del manual que viene con el kit: PureLink Genomic DNA kits de la marca Invitrogen

PROTOCOLO DE PURIFICACIN DE PRODUCTOS DE PCR Y ADN CON EL KIT

Kit a usar: Wizard sv gel and PCR clean-up system de la marca Promega

Tipo de muestras: Muestras de ADN de una concentracin mxima de 40ug, o productos de PCR, con una capacidad de 1ml a purificar.1. En la columna colocar el DNA o el producto de PCR y aadir un volumen igual de Membrane Binding Solution.Ejemplo: 30ul de producto de PCR o DNA ms 30ul de Membrane Binding Solution

2. Insertar en un tubo colector de 2ml la minicolumna.3. La solucin disuelta en el paso uno colocarla en la minicolumna. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto.

4. Centrifugar a 13400 rpm por 75 segundos, descartar el lquido filtrado y reinserte la minicolumna en el tubo colector.

5. Aadir 700ul de Membrane Wash Solution, centrifugar a 13400 rpm por 1 minuto. Descartar el lquido filtrado y reinsertar la minicolumna en el tubo colector.

6. Repetir el paso 5 con 500ul de Membrane Wash Solution, centrifugar a 13400 rpm por 5 minutos. Volver a centrifugar por 1 minuto (para eliminar toda el etanol residual)

7. Con cuidado transfiera la minicolumna a un tubo limpio de 1.5ml

8. Aadir 30ul de Nuclease-Free Water a la minicolumna (verificar que la membrana este cubierta totalmente con el lquido). Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto. Centrifugar a 13400 rpm durante 1:30 minuto.

9. Descartar la minicolumna y mantener el ADN a 4 C o 20C

Fuente:

Modificado del manual que viene con el kit: Wizard sv gel and PCR clean-up system de la marca Promega

PROTOCOLO DE CUANTIFICACIN DE DNA CON PICOGREEN

Kit a usar: Quant-iT PicoGreen ds Reagent and kits de la marca Invitrogen

Tipo de muestras: Muestras de DNA

1. Diluir el TE 20 X a TE 1X (19 ml de Agua destilada y desionisada : 1 ml TE20X)

2. Diluir 200 veces el Quant-iT PicoGreen del stock en TE 1X (0,05ml de Picogreen:9,95ml de TE1X) Colocar en un envase de plstico, el PicoGreen reacciona con el vidrio

Factor de dilucinVolumen finalVolumen a tomar de picogreen

0,00520ml0,1ml

0,00515ml0,075ml

0,00510ml0,05ml

Nota: Guardar refrigeracin y cubierto de la luz, la fluorescencia se comienza a perder a la semana. Para guardar por un periodo mayor hacerlo en congelacin.

3. Diluir el stock de 100ug/ml DNA a una concentracin de 50ng/ml, y preparar la curva de calibracin para concentraciones bajas de DNA en muestras, segn el siguiente cuadro

Preparacin de una curva de baja concentracin

TE 1X (ul)DNA 50ng/ml (ul)Dilucin de Picogreen (ul) Concentracin final del DNA con PicoGreen

01000100025ng/ml

90010010002,5ng/ml

9901010000,25ng/ml

999110000,025ng/ml

100001000Blanco

En el caso que las muestras tengan alta cantidad de DNA, preparacin de una curva de alta concentracin, diluir el stock de 100ug/ml a 2ug/ml en TE 1X, y a partir de este se preparan el resto de puntos de la curvaTE 1X (ul)DNA 2ug/ml (ul)Dilucin de Picogreen (ul) Concentracin final del DNA con PicoGreen

0100010001000ng/ml

9001001000100ng/ml

99010100010ng/ml

999110001ng/ml

100001000Blanco

Nota: Trabajar todos los controles y el blanco por duplicado.

4. Diluir las muestras a cuantificar con TE 1X.

Ejemplo: 2,5 DNA: 497,5 TE1X, factor de dilucin 200.

1ul de muestra: 49 ul de TE, factor de dilucin 50.

Nota: Tomar en cuenta que el factor de dilucin incrementa al colocar el picogreen

5. En un multidish de 96 pocillos, colocar 50ul de la muestras de DNA y 50 ul del picogreen diluido. Y llevar al Fluoroskan, se debe colocar el plato sin tapa.

Se debe primero prender la computadora, luego el fluoroskan y por ltimo abrir el software. Abril el programa PICO.SEC en el disco C.

Debe revisar las caractersticas generales que son:

rea definitionSeleccionar los pocillos donde se necesita leer.

