Rev Iberoam Micol 2002; 19: 84-8884 Original

Efecto de extractos alcohlicos deplantas silvestres sobre la inhibicinde crecimiento de Aspergillus flavus,Aspergillus niger, Penicilliumchrysogenum, Penicillium expansum,Fusarium moniliforme y FusariumpoaeMartn Tequida-Meneses, Mario Cortez-Rocha, Ema Carina Rosas-Burgos, Susana Lpez-Sandoval y Consuelo Corrales-MaldonadoDepartamento de Investigacin y Posgrado en Alimentos (DIPA),, Universidad de Sonora, Unidad Centro,Hermosillo, Sonora, Mexico

Se evalo la actividad fungicida de las plantas silvestres Larrea tridentata,Karwinskia humboldtiana, Ricinus communis, Eucalyptus globulus, Ambrosiaambrosioides, Nicotiana glauca, Ambrosia confertiflora, Datura discolor,Baccharis glutinosa, Proboscidea parviflora, Solanum rostratum, Jatropha cine-rea, Salpianthus macrodonthus y Sarcostemma cynanchoides sobre las espe-cies de hongos Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum,Penicillium expansum, Fusarium poae y Fusarium moniliforme. Se prepararonextractos alcohlicos al 6% con polvo vegetal seco (tallos y hojas), donde lossolventes utilizados fueron metanol y etanol al 70%. Se prepar una suspensinde esporas (1x106 ufc/ml) de cada hongo, con solucin salina al 0,85% y 0,1%de tween 80. Los extractos fueron mezclados con agar Czapeck extracto delevadura (CYA) a 45-50 C en una relacin 1:10 en placas petri y posteriormentese realiz la inoculacin de cada hongo, y como tratamiento control placas petricon CYA y el solvente utilizado. Estas fueron incubadas por un perodo de ochodas a 25 2 C. Se midi el dimetro (crecimiento radial) de las colonias cada48 h. L. tridentata, B. glutinosa, D. discolor y P. parviflora controlaron al menosel crecimiento de dos especies de hongos. Por ejemplo, L. tridentata, inhibi elcrecimiento de las seis especies de hongos en un rango de 41,5% hasta el100% tomando en cuenta tanto a los extractos metanlicos como a los extractosetanlicos.

Actividad fungicida, Plantas silvestres, L. tridentata, Suspensin de esporas,Crecimiento radial

Effect of alcoholic extracts of wild plants on theinhibition of growth of Aspergillus flavus, Aspergillusniger, Penicillium chrysogenum, Penicilliumexpansum, Fusarium moniliforme and Fusarium poaemouldsFungicidal activity of wild plants Larrea tridentata, Karwinskia humboldtiana,Ricinus communis, Eucalyptus globulus, Ambrosia ambrosioides, Nicotiana glau-ca, Ambrosia confertiflora, Datura discolor, Baccharis glutinosa, Proboscideaparviflora, Solanum rostratum, Jatropha cinerea, Salpianthus macrodonthus ySarcostemma cynanchoides was evaluated against the moulds speciesAspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Penicilliumexpansum, Fusarium poae y Fusarium moniliforme moulds species. Alcoholicextracts 6% (w/v) were prepared using six grams of dried plant powders (leaves

Summary

Resumen

Direccin para correspondencia: Dr. Martn Tequida-Meneses Departamento de Investigacin y Posgrado en Alimentos (DIPA),Universidad de Sonora, Unidad CentroApartado postal 1658C.P. 83000, Hermosillo,Sonora, MexicoTel./Fax: +52 01 (6) 12 54 88E-mail: mtequida@guayacan.uson.mx

Aceptado para publicacin el 15 de Marzo de 2002

2002 Revista Iberoamericana de MicologaApdo. 699, E-48080 Bilbao (Spain)1130-1406/01/10.00 Euros

Palabras clave

Extractos de plantas y crecimiento fngicoTequida-Meneses M, et al. 85

Mxico es un pas muy poblado que tiene que pro-ducir grandes cantidades de granos que forman parteimportante en la dieta de los mexicanos. Todos los pro-ductos agrcolas son invadidos por diversos insectos yhongos. El trigo y el maz son los cereales ms suscepti-bles al ataque de estos organismos, que degradan su cali-dad en diversas formas [1].

