กระบวนว�ชาเทคน�คทางห้�องปฏิ�บ�ติ�การช�นสู�ติร 2 (510204)

ภาคเร�ยนท�� 2 ป�การศึ�กษา 2550

ผู้��สูอน: ผู้ศึ.ดร.ร" �งสู�ร� โชติ�ปฎิ�เวชก"ล คณะเทคน�คการแพทย) มห้าว�ทยาล�ยเช�ยงให้ม,

E-mail: c_roongsiri@hotmail.com

วั�ตถุ�ประสงค์�การเร�ยนร��1. เพ-�อให้�น�กศึ�กษาม�ความร� � ความเข้�าใจในห้ล�กการข้องว�ธี�โครมาโติกราฟี�

แบบติ,างๆ2. เพ-�อให้�น�กศึ�กษาเข้�าใจความห้มายข้องศึ�พท)เทคน�คพ-3นฐานท��ใช�ใน

ว�ธี�โครมาโติกราฟี�แบบติ,างๆ3. เพ-�อให้�น�กศึ�กษาสูามารถเล-อกว�ธี�การแยกสูารโดยโครมาโติกราฟี�ท��เห้มาะ

สูมได�

โค์รมาโตกราฟี� (Chromatography)Chromatography เป7นเทคน�คท��น�ยมใช�ในการแยกสูารช�ว

โมเลก"ล เน-�องจากม�ห้ล�กการประย"กติ)ใช�ได�ห้ลากห้ลาย และสูารท��แยกได�น�3น สูามารถน8ามาว�เคราะห้)ห้ร-อว�ดปร�มาณได�ท�นท� แล�วย�งสูามารถเติร�ยมสูารในปร�มาณมากได�

ผู้ ล ล� พ ธี) ข้ อ ง ก า ร แ ย ก สู า ร โ ด ย ว� ธี� โ ค ร ม า โ ติ ก ร า ฟี� เ ร�ย ก ว, า ‘Chromatogram’ (ร�ปท�� 1)

1

a.

b.

ร�ปที่�� 1 แสูดงติ�วอย,างข้องโครมาโติกราฟี� 2 แบบค-อ (a)โครมาโติกราฟี� แบบคอล�มน) (Column chromatography)

แ ล ะ (b)โ ค ร ม า โ ติ ก ร า ฟี� แ บ บ แ ผู้, น ร ะ น า บ (Planar chromatography) (จ า ก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

Chromatography ประกอบด�วย 3 สู,วนห้ล�ก ได�แก,1. Stationary phase2. Mobile phase3. สูารผู้สูมท��จะน8ามาแยก (Sample mixture)

การเคล-�อนท��ข้องโมเลก"ลสูารถ�กก8าห้นดโดยสูมด"ลระห้ว,างแรง 2 แรง- แรงฉุ"ดข้อง mobile phase ซึ่��งจะพาโมเลก"ลข้องสูาร

เคล-�อนไปเร;วห้ร-อช�าข้�3นก�บค"ณสูมบ�ติ�การละลาย (Liquid

chromatography) ห้ ร- อ ก า ร ร ะ เ ห้ ย (Gas Chromatography)

- แรงเห้น��ยวร�3งข้อง Stationary phase ซึ่��งจะด�งโมเลก"ลข้องสูารท��เกาะไว�สูมด"ลข้องท�3งสูองแรงน�3จะแติกติ,างก�นติามชน�ดข้องโมเลก"ลสูาร จ�งท8าให้�โมเลก"ลข้องสูารผู้สูมน�3น เคล-�อนท��ด�วยอ�ติราเร;วแติกติ,างก�น จ�งสูามารถท��จะแยกสูารผู้สูมออกจากก�นได� (ร�ปท��2)

2

ร�ปที่�� 2 แสูดง Retension mechanism ในการแยกสูารโดยว�ธี� Chromatography แบบติ,างๆ

(S= สูารท��ติ�องการแยก, ล�กศึรไปกล�บ = แรงระห้ว,าง mobile

phase และ stationary phase)(จ า ก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

Partition Chromatographyโมเลก"ลข้องสูารผู้สูมจะกระจาย (partition) ระห้ว,าง liquid

stationary phase และ mobile phase mobile phase

อาจเป7นข้องเห้ลว (LC, HPLC) ห้ร-อเป7นกาซึ่ (GLC)

Retention ข้�3นก�บสูมด"ลระห้ว,างการละลายข้องโมเลก"ลใน stationary phase และการเข้�ามาอย�,ใน mobile phase (ร�ปท�� 3)

ร�ปที่�� 3 การละลายข้องโมเลก"ลสูารใน stationary phase และการเข้�ามาอย�,ใน mobile phase