Observaciones:

Color amarillo los lugares a leer

Color negro los lugares que no hay lectura

LayoutEscoger el tipo de muestras, en el pocillo que se lo va a colocar:

CALIBR.: colocar la concentracin empleada para la curva de calibracin

Blank: Los blancos

Sample: colocar el nombre de la muestra, el factor de dilucin usado, y el nmero de rplicas.Se selecciona con apply para mantener o clear para borrar

SettingsSeleccionar la direccin de la lectura

Pasos del programa:

1. Incubate.- Se puede aadir en el programa una incubacin de 2 minutos a 25C, o dejar a temperatura ambiente 2 minutos.

2. Shake.- Por un tiempo de 20 segundo, y una velocidad de 240 rpm (no exceder de 360rpm, cuando se use una placa de 96 pocillos)

3. Measure1.-Son las caractersticas de lectura. El mtodo de medicin es por Fluorometric, las unidades RFU (unidades de fluorescencia), los filtros usados: excitacin 485 y el de emisin 538

4. Save/load1.- guarda los datos de las mediciones realizadas segn Measure1. Se puede cambiar la direccin de destino de los datos, esos se guardan con numeraciones consecutivas.

5. Save/loas2.-guarda el anlisis de datos de la funcin Curve Fit. Se puede cambiar la direccin de destino de los datos, esos se guardan con numeraciones consecutivas.

6. Seleccionar START. Y esperar a que termine el equipo7. Revisar los datos en la carpeta que se seleccion para que se almacenen, se guardan en base al nmero de lectura (siendo su lectura la que tenga los valores ms altos)

Nota: Cuando el equipo est en funcionamiento el foco tintine y es de color tomate. En el caso de algn error leer la nota que nos presente el equipo y revisar en el manual del equipo las posibles medidas que se deben tomar.Fuente:

Modificado del manual que viene con el kit: Quant-iT PicoGreen ds Reagent and kits de la marca InvitrogenPROTOCOLO DE CUANTIFICACIN DE DNA CON EL NANODROP


1. Meclar la muestras por unos 5 segundos en el vortex

2. Centrifugar por unos 15 segundos a 6000rpm.

3. Encender la computadora e ingresar al software del NanoDrop

4. Ingresar a Nucleic Acid. Y seleccionar en tipo de muestra DNA.

5. Colocar en el pedestal 3 ul de agua destilada y des ionizada y dejar por 3 minutos, limpierar el pedestal con un franela (que no produzca lanas). Repetir este lavado por 3 veces, consecutivamente.

6. Colocar en el pedestal 2ul de agua destilada y des ionizada, y seleccionar BLANK. Limpiar el pedestal.

7. En Sample ID, colocar el nombre de la muestra.

8. Colocar en el pedestal 2ul de la muestra (homogenizada anteriormente) y seleccionar Meassure.

9. Los datos que nos da el equipo son:

Concentracin de la muestra en ng/ul (puede cambiarse la concentracin)

Las correlaciones: 260/280 y 260/230

10. Una vez finalizada la cuantificacin repetir los lavados del paso 5. Y dejar tapando el nanodrop, y apagandoloFuente:

Tomado del manual que viene con el equipo NanoDrop de Thermo Scientific

COMPROBACIN DE EXTRACIN DE DNA POR GELES DE AGAROSA


1. Se prepara un gel de agarosa al 0,8% en buffer TE 1X, y una concentracin de 0,14ug/ml de Bromuro de etidio (es un agente cancergeno, debe manipularse con guantes de nitrilo).

2. Se preparan las muestras: 1 ul de azul de bromofenol : 2ul del DNA

3. Correr el gel por 30 min, a 300 mA y 125 V

4. Tomar la foto

Preparacin de soluciones

Buffer TE 10X

1. Disolver en 800ml de agua destilada y desionizada: 107,8g Tris Base, 7,44g EDTA, y 55,0g de cido brico.

2. Ajustar el pH 8,3, y aforar a un litro.

Fuente:

Techical Manual, Gene Print STR Systems (Silver stain Detection) de la marca Promega, Pag. 38

Azul de BomofenolPreparar una solucin de Azul de Bromofenol al 0,25% y 40%g de sucrosa, en agua destilada. Nota: Debe guardarse a 4CFuente:

Molecular Cloning

GUIA PARA ELECTROFORESIS

1. Limpiar el rea de trabajo, usar alcohol 70%.

2. Verificar que las cubetas de electroforesis estn limpias y secas.

3. Antes de colocar el gel en la cubeta, revisar que est nivelada.

4. Colocar el gel en la cubeta y llenar con buffer de corrida hasta la marca.

5. Cargar las muestras en el gel, tapar y conectar la cubeta de electroforesis a la fuente de poder.

6. Encender la fuente de poder y colocar las condiciones de corrida: voltios, miliamperios y tiempo.

7. Una vez terminada la electroforesis, tomar la foto, limpiar el rea de trabajo, lavar y secar la cubeta de electroforesis antes de guardar.

