Manual bIR - Inspiracle€¦ · Receptor de Ag del linfocito T.. .....89 Tema 9. Desarrollo de...
Transcript of Manual bIR - Inspiracle€¦ · Receptor de Ag del linfocito T.. .....89 Tema 9. Desarrollo de...
Manual bIR
VOLUMEN V: MANUAL DE INMUNOLOGÍA
Autor: Dr. Tomás E. Verdura González
Editora: Dra. Iliana Perdomo López
Manual BIR. VOLUMEN V: MANUAL DE
INMUNOLOGÍA
Autor: Dr. Tomás E. Verdura González
© Iliana Perdomo López (editora). Depósito legal: DLC 615-2012
Reservado todos los derechos. Está prohibido, bajo las sanciones penales y el resarcimiento civil previsto en las leyes, reproducir, registrar o transmitir esta publicación, íntegra o parcialmente por cualquier sistema de recuperación y por cualquier medio, sea mecánico, electrónico, magnético, por fotocopia o por cualquier otro, sin la autorización previa por escrito de la editora.
ÍNDICE DE MANUAL DE INMUNOLOGÍA
Tema 1. Introducción. Generalidades. Células y tejidos del sistema
inmune .................................................................................................................. 1
Tema 2. Inmunoglobulinas. Estructura funcional. ..................................................... 21
Tema 3. Genética de las inmunoglobulinas .................................................................. 35
Tema 4. El sistema del complemento. ............................................................................. 43
Tema 5. Complejo principal de histocompatibilidad (MHC). .................................. 57
Tema 6. Citocinas. ..................................................................................................................... 65
Tema 7. Desarrollo de linfocitos B.. .................................................................................. 83
Tema 8. Receptor de Ag del linfocito T.. ......................................................................... 89
Tema 9. Desarrollo de linfocitos T .................................................................................... 95
Tema 10. Transducción de señales mediante los receptores de Ag de linfocitos B y T. ............................................................................................. 99
Tema 11. Inmunidad mediada por linfocitos T.. ........................................................ 107
Tema 12. Activación de linfocitos B y producción de anticuerpos.. ................ 125
Tema 13. Regulación de la respuesta inmune ........................................................... 135
Tema 14. Inmunidad frente a microorganismos. ...................................................... 145
Tema 15. Inmunodeficiencias ............................................................................................ 159
Tema 16. Reacciones de hipersensibilidad. ............................................................... 171
Tema 17. Autoinmunidad ..................................................................................................... 181
Tema 18. Trasplantes y aloinmunidad ........................................................................... 187
Tema 19. Respuesta inmune frente a tumores .......................................................... 193
Tema 20. Técnicas Inmunológicas y manipulación de la
respuesta inmune tumores ............................................................................ 201
Bibliografía ................................................................................................................................. 237
Inmunología InspiracleBIR/2015
1
Tema 1. Generalidades. Células y tejidos del sistema inmune.
(2014: 133, 134, 143, 160), (2013: 53, 207, 214) (2012: 122, 136, 137, 139) (2011: 128, 138, 255) (2010: 122,
126,128, 139, 140, 141) (2009: 122, 126, 138) (2008: 129, 138, 143, 144) (2007: 73, 131, 134) (2006: 144,
164, 254) (2005: 53, 54, 55, 60, 62, 64, 69) (2004: 184, 186, 195, 196) (2003: 147)
El sistema inmune es, por excelencia, el encargado de mantener la homeostasia del
organismo. Originado a partir de adaptar moléculas, células y tejidos a las tareas de
preservar el equilibrio interno, fue complejizándose bajo la presión evolutiva hasta alcanzar
la diversidad de estructuras, mecanismos y funciones que caracterizan a dicho sistema en
los organismos superiores. Los seres vivos tienen que preservar constantemente su
integridad biológica frente a los cambios internos y externos (tumores, infecciones, etc.) que
amenazan su supervivencia. Esta es la tarea del sistema inmune y la realiza mediante la
identificación de las moléculas propias y extrañas y la destrucción de aquellas consideradas
“peligrosas”. El estudio de las estructuras y mecanismos que conforman dicho sistema y de
sus alteraciones patológicas es el campo de interés de la inmunología.
Los llamados mecanismos de defensa (en realidad adaptaciones del medio interno ante
cambios probablemente peligrosos) son muy diversos y de origen filogenético diferente, pero
en un organismo funcionan todos, concatenados y coordinados, al unísono. Dichos
mecanismos de defensa se suelen clasificar en innatos (inmunidad natural o inespecífica) y
adaptativos (inmunidad adquirida o específica).
Rep. De . Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
2
La respuesta inespecífica o innata constituye la primera barrera defensiva del organismo y
no requiere, para su funcionamiento óptimo, de contacto previo con el agente agresor. Por lo
general a igual estimulo siempre se desarrolla con igual intensidad (no se amplifica) y su
sistema de discriminación de las características fisicoquímicas del agente agresor es menos
sofisticado (solo reconoce estructuras muy primitivas y conservadas filogenéticamente y
estímulos físicos o químicos).
Consta de estructuras y mecanismos físico-químicos como la existencia de las barreras
naturales (la piel y las mucosas impiden la fácil penetración de agentes externos), el flujo
constantes de secreciones (flujo de orina que arrastra bacterias) y las secreciones de
sustancias con actividad antibacteriana (como la lisosima de la saliva y lágrimas que rompe
la unión de azúcares en las paredes bacterianas, el PH extremo del estómago, los ácidos
grasos de la piel, etc).
También entre estos mecanismos inespecíficos se encuentran células y moléculas que
participan fundamentalmente en los procesos de inflamación, fagocitosis e histolisis como
los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos, los macrófagos y las células NK. A esto se le
suma la participación de otras células que tienen una acción con carácter más particular
como basófilos, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, etc.
En ella participan también moléculas como las citoquinas (interleuquinas, quimioquinas,
interferones, etc.), las enzimas citoliticas intracelulares, sistemas moleculares integrados
como el complemento y otro gran número de estructuras de membrana, mecanismos
bioquímicos (ej. proteinas de fase aguda como el fibrinógeno y la proteina C reactiva, etc.) y
metabólicos cuya actividad integrada y coordinada tiene como finalidad el aislamiento y la
destrucción de los agentes “agresores” sean de naturaleza física, química o biológica.
La respuesta específica o adquirida se desarrolla solo (especificidad) frente a las
moléculas extrañas (antígenos) que indujeron su iniciación y está mediada
fundamentalmente por los linfocitos y las sustancias liberadas por los mismos (anticuerpos,
citoquinas, etc.) Requiere del reconocimiento antigénico (discriminación, especificidad,
clonalidad), lo cual le caracteriza, además de otras propiedades como memoria,
amplificación y autorregulación. Mejora cuantitativa y cualitativamente con los subsiguientes
encuentros con el antígeno que le dio origen (cambios en la respuesta secundaria con
respecto a la primaria).
InspiracleBIR/2015 Inmunología
60
constituyen regiones de contenido variable en aminoácidos, es decir son las zonas donde
radica la variabilidad de la molécula. Por el contrario el dominio alfa-3 es bastante constante.
Rep.de Peña. J. Inmunologíaonline. http://www.uco.es/grupos/inmunologia-molecular/ 2003.
Los dominios 1 y 2 constan cada uno de ellos de una zona formada por cuatro
fragmentos en estructura de hoja plegada seguido de otro segmento organizado en forma
de -hélice. Esta organización delimita una hendidura denominada sitio de unión al
péptido en el que los residuos más polimórficos se encuentran en el suelo y las paredes de
la hendidura. En esa hendidura se sitúa un péptido que va ser presentado a los linfocitos T
CD8. Este péptido procede de proteínas endógenas y tiene un tamaño de aproximadamente
8-10 aminoácidos. Un determinado antígeno de histocompatibilidad puede unirse a péptidos
diferentes siempre que éstos posean uno o varios motivos que interaccionen con las zonas
adecuadas complementarias de la molécula MHC (promiscuidad o degeneración).
InspiracleBIR/2015 Inmunología
70
hepatocitos y actúa sobre el SNC induciendo sueño y anorexia, típicamente asociados con
los procesos infecciosos. Posee notable redundancia con IL-6 y también con TNF.