En particular los granos y las semillas son infecta-dos por diversos hongos en el campo entre ellos Fusariumsp., Alternaria sp. y Helminthosporium sp. Por otra parte,los granos tambin pueden ser invadidos por hongos dealmacn, siendo Aspergillus sp. y Penicillium sp. los prin-cipales gneros de hongos que se presentan [2]. Durantesu desarrollo en los granos, los hongos causan diferentesclases de daos, siendo los ms importantes la prdida decapacidad de germinacin, decoloracin, calentamiento yproduccin de micotoxinas [3,4]. Existen varios mtodosde control de plagas, pero desgraciadamente las sustanciasqumicas empleadas en el control de insectos han provo-cado el desarrollo de resistencia, contaminacin ambientaly riesgos de salud pblica [5,6]. As mismo, actualmenteno existe ningn mtodo de control de hongos, slo medi-das preventivas como monitorizar la temperatura y lahumedad del grano. Por esta razn, el objetivo de esteestudio fue evaluar el efecto fungicida de extractos alco-hlicos de plantas silvestres de tres regiones de Sonora,Mxico sobre diversas especies de hongos comoAspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium chryso-genum, Penicillium expansum, Fusarium poae y Fusariummoniliforme. La seleccin de plantas se realiz con base aestudios previos realizados con el insecto Rhyzoperthadominica, entre las cuales Nicotiana glauca fue la plantaque mejor efecto present [7]. Adems, en otro estudio seobserv que el extracto de Larrea tridentata en dicloro-metano inhibi el 92% del crecimiento radial de A. flavus [8].

MATERIALES Y MTODOS

Las plantas estudiadas fueron L. tridentata,Karwinskia humboldtiana, Ricinus communis, Eucalyptusglobulus, Ambrosia ambrosioides, N. glauca, Ambrosiaconfertiflora, Datura discolor, Baccharis glutinosa,Proboscidea parviflora, Solanum rostratum, Jatrophacinerea, Salpianthus macrodonthus y Sarcostemmacynanchoides. Su recoleccin se llev a cabo en las pobla-ciones de Soyopa, Ures, Bavicora y Costa de Hermosillo,todas ellas en el estado de Sonora, Mxico.

Se emplearon nicamente tallos y hojas, que fue-ron secados al sol por dos das y posteriormente a la som-bra hasta secado completo (25 das totalesaproximadamente). Una vez secas, fueron molidas en un

molino Willey (Laboratory Mill modelo 4, EE.UU.) hastaobtener un tamao de partcula de 0,5-1 mm [9].

Se prepararon extractos de cada planta al 6% portriplicado. Se mezclaron 6 g de polvo de planta y 94 ml dealcohol, utilizando como solventes metanol y etanolambos al 70% [10]. La extraccin se hizo mediante remo-jo por 15 min con agitacin mecnica en una placa decalentamiento-agitacin (Barnstead-Thermolyne, EE.UU.)y un reposo de 48 h a 25 2 C. Los extractos obtenidosse filtraron en dos etapas: primero a travs de tela de linopara eliminar las partculas vegetales de mayor tamao,seguida de centrifugacin-decantacin a 7000 rpm por 10min y finalmente una segunda filtracin bajo vaco enpapel Whatman # 4 (Whatman , EE.UU.). Los extractosobtenidos se guardaron en frascos de plstico color mbarque se guardaron en refrigeracin.

Las especies de hongos utilizadas fueron A. flavus,A. niger, P. chrysogenum, P. expansum, F. poae yF. moniliforme, aisladas de grano de trigo y maz.

Preparacin del inculo. Cada especie de hongofue cultivada en forma inclinada en agar papa dextrosa(PDA) a 25 2 C por 10 das en tubos de ensayo(18x150). Posteriormente, se prepar una suspensin deesporas, agregando a cada tubo 10 ml de solucin salina(0,85%) con 0,1% de Tween 80 (Polisorbato 80, Sigma,EE.UU.), este ltimo para prevenir la aglomeracin y larpida precipitacin de las esporas [11,12]. Las esporasfueron desprendidas del micelio con una varilla de vidrioestril. La suspensin obtenida se transfiri a otro tubo deensayo estril y se determin su concentracin, la cual seajust a 1x106 UFC/ml con solucin salina [12-14].