(จ า ก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

3

[ความเข้�มข้�นข้องสูารท��ละลายใน stationary phase]

Partition coefficient, KD =

ติ� ว อ ย, า ง ข้ อ ง Partition Chromatography ไ ด� แ ก, Gas liquid chromatography (GLC), paper chromatography แ ล ะ Thin layer chromatography

(TLC) บนติ�วค83าจ"นม�ประจ" เช,น silica gel ห้ร-อ alumina

สู8า ห้ ร� บ paper chromatography ห้ ร- อ TLC

mobile phase เป7นสูารผู้สูมระห้ว,างติ�วท8าละลายม�ข้� 3ว เช,น น83า และติ�วท8าละลายไม,ม�ข้� 3วเช,น butanol ติ�วท8าละลายม�ข้� 3วจะถ�กด�ดซึ่�บโดยติ�วค83าจ"นม�ประจ"เพ-�อ form stationary phase ด�งน�3นสูารท��ละลายในติ�วท8าละลายม�ข้� 3วก;จะถ�กเห้น��ยวร�3งไว� ติ�วท8าละลายม�ข้� 3วน�3จ�งเร�ยกว,าเป7น “retarder” สู,วนติ�วท8าละลายไม,ม�ข้� 3วจะอย�,รอบๆ stationary phase ด�งน�3นสูารท��ละลายในติ�วท8าละลายไม,ม�ข้� 3ว ก;จะเคล-�อนท��ไปก,อน ติ�วท8าละลายไม,ม�ข้� 3ว จ�งเร�ยกว,าเป7น “mover”

Adsorption Chromatographyสูารท��ละลายใน liquid (ห้ร-อ gas) phase จะ interact ก�บ

ผู้�วข้องสูารจ8าพวก Hydroxyapatite (Ca3(PO4)2, Ca(OH)2),

alumina (Al2O3), Magnesium carbonate ซึ่�� ง น� ย ม ใ ช�เคล-อบบนแผู้,นแก�ว สู8าห้ร�บ TLC

ห้ม�,ท��ม�ข้� 3วบนสูารเคล-อบแผู้,นแก�ว จะสูร�างพ�นธีะไฮโดรเจนก�บสูารท��ติ�องการแยกซึ่��งละลายใน organic solvent

การชะสูารท8าโดยเพ��ม potarity ข้องติ�วท8าละลายเช,น ถ�าให้� acetonitrite (CH3CN) ก;ให้�เติ�ม methanol (CH3OH) เพ-� อไปแย,งจ�บก�บสูารเคล-อบบนแผู้,นแก�ว บางคร�3งก;ใช�การชะแบบ Gradient (ร�ปท�� 4)

4

[ความเข้�มข้�นข้องสูารท��ละลายใน mobile phase]

ร�ปที่�� 4 การชะแบบ Gradient (เพ��ม/ลดความเข้�มข้�นข้อง Solvent

เป7นล8าด�บ โดยค,อยๆปล,อย Solvent 2 เข้�ามาผู้สูมก�บ Solvent 1) (จ า ก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

Ion-exchange chromatographyสูารจะถ�กด�งไว�โดยแรงด�งด�ดระห้ว,าง ห้ม�, บน stationary phase

ซึ่�� งม�ประจ"ติรงข้�ามก�บสูารท��ติ�องการแยก ion-exchange

chromatography ม� 2 แ บ บ ค- อ Anion-exchange แ ล ะ Cation-exchange ซึ่��งเร�ยกติามประจ"ข้องสูาร แติ,คอล�มน)จะบรรจ"ด�วย stationary phase ท��ม�ประจ"ติรงข้�าม (ร�ปท�� 5,6)

ร�ปที่�� 5 Ion-exchange chromatography(จาก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/

section3.html)

การชะสูารท8าได�โดย- การเปล��ยนแปลง pH เพ-�อจะ neutralize ห้ม�,ท��ม�ประจ"ท�3ง

ท��อย�,บนโมเลก"ลข้องสูารและบน stationary phase

- เพ��มความเข้�มข้�นข้องเกล-อในบ�ฟีเฟีอร)ท��ใช�ชะ เพ-�อไปแทนท��อ�ออนท��จ�บอย�,

- ใช� pH ห้ร-อ salt gradient เพ-� อเพ��มประสู�ทธี�ภาพการแยก matrix ติ�วกลางท��ใช�แยกสูารแบ,งออกติามประจ" ช��วคราว

5

ร�ปที่�� 6 (บน) แสูดงประจ"ข้องห้ม�,ท��อย�,บน stationary phase ท��น� ย ม ใ ช� ไ ด� แ ก, diethylaminoethyl (DEAE) ก� บ carboxymethyl (CM) (ล,าง) แสูดงการเปล��ยนแปลงความจ"ข้องประจ"ท�� pH ติ,างๆ