IL-6: Producida por monocitos y macrófagos, células endoteliales vasculares, fibroblastos y
otras células, en respuesta a IL-1 y TNF. Induce a la síntesis hepática de proteínas de fase
aguda, como el fíbrinógeno, la PCR y factores del complemento, que contribuyen a la
respuesta de fase aguda. Actúa como factor de crecimiento de células B activadas en sus
últimas etapas de diferenciación. Regula la hematopoyesis y estimula la producción de
inmunoglobulinas.
Rep.de Peña. J. Inmunologíaonline. http://www.uco.es/grupos/inmunologia-molecular/ 2003.
Quimiocinas: Las quimiocinas son un grupo de pequeñas moléculas proteicas (8-14 kDa)
con características bioquímicas comunes producidas por muchos tipos celulares en
respuesta a estímulos exógenos o endógenos. Son moléculas que estimulan el
movimiento de leucocitos en sentido del gradiente de concentración
(quimioatrayentes de leucocitos) y actúan sobre las células endoteliales favoreciendo su
separación y expresión de moléculas de adhesión para facilitar la migración leucocitaria.
Además participan en la angiogénesis, otras organogénesis y la regulación del tráfico
linfocitario. Se han dividido en tres familias: Familia o C-X-C, siendo las más
representativas la IL-8 y el factor activador de plaquetas 4 (PAF-4), Familia o C-C, dentro
de la cual se encuentran RANTES, proteínas inhibidoras de macrófagos (MIP) y proteínas
quimioatrayentes de monocitos (MCP) y Familia o C, representada por la linfotactina.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
80
Rep.de Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.
Dentro de esta familia hay dos grupos de receptores: Tipo I o receptores de hematopoyetinas: presentan el motivo WSXWS que les
caracteriza. Pertenecen a este grupo los receptores de IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-
9, IL-11, IL-12. Pueden presentar varias vías de transducción.
Tipo II, carecen del motivo WSXWS y presentan una sola vía de transducción.
Pertenecen a este grupo los receptores de IFN e IL-10.
Familia de los receptores de quimiocinas: Se caracterizan por presentar siete
dominios transmembrana típicos de la transducción mediada por proteínas G
(asociadas a su extremo carboxiterminal intracitoplasmático y que catalizan la
conversión de GDP en GTP).
Inmunología InspiracleBIR/2015
109
integrados en tejidos sólidos; allí reciben distintos nombres y, aunque mantienen sus
propiedades principales, adquieren características específicas al diferenciarse en los
diferentes tejidos. Los macrófagos activados en el lugar de la infección inician un proceso de
fagocitosis muy activo mediante receptores específicos, receptores tipo toll (TLR) y
receptores scavenger, capaces de reconocer patrones moleculares (PAMPS) expresados en
los patógenos. Los macrófagos también pueden endocitar antígenos opsonizados con
moléculas del complemento o anticuerpos, vía receptores del complemento o receptores Fc.
También aumentan la expresión de moléculas de clase II y las moléculas accesorias en su
superficie, por lo que aumentan su capacidad de presentación de antígeno. A consecuencia
de la activación, los macrófagos secretan quimiocinas que reclutan células inflamatorias y
citocinas implicadas en la activación de las células T como IL-12.
Linfocitos B: Los linfocitos B pueden actuar como células presentadoras de antígeno ya
que expresan MHC-II constitutivamente, expresión que aumenta cuando se activan, aunque
su capacidad de captación de antígeno es muy baja. Sin embargo, los linfocitos B son
células presentadoras muy eficientes si expresan una inmunoglobulina de superficie (BCR)
específica del antígeno. La presentación de antígeno a linfocitos T específicos es parte
esencial de la completa activación y diferenciación de la célula B en célula plasmática
productora de anticuerpos, ya que para este proceso, los linfocitos B requieren de la
colaboración de los linfocitos T. La presentación de antígeno es su forma de obtener esta
colaboración.
APCs no profesionales: En condiciones de inflamación y presencia de citocinas,
especialmente IFN-, otras células como las endoteliales, las epiteliales o los fibroblastos,
expresan MHC-II y como consecuencia podrían presentar antígeno en determinadas
situaciones. Por otra parte, todas las células nucleadas que expresan MHC-I pueden
presentar antígeno a células T CD8+ aunque no son capaces de iniciar una respuesta
inmune.
Captacion de antigenos exógenos.
Las células captan antígenos exógenos por endocitosis, mediada o no por receptores. Se
distinguen dos tipos de endocitosis: pinocitosis y fagocitosis. La pinocitosis es la captación
de líquido extracelular en el que se hallan los antígenos en forma soluble, llamada
macropinocitosis cuando la célula es capaz de captar grandes volúmenes de fluido,
mecanismo clásico de las células dendríticas. La fagocitosis es un proceso utilizado por
fagocitos mononucleares, neutrófilos y otras células para ingerir y eliminar partículas de gran
tamaño (bacterias, restos celulares). La internalización de la partícula se inicia por la
InspiracleBIR/2015 Inmunología
110
interacción de receptores en la superficie de la célula con ligandos de la superficie de la
partícula o por simple invaginación mecánica de la membrana. Después de la
internalización, la vesícula formada (endosoma o fagosoma) madura por fusión con
compartimentos de la vía endocítica en varios pasos, que culminan en la formación de
lisosomas. La vía endocítica está constituida por distintos tipos de vesículas cuyo contenido
se va modificando a medida que van madurando en el interior de la célula. El pH del interior
de estas vesículas es bajo y va acidificándose a medida que éstas van evolucionando hacía
lisosomas. Los diferentes compartimentos contienen distintas proteasas que los
caracterizan. El procesamiento de antígeno consiste en la desnaturalización y proteolisis de
las proteínas captadas en las vesículas acídicas.
Biosintesis de las moléculas del MHC.
Las moléculas del MHC (clase I y clase II) son proteínas de membrana, cuyas vías
biosintéticas y de exocitosis son distintas e influyen en el tipo y origen de los péptidos que
presentan.
Rep.de Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.
Inmunología InspiracleBIR/2015
153
Rep.de Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.
Los virus inducen la síntesis de varios IFNs que juegan un papel muy importante en la
resistencia a ciertas infecciones virales. Los IFNs son capaces de ejercer la acción antiviral
de varias maneras sinérgicas: bloqueo de la replicación viral, aumento en la expresión de
MHC, activación de las células NK y de los macrófagos.
Otro mecanismo, a nivel de respuesta innata, es mediado por células NK, un grupo de
linfocitos grandes granulares cpaces de destruir células infectadas por virus y parásitos
intracelulares mediante citotoxicidad directa no restringida por el MHC o por mecanismos de
citotoxicidad celular dependiente de Ac (ADCC), otro ejemplo de cooperación entre
respuesta innata y específica.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
154
Rep.de Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.
En el caso de los parásitos extracelulares es importante la actividad de los fagocitos.
La destrucción del parásito por células fagocíticas se lleva a cabo por dos tipos de
mecanismos:
Oxígeno-dependientes: Actuan mediante la formación de productos metabolitos del
oxígeno debido a la acción de enzimas como la mieloperoxidasa y a la formación
espontánea de radicales. Otro mecanismo importante es mediado por la acción del
óxido nítrico.
Oxígeno-independientes: variaciones del pH, la acción de enzimas como la
lisozima, la lactoferrina y las proteínas catiónicas.
Receptores del sistema inmune innato.
El sistema inmune innato carece de la especificidad del adaptativo, pero es capaz de reconocer
las estructuras no propias consideradas como “peligrosas” y activar mecanismos para
destruirlas. Al contrario que los receptores de la respuesta adaptativa, los del sistema
innato no se distribuyen de forma clonal, sino que existen en todas las células del mismo
tipo o linaje. La unión de patógenos a estos receptores dispara rápidamente la respuesta,
sin el retraso impuesto por los mecanismos de expansión clonal de la respuesta adaptativa.
Inmunología InspiracleBIR/2015
175
Las reacciones de tipo II son reacciones mediadas por la interacción de antígenos
presentes en la superficie de diferentes células con anticuerpos de tipo IgG e IgM
preformados y que reconocen el tejido en cuestión. El daño celular resulta de la posterior
activación de la cascada del sistema complemento o su interacción con células
efectoras a través de su fracción Fc. Los receptores para la fracción Fc de la IgG se
encuentran presentes en células fagocíticas (neutrófilos, macrófagos), células NK y
plaquetas. La activación de estos receptores causa la liberación de proteasas y radicales
libres de las células fagocíticas y el proceso de citotoxicidad dependiente de anticuerpo
(ADCC) mediado por los linfocitos NK. Además, la activación del sistema del complemento
origina el depósito de las fracciones C3b y C3bi en la membrana celular. Tanto las células
fagocíticas como las NK poseen receptores para estos fragmentos (CR1 y CR3) lo que
favorecerá su unión a la célula diana y su subsecuente destrucción.