Crecimiento radial e inhibicin de crecimiento dehongos. Cada uno de los extractos preparados fue mezcla-do con agar Czapeck extracto de levadura (CYA) a 45-50 C en una relacin 1:10. La mezcla fue vertida sobreplacas Petri. Una vez solidificado el agar, las placas seincubaron por 24 h para la evaporacin del alcohol utiliza-do como solvente. Despus se inocularon con la suspensinde esporas correspondiente por puncin central de 1 mm dedimetro. Se cont con un tratamiento control de placasPetri que consisti de CYA y el solvente utilizado [14]. Lasplacas fueron incubadas por ocho das a 25 2 C.

Las placas se examinaron cada 48 h con un estere-omicroscopio biocular (Carl Zeiss, Alemania). Se midi eldimetro de las colonias de los hongos desarrollados, quese represent grficamente en funcin del crecimientoradial expresado en centmetros y el tiempo de incubacinen horas [14]. El porcentaje de inhibicin de crecimientofue calculado tomando en cuenta que la inhibicin es elinverso del crecimiento.

Se utiliz un diseo completamente al azar con tres

and stems) and alcohol (70% ethanol or 70% methanol). A spore suspension(1x106 ufc/ml) of each mould was prepared by adding saline solution (0.85%)and 0.1% tween 80. The Extracts were mixed with Czapeck yeast agar (CYA) at45-50 C in 1:10 relation on Petri dishes. Triplicate Petri dishes of each treat-ment and for each mould were centrally inoculated and three Petri dishes wereused without treatment as controls. The inoculated dishes and controls wereincubated at 25 2 C for eight days. The incubated dishes were examinatedeach 48 h and after the colony diameter (radial growth) was measured. Twomould species were controlled by L. tridentata, B. glutinosa and P. parviflora.Extracts of L. tridentata in methanol or ethanol at 41.5-100% inhibited all six spe-cies of moulds.

Fungicidal activity, Wild plants, L. tridentata, Spores suspension, Radial growthKey words

Paul Castro

Paul Castro

Rev Iberoam Micol 2002; 19: 84-8886

repeticiones y se realiz el anlisis de varianza (ANOVA)con un nivel de significancia de a = 0,05 (p < 0,05).Adems, se realiz una comparacin de medias con laprueba de Tukey utilizando el paquete estadstico SAS [15].

RESULTADOS Y DISCUSION

Crecimiento radial de hongosAspergillus niger. Los valores obtenidos con los

extractos alcohlicos aplicados a A. niger fueron estadsti-camente significativos ( p < 0,05) entre solvente y entrelas plantas. En la figura 1 se presentan los resultados decrecimiento radial de A. niger con los tratamientos meta-nlicos. Se observ que los tratamientos de K. humbold-tiana y A. ambrosioides tuvieron mayor efecto en elcrecimiento de ste hongo, con 0,7 y 0,8 cm, respectiva-mente, comparados con el testigo que tuvo un crecimientode 1,4 cm. Esto represent una inhibicin en el crecimien-to del 52 y 50 % respectivamente (Tabla 1) Los extractosde R. communis y J. cinerea no presentaron inhibicin, yaque su crecimiento fue similar al testigo.

El crecimiento radial de A. niger con los extractosetanlicos fue variado. Estadsticamente hubo diferenciaentre las plantas (p < 0,05). L. tridentata present el mejorefecto, ya que con ella el hongo creci 1,6 cm, de igualforma con B. glutinosa creci slo 3,1 cm, comparadoscon el crecimiento de dicho hongo en el testigo que fue de7,2 cm. Estos valores representaron una inhibicin de 77,3y 56,9%, respectivamente (Tabla 2). El anlisis estadsticoindic que entre estos tratamientos si hubo diferencia sig-nificativa (p < 0,05).

Aspergillus flavus. Se encontr diferencia signifi-cativa entre solvente y plantas (p < 0,05). Al comparar elcrecimiento del testigo (2,7 cm) con los extractos metan-licos, se observ que las plantas de L. tridentata y A. con-fertiflora causaron el menor crecimiento radial con 0,8 y1,3 cm, respectivamente. Esto represent una inhibicinde 71,2 y 52% respectivamente para dichos tratamientos.

Por otro lado, los extractos etanlicos de L. triden-tata y D. discolor causaron reduccin en el crecimientoradial de A. flavus con 1,6 y 2,3 cm, respectivamente. Elcrecimiento en el testigo fue de 6,8 cm (Figura 2). Estosvalores indican una inhibicin de 76 y 66,2% para L. tri-dentata y D. discolor, respectivamente (Tabla 2).

