La historia del canthin-6-ona.

La historia del canthin-6-ona : un potencial

nuevo tratamiento de la enfermedad de Chagas

aislado a partir de la planta paraguaya Z.

chiloperone (tembetary hu)

Alain FOURNET, PhD

UMR217 - IRD

Laboratorio de Farmacognosía

Facultad de Farmacia-Paris 11

Châtenay-Malabry 92290 – Francia

Primer Congreso Paraguayo sobre Medio Ambiente y

Desarrollo Sostenible

Hotel Excelsior Asunción, Paraguay

28 Jul. 2010 – 30 Jul. 2010

Proporción de nuevas drogas desarolladas

durante el periodo 1975-2005 para las

enfermedades desatendidas tropicales y la

tuberculosis

Chirac P., Torreele E. Lancet. 2006 May 12; 1560-1561.

Criterios etnofarmacológicos y

químiotaxonomicos (presencia de

alcaloides)

Actividad in vitro sobre tres cepas de

Leishmania y tres clones de Trypanosoma

cruzi

Métodos de selección

Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium

Engl. (Rutaceae)

tronco frutas

Nombre vernacular: tembetary hu (tembé = labio, ità = piedra, y = arbol, hu =

negro)

Uso: antiparasitico, antimálarico, antiinflamatorio

Aislamiento y identificación

de los principios activos

Esquema de extracción de la corteza del tronco de

Zanthoxylum chiloperone (Rutaceae)

Cortezas del tronco de Zanthoxylum chiloperone (1.9 kg)

Amoladura y alcalinización

Con NH4OHSoxhlet CH2Cl2 y

Soxhlet MeOH Extracto

CH2Cl244 gExtracto MeOH

258.5 gCC flash elución AcOEt/ CH2Cl2 (8:2)

CC= columna cromatográfica

CLHP = cromatografía líquida de

alta performance

f1

3.81 g

f2

16.52 g

f3

2.32 g f4

3.78 g

f5

1.99 g

f6

1.65 g

f7

1.99

g

f8

1.88 gf9

6.52 gEt2O/Ac2O (v/v)

F6a

soluble

1.35 g

F6b

insoluble

306 mg

CLHP semi-preparativa

con 197 mg

5-metoxi-canthin-6-ona

150 mg

Cristalización en acetona

f3a

16.52 g

f3b

520 mgf4a

1.84 gf4b

1.94

g

canthin-6-ona 3.2 g

Moléculas responsables de la actividad antifúngica

1 2 3 41 2 31 2 3 41 2 3 4

Perfil CCM(a 254 nm)

Candida albicans

N-oxi-canthin-6-ona


canthin-6-ona

1 2 3 41 2 3 41 2 3

Aspergillus fumigatus

(cepa resistante)

C6

Candida albicans

1 2 3 41 2 3C6

Canthin-6-ona

3 C6 21

Saccharomyces cerevisiae

Cryptococcus neoformans

1 23 C6

Actividad antifúngica del canthin-6-ona y de

5-MeO-canthin-6-ona

Thouvenel C., Gantier J. C., Duret P., Fourneau C., Hocquemiller R., Ferreira M. E., Rojas de Arias A., Fournet A.

(2003) Antifungal compounds from Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium. Phytotherapy Research 17, 678-680

Estudio biológico sobre

Trypanosoma cruzi

Químoterapia existante de la enfermedad

de Chagas

Fase aguda

NifurtimoxBenznidazole

Ningún tratamiento realmente eficaz

para tratar la fase crónica

Drogas en estudio preclínico o en desarollo

clínico

Compuestos antifúngicos de tipo triazoles

D0870

(Zeneca Pharmaceuticals)SCH56592 Posaconazole

(Schering)

BMS-207,147

(ravuconazole)

UR-9825

(Grupo Uriach)TAK-187

(Takeda Co)

Características de la droga ideal para tratar la

enfermedad de Chagas

Nuevo tratamiento por adultos y niños eficaz en los

estadios agudo y crónico

Prioridad a la formulación pediatrica

Eficaz contra todas las cepas de T. cruzi

Menos tóxico y más eficaz que las drogas en el

mercado

« Facil de uso »

– Tratamiento de