Los ejemplos más claros de hipersensibilidad de tipo II lo constituyen las reacciones
hemolíticas. En determinadas circunstancias existen anticuerpos preformados que pueden
reaccionar con antígenos de membrana del eritrocito y ocasionar su destrucción. Tal es el
caso de las reacciones contra antígenos de grupos sanguíneos. A veces no se reconocen
Ag propios sino Ag adsorbidos a la membrana como puede ocurrir con los medicamentos.
El ejemplo clásico es la eritroblastosis fetal por conflicto Rh entre madre y feto.
Hipersensibilidad tipo III
Las reacciones de hipersensibilidad tipo III se producen por la existencia de
inmunocomplejos circulantes que al depositarse en los tejidos causan la activación
de los fagocitos y el subsecuente daño tisular.
Rep.de Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.
Inmunología InspiracleBIR/2015
183
Además del MHC (HLA) otros muchos genes han sido asociados con una frecuencia
significativamente más elevada de enfermedades autoinmunes en comparación con la
población general, pero esta asociación siempre es débil e incompleta y en la mayor parte
de los casos se desconoce gran parte o totalmente los mecanismos que subyacen en esta
aparente asociación.
Factores ambientales
La concordancia de gemelos monocigotos para una enfermedad autoinmune no supera en
ningún caso el 60%. En consecuencia debe haber factores no controlados genéticamente
que intervienen en la expresión de las enfermedades autoinmunes. A dichos factores en
general les denominamos factores ambientales. Entre ellos destacan los agentes
infecciosos (mimetismo molecular, desrepresión de genes) las sustancias químicas
(modificación del DNA, neoantígenos) y las hormonas (por lo general más frecuentes en el
sexo femenino).
Rep.de Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
190
Rep.de Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic. 2008.
Tipos de rechazo.
En dependencia del tiempo mediado entre el transplante y el rechazo y los mecanismos
implicados, desde el punto de vista clínico el rechazo se clasifica en hiperagudo, agudo y
crónico.
Rechazo hiperagudo: Ocurre en los minutos u horas inmediatas a la revascularización del
órgano transplantado (existe una variante un poco más lenta que ocurre en los primeros
días tras el transplante que se le llama rechazo acelerado). Se debe a anticuerpos
preformados en el receptor contra antígenos presentes en el órgano transplantado.
Habitualmente antígenos de grupos sanguíneos presentes en hematíes adheridos y
fundamentalmente los expresados en las células del endotelio vascular del órgano
transplantado. Tras esta unión se activa complemento y a través de él la cascada de la
coagulación produciéndose trombosis e isquemia. Además, mecanismos inflamatorios que
atraen células fagocíticas y citotóxicas.
Rechazo agudo: es aquel que se produce en el primer mes postransplante. No se conoce
el mecanismo exacto por el que se produce un rechazo agudo, pero los hallazgos
histológicos y la respuesta a la terapia inmunosupresora indican que en él intervienen tanto
la inmunidad específica (humoral y celular) como otros mecanismos no específicos
(respuesta inflamatoria con estimulación de polimorfonucleares, plaquetas y macrófagos,
Inmunología InspiracleBIR/2015
203
Inmunoelectroforesis:
Consiste en la separación electroforética de los antígenos en el gel de agarosa y posterior
identificación mediante reacción de precipitación con anticuerpos. Útil en mezclas problema
de Ag muy complejas (muchos Ag que se quieren identificar en la misma muestra como
bandas mono u oligoclonales de Ig en el suero para dignosticar mielomas o en LCR para
diagnosticar esclerosis múltiple -bandas monoclonales, a veces de paraproteínas-.
En los agujeros se depositarán las mezclas antigénicas y se aplica un dipolo por el que se
hace fluir corriente eléctrica. Los Ag se separan al migrar en función de su carga eléctrica y
a una velocidad dependiente de su peso molecular (a veces expresado en KDa y a veces
referido a su coeficiente de sedimentación en unidades Svedberg). A continuación hacemos
una ranura a lo largo del gel donde colocamos los anticuerpos (suero, mezcla de
monoclonales, policlonales, etc.) y se dejan difundir como en la inmunodifusión doble. Se
formarán bandas de precipitación donde cada anticuerpo reconozca a su antígeno
específico complementario en equivalencia de concentraciones. En el diagnóstico de
tumores
Rep.de Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.
La mayoría de los antígenos, a pH alcalino, migran hacia el polo positivo porque la
resultante de cargas entre los aminoácidos será negativa. Pero algunas proteínas con
muchos aminoácidos básicos compensan los OH- del medio y migran hacia el polo negativo.
Excepto la IgA de ratón, que a pesar de ser una Ig migra hacia el polo positivo, el resto de
las inmunoglobulinas (anticuerpos) migra hacia el polo negativo. Estas características en su
migración se aprovechan también en la contrainmunoleectroforesis.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
204
Contrainmunoelectroforesis:
Como en la inmunodifusión doble, se plantan el Ag y el Ac en pozos enfrentados, pero en
este caso no se dejan difundir espontáneamente, sino que para aumentar la sensibilidad y la
velocidad de la reacción se aplica un campo eléctrico para que migren uno hacia el otro.
Rep.de Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.
Electroinmunodifusión cuantitativa:
Semejante a la inmunodifusión radial de Mancini, pero inmersa en un campo eléctrico, es un
método cuantitativo y se conoce como Rocket electroforesis o electroinmunodifusión
cuantitativa. En esta técnica se añade el Ac al agar y luego cuando fragua se hacen los
pocillos en los que se añaden los Ag problema. Es necesario buscar un pH en el que los Ac
se carguen isoeléctricamente y no migren en el campo. Al aplicar el campo eléctrico los Ag
migrarán y precipitarán formando una banda según encuentren la equivalencia con el Ac. A
mayor concentración necesitarán más Ac por lo que la banda será mucho más larga. La
altura del cohete (forma de la banda) será entonces directamente proporcional a la
concentración del Ag.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
208
Rep. De Germ-Rudiger Burmester, Antonio Pezuto. Color Atlas of Immunology. Thieme.2003.
En la reacción indirecta (dos pasos), el caso de querer conocer si la madre está
sensibilizada (si tiene Ac anti-D en su suero), se toman hematíes Rh positivos y se hacen
reaccionar con el suero de la madre, que si tiene Ac anti-D se unirán a estos hematíes. En el
segundo paso se añade el suero de Coombs y si hay Ac maternos adheridos a los hematíes,
los Ac anti-IgG del suero de Coombs se fijarían a ellos y aglutinarían los hematíes.
Rep. De Germ-Rudiger Burmester, Antonio Pezuto. Color Atlas of Immunology. Thieme.2003.
Inmunología InspiracleBIR/2015
209
Reacciones de hemólisis:
Se basan en el principio de que si se forma un inmunocomplejo sobre la superficie de un
hematíe (un Ac que reconoce un Ag en la membrana del eritrocito y se une a él) y el Ac es
capaz de fijar complemento, al añadirle el complemento éste lisará al hematíe. Hay varios
tipos de reacciones de diagnóstico que descansan sobre este principio: Reacción de fijación
del complemento, técnica de formación de placas, etc.
Reacción de fijación del complemento.
El objetivo es detectar la presencia de determinados Ac en un suero problema.
Se realizarán secuencialmente 2 reacciones en un mismo tubo.
1) Ag + suero (puede contener los Ac) + complemento (C´) en cantidad limitada. Si en
el suero hay los Ac se consumirá el C´.
2) Hematíes + Ac anti-hematíe + el C´ de la reacción anterior si no se consumió).
Si había anticuerpos en el suero, el C´ se consumirá en la primera reacción y no habrá
hemólisis. En cambio, si en el suero problema no hay los Ac, el C´ permanecerá activo y se
unirá a los hematíes con los Ac de la segunda reacción fijados y los lisará.
Se suele montar en paralelo un tubo control sin el suero para controlar la reacción; en este
tubo siempre ocurrirá hemólisis.
Rep.de Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.
El resultado se da como titulación (1/ dilución máxima que produce inhibición total de la
hemólisis).
Técnica de células formadoras de placas (CFP).