Un estudio del extracto acuoso de Andrographispeniculata sobre el crecimiento de A. flavus, indic unainhibicin de 75,1% a concentraciones de 3, 5, 8 y 10mg/ml [16]. Estos resultados son comparables con losobtenidos en este estudio, ya que el crecimiento de A. fla-vus fue inhibido con los extractos etanlicos y metanli-cos de L. tridentata en un 76 y 71,2%, respectivamente.

Penicillum chrysogenum. El anlisis estadsticoindic diferencia significativa entre los solventes y lasplantas (p < 0,05). El crecimiento radial de P. chrysoge-num con los extractos metanlicos de S. macrodonthus,J. cinerea, E. globulus y P. parviflora fue reducido hasta1 cm. Estos extractos causaron una inhibicin del creci-miento del hongo hasta 59,3% (Tabla 1).

Con los extractos etanlicos de L. tridentata, segui-da por D. discolor el hongo creci 0,8 y 1,3 cm, respecti-vamente, mientras que el testigo creci 2 cm. Estecrecimiento con L. tridentata equivale a una inhibicin

Tabla 1. Inhibicin de crecimiento (%) de hongos por extractos metanlicos de plantas.

Planta An Af Pch Pexp Fp Fm

Testigo 0,0d 0,0e 0,0d 0,0d 0,0f 0,0eE. globulus 2,1d 44,0bc 56,9ab 15,4cd 58,2c 45,8bcB. glutinosa 39,5ab 37,4c 37,7bc 38,5b 66,6bc 53,7bS. cynanchoides 33,0b 42,5bc 25,5c 58,3 25,9e 23,6dD. discolor 28,9bc 49,0b 44,5b 58,3 70,1b 46,3bcP. parviflora 16,6c 34,0c 53,8ab 10,3cd 67,8bc 42,6bcN. glauca 22,9bc 16,2d 21,5c 20,5c 32,6de 18,7dA. confertiflora 25,1bc 52,0b 6,7d 41,1b 58,1c 47,8bcR. communis 0,0d 48,1bc 5,4d 28,2bc 39,9d 36,7cS. rostratum L. tridentata 41,5ab 71,2a 50,0ab 58,3 100a 87,7aS. macrodonthus 12,5cd 46,8bc 59,3a 50,0ab 37,8de 28,9cA. ambrosioides 50,0a 34,0c 21,7c 35,9b 56,6c 44,3bcK. humboldtiana 52,0a 34,0c 48,4ab 38,5b 18,7dJ. cinerea 0,0d 42,5bc 54,2ab 25,7bc 25,1e 28,7c

a,b, c: Tratamientos con diferente letra son significativamente diferentes entre si (p > 0,05). An = A. niger; Af = A. flavus; Pch = P. chrysogenum; Pexp = P. expansum; Fp = F. poae y Fm = F. moniliforme. Elaborados al 6% (p/v).

Tabla 2. Inhibicin de crecimiento (%) de de hongos por extractos etanlicos de plantas.

Planta An Af Pch Pexp Fp Fm

Testigo 0,0e 0,0d 0,0d 0,0f 0,0f 0,0dE. globulus 14,8de 0,0d 19,7c 23,4d 36,9de 42,6bcB. glutinosa 56,9b 27,6b 36,0b 85,8a 79,6b 30,9cS. cynanchoides 0,0e 0,0d 13,1cd 46,8cd 25,5e 29,6cD. discolor 37,5c 66,0a 37,7b 58,0bc 100a 39,6bcP. parviflora 20,8d 36,0b 14,7cd 8,1def 86,6ab 22,6cN. glauca 0,0e 0,0d 8,1cd 0,0f 24,3e 2,6dA. confertiflora 39,3c 12,3c 26,1bc 6,5ef 49,7cd 41,7bcR. communis 3,7e 5,9cd 11,5cd 6,5ef 38,8cd 9,1cS. rostratum 17,1d 0,5d 4,8ef 26,1e 20,9cdL. tridentata 77,3a 76,0a 63,0a 71,4b 100a 100aS. macrodonthus 9,7de 0,0d 14,7cd 0,0f 33,7de 0,0dA. ambrosioides 40,7c 26,1b 29,5bc 16,2def 51,6c 50,4bK. humboldtiana 0,0e 0,0d 4,9cd 0,0f 29,9de 8,7dJ. cinerea 1,8e 0,0d 8,2cd 0,0f 42,0cd 5,2d

a, b, c: Tratamientos con diferente letra son significativamente diferentes entre si (p > 0,05). An = A. niger; Af = A. flavus; Pch = P. chrysogenum; Pexp = P. expansum; Fp = F. poae y Fm = F. moniliforme. Elaborados al 6% (p/v).