8. Tener cuidado con los cables de las cubetas ya que son delicados y pueden romperse si los hala o dobla al guardar.

NOTA: Si durante la corrida observa algn mensaje de alerta revisar el manual del equipo. (Por lo general sta alerta indica bajo nivel del buffer, mala posicin de la tapa y cables en los conectores de la fuente de poder, o fallo en la corriente, es probable que requiera apagar y volver a encerder el equipo, adems de verificar las condiciones de corrida).

ELECTROFORESIS POLIACRILAMIDA SSCPDebe prepararse en un lugar protegido de la luz. Los componentes a usar en el gel

Reactivos1XConc Final

Glicerol3ml10%

H2Odd18ml

TBE 10X1,5ml0,5X

Acrilamida:bis (19:1) 40%7,5ml10%

TEMED30ul

PSA 10%300ul

TOTAL30ml

Se debe armar los vidrios para el gel e ir aadiendo uno a uno los reactivos indicados en la tabla, en el siguiente orden:

1. Glicerol + agua (mezclar por 5 minutos),

2. TBE 10X

3. Acrilamida (mezclar por 10 minutos)

4. TEMED y PSA 10%

Una preparado dejar hasta que se gelidificar (aproximadamente 2 horas)

Preparacin de muestras1. Tomar 2,5ul del producto del PCR ms el azul de bromofenol

2. Desnaturalizar por 8 minutos a 95C por 5 minutos (incluir el marcador de peso molecular) y cargar en el gel.

Caractersticas de electroforesis: 1500V, 25mA, 3W durante 8 horasPCR DEL INDEL -19

Caractersticas del Mix para la PCR, con reactivos de marca Promega, a excepcin de los primers (PTF Y PTR) que son Invitrogen.

Protocolo para determinar el SNP 19 en humanos

El mix para la PCR, con reactivos de marca Promega, a excepcin de los primers (PTF Y PTR) que son Invitrogen.

Reactivo Volumen (por muestra) Concentracin final

Buffer, 5X (Mg Cl2, 7,5mM) 14ul1X(1.5mM)

PTF, 10uM 0,2 ul

0.1uM

PTP, 10uM 0,2 ul

0.1Um

BSA 1%0,2 ul0,01%

dNTPs 10nm 0,2ul0,1nM

TaqPol 5U/ul 0,2ul0.05U/ul

Muestra 10ng/ul 4ul2ng/ul

Agua, destilada y desionizada 11ul

Volumen final 20ul

Siempre se deben utilizar controles:

Negativo: agua destilada y des ionizada estril

Positivo: Ana Crdova para 3R/2R; Paula Torres para 3R, y kDNA (promega) para 2R

El programa utilizado en el Termociclador BIO RAD se denomina Indel 19 que consta de los siguientes ciclos

94 por 12 min; 40 ciclos de: 94 por 30seg, 58 por 30seg, y 72 por 30 seg; y 72 por 10 min

En el termociclador A&B, se tiene otro programa denominado igualmente Indel 19, pero los ciclos son diferentes, siendo el programa:

94C por 2min, 40 ciclos: 94c por 30 seg, 55C por 30 seg, 72C por 80seg, y una extensin final de 72C por 5 min

En este mismo termociclador tambin hay otro programa que ha dado bueno resultados indel 19-nuevo, que ha sido tomado del rea de Biomdica de la UMAN, siendo sus ciclos:

94 por 12 min; 40 ciclos de: 94 por 30seg, 58 por 30seg, y 72 por 30 seg; y 72 por 10 min

Para comprobar que sali bien la PCR, y conocer los genotipos de las muestras corridas se hace un gel al 2% en TBE 1X, que se lo corre a 90 Voltios, 300mA y 40 minutos.

EJEMPLO:

2R: 155

3R:187

PCR DEL SNP -63

El SNP 63 es polimorfismo del gen de Calpaina 10, siendo los posibles genotipos a observar: C y T.

Protocolo para determinar el SNP 63 en humanosEl mix para la PCR, con reactivos de marca Promega, a excepcin de los primers (PTF Y PTR) que son Invitrogen.

Mix de PCR (Promega):

Reactivo Volumen (por muestra) Concentracin final

Buffer, 5X (Mg Cl2, 7,5mM) 12ul1X(1.5mM)

PTF, 10uM 0,6 ul

0.1uM

PTP, 10uM 0,6 ul

0.1uM

dNTPs 10nm 0,6ul0,1nM

TaqPol 5U/ul 0,6ul0.05U/ul

Muestra 20ng/ul 6ul2ng/ul

Agua, destilada y desionizada 39,6ul

Volumen final 60ul

Siempre utilizar controles negativos (agua destilada y des ionizada estril) y positivos (Homocigotos y heterocigotos)

El programa utilizado en el Termociclador A&B se demoniza: SNP 63 polimerasa, que tiene el siguiente ciclo:

94C por 2min, 40 ciclos: 94c por 30 seg, 54C por 30 seg, 72C por 80seg, y una extensin final de 72C por 5 min

Para la comprobacin del producto de PCR se corre un gel al 1,2% en TBE 1X, y las caractersticas de la corrida son: 100 Voltios, 300mA y 35 minutos. Se observa una banda de 418pbA continuacin se realiza la purificacin con el kit de purificacin de productos de PCR y DNA con el kit wizard sv gel and PCR clean-up system.