El objetivo de la técnica es detectar si en una suspensión celular hay células productoras de
anticuerpos para determinados Ag.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
210
Se prepara una suspensión celular mixta con las células a testar (linfocitos obtenidos
mediante separación en gradiente de ficoll de sangre periférica) y eritrocitos de carnero
sensibilizados con el antígeno (con el Ag adherido a su membrana). Se incuban a 37 grados
y se añade complemento. Durante la incubación las células secretoras de Ac producen
inmunoglobulinas que secretan a su alrededor y se unen a los Ag fijados a la membrana de
los hematíes que se encontraban en este radio de acción. Al añadirse el complemento será
fijado por los inmunocomplejos (Ig que reconocieron los Ag de la membrana del eritrocito) y
lisará dichos eritrocitos. Entonces se vé que alrededor de la célula productora de Ac se
forma una zona vacía o placa de hemólisis. El número de placas de hemólisis equivale al
número de células que producen anticuerpos específicos.
Separación en gradiente de Ficoll
Rep.de Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.
Inmunología InspiracleBIR/2015
211
Técnicas con ligandos marcados.
Se basa en la conjugación de moléculas trazadoras (emisoras de una señal identificable) a
antígenos y más frecuentemente a anticuerpos. La presencia o no de la señal implica la
existencia o ausencia del ligando (ensayos cualitativos) y en muchos casos se puede medir
la cantidad o intensidad de la señal e inferir la cantidad de ligando (ensayos cuantitativos).
Se han utilizado, como moléculas trazadoras acoplables a los ligandos, diversidad de ellas
con cualidades diferentes:
-Moléculas fluorescentes
-Moléculas cromogénicas (con activación enzimática o no)
-Moléculas radiactivas
-Moléculas luminiscentes
Los ensayos con ligandos marcados pueden clasificarse de diversas maneras atendiendo a
las características del Ag (Ag fijos a tejidos o antígenos solubles), las características del
marcador o trazador (fluorescente, enzimático, radiactivo), la características del diseño de la
técnica (cualitativos, semicuantitativos, cuantitativos, competitivos, no competitivos,
homogéneos, heterogéneos), etc.
Inmunofluorescencia.
En esta técnica se conjuga el ligando (casi siempre el anticuerpo) con una molécula
trazadora fluorescente. Por lo general se aprecia la emisión de fluorescencia en un
microscopio específico llamado de fluorescencia que emite luz UV.
Inmunofluorescencia directa.
Se usa para detectar antígenos en tejidos o células e identificarlos. Es directa porque el Ac
marcado es el que reconoce directamente, en un solo paso, al Ag que se desea identificar.
Inmunofluorescencia indirecta.
Puede usarse igualmente para detectar o identificar antígenos en tejidos o muestras o para
detectar la existencia de Ac en suero o fase soluble para lo cual suele fijarse Ag específico a
fase sólida. En cualquier caso al ser indirecta se realizan dos pasos y se suelen usar dos Ac
de los cuales sólo uno se marca con la molécula fluorescente. Esta técnica además de ser
más versátil es más sensible que la directa.
Tinción del complemento.
Es una variante de la técnica indirecta aplicada para amplificar la señal fluorescente y
aumentar la sensibilidad del ensayo. Para ello es necesario que el Ac que reconoce el Ag (el
InspiracleBIR/2015 Inmunología
212
Ac del primer paso) sea capaz de fijar complemento. Como segundo anticuerpo o anticuerpo
conjugado (el Ac marcado que se añade en el segundo paso) reconozca específicamente un
componente del complemento. De este modo se marcará el C´ unido al primer Ac y el que
esté insertado a la membrana en la cercanía del Ag que al formar el inmunocomplejo activó
y fijó el C’.
Rep.de Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.
Inmunohistoquímica.
Es una técnica semejante a la anterior pero la molécula trazadora no es fluorescente sino un
colorante químico, una molécula electrodensa metálica si se quiere aplicar microscopía
electrónica (ej. Oro coloidal), una enzima que hace colorear un sustrato, etc. Este marcaje
se utiliza de modo directo o indirecto para detectar Ag en tejidos o utilizándolos como fase
sólida para detectar Ac en suero u otro fluido.
Los marcadores o trazadores utilizados, sean enzimas u otro tipo de molécula, deben poder
ser acoplados al Ac sin que esto afecte sus propiedades. En el caso de enzima, en
presencia de un determinado sustrato producirá color, pero este debe tener la particularidad
de ser soluble cuando lo añadimos, pero al unirse al enzima debe hacerse insoluble y formar
un precipitado insoluble en el sitio de reacción.
Inmunología InspiracleBIR/2015
213
Para la localización de estructuras subcelulares o simultáneas puede hacerse un doble o
triple marcaje. También estas técnicas pueden hacerse de modo directo (un Ac marcado) o
indirecto (dos anticuerpos, uno de ellos marcado) según lo requiera la determinación del
ligando que se pretenda evidenciar.
Inmunohistoquímica directa.
Inmunohistoquímica indirecta.
Rep.de. www.usc.es
Inmunocromatografia (dip-stick).
Son métodos que se basan en la migración de un ligando marcado con partículas
coloreadas apreciables a simple vista. Se utilizan en kits de diagnóstico rápido (Ej. test de
embrazo). Existen adaptaciones de esta metodología para diagnosticar un gran número de
enfermedades infecciosas, determinar Ag en alimentos, etc.
El soporte suele ser papel de acetato de celulosa embebido en un buffer apropiado y
envuelto en un chasis o cartucho de plástico en el cual hay practicadas ventanas
transparentes para permitir ver el color en ellas. En un extremo se pone la muestra problema
(que puede contener Ag o Ac a determinar) y cerca, pero un poco más adelantado se ha
preparado un sitio donde se ha colocado previamente el ligando conjugado con la partícula
trazadora (oro coloidal, partículas de látex coloreadas, etc). En otro sitio más adelantado
aún, y también preparado de antemano se coloca un reactivo capaz de unirse al ligando
problema. Sobre este sitio hay practicada una ventana (llamada positiva) para poder
visualizar el color. Más adelante hay practicada otra ventana (llamada negativa) que permite
apreciar color a este nivel.
Los reactivos migran por capilaridad en el papel de acetato de celulosa (de la zona más
húmeda a la más seca). Al migrar el ligando problema interactúa con el ligando marcado
(reaccionan y se unen formando un inmunocoplejo) y siguen migrando juntos. También
migran el ligando marcado y el ligando problema que no se unieron (excesos). El
InspiracleBIR/2015 Inmunología
214
inmunocomplejo migrará hasta llegar a la ventana positiva, donde hay fijado otro ligando del
componente de la muestra problema, diferente al conjugado. Este ligando fijo retendrá los IC
coloreados en este sitio que es la ventana positiva (color en esa ventana significa que hubo
reacción Ag-Ac y formación de IC o sea que se detectó el ligando buscado). El resto de los
ligandos que no se unieron (excesos) continuará migrando hasta la otra ventana y al contar
entre ellos con ligando marcado se coloreará entonces también esta ventana llamada
negativa. Esto sirve como control y como señal de fin de ensayo. En un caso positivo se
colorearán ambas ventanas y en uno negativo sólo la ventana negativa.
Rep.de. www.usc.es
Inmunoblot o inmunotransferencia (westernblot marcado con Ac).
Es un ensayo de alta sensibilidad y especificidad. Es altamente resolutivo y se usa tanto en
investigación como en diagnóstico. Se utiliza para identificar Ag inmersos en una muestra
compleja (muestra con muchos Ag diferentes). Permite además determinar el peso
molecular de los antígenos.
Se realiza en tres etapas:
Separación de los Ag (SDS-PAGE). Se prepara previamente un gel de poliacrilamida1 en el
que se incluye un molde antes de que polimerice, para crear los pocillos, en el extremo
donde se pondrá la muestra. Este gel, al polimerizar, forma un entramado microscópico a
través del cual podrá difundir la muestra. El gel, ya polimerizado, se coloca en una cámara
de electroforesis inmerso en un buffer apropiado. Antes de poner las muestras en los
pocillos se someten a tratamiento térmico para desnaturalizarlas (romper enlaces que
conforman la estructura tridimensional) y linearizarlas. Si se desea conocer el peso
molecular hay que poner en un pocillo un marcador especial que al separarse durante la
migración se divide en bandas de peso molecular conocido con las cuales se compararán
las obtenidas de la muestra problema. Al gel inmerso en el buffer se le somete a un campo
1 El Gel de poliacrimamida ofrece una mejor resolución de las bandas en la electroforesis con respecto a
otros soportes como papel, acetato de celulosa, gel de agarosa.