Extractos de plantas y crecimiento fngicoTequida-Meneses M, et al. 87

superior al 60%, todos los dems extractos presentaronbajos porcentajes de inhibicin (Tabla 2).

Penicillium expansum. El crecimiento de P. expan-sum se vio afectado con los extractos metanlicos deL. tridentata, D. discolor, S. cynanchoides y S. macro-donthus, ya que el hongo present un desarrollo de 0,5,0,5, 0,5 y 0,6 cm, respectivamente, mientras que en el tes-tigo tuvo un crecimiento de 1,2 cm. Originando esto unainhibicin del hongo con dichos extractos entre el 58,3%y 50% con respecto al testigo, respectivamente (Tabla 1).En el anlisis estadstico se encontr diferencia significati-va entre solventes y plantas (p

Rev Iberoam Micol 2002; 19: 84-8888

L. tridentata, ya que solo alcanz un crecimiento de0,8 cm, comparado con el testigo que fue de 6,7 cm(Figura 4). Adems, los extractos de B. glutinosa yA. confertiflora solo permitieron un crecimiento de 3,1 y3,5 cm, respectivamente. Se encontr diferencia significa-tiva entre solventes y plantas (p < 0,05) segn el anlisisestadstico realizado. La inhibicin del crecimiento con elextracto de L. tridentata fue de 87,7 %, seguido porB. glutinosa con 53,7% (Tabla 1).

Por otra parte, los extractos etanlicos que afecta-ron ms el crecimiento de este hongo fueron L. tridentatay A. ambrosioides con 0 y 1,9 cm de crecimiento radial,respectivamente. En el tratamiento testigo el hongo pre-sent un crecimiento de 3,8 cm. Esto implica que F. moni-liforme fue inhibido completamente en su crecimiento conel extracto de L. tridentata, seguido por el de A. ambro-sioides con 50,4%.

CONCLUSIONES

Se encontr mucha variacin en el grado de inhibi-cin de crecimiento en los hongos en estudio. Destacaronlos extractos de las plantas L. tridentata, B. glutinosa,D. discolor y P. parviflora, las cuales controlaron almenos el crecimiento de dos especies de hongos.

Larrea tridentata, inhibi el crecimiento de las seisespecies de hongos en un rango de 41,5% hasta el 100%tomando en cuenta tanto a los extractos metanlicos comoa los etanlicos.

En el caso de B. glutinosa las especies de hongosque presentaron una mayor sensibilidad al extracto etan-lico fueron Penicillium expansum con 85,7% de inhibi-cin y Fusarium poae con 79,6%. As mismo, su extractometanlico tambin afect a F. poae y F. moniliforme con66,6 y 53,7% de inhibicin, respectivamente.

Fusarium poae y Aspergillus flavus fueron lasespecies de hongos que se inhibieron en mayor proporcin

con el extracto etanlico de D. discolor con 100 y 66%,respectivamente. En cambio, su extracto metanlico, solocaus una reduccin del crecimiento de 70,1 y 58,3%, res-pectivamente, en F. poae y Penicillium expansum.

Los extractos etanlico y metanlico de P. parvi-flora, solamente inhibieron a F. poae con 86,6% y 67,8%,respectivamente.

Los hongos del gnero Fusarium fueron los mssensibles a los extractos de L. tridentata, B. glutinosa yD. discolor, ya que con ellos se logr la total inhibicindel crecimiento (100%).

En general, se puede decir que los extractos de laplanta L. tridentata causaron el mejor efecto fungicida, yaque a la mayora de los hongos en este estudio, con excep-cin de A. niger, les afect su crecimiento en ms del50%. No todos los hongos fueron inhibidos por los mis-mos extractos, ni en el mismo grado, ya que A. niger,A. flavus y F. moniliforme solamente fueron afectados pordos extractos vegetales, por lo que se podra decir que sonlos hongos ms resistentes. En cambio, F. poae fue el mssensible a los extractos, ya que fue inhibido hasta en un100%, y adems, la mayora de los extractos presentaronun buen efecto sobre dicho hongo.