Protocolo para secuenciacin del SNP 63

Al producto de PCR, se lo puede cuantificar con NanoDrop y proceder a la prepara el mix:ReactivosVolumen (por muestra)

Big Dye Terminator Cycle Sequencing1ul

Primer 5uM1

Producto de PCR 5 a 10ng/ul1ul

Agua destilada y des ionizada5ul

Buffer2

Volumen final10ul

Adicionalmente a las muestras colocar el control positivo de la amplificacin:

ReactivosVolumen


Primer 4

PGEN1ul


Buffer2

Volumen final10ul

Correr el programa para el SEQ BDT3 que se encuentra en el termociclador A&B.

Se toma 5ul del producto de esta PCR y se le agrega el siguiente mix:ReactivosVolumen (por muestra)

SAM20

Bigdye Xterminator Purification 5

Mantener en movimiento por 30 a 40 minutos. Centrifugar 2 min a 4680 rpm.

Tomar 10ul del sobrenadante y colocar en la placa de 96 pocillos para llevar al secuenciador A&B. DETERMINACIN DE LOS SNPs 43 y 44

Los SNPs 43 y 44 son polimorfismos del gen de Calpana 10, siendo los posibles genotipos C/T para el SNP 44 y G/A para el 43 que se determina por PCR tiempo real.El mix para la PCR tiempo real, son reactivos de marca A&B

SNP-431X (ul)

Taq Man Genotyping Master Mix5

Taq Man Pre-Designed SNP Genotyping C_27483762_10 rs37922670.5

DNA 1-10 ng + Agua 4.5

Volumen Total10

Marcaje de alelos: VIC: A, alelo 1

FAM: G, alelo 2SNP-441X

Taq Man Genotyping Master Mix5 ul

Taq Man Pre-Designed SNP Genotyping C_16178365_10 rs29757600.5 ul

DNA 1-10 ng + Agua 4.5 ul

Volumen Total10 ul

Marcaje de alelos: VIC: C, alelo 1

FAM: T, alelo 2Una vez distribuido el mix en los tubos y colocado el DNA sellar con plstico ptico, debe estar bien sellado para evitar evaporizaciones, posteriormente centrifugar.

Correr el programa, para lo cual:

1. Debe abrirse el programa ya almacenado, que se encuentra en la carpeta Paula, que est en formato .edt,2. Deleccionar las pocillos e identificado donde se va a colocar: control negativo (NTC), control positivo y muestras, guardar los cambios (save as), para que cambie al formato .eds,3. Ccomenzar la corrida (start run).

Nota.- el Control positivo usado DNA humano K562 de concentracin10 ng/ul (SNP 43 GG, SNP 44 CC).En el caso que exista algn erros en una muestras que est confundiendo la discriminacin allica del resto de muestras se la puede eliminar y reanalizar (Analize).

PCR DE ABCA1, HNF1 y HNF4Protocolo para derminar el exn 7 de ABCA1, 4 y 9 de HNF1a, y 4 de HNF4a.

Caractersticas del Mix para la PCR, con reactivos de marca Promega, a excepcin de los primers (PTF Y PTR) que son Invitrogen.

ReactivosVolumen (por muestra)

Buffer (5X con Cl2Mg)4 ul

dNTP Mix 10 mM0,4 ul

Primer F 25 pmol/ul0,4 ul

Primer R 25 pmol/ul0,4 ul

Taq polimerasa 5U/ul0,1 ul

DNA2 ul

Agua destilada y des ionizada12,7 ul

Volumen final20 ul

El programa utilizado en el Termociclador A&B o se demoniza: SNP 63 polimerasa, que tiene el siguiente ciclo:

96C por 7min, 37 ciclos: 95c por 30 seg, temperatura de anillamiento por 30 seg, 72C por 30seg, y una extensin final de 72C por 10 min.La temperatura de anillamiento depende del gen y el exn a estudiar:

GenExnTm (C)

ABCA1760

HNF1a463

963

HNF4a463

Para la comprobacin del producto de PCR se corre un gel al 2 o3 % en TBE 1X, y las caractersticas de la corrida son: 90 Voltios, 200mA y 35 minutos. El tamao de banda depende del exn estudiadoGenExnTamao de banda (pb)

ABCA17290

HNF1a4486

9334

HNF4a4401

A continuacin se realiza la purificacin con el kit de purificacin de productos de PCR y DNA con el kit wizard sv gel and PCR clean-up system.