Inmunología InspiracleBIR/2015
215
eléctrico (dipolo) creado en la cámara de electroforesis que hará migrar los antígenos que
componen la muestra e irse separando en función de su peso molecular (por lo general las
proteínas migran del polo negativo al positivo en función de su carga neta). Los de menor
peso molecular migrarán más rápido (mayor facilidad para difundir a través de los poros del
entramado microscópico del gel) y los de mayor peso molecular lo harán más lentamente. Al
cabo de un tiempo los Ag de la muestra compleja quedan separados en el gel.
Transferencia a papel de nitrocelulosa: En una cámara de transferencia se hacen
coincidir el gel y una lámina de papel de nitrocelulosa de igual dimensión que este y
mediante capilaridad (utilizando papel de filtro) o más habitualmente con la aplicación de un
nuevo campo eléctrico se hacen migrar los Ag (proteínas), ya separados previamente en el
gel de poliacrilamida, desde el gel hacia el papel de NC donde quedan retenidos. Es
necesario hacer la transferencia de las proteínas a un papel de nitrocelulosa porque los
anticuerpos, debido a su estructura no pueden penetrar en el gel.
Revelado o marcaje: Una vez que tenemos las proteínas en el papel de nitrocelulosa se
añaden sobre este los Ac específicos que reconocerán los Ag presentes en él. Para poder
verlo (revelado) se utilizan Ac marcados con enzimas a los que se les añade el sustrato
correspondiente para obtener una señal de color semejante al inmunodot.
Las aplicaciones de esta técnica son prácticamente universales, en la clínica y en
investigación, en muchas ramas de las ciencias biológicas.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
216
Rep.de Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología del Sistema Inmune. Editorial médica
Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp. 2006.
ELISPOT:
Es una técnica muy sensible que se aplica para determinar la frecuencia de células
específicas en una suspensión celular (fracción mononuclear). Se pueden detectar células
de estirpe B secretoras de Ac (incluso de un isotipo determinado) o células T totales,
subpoblaciones o específicas. Aunque es un ensayo con alta disponibilidad y sensibilidad
actualmente ha sido relegado por las técnicas de citometría de flujo.
Si se quiere determinar la frecuencia de células de estirpe B productoras de Ac de una
especificidad determinada (productor de determinado idiotipo de Ig), se fija previamente a la
fase sólida (pocillo de placa) el Ag específico complementario. Sobre este se añade la
suspensión celular dentro de la cual estarán las células cuya frecuencia queremos
determinar. Si hay células productoras de Ac específicos para el Ag fijado, dichas células
secretarán dichos Ac que se adherirán los Ag que encuentren en su vecindad y entonces no
se eliminarán con los lavados. Seguidamente se añade un Ac anti-Ig conjugado con una
enzima. Se añade el sustrato que cambia de color por la acción de la enzima y si es
insoluble formará en cada sitio un punto de color correspondiente a cada célula específica
detectada. Si se utiliza un cromógeno que permanece soluble tras su interacción con la
Inmunología InspiracleBIR/2015
217
enzima se puede cuantificar, por la intensidad de color del medio, la cantidad de Ig
producida.
Puede también aplicarse el método para detectar células T, pero en este caso lo que se
detecta es alguna citoquina que produzcan dichas células. Es necesario activarlas
previamente enfrentándolas al Ag en presencia de células presentadoras (de otro modo no
producen las citoquinas). En esta variante en lugar de Ag fijado a la fase sólida se fija Ac
anticitoquina. El resto de la técnica es igual.
ELISPOT. Rep.de Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología del Sistema Inmune. Editorial médica
Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp. 2006.
Radioinmunoensayos (RIAs) y Enzimoinmunoensayos (EIAs).
Se define como inmunoensayo a todos aquellos métodos, empleados para la detección de
cualquier sustancia o compuesto, que están basados en las reacciones inmunológicas. Es
decir, que se fundamentan en el extraordinario poder discriminatorio que presentan los
anticuerpos y su gran afinidad por agentes externos extraños. Con estos métodos pueden
ser detectadas en muestras biológicas sustancias en el orden de picogramos. En ellos
alguno de los componentes de la reacción (antígeno o anticuerpo) está marcado con una
InspiracleBIR/2015 Inmunología
218
enzima (EIA) o con un elemento radioactivo (RIA). Existen muchas variantes con multitud de
aplicaciones.
Radioinmunoensayos (RIA).
Es un método para detectar algunas sustancias que pueden ser marcadas con radioisótopos
y constituir antígenos para determinados anticuerpos. Los RIAs originalmente utilizaban a
las sustancias que se querían determinar marcadas isotópicamente, o sea que lo que
presentaban marcado era el antígeno (Ag). Posteriormente aparecieron métodos en los que
lo que se marcaba era los anticuerpos (Ac) y a los que se les denominó ensayos
inmunoradiométricos (IRMAs) para diferenciarlos de los RIA. Los IRMA son más fáciles de
desarrollar, más precisos y más sensibles que los RIA originales. Es oportuno señalar que
actualmente, de manera general, se les llama “radioinmunoensayos” indistintamente si lo
que se marca es el Ag o el Ac. Estos métodos tienen alta sensibilidad y especificidad así
como mínimas interferencias, pero dado lo engorroso de los métodos de separación que
requieren, el elevado precio de los equipos lectores de radiactividad y el peligro que
representa la radiactividad para la salud de los operadores como para el medio ambiente
han sido sustituidos casi totalmente en la actualidad por los métodos inmunoenzimáticos. No
obstante se siguen usando en la determinación cuantitativa de hormonas, drogas y algunos
marcadores tumorales; todos ellos compuestos de muy bajo peso molecular y a bajas
concentraciones en la muestra. Debido a las características de dichos analitos, y a la
necesidad de cuantificarlos, se diseña el ensayo tipo competitivo, ya sea en una sola fase
líquida pero con sistemas de separación, o en dos fases (una líquida y una sólida).
Ej. RIA en medio líquido.
Si queremos determinar la concentración de un hapteno (H) en un fluido corporal;
habitualmente una hormona en orina o en suero, diseñaremos un ensayo competitivo para el
cual será necesario realizar primeramente una curva patrón donde interpolar posteriormente
la reacción específica con el analito (H) a concentración desconocida.
Es necesario disponer de:
a) un anticuerpo que se una específicamente a H (Ac anti-H).
b) el analito (hapteno H) a concentración conocida.
c) el mismo hapteno pero marcado con el isótopo radiactivo (hapteno radioactivo H*)
también a concentración conocida.
.
Inmunología InspiracleBIR/2015
219
Procedimiento:
1. Hacemos diluciones seriadas de H en tubos o pocillos de microtitulación
2. Añadir a todos los tubos una concentración conocida de H*
3. Añadimos a todos los tubos una cantidad fija de anticuerpos. Debe ponerse en
cantidad limitada, no en exceso. Idealmente aquella que captura aproximadamente el
70% de la hormona marcada.
4. El Ac se unirá a los analitos marcados y sin marcar indiscriminadamente (misma
estructura). En los primeros tubos se unirá más a los analitos sin marcar y en los
finales en mayor medida a los marcados, dadas las concentraciones relativas a que
estarán estos (competencia).
5. Posteriormente se aplica un método de separación para separar de la mezcla la
radiactividad libre de la radiactividad ligada al anticuerpo y se mide una de las dos.
La radiactividad que se una al Ac será menor a medida que es mayor la
concentración del analito sin marcar, dado que las afinidades son iguales y la
probabilidad de unión dependerá entonces de la concentración.
6. Con los datos obtenidos de la serie se realiza una curva patrón.
Posteriormente se hace un ensayo semejante con las muestras con el analito a
concentración desconocida y concentraciones conocidas del analito marcado y del Ac, para
determinar el rango de la curva en la que se trabajará y donde se podrán interpolar los
resultados. En este rango la cantidad de marcador unido a los Ac dependerá de la
concentración del analito sin marcar y será inversamente proporcional a la concentración de
este.
El RIA competitivo también se puede hacer sobre fase sólida.
Enzimoinmunoensayos (EIA).
Inmunoensayos en los cuales la detección del compuesto a determinar es realizada al
evaluar los cambios de concentración en el producto de una reacción enzimática. La enzima
va unida a uno de los componentes de la reacción Ag-Ac y su actividad va a depender de la
cantidad de ligando que se una a este componente.
