Laboratorio No. 12Laboratorio No. 12

BiologBiologíía moleculara molecular

Instructora Andrea Arias GarciaInstructora Andrea Arias Garcia

Biología 3051 LBiología 3051 LLaboratorio 12Laboratorio 12

BiologBiologíía moleculara molecular

Andrea Arias GarciaAndrea Arias Garcia

El NúcleoEl Núcleo

El núcleo es un El núcleo es un organelo organelo característico de las característico de las células eucariotas. células eucariotas.

El material El material genético genético de la célulade la célula se se encuentra dentro del encuentra dentro del núcleo en forma de núcleo en forma de cromatinacromatina

Cromatina y cromosomaCromatina y cromosoma

Un cromosoma es una Un cromosoma es una molécula muy larga de molécula muy larga de ADNADN que contiene una serie de que contiene una serie de genesgenes. .

Un cromosoma está formado Un cromosoma está formado por por dosdos cromátidascromátidas. En cada . En cada una de ellas hay un filamento una de ellas hay un filamento de ADN replegado idéntico en de ADN replegado idéntico en ambas cromátidas. ambas cromátidas.

El ADNEl ADN

La molécula de ADN La molécula de ADN está constituída por está constituída por dos largas cadenas dos largas cadenas de de nucleótidosnucleótidos unidas unidas entre sí formando una entre sí formando una doble hélice.doble hélice.

Los nucleótidosLos nucleótidos

Un nucleótido es una molécula compuesta por : Un nucleótido es una molécula compuesta por : Una pentosa Una pentosa – ribosaribosa – desoxirribosadesoxirribosa

Ácido fosfórico Ácido fosfórico Una base nitrogenada, que puede ser :Una base nitrogenada, que puede ser :– adeninaadenina – guaninaguanina – citosinacitosina – timinatimina – uracilouracilo

Partes de un nucleótidoPartes de un nucleótido

Estructura del ADNEstructura del ADN

La estructura del ADN La estructura del ADN está definida por la está definida por la "secuencia" de las "secuencia" de las bases nitrogenadas.bases nitrogenadas.

Este orden Este orden constituye las constituye las instrucciones del instrucciones del programa genético de programa genético de los organismos. los organismos.

Las bases nitrogenadasLas bases nitrogenadas

La unión de las bases se La unión de las bases se realiza mediante puentes realiza mediante puentes de hidrógenode hidrógeno

Este apareamiento está Este apareamiento está condicionado condicionado químicamente de forma químicamente de forma que la adenina (A) sólo que la adenina (A) sólo se puede unir con la se puede unir con la Timina (T) y la Guanina Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C).(G) con la Citosina (C).

                   

         

MMÓÓdelo del ADNdelo del ADN

Watson y Crick (1953)

Biología molecularBiología molecular

La biología molecular es una herramienta para La biología molecular es una herramienta para estudiar las relaciones evolutivas entre los estudiar las relaciones evolutivas entre los organismos.organismos.

Estudia el ADN y los genes que contiene.Estudia el ADN y los genes que contiene.

Todas las células contienen ADN que Todas las células contienen ADN que caracteriza a los organismos vivos. Por cambios caracteriza a los organismos vivos. Por cambios y mutaciones en el ADN tenemos organismos y mutaciones en el ADN tenemos organismos compuestos por pocos cientos de bases hasta compuestos por pocos cientos de bases hasta organismos mas complejos.organismos mas complejos.

Enzimas de restricción y Enzimas de restricción y electroforesis de ADNelectroforesis de ADN

Enzimas de restricciónEnzimas de restricción

También conocidas como También conocidas como endonucleasasendonucleasas. Son . Son extraídas de organismos procariotas (bacterias) extraídas de organismos procariotas (bacterias) donde actúan como un mecanismo de defensa donde actúan como un mecanismo de defensa para degradar ADN exógeno.para degradar ADN exógeno.

Su nombre esta dado según el genero y la Su nombre esta dado según el genero y la especie de la bacteria de donde se aisló. Ej:especie de la bacteria de donde se aisló. Ej:

Eco RI E genero Eco RI E genero EscherichiaEscherichia co especie co especie colicoli R cepa RV 13R cepa RV 13 I primera endonucleasa aislada I primera endonucleasa aislada

Enzimas de restricciónEnzimas de restricción

Son enzimas que cortan los enlaces Son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.de una secuencia que reconocen.