Protocolo para secuenciacin del SNP 63

Al producto de PCR, se lo puede cuantificar con NanoDrop y proceder a la prepara el mix:



Primer 5uM1

Producto de PCR 5 a 10ng/ul1ul


Volumen final10ul

Correr el programa para el Big Dye terminator que se encuentra en el termociclador A&B, con este producto agregar 55ul de la solucin formada por:


SAM45

Bigdye Xterminator Purification 10

Mantener en movimiento por 30 a 40 minutos. Centrifugar y tomar unos 10ul del sobrenadante y colocar en la placa de 96 pocillos para llevar al secuenciador A&B.

EQUIPOS

Equipo Descripcin Cantidad

Mini centrifugaMarca: Eppendorf

Modelo: MiniSpin1

Centrifuga Marca: Heraeus

Modelo: Labofuge 200 (Para tubos de 15 ml)1

Vortex MixerMarca: Labnet

Vortex Mixer: Vortex Mixer1

Cabina de flujo laminarMarca: Labconco

Modelo: Vertical, incluye luz UV y fluoresente1

Fluooskan Ascent Marca: Thermo Scientific

Modelo: Fluooskan Ascent (Fluorometro y luminometro para microplatos)1

Fuente de poderMarca: Thermo Scientific1

Bao MaraMarca: SakuaraModelo: KH806 (el regulador de temperatura se encuentra daado)1

NanodropMarca: Thermo ScientificModelo:Nanodrop 200c1

NORMAS GENERALES DEL LABORATORIO

1. Vestimenta adecuada (mandil, guantes, mascarilla, gafas). No utilizar sandalias.

2. Deber ingresarse solo con lo indispensable, las mochilas o bolsos deben dejarse en los casilleros que se encuentran junto a los baos.

3. Lavarse las manos al inicio y al trmino de las actividades realizadas.

4. Antes de utilizar los equipos revisar los manuales, y las hojas de seguridad de los reactivos a emplearse.

5. Limpiar el rea de trabajo antes y despus de realizar sus actividades.

6. AL terminar las actividades deje dejarse el material donde corresponda y lavar lo que sea necesario.

7. En el caso de algn inconveniente debe comunicrsele con los docentes del rea, en el caso que no se encuentren a otro, para que notifique lo sucedido.

NORMAS PARA EL ACCESO Y USO DEL LABOTORIO

Antes de hacer uso de las instalaciones de este laboratorio revise detenidamente las siguientes normas.

Cmo ingresar al laboratorio?

El ingreso est restringido solamente al personal que forma parte de equipo de trabajo.

Usar la vestimenta adecuada (mandil, guantes, mascarilla, gafas de seguridad y zapatos cerrados).

El pelo largo se debe recoger, no usar bufandas ni lazos que cuelguen, la mayora de estos tejidos estn hechos de fibras inflamables.

No ingresar comida, bebidas, maquillaje, etc.

Antes de trabajar

Revisar el protocolo de trabajo minuciosamente

Realizar todos los clculos previos necesarios a fin de que tu trabajo no se interrumpa.

Identificar y preparar todo lo necesario (material, equipos, muestras, soluciones, reactivos, etc.)

Limpiar el rea de trabajo con alcohol 70%

Evaluar el riesgo del procedimiento a realizar a fin de utilizar la proteccin correcta.

Durante el trabajo

Lavar con abundante agua en caso de salpicaduras con cidos o bases, o en caso de quemaduras.

Nunca pipetear con la boca, usar peras ya sean de goma o automticas.

Si utiliza mecheros de alcohol nunca llenarlos ms de la mitad del contenido, y nunca cambiarlos de lugar estando encendidos.

No usar el telfono celular.

Mantener el orden durante todo el procedimiento, esto le evitar cometer errores y accidentes graves.

Despus del trabajo

Limpiar el rea de trabajo con alcohol al 70%

Limpiar los equipos usados con alcohol al 70% o agua destilada, dependiendo de las instrucciones de uso de cada equipo.

Los materiales usados lavarlos y dejarlos en su lugar de almacenamiento.

Cmo eliminar los desechos?

En desechos comunes se eliminan papeles, cartones o cualquier desperdicio producido de las actividades diarias y que no constituya ningn riesgo para la salud (funda negra).

En desechos infecciosos se eliminan guantes, mascarillas, algodones y todos aquellos materiales que estuvieron en contacto con material infeccioso (funda roja).

En desechos cortopunzantes se eliminan las puntas, agujas, y aquellos instrumentos que tengan filos; se elimina tambin en estos recipientes los microtubos (embace plstico con tapa).