Gel filtration Chromatographyม� ช-� อ เ ร�ย ก อ� ก อ ย, า ง อ-� น ว, า Gel permeation ห้ ร-อ Size-

Exclusion chromatography ม�ห้ล�กการแยกติามข้นาด (และร�ปร,าง) โมเลก"ลข้องสูาร ด�งร�ปท�� 7 และได�ผู้ลออกมาด�งร�ปท�� 8

6

ร�ปที่�� 7 แสูดงการแยกสูารติามข้นาดด�วยว�ธี� gel filtration chromatography

(void volume = ปร�มาติรข้อง mobile phase ก,อนท��สูารจะออกมาจากคอล�มน))(จ า ก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

ร�ปที่�� 8 Chromatogram ข้องว�ธี� Gel filtration chromatography

(จาก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.

html)

สู ภ า ว ะ ท�� ใ ช� ใ น ก า ร แ ย ก จ ะ เ ป7 น แ บ บ mild, non-denaturing

conditions ซึ่��งเห้มาะสูมสู8าห้ร�บการแยกโปรติ�นท��ม�น83าห้น�กโมเลก"ลติ,างก�น นอกจากน�3นย�งใช�สู8าห้ร�บ

- การข้จ�ดเอาเกล-อออก (Desalting)

- โปรติ�นท��แยกโดยว�ธี�น�3ย�งคงโครงร,าง Quaternary อย�,- สูามารถใช�ห้า molecular weight ข้องสูารได� โดยเท�ยบ

ก�บ standard protein ท��ทราบ molecular weight

7

(จาก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.

html)

ชน�ดข้อง matrix ท��ใช�ในการ form stationary phase :- cross-linked dextran polymer (Sephadex

G-10 ถ�ง G-200)

- cross-linked polyacrylamide (Biogel P-2 ถ�ง P-300)

Affinity chromatographyRetention เ ก� ด จ า ก biospecific interaction ร ะ ห้ ว, า ง ligand ซึ่��งเกาะอย�,บน dextran ห้ร-อ cellulose matrix ก�บโมเลก"ลข้องสูารผู้สูม

ตารางที่�� 1 แสูดงชน�ดข้องสูารท��ติ�องการแยกก�บ ligand จ8าเพาะท��เคล-อบบน Stationary phase

(จ า ก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

สูารท��ติ�องการแยก ligand

enzyme Substrate, coenzyme, reversible competitor

antigen Antibodyhormone Receptor, binding proteinreceptor Effector molecules eg.

hormone, neurotoxin

8

การชะสูารออก ท8าได�โดยการแทนท��ด�วยสูารละลายท��ม�อย�, ligand

อย�, แติ,ว�ธี�น�3สูารท��ติ�องการแยกจะจ�บก�บ ligand ติอนถ�กชะออกมา จ�งน�ยมใช�การชะโดยการเปล��ยนแปลง pH เพ-�อไปรบกวนการจ�บระห้ว,าง ligand ก�บสูารน�3น

ร�ปที่�� 9 การเช-� อม ligand ให้�เกาะอย�,บนผู้�วข้อง matrix ใช� cyanogen bromide

(จ า ก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

Qualitative Chromatographic analysis

- Paper & Thin Layer Chromatography

Retardation factor (Rf) =

9

ระยะทางท��สูารเคล-�อนท��ระยะทางท��ติ�วท8าละลายเคล-�อนท��

เปร�ยบเท�ยบก�บสูารมาติรฐานท��เคล-�อนท��ควบค�,ก�นไปข้�างๆ- อาจมองเห้;นจ"ดท��สูารเคล-�อนท��ไปโดยการฉุ�ดพ,นสูาร (เช,นพวก ninhydrin สู8าห้ร�บการว�เคราะห้)กรดอะม�โน)

Quantitative chromatographic analysis- GLC and HPLC

ใช�ว�ธี� calibrate เท�ยบก�บ standard ท��ทราบ molecular

weight แล�วว�ดพ-3นท��ใติ�กราฟี (peak area)

(จ า ก http://www.phys.uts.edu/au/subjects91326/Section3/section3.html)

เคร-�องม-อ GLC and HPLC ป=จจ"บ�น จะแสูดงผู้ล และค8าณวณความเข้�มข้�นข้องสูารออกมาได�เลย

เอกสารอ�างอ�งและแนะน าอ!านเพิ่��มเต�ม1. http://www.phys.uts.edu/au/

subjects91326/Section3/section3.html2. http://gc.discussing.info/gs/b_theory

10

3. http://www.chem.vt.edu/chem-ed/sep/ tlc/tlc.html

4. http://www.chromatography.co.uk/ techniqs/Bio/bio_003.htm

11