Permiten cortar ADN de hebra doble, Permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias donde reconocen secuencias palindrpalindróómicasmicas (secuencias que se leen (secuencias que se leen igual en ambas direcciones)igual en ambas direcciones)

Enzimas de restricción Enzimas de restricción

Al cortar el ADN las Al cortar el ADN las enzimas de restricción enzimas de restricción pueden producir dos tipos pueden producir dos tipos de cortes: cohesivos y de cortes: cohesivos y abruptos.abruptos.

Abruptos: cortan las Abruptos: cortan las hebras ADN en la misma hebras ADN en la misma posición posición

AATATTAATATT

    TTATAATTATAA

Cohesivos: cortan la Cohesivos: cortan la doble hebra de ADN de doble hebra de ADN de manera escalonada.manera escalonada.

Factores que afectan la actividad Factores que afectan la actividad de las enzimas de restricción de las enzimas de restricción

Pureza del ADN: la presencia de contaminantes Pureza del ADN: la presencia de contaminantes como proteínas, cloroformo, etanol etc. inhiben como proteínas, cloroformo, etanol etc. inhiben la endonucleasa.la endonucleasa.

Temperatura y pH: pueden afectar la estabilidad Temperatura y pH: pueden afectar la estabilidad y la actividad de las endonucleasas.y la actividad de las endonucleasas.

Amortiguador (buffer) adecuado: este provee el Amortiguador (buffer) adecuado: este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones optimas.en condiciones optimas.

ElectroforesisElectroforesis

La electroforesisLa electroforesis es un método que permite el es un método que permite el desplazamiento de una molécula dentro de un desplazamiento de una molécula dentro de un campo campo eléctricoeléctrico. La molécula con carga se mueve en dirección . La molécula con carga se mueve en dirección al electrodo con signo opuesto.al electrodo con signo opuesto.En la electroforesis se aplica un campo eléctrico a lo En la electroforesis se aplica un campo eléctrico a lo largo de un largo de un soporte físicosoporte físico, generalmente , generalmente gelesgeles de agar, de agar, agarosa, almidón, acrilamida, también se pueden usar agarosa, almidón, acrilamida, también se pueden usar otros soportes como las tiras de acetato de celulosa. otros soportes como las tiras de acetato de celulosa. Las moléculas que posean una carga neta (proteínas y Las moléculas que posean una carga neta (proteínas y ácidos nucleicos) se moverán dentro del campo ácidos nucleicos) se moverán dentro del campo eléctrico, separándose a medida que pasa el tiempo. eléctrico, separándose a medida que pasa el tiempo.

Cámara de electroforesisCámara de electroforesis

La agarosaLa agarosa

La La agarosaagarosa es un polisacárido de galactosa es un polisacárido de galactosa (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición más homogénea), cuyas pero de composición más homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0,5 a 2%)  poseen la disoluciones (típicamente de 0,5 a 2%)  poseen la propiedad de permanecer líquidas por encima de aprox. propiedad de permanecer líquidas por encima de aprox. 50ºC y formar un gel, semisólido, al enfriarse. 50ºC y formar un gel, semisólido, al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de tridimensional de fibras polimericasfibras polimericas, embebida en gran , embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas de ácido nucleico a su través, en mayor moléculas de ácido nucleico a su través, en mayor medida cuanto más grandes sean éstas. medida cuanto más grandes sean éstas.

Preparación del gelPreparación del gel

Factores que inciden en la Factores que inciden en la electroforesiselectroforesis

La carga eléctrica de las moléculasLa carga eléctrica de las moléculas

El pH del medio. El pH del medio.

El tamaño de las moléculas: Las moléculas de DNA y El tamaño de las moléculas: Las moléculas de DNA y RNA son en general demasiado grandes para que RNA son en general demasiado grandes para que avancen a una velocidad razonable por los geles, por lo avancen a una velocidad razonable por los geles, por lo que lo habitual es fragmentarlas antes de someterlas a que lo habitual es fragmentarlas antes de someterlas a electroforesis.electroforesis.

Para servir la muestraPara servir la muestra

Al preparar el gel Al preparar el gel enfriando la agarosa en enfriando la agarosa en un molde adecuado, se un molde adecuado, se dejan en él unos huecos dejan en él unos huecos o o pocillospocillos para poder para poder introducir luego en ellos introducir luego en ellos la muestra, y que así ésta la muestra, y que así ésta se vea obligada a se vea obligada a introducirse en el seno introducirse en el seno del gel cuando del gel cuando apliquemos el campo apliquemos el campo eléctrico eléctrico

ProcedimientoProcedimiento

Para preparar TBE 1XPara preparar TBE 1X::Si se usa TBE 20X, para preparar 100 ml: echar en Si se usa TBE 20X, para preparar 100 ml: echar en probeta 5 ml de TBE 20X y echar agua destilada hasta probeta 5 ml de TBE 20X y echar agua destilada hasta llegar a 100 ml.llegar a 100 ml.