Antes de eliminar los desechos cortopunzantes se deben mantener al menos dos horas en una solucin de cloro al 10%.

Para eliminar los desechos infecciosos se deben pesar y etiquetar, los desechos cortopunzantes se deben etiquetar. Este tipo de desechos se eliminan una vez por semana en el da asignado.

Cmo trabajar en la zona estril?

Limpiar con alcohol al 70% el rea de trabajo dentro de la cabina de flujo laminar y las pipetas.

Colocar todo el material a usar dentro de la cabina (puntas, microtubos, pipetas, gradillas, etc.).

Antes de iniciar el trabajo encender la luz UV 60 minutos en el cuarto y 15 minutos en la cabina de flujo laminar.

Apagar la luz UV, esperar aproximadamente 10min antes de iniciar el trabajo (el UV produce molculas de ozono).

Terminado el protocolo, limpiar toda la zona, dejar los materiales en su lugar de almacenamiento.

MANUAL DEL USO BASICO E INSTALIACIN DE EQUIPOSMini centrifuga

Marca: Eppendorf

Modelo: MiniSpin

Aplicaciones:

Separacin de sustancias en base a su densidad

Precauciones:

Colocar el equipo en una superficie plana y estable.

Debe de encontrarse lejos de equipos que generen calor (como mecheros), ni exponer directamente a la luz del sol.

Fuente de energa de 110V

No debe colocarse cerca de balanzas u otro tipo de equipos que puedan des calibrarse con el movimiento.Caractersticas:

Su capacidad es para 12 tubos de 1,5ml.

Velocidad mxima 13400rpm y tiempo mximo 30 minutos.

Proceso de encendido

1. Encender el equipo en el switch que se encuentra en la parte posterior.

2. Elegir el tiempo con los botones 1 y 23. Elegir las rpm con los botones 3 y 44. Se abre la tapa con el botn Open. Se recomienda limpiar siempre antes de su uso.

5. Colocar las muestras tener cuidado que siempre estn equilibradas. Como se indica en el grfico :

6. Colocar la tapa interna. Y dar inicio es en el botn Start.Proceso de apagado

Esperar a que la centrifuga termine de trabajar y se observe en el centro de la pantalla. La tapa se abre automticamente.

1. Sacar todas las muestras.

2. Cerrar la tapa.

3. Apagar en equipo en el switch que se encuentra en la parte posterior.

En el caso que necesite detener el equipo:

1. Seleccionar el botn Stop.2. Abrir la tapa con el botn Open.Seales de alerta

Smbolo

Razn

Solucin de problema Mal tapado Presionar el botn Open, y volver a tapar correctamente

Sonido fuerte Mal equilibradosDetener el proceso y colocar correctamente las muestras.

los tubos

Vortex Mixer

Marca: Labnet

Aplicaciones:

Mezclar muestras

Precauciones:




No debe colocarse cerca de balanzas u otro tipo de equipos que puedan des calibrarse con el movimiento.

Caractersticas:

Se puede usar para un solo tubo cabezal (negro), o utilizar el cabezal (azul) para varios tubos de 0,2 ml a 2 ml

Tiene dos opciones la de movimiento continuo o cuando da movimiento solo al realizar la presin sobre el cabezal


1. Escoger la velocidad con la varilla hay de mximo a mnimo.

2. Si se desea un movimiento continuo, el interruptor debe colocarse en ON.

Y si se desea solo un momento hacer presin con el tubo sobre el cabezal.

Proceso de apagado

Debe el interruptor colocarse en OFF.

Cabina de flujo laminar

Marca: Labconco

Aplicaciones:

Sirve para trabajar procesos que pueden contaminarse.

Protege al operario de posibles contaminaciones con las muestras a trabajarse.

Precauciones:

Fuente de energa de 110V.

Debe revisarse anualmente el filtro HEPA y cambiarse en el caso de ser necesario.


1. Encender el UV de la cabina por 15minutos, al igual que el flujo laminar.

2. Apagar el UV. Y limpiar con alcohol etlico al 70%, de la siguiente manera . No se debe pasar por el mismo sitio ya limpio.

3. Introducir a la cabina todo el material de uso. Y trabajar a unos 10cm de la superficie, as como evitar sacar o incluir mayor cantidad de materiales, pues esto causa turbulencias en el flujo, en el caso ser necesario esperar unos 2 minutos antes de continuar con el trabajo.

Proceso de apagado

1. Sacar el material, y limpiar con alcohol etlico al 70%.

2. Dejar el flujo prendido durante unos 15 minutos.

3. Apagar el flujo. En el caso que se va seguir trabajando pero con otro proceso se recomienda colocar nuevamente la luz UV durante unos 15minutos.