Las enzimas, como marcadores, presentan muchas ventajas ya que pueden diseñarse
ensayos con tanta detectabilidad, sensibilidad, especificidad y precisión como las que
presentan los RIA sin muchos de sus inconvenientes.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
220
Tipos de enzimoinmunoensayos.
Homogéneos: se caracterizan por realizarse en una sola fase líquida sin pasos intermedios
de lavado. Son diseños de tipo competitivo y en ellos la actividad enzimática se modifica con
la unión de los ligandos (inhibición o activación catalítica durante la reacción Ag-Ac). Son
muy empleados para la determinación de fármacos y hormonas en fluidos biológicos
(compuestos de pequeño tamaño molecular que se comportan como haptenos).
Heterogéneos: El ensayo transcurre en dos fases, una líquida y una sólida y no se modifica
la actividad enzimática Se realizan pasos de lavado intermedios en los que se eliminan los
elementos de la fase líquida que no se han unido a la fase sólida. Según su diseño pueden
ser competitivos y no competitivos, directos e indirectos, de captura, etc. Son los que se
denominan ELISA.
Ambos tipos de ensayos pueden ser cualitativos o cuantitativos.
Ej. EIA homogéneos: CEDIA (Combined Enzyme Donor Inmunoassay): La enzima
conjugada es la -D-galactosidasa que está compuesta por dos subunidades que cuando se
juntan adquieren actividad enzimática. Se conjuga una subunidad a una cantidad conocida
de analito y la otra se añade sin conjugar. De unirse el analito conjugado al Ac esto impide
que se una a la otra subunidad y no habrá actividad enzimática. Como el sistema es
competitivo la actividad enzimática dependerá de cuánto Ac se utilice en reaccionar con el
analito de la muestra. A mayor concentración del analito más Ac secuestrará y entonces
más analito conjugado quedará en disposición de unirse a las otras subunidades y más
transformación de sustrato y señal habrá. La señal será directamente proporcional a la
concentración de analito en la muestra.
Inmunología InspiracleBIR/2015
221
Rep.de. www.usc.es
EIA heterogéneos.
Estos ensayos se realizan sobre una fase sólida que habitualmente es de poliestireno o
cloruro de polivinilo. Dada la adaptabilidad a equipos automáticos y la posibilidad de analizar
muchas muestras se suelen usar placas de microtitulación aunque también se pueden se
pueden utilizar otros soportes como tubos, microesferas, membranas, etc.
El primer paso siempre es adherir a este soporte sólido uno de los ligandos, que puede ser
un Ag o un Ac según el diseño. Tras cada paso se realiza lavado para eliminar los
elementos no adheridos a la reacción, excepto en el último paso para no perder el sustrato
modificado. La evidencia de este cambio de color, ya sea presencia o ausencia en el caso
de los cualitativos o grados de intensidad en el de los cualitativos, se lee en un equipo
automático cuyas características depende de las cualidades de la señal del sustrato utilizado
(cromógenos en un espectrofotómetro, sustratos fluorescentes en un fluorímetro, sustratos
luminescentes en un luminómetro). Como los equipos leen el total de señal en una sección
estrecha de la columna líquida es preferible que los sustratos al modificarse se mantengan
solubles y no precipiten, así se mantienen homogéneamente distribuíos en el pocillo y la
lectura de esta señal es representativa de toda la reacción.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
222
Rep.de Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.
A partir de estas características básicas pueden diseñarse diferentes tipos de ensayos
heterogéneos con diversas aplicaciones que pueden clasificarse en dos grandes grupos:
EIA heterogéneos competitivos y no competitivos.
Rep.de Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.
En los competitivos se establece una competencia entre el analito y uno idéntico marcado
por el sitio de unión en el ligando y esta unión dependerá de sus cantidades relativas en la
reacción. La evidencia (cantidad de señal) es indirecta. Al haber más cantidad de analito,
menos analito marcado se fijará y quedará en la fase sólida, por lo tanto al revelar habrá
menos señal. Estos ensayos se usan generalmente para detectar antígenos a bajas
concentraciones.
Inmunología InspiracleBIR/2015
223
Rep.de. www.usc.es
En los ensayos no competitivos no hay competencia por el ligando y la evidencia procede
directamente de la cantidad de analito. Pueden diseñarse EIA no competitivos directos,
indirectos y de captura o tipo “sándwich” para detectar Ag o Ac. En las aplicaciones clínicas
se utilizan con mayor frecuenta los indirectos para detectar o cuantificar Ac en suero.
Rep.de. www.usc.es
Técnicas inmunológicas con aplicación de biología molecular.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Se aprovecha la termoestabilidad de la DNA polimerasa de bacterias extremófilas para
poder realizar en el laboratorio múltiples ciclos de reacciones de polimerización
encadenadas. De esta manera se puede obtener un alto número de copias de un segmento
de DNA determinado.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
224
Se desnaturaliza el DNA en bandas sencillas mediante un tratamiento breve con calor y a
continuación se enfría en presencia de exceso de oligonucleótidos cebadores (primers)
complementarios de las secuencias de DNA que flanquean el segmento que se desea
amplificar. Se emplea una polimerasa de DNA termoresistente para copiar el DNA a partir de
los extremos 3´ de los cebadores. Como todos los elementos de la reacción son
termoestables se puede repetir el ciclo de calentamiento y enfriamiento muchas veces, lo
que tiene como resultado fusión y síntesis de DNA complementario y amplificación rápida de
una secuencia determinada. En pocos ciclos se puede amplificar alrededor de un millón de
veces la secuencia de DNA seleccionada.
Rep.de Kindt. T, goldsby. R, Osborne. B. Inmunología de Kuby. Mc Graw Hill, Ed. 6. 2007.
La posibilidad de amplificar muchas veces un segmento de DNA lo convierte en un elemento
inmejorable para diseñar sistemas de amplificación de señales. Se adhiere un ligando de la
reacción Ag-Ac con una cadena de ácido nucleico que luego podrá amplificarse mediante
PCR y servir de elemento de evidencia ya sea solo o marcado con otras moléculas.
Inmunología InspiracleBIR/2015
225
Inmuno-PCR.
Técnica de amplificación de señal que utiliza la especificidad de la detección de la reacción
Ag-Ac y la capacidad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de obtener miles de
copias idénticas de una cadena corta de DNA. Aumenta considerablemente la sensibilidad
del ensayo sin perder especificidad. De particular utilidad cuando se pretende cuantificar Ag
que se encuentran en muy pequeña cantidad en la muestra.
Ej. Inmunoensayo con amplificación por PCR cuantitativa: Se diseña un sistema de
captura con el Ac de captura unido al soporte sólido; se añade la muestra y posteriormente
se añade un Ac de reconocimiento o detección que lleva unido (marcado) un
oligonucleótido. Este último se amplifica mediante PCR. La existencia de copias de DNA es
la evidencia de la existencia del Ag en la muestra, que puede ser a u vez cuantificada de
esta manera. Pueden utilizarse oligonucleótidos marcados con fluoresceína o enzimas. La
fluorescencia emitida que depende del número de copias obtenidas tras un número de
ciclos de amplificación predefinido será proporcional al número de cadenas iniciales, que a
su vez se corresponderá con la cantidad de Ag presente en la muestra. Es un método de
alta sensibilidad y especificidad e incrementa enormemente la detectabilidad del ensayo.
Rep.de. www.usc.es
Citometría de flujo.
La citometría de flujo permite el análisis morfológico y fenotípico de leucocitos y otras células
en suspensión. Se puede cuantificar y clasificar distintas poblaciones de leucocitos,
linfocitos, células de cultivo, etc (Ej. clasificar leucemias según los marcadores de la
superficie celular). Si el citómetro es un citofluorímetro está equipado con detectores de
fluorescencia y con él se puede determinar la expresión de moléculas en las células
(moléculas de membrana o intracitoplasmáticas) mediante el marcaje con anticuerpos
InspiracleBIR/2015 Inmunología
226
monoclonales conjugados con moléculas fluorescentes. Cada molécula tiene un espectro de
excitación y emisión diferente que permite su identificación mediante filtros selectivos.
Algunos aparatos están equipados para separar las células identificadas (FACS; separador
de células activado por fluoresecencia).