Se recomienda seguir esta lnea de investigacin,ya que es de suma importancia encontrar nuevas fuentesde control de hongos que atacan a los granos, las cualessean inofensivas tanto para el hombre como para elambiente. Adems, se recomienda que en prximas inves-tigaciones se realicen mezclas en iguales proporciones delos extractos etanlicos de L. tridentata, D. discolor yB. glutinosa, ya que stas fueron las plantas con mejorefecto en la mayora de los hongos usados en la presenteinvestigacin.

Los autores manifiestan su agradecimiento al ConsejoNacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) por el apoyofinanciero otorgado para el desarrollo del proyecto 28293-B.

1. Ramrez MM. Caracteres adaptativos deProstephanus truncatus (Horn) en sumorfologa, ciclo de vida, distribucin yatributos taxonmicos. En: Memorias dela I Reunin Nacional sobre la investiga-cin en Mxico del barrenador mayor delos granos Prostephanus truncatus(Horn), Mxico, Instituto de Biologa deAguascalientes, 1991.

2. Moreno ME. Manual para la identificacinde hongos en granos y sus derivados.Mxico DF, Universidad NacionalAutnoma de Mxico, 1988.

3. Moreno ME, Gil GM. La biologa deAspergillus flavus y la produccin de afla-toxinas. Mxico DF, UniversidadNacional Autnoma de Mxico, 1991.

4. Moreno ME. La problemtica y la investi-gacin sobre la conservacin de granos.En: Memorias del Encuentro latinoameri-cano sobre almacenamiento y conserva-cin de granos bsicos. Cd. de Mxico,1987.

5. Arenas LC. DL50 de siete insecticidas dediferentes grupos toxicolgicos aplicadostpicamente a Prostephanus truncatus(Horn) (Coleoptera: Bostrichidae). En:Memorias de la primera reunin nacionalsobre la investigacin en Mxico delbarrenador mayor de los granosProstephanus truncatus (Horn). Pabellnde Arteaga, Pual, 1995.

6. Sauer DB. Storage of cereal grains andtheir products. 4. Ed. St. Paul, EditorialAmerican Association of CerealChemists, Inc., 1992.

7. Lpez BMG. Extractos vegetales comoalternativa para el control deRhyzopertha dominica (F) (Coleoptera:Bostrichidae) en Trigo (Triticum durum)Almacenado. Tesis Profesional.Universidad de Sonora, Mxico, 1989.

8. Araujo BSR. Evaluacin de la actividadfungicida y aflatoxignica de extractos deplantas del estado de sonora para el con-trol de Aspergillus flavus y Aspergillusparasiticus. Tesis Profesional.Universidad Sonora, Mxico, 1997.

9. Munro DB. Ricinus communis. Canadianpoisonous plants information system,1996.http://www.ansci.cornell.edu/plants/cas-torbean.html

10. Mamoru K, Mujo, Takehiko Y. Antifungalactivity against food-borne fungi ofAspidistra elatior Blume. J Agric FoodChem 1996; 44:301-303.

11. Merkulow N, Ludwing L. High pressureinactivation kinetics of moulds.Universitt Heidelberg, Institut frPharmazeutische Technologie andBiopharmazie, 1999.http://www.rzuser.uniheidelberg.de/~u53/poster.../merkulow1.htm

12. Wyatt MK, Parish ME. Spore germinationof citrus juice-related fungi at low tempe-ratures. Food Microbiol 1995; 12: 237-243.

13. Giffel MC, Beumer RR, Hoekstra J andRombouts FM. Germination of bacterialspores during sample preparation. FoodMicrobiol 1995; 12:327-332.

14. Lpez-Malo A, Alzamora SM, Argaiz A.Effect of natural vanillin on germinationtime and radial growth of moulds in fruitsbased agar system. Food Microbiol 1995;12:213-219.

15. SAS/STAT Users Guide. Release 6.08Version, SAS Institute Inc. Cary, NC,USA, 1992.

16. Kumar SG, Pasard I. Efficacy of medicalplant (Andrographis peniculata) extracton aflatoxin production on growthAspergillus flavus. Lett Appl Microbiol1992; 15:131-132.

Bibliografa