Fluooskan Ascent (Fluorometro y luminometro para microplatos)

Marca: Thermo Scientific

Aplicaciones:

Sirve para: pruebas de proliferacin celular, citotoxicidad, cuantificacin de DNA y de productos de PCR, actividad enzimtica, inmuno ensayos, cuantificacin de bacterias, entre otros.

Precauciones



Caractersticas

Para medir fluorescencia de platos de 1 a 384 pocillos.

Los filtros que se tiene son: Exitacin: 355 y 485

Emisin: 460 y 538

Se adjuntan caractersticas dadas por la casa comercial


1. Prender la computadora, luego el fluoroskan (el switch se encuentra en la parte lateral izquierda del equipo) y por ltimo abrir el software del equipo. Esperar que en la parte inferior del programa se indique que ya est conectado al equipo. Adicionalmente observar el color del foco: verde es que el equipo est listo, anaranjado el equipo est ejecutando un programa y roja que existe un problema

2. Se puede utilizar un programa que exista en el software ingresando a abrir (2) o crear un programa (1). El programa puede incluir:

Incubate

Shake.- para determinar la velocidad revisar en la pag. 39 del manual, pues esta debe ser en base al dimetro de los pocillos.

Measure.- Son las caractersticas de lectura. El mtodo de medicin es por Fluorometric, las unidades RFU (unidades de fluorescencia), los filtros usados: excitacin 485 y el de emisin 538).

Save/load1 (guarda los datos de las mediciones realizadas segn Measure1. Se puede cambiar la direccin de destino de los datos, esos se guardan con numeraciones consecutivas.)

Save/loas2 (guarda el anlisis de datos de la funcin Curve Fit. Se puede cambiar la direccin de destino de los datos, esos se guardan con numeraciones consecutivas) Todas estas opciones pueden modificarse segn el ensayo y pueden repetirse las veces que sean necesarias. En el manual puede encontrar ms opciones.

3. Para definir las caractersticas del plato a leer se debe ingresar a las diferentes pestaas de la barra, que son:rea definitionSeleccionar los pocillos donde se necesita leer.

Observaciones:

Color amarillo los lugares a leer

Color negro los lugares que no hay lectura

LayoutEscoger el tipo de muestras, en el pocillo que se lo va a colocar:

CALIBR.: colocar la concentracin empleada para la curva de calibracin

Blank: Los blancos

Sample: colocar el nombre de la muestra, el factor de dilucin usado, y el nmero de rplicas.

Se selecciona con apply para mantener o clear para borrar

SettingsSeleccionar la direccin de la lectura

4. Para colocar el plato hacer click en open in (4). Debe colocarse la placa sobre el drop plate.(Para evitar que caiga liquido en el sistema del equipo) Posteriormente para cerrar hacerlo en plateo ut (5)

5. Seleccionar START run (3). Y esperar a que termine el equipo, durante el proceso el foco ser de color naranja. En el caso que exista algn inconveniente se observara el foco rojo y saldr un mensaje. (recurrir al manual del equipo para solucionar el problema)

6. Revisar los datos en la carpeta que se seleccion para que se almacenen, se guardan en base al nmero de lectura (siendo su lectura la que tenga los valores ms altos)

7. Sacar la placa de la misma manera que se la coloco.

Proceso de apagado

Cerrar el software, posteriormente apagar el equipo en el switch

Mantenimiento

Para mantener los capilares se recomiendo cada cierta cantidad de meses dependiendo del uso hacer un lavado con agua destilada y desionizada. Para lo cual se usa la funcin prime y empty ubicados en el men Execute. En ambos casos asegurarse que se ha colocado una placa para evitar que caiga agua al interior del equipo.

Recomendacin

Leer el manual del equipo.

MANUAL DE USO DE LA FUENTE DE PODER Y CUBETA DE ELCTROFORESIS

Marca: Thermo Scientific

Precauciones

La fuente de poder se conecta a una toma de corriente 110V.Revisar el manual completo antes de usar los equipos.Caracteristicas

Los valores mximos del equipo: Max. Voltage: 300 V

Max. Current: 400 mA

Max. Power: 75 AProceso de utilizacin

Llenar la cubeta de electroforesis con buffer hasta la seal, e insertar los cables en los conectores de la fuente de poder. Asegurarse que cada cable est en el conector correspondiente.

Encender la fuente de poder (botn power switch) en la parte posterior del equipo.

Selecciones las condiciones de corrida (voltios, miliamperios, tiempo) presionando en cada uno de estos botones y ajustando el valor con las flechas.

Presiones el botn ON/OF del frente para iniciar.

Confirme que la cubeta y la fuente de poder estn funcionando correctamente antes de retirarse del lugar.

Retire los cables de los conectores tomndolos nicamente de la parte final de plstico, NO hale del cable.