Las células en suspensión se hacen pasar con gran rapidez (50000 células por segundo)
por un colector en forma de flujo laminar de células individuales (en “fila india”). El paso de
cada célula atravesando una fuente de rayos láser dispersa la luz y da señales que son
analizadas por un ordenador mediante detectores específicos. Hay detectores para luz
dispersada que informa del tamaño de la célula (forward light scatter o luz refractada) y de
su morfología o rugosidad (side Light scatter o complejidad estimada por la luz reflejada a
90º). Para fluorescencia hay detectores precedidos de filtros que seleccionan las longitudes
de onda de los fluorocromos correspondiente cada una a un color diferente. Estos
receptores sólo son activados cuando pasa una célula recubierta por el anticuerpo
monoclonal marcado con el color correspondiente.
Rep.de Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología del Sistema Inmune. Editorial médica
Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp. 2006.
Inmunología InspiracleBIR/2015
227
Técnicas de histocompatibilidad y prevención de rechazos.
Pruebas cruzadas:
Se realiza siempre y permite descartar que no haya anticuerpos preformados en el receptor
contra Ag del donante. En este ensayo se enfrenta in vitro el suero del receptor con las células
(linfocitos, monocitos, eritrocitos) del donante. Si existe reconocimiento ocurrirá aglutinación o
lisis celular (si se añade complemento a la reacción). De esta forma se previene el rechazo
hiperagudo.
Ensayo de microlinfocitotoxicidad:
Se utiliza para identificar las moléculas de HLA que expresan las células (linfocitos y moncitos)
del receptor y los posibles donantes. Es una técnica serológica en la que se hacen reaccionar, en
una placa de Terasaki, las células a tipar con una batería de anticuerpos con especificidades
para los diferentes antígenos HLA en presencia de una fuente de complemento. Si existe
reconocimiento específico se formará un inmunocomplejo sobre la membrana de la célula que
activará el complemento por la vía clásica y culminará con la lisis celular por la acción del MAC.
Actualmente también se aplican técnicas de marcaje con Ac fluoresecentes y detección mediante
citometría de flujo. También se aplican con este propósito técnicas de biología molecular que
identifican las secuencias génicas de los diferentes alelos.
Rep.de Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología del Sistema Inmune. Editorial médica
Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp. 2006.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
228
Cultivo mixto de linfocitos: Es una prueba in vitro en la que se cultivan en conjunto células del
anillo mononuclear (Linfocitos y APC) del donante y receptor. Si los antígenos de
histocompatibilidad son diferentes, una gran proporción de estas células proliferarán en pocos
días y es indicativo del reconocimiento de antígenos extraños e inmunogénicos y permite predecir
que va a ocurrir una reacción de rechazo (o enfermedad de injerto contra huésped en el caso del
transplante de médula ósea). La proliferación puede medirse cuantificando la incorporación de
timidina tritiada en el ADN de las células que replican o, más recientemente, mediante marcaje
(CFSE) aplicando citometría de flujo.
Anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos pueden unirse y reconocer una variedad prácticamente ilimitada de moléculas
(antígenos). El suero de animales de laboratorio hiperinmunizados con un determinado antígeno
contiene una gran cantidad de anticuerpos específicos para ese antígeno. Estos anticuerpos son
heterogéneos, pues son producidos por numerosos clones de linfocitos B y reconocen epítopes
diferentes, por ello se denominan anticuerpos policlonales. Aunque pueden emplearse en
numerosos ensayos inmunológicos tienen como limitantes su heterogeneidad y su cantidad
limitada. Por ello se han creado técnicas que permiten la obtención de anticuerpos de una
especificidad única y definida (reconocern un epítope concreto) en cantidad ilimitada
denominados anticuerpos monoclonales. Se trata de anticuerpos sintetizados por un único clon
de linfocitos B.
Rep.de Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología del Sistema Inmune. Editorial médica Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp. 2006.
Inmunología InspiracleBIR/2015
229
En teoría bastaría aislar un clon de los activados por la inmunización para obtener in vitro un
anticuerpo monoclonal (AcMo) pero los linfocitos B y células plasmáticas sólo sobreviven de
modo limitado en cultivo. La solución es fusionarlos con células de un tumor (mieloma) creando
células híbridas o hibridomas. Las células B no fusionadas morirían al cabo de un número
limitado de divisiones en cultivo pero para separar mielomas de hibridomas es necesario
seleccionar mielomas mutados incapaces de crecer en un medio selectivo con aminopterina. La
minopterina bloquea la síntesis de novo de nucleótidos y la mutación afecta la enzima
hipoxantina-guaninafosforribosil transferasa (HPRT) que permite una ruta alternativa de de
obtención de nucleótidos. De este modo los linfocitos B aportan al hibridoma la facultad de
producir Ac de una especificidad determinada y la posibilidad de producir la HPRT que salva al
hibridoma de morir en el medio selectivo y el mieloma le aporta la capacidad de dividirse sin
límites y vivir eternamente en cultivo.
Debido a las diferencias xenogénicas el uso terapéutico de los Ac monoclonales murinos es muy
limitado por su inmunogenicidad. Por esta razón, y por lo poco estables de las células
maliginizadas con virus para producir AcMo humanos, se ha aplicado la ingeniería genética para
obtener AcMo mixtos (quiméricos, humanizados y “reshaped”) donde casi toda la molécula es
humana, excepto los sitios de unión al Ag). Tambien se han obtenido AcMo humanos mediante
tecnicas de “inmortalización” de linfocitos B utilizando virus (Saimiri, virus de Epstein-Baar).
Los AcMo además de resultar un reactivo de múltiples aplicaciones en técnicas inmunológicas in
vitro también son utilizados actualmente como parte del arsenal terapéutico para tratar
enfermedades. (Ej: anti-TNF (infliximab) en el tratamiento de la artiritis reumatoide y la psoriasis,
InspiracleBIR/2015 Inmunología
230
anti-CD20 en el tratamiento del linfoma de Hodgkin, anti-IgE (omalizumab) en enfermedades
alérgicas).
Pruebas in vivo.
Permiten evaluar la respuesta inmunológica de diversa índole en un individuo concreto.
-Tests cutáneos de hipersensibilidad inmediata IgE mediada (Prick-test, intradermoreacción
con lectura inmediata). Detectan y miden de un modo semicuantitativo la sensibilización de un
individuo a alergenos específicos. Consiste en la administración de alergenos en capas diferentes
de la piel (prick test en la epidermis e ID en el interior de la dermis) y la medición, 15-20 minutos
después, de la reacción local (habón y eritema) causada por los mediadores de la inflamación
que liberan los mastocitos que se hayan activado mediante el reconocimiento del alergeno por
las IgEs específicas fijadas a la membrana por receptores de Fc de alta afinidad.
-Tests cutáneos de hipersensibilidad retardada (patch tests, intradermoreacción con lectura
tardía). Miden la respuesta inmune celular, ya sea para evaluar su capacidad o para detectar
hipesensibilidades tipo IV. Los llamados patch tests o pruebas epicutáneas consisten en la
aplicación sobre la piel de parches con el antígeno que se quiere testar y un vehículo apropiado y
se aplica en el diagnóstico de las dermatitis de contacto. En la ID se procede igual que en el caso
de la inmediata pero varía el intervalo hasta la lectura. Se aplica para el estudio de los exantemas
medicamentosos y la evaluación de la capacidad de la rama celular de la inmunidad (utilizando
antígenos ubicuos). En ambos casos las lecturas de las reacciones se hacen como mínimo a las
48 horas.
Inmunología InspiracleBIR/2015
231
Manipulación de la respuesta inmune
La inmunidad dadas sus propiedades de ser específica y generar memoria puede ser utilizada
con diversos fines médicos (ej. profilaxis, terapéutica).
Pude adquirirse de diversas maneras; de modo natural o artificial y de forma activa o pasiva.
La inmunidad natural es la que se adquiere sin intervención de la mano del hombre, o sea
durante la vida del individuo biológico a través de su interacción con el medio; y la inmunidad
artificial es aquella que se induce intencionadamente para modificar el curso de procesos
patológicos mediante la acción del hombre en el proceso.
La inmunidad activa es aquella en la cual se crean en el individuo los efectores de la respuesta
inmune como consecuencia de la interacción con el antígeno. La inmunidad pasiva es la que se
adquiere por la transferencia de dichos efectores a un individuo que no los ha creado.
La inmunidad creada a través del proceso natural de la infección por un agente biológico es el
ejemplo típico de inmunidad natural activa (se crean los efectores de la respuesta inmune
específica contra ese patógeno, ya sean anticuerpos o linfocitos T efectores, como
consecuencias de la interacción del sistema inmune del individuo con los antígenos del
microorganismo con el que se puso en contacto).