Si se usa TBE 10X: 10 ml de TBE 10X y echar agua Si se usa TBE 10X: 10 ml de TBE 10X y echar agua destilada hasta llegar a 100 ml.destilada hasta llegar a 100 ml.

ProcedimientoProcedimiento

Elaboración de agarosa:Elaboración de agarosa:2 microtubos (1 gramo) de agarosa más 100 ml 2 microtubos (1 gramo) de agarosa más 100 ml de TBE 1X de TBE 1X Mezclar en erlenmeyer LIMPIO y poner en hot Mezclar en erlenmeyer LIMPIO y poner en hot plate USAR GUANTE DE CALOR y agitar plate USAR GUANTE DE CALOR y agitar girando la mezcla hasta que hierva y se vean las girando la mezcla hasta que hierva y se vean las burbujas en la superficie. burbujas en la superficie. Saque de hot plate y deje enfriar(50C)Saque de hot plate y deje enfriar(50C)Vertir en bandeja empezando en una esquinaVertir en bandeja empezando en una esquinaColoque la peinillaColoque la peinillaDeje que solidifique.Deje que solidifique.

Activación del DNAActivación del DNA

El DNA se prepara añadiendo 100 microlitros de agua El DNA se prepara añadiendo 100 microlitros de agua destilada y dejando a temp ambiente por 5 minutos y destilada y dejando a temp ambiente por 5 minutos y agitar luego. Colocar en hielo o nevera luego mientras agitar luego. Colocar en hielo o nevera luego mientras se usa.se usa.

DNA

+ 100 uL de Agua destilada

Incubar por 5 min. a temperara ambiente

Utilización de Enzimas de Utilización de Enzimas de restricciónrestricción

2 microlitros de DNA y 18 de agua destilada (con la 2 microlitros de DNA y 18 de agua destilada (con la punta de micropipeta, agitar) y colocar a 37° C por 20-30 punta de micropipeta, agitar) y colocar a 37° C por 20-30 minutos. LA TEMPERATURA ES CRITICA, no dejen minutos. LA TEMPERATURA ES CRITICA, no dejen que suba!!! Luego ponga tubos en hielo mientras se que suba!!! Luego ponga tubos en hielo mientras se

preparan muestraspreparan muestras..

Tubo pqñCon enz.

+ 2 uL de DNA +18 de agua destilada

Incubar por 30 min. a 37° C y luego colocar en37° C y luego colocar enHieloHielo

Para preparar muestras para Para preparar muestras para corrida corrida

DNA sin cortar:DNA sin cortar:

2 microlitros de DNA2 microlitros de DNA

8 de agua destilada8 de agua destilada

2 de loading dye2 de loading dye

Para DNA cortado Para DNA cortado (restricciones):(restricciones):

10 microlitros de 10 microlitros de digestióndigestión

2 de loading dye2 de loading dye

Para correr gelPara correr gel

Coloque un papel blanco debajo de la cámara Coloque un papel blanco debajo de la cámara Ponga bandeja en la cámara, de manera que las fosas Ponga bandeja en la cámara, de manera que las fosas queden en el lado negativo (negro), queden en el lado negativo (negro), Asegúrese de que el buffer cubra el gel Asegúrese de que el buffer cubra el gel Quite CON CUIDADO la peinilla. Quite CON CUIDADO la peinilla. Añada muestras a las fosas. NO MUEVA CAMARA!!!! Añada muestras a las fosas. NO MUEVA CAMARA!!!! Ponga tapa y prenda voltímetro. Se correra a 80 voltios Ponga tapa y prenda voltímetro. Se correra a 80 voltios Deje que corra el gel hasta llegar aprox. a media Deje que corra el gel hasta llegar aprox. a media pulgada del extremo positivo.pulgada del extremo positivo.

TeñirTeñir

Poner el gel en bandeja y cubrir con tinte. Poner el gel en bandeja y cubrir con tinte.

Dejar por media hora, agitar de vez en cuando. Dejar por media hora, agitar de vez en cuando.

Sacar gel (usen guantes!!!) y poner en agua a lavar Sacar gel (usen guantes!!!) y poner en agua a lavar hasta que destiña bastante. Ver en iluminador. hasta que destiña bastante. Ver en iluminador.

Fotografía electroforesis de ADNFotografía electroforesis de ADN

Marcador

Fragmentos de ADN

ADN + enzimas de restricción