Apagar el equipo.

Lavar la cubeta de electroforesis y accesorios con agua y detergente, la tapa no es necesario lavarla, puede usar una toalla de papel para limpiarla.

NO usar alcohol o solventes orgnicos para limpiar la cubeta.

Secar la cubeta y accesorios antes de guardar.

Centrifuga

Marca: Heraeus

Modelo: Labofuge 200 (Para tubos de 15 ml)

Aplicaciones:

Separacin de sustancias en base a su densidad

Precauciones:




No debe colocarse cerca de balanzas u otro tipo de equipos que puedan des calibrarse con el movimiento.Caractersticas:

Su capacidad es para 12 tubos de 15ml.

Velocidad mxima 5300rpm.Con rotor de ngulo fijoProceso de encendido

7. Conectar el equipo8. Para elegir el tiempo seleccionar el botn Time y luego con los botones + y modificar los hasta llegar al tiempo deseado.9. Para elegir las rpm seleccionar el botn Speed y luego con los botones + y cambiar el valor preexistente hasta llegar a las rpm deseadas.10. Se abre la tapa con el botn Lid. Se recomienda limpiar siempre antes de su uso.

11. Colocar las muestras, tener cuidado que siempre estn equilibradas. Como se indica en el grfico :

12. Cerrar la tapa y dar inicio es en el botn Start.Proceso de apagado

Esperar a que la centrifuga termine de trabajar.

4. Sacar las muestras. Deben sacarse al muestras solo cuando marque cero tanto en tiempo como en velocidad.5. Cerrar la tapa.

6. Para apagar el equipo es necesario desconectarlo.

En el caso que necesite detener el equipo:

3. Seleccionar el botn Stop.4. Abrir la tapa con el botn Lid.Seales de alerta

Smbolo

Razn

Solucin de problemaSonido fuerte Mal equilibradoDetener el proceso y colocar correctamente las muestras.

Bao MaraMarca: Sakuara

Modelo: KH806 Aplicaciones:

Calentar muestras o reactivos, o mantener a una temperatura constante

Precauciones

La fuente de poder se conecta a una toma de corriente 110V.Este equipo tiene el regulador de temperatura daado, por lo que se recomiendo utilizar un termmetro para determinar la temperatura, pero una vez estabilizada la temperatura no se cambia.Proceso de utilizacin

Llenar con agua destilada, hasta que cubra el calentador. Encender en el switch, y seleccionar la temperatura deseada (debe seleccionarse una menor a la requerida) Monitorear con el termmetro la temperatura, una vez que llegue a la requerida, mover la perilla del a temperatura hasta que el foco rojo se apague, indicando as que esta temperatura se mantendr constante. Al terminar de usarlo dejar apagando el equipoMantenimiento

Debe lavarse peridicamente el equipo con agua y jabn, y luego dejarlo nuevamente con agua destiladaNanodrop

Marca: Thermo ScientificModelo: Nanodrop 200cAplicaciones:

Cuantificacin de cidos nucleicos y de protenas.

Caractersticas Espectrofotometro UV-visible: de 190 a 840 nm de longitud de onda

Lmite de deteccin del pedestal mnimo 2ng/ul ds DNA

Lmite de deteccin de para cubeta mnimo 4ng/ul ds DNA y mximo 750 ng/ul dsDNA

Mnimo volumen de medida 0.5ul en el pedestal. Tambin se puede medir con cubeta

Software compatible a Windows XP y Vista

Tipo de detector: 2048-elemento lineal de Silicon CCDPrecauciones:

Fuente de energa de 110V.

Cuando se desea determinar protenas en el pedestal es necesario adquirir con anterioridad PR-1 kit (para reconstituir la tensin superficial del pedestal)El pedestal debe limpiarse con paos que no dejen pelusas, y sin ninguna sustancia.Proceso de encendido

1. Encender la computadora (automticamente se enciende el nanodrop)2. Abrir el softwareProceso de apagado

4. Sacar el material, y limpiar con alcohol etlico al 70%.

5. Dejar el flujo prendido durante unos 15 minutos.

6. Apagar el flujo. En el caso que se va seguir trabajando pero con otro proceso se recomienda colocar nuevamente la luz UV durante unos 15minutos.

UNIVERSIDAD TECNICA PARTICULAR DE LOJA

CENTRO DE BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

DESECHO CORTOPUNZANTE

FECHA

UNIVERSIDAD TECNICA PARTICULAR DE LOJA

CENTRO DE BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

DESECHO INFECCIOSO

PESO.kg

FECHA

1 2 3 4

O

Cabezal

Interruptor

Cabezal

Foco

Puerta por la cual se introduce el plato

1 2

3 4 5

Barra

1 2 3 4 5

O

Manual y Protocolos Del Area Biologia Molecualr Humana

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