La transferencia transplacentaria materno-fatal, de los anticuerpos específicos creados por la
madre a través su vida, es el ejemplo que ilustra la inmunidad natural pasiva. En este caso el feto
recibe los efectores de la respuesta inmune (anticuerpos maternos) sin haberse enfrentado al
antígeno ni haberlos creado por sí mismo.
La vacunación con microorganismos modificados o antígenos de los mismos es el modo de
adquirir inmunidad activa de modo artificial (se crean los efectores propios pero el antígeno que
desencadena el proceso es administrado de forma artificial).
Cuando se administran anticuerpos preformados inducidos por la inmunización de un animal de
laboratorio o tomados de individuos que los han creado al enfrentarse a los antígenos, para
proteger a un individuo de ciertos procesos patológicos, estamos hablando de inmunidad pasiva
artificial (Ej. suero antirrábico, “vacunación” anti-D).
Vacunas.
El objetivo de la inmunización es proteger al individuo vacunado de la enfermedad causada
naturalmente por el agente del que proceden los antígenos utilizados. Idealmente esto debería
realizarse con la mayor seguridad posible (mínimos riesgos) y generar una respuesta protectora
que durara el mayor tiempo posible (a veces toda la vida). Intentando conseguir estos objetivos y
dadas las dificultades propias de cada caso particular, se han creado diversos tipos de vacunas.
InspiracleBIR/2015 Inmunología
232
Vacunas de microorganismos vivos: implica mayor riesgos que otras pero suelen ser
excelentes inmunogénicamente. Se aplican solo cuando otros tipos de vacunas más seguras no
generan un grado de protección aceptable. Se utilizan cepas atenuadas, por selección o
genéticamente modificadas (ej. Vacuna antipolio de Sabin y BCG).
Vacunas de microorganismos inactivados: se utiliza el agente biológico entero pero muerto,
sin capacidad infectiva ni de replicación (ej. Vacuna contra el cólera).
Vacunas de antígenos, subunidades y toxoides: en ellas sólo se utilizan partes antigénicas, a
veces modificadas como los toxoides, de microorganismos para inducir la respuesta inmune
protectora en el individuo vacunado (ej. vacunas contra la difteria y tétanos).
Más recientemente se han aplicado otros tipos de vacunas con diversos propósitos (vacunas de
péptidos sintéticos, proteínas recombinantes, DNA purificado, etc.).
A veces la administración de Ag de modo no natural no es capáz de inducir una respuesta
inmune adecuada por lo que se acompaña de otras sustancias, denominadas adyuvantes. Estos
compuestos tienen la función de estimular de manera inespecífica la activación de linfocitos por
diversos mecanismos (estimulación de células presentadoras, incremento de la emisión de
señales co-activadoras, particulación del Ag, activación inespecífica de linfocitos, etc.) El más
usado en investigación es el adyuvante copmpleto de Freund (una emulsión oleosa con
micobacterias muertas) pero no está autorizado su uso invivo en humanos por lo que en vacunas
el más utilizado es el hidróxido d e aluminio.
Terapia adoptiva.
El termino terapia adoptiva se refiere a la administración de elementos celulares o moleculares
generados en otro individuo o del propio individuo pero modificados fuera del organismo, para el
tratamiento de enfermedades de diversa naturaleza. El ejemplo más antiguo de todos es la
transfusión sanguínea. Posteriormente otros procederes y técnicas han permitido utilizar
moléculas y células de la respuesta inmune. Las inmunoglobulinas (preparados purificados
generados a partir de plasma de donantes) se utilizan por vía endovenosa para tratar las
inmunodeficiencias de células B y en ocasiones como tratamiento inmunosupresor (dependiente
de dosis). Otras inmunodeficiencias como las severas combinadas debidas a déficit enzimáticos
(ADA y PNP) se pueden tratar con las propias células del individuo afectado tras ser modificadas
genéticamente (terapia génica). En el tratamiento de las enfermedades tumorales se han
ensayado aplicaciones terapéuticas de linfocitos circulantes o intratumorales procedentes del
propio individuo a los cuales se les somete a procesos in vitro de estimulación con citocinas y Ag
tumorales antes de ser reintroducidos (terapia LAK y TIL).
A veces para inducir la proliferación de subpoblaciones celulares seleccionadas in vitro se utilizan
los mitógenos. Son moléculas, generalmente de origen vegetal, capaces de interactuar con
Inmunología InspiracleBIR/2015
233
receptores en las membranas de los linfocitos y producir la transducción de señales necesaria
para lograr dicho efecto (ej. LPS para linfocitos B, fitohemaglutinina y concanavalina A para
linfocitos T y pokeweed para ambos tipos celulares.
Otras moléculas “transplantadas” que se utilizan para tratar enfermedades son las citocinas como
el interferón beta (generalmente en complejo con polietileno glicol) para las hepatitis o la
esclerosis múltiple y el GM-CSF en las leucopenias.
Inmunosupresión.
Tanto la respuesta inflamatoria como la respuesta inmune específica pueden estar implicadas en
la producción de daño hístico y enfermedad por esta causa (enfermedades inflamatorias, por
hipersensibilidad y autoinmunes). En estos casos es necesario inhibir la respuesta inadecuada o
lesiva. Existen fármacos que permiten actuar en este sentido sobre la respuesta inmunológica a
través de diferentes mecanismos de acción.
Fármacos inmunosupresores: Se pueden dividir en tres categorías:
Drogas antiinfiamatorias de la familia de los corticosteroides como la prednisona.
Drogas citotóxicas, como la azatioprina y la ciclofosfamida.
Derivados fúngicos y bacterianos como la ciclosporina A.
Glucocorticoides: Efectos dosis dependientes de predominio antiinflamatorio mediante su
acción sobre diferentes sitios de las células. Tras su unión a receptores intracitoplasmáticos son
capaces de inducir cambios en la transcripción de proteínas (entre ellas citocinas) que conllevan
a cambios en la distribución de leucocitos, inhibir su migración, modular la función de las células
efectoras y disminuir la producción de mediadores de la inflamación.
Inmunología InspiracleBIR/2015
235
La ciclofosfamida es una de las drogas más potentes como inmunosupresoras. Uno de
sus metabolitos se comporta como agente alquilante de diversos componentes
celulares incluyendo bases de DNA y RNA creando uniones cruzadas en la molécula
de ácido nucleico que conllevan a la muerte celular.
Rep.de Rudiger Burmester, Antonio Pezuto. Color Atlas of Immunology. Thieme.2003.
La ciclosporina A, el tacrolimus (FK506) y el rapamicin inhiben la síntesis de citocinas,
especialmente la IL-2 por mecanismos semejantes.
Rep.de Rudiger Burmester, Antonio Pezuto. Color Atlas of Immunology. Thieme.2003.
Anticuerpos
InspiracleBIR/2015 Inmunología
236
Mediante inmunoglobulinas se puede interferir la respuesta inmune de una forma no
tóxica y mucho más específica que los fármacos. Actualmente los más usados en este
sentido son anticuerpos monoclonales de origen humano, transgénicos o murinos
humanizados anti-CD3, anti-CD4, anti-TNF, anti-IgE, etc. También se utilizan
inmunoglobulinas a dosis altas (>400 mg/kg) como inmunosupresores. Hace unos años se
conjugaron Ac específicos (casi siempre monoclonales) contra dianas celulares con
diversas sustancias antitumorales (toxinas, fármacos, etc.), a lo cual que se llamó inmuno
toxinas, “magic bullets”, etc., con muy poco exíto en general.
Inmunología InspiracleBIR/2015
237
Bibiliografía:
1. Abbas. A, Lichtman. A, Pillai. S. Inmunología Celular y Molecular. Elsvier, Ed. 6 edic.
2008.
2. Kindt. T, goldsby. R, Osborne. B. Inmunología de Kuby. Mc Graw Hill, Ed. 6. 2007.
3. Regueiro. J, López. L, González. S, Martínez. E. Inmunología Biología y Patología
del Sistema Inmune. Editorial médica Panamericana, Ed. 3 edic. 2002. 6 reimp.
2006.
4. Roitt. I, Brostoff. J, Male. D. Inmunología. Elsvier España, Ed. 5 ed. 2000.
5. Peña. J. Inmunologíaonline. http://www.uco.es/grupos/inmunologia-molecular/
2003.
Las ilustraciones del manual han sido tomadas de bibliografías 1, 2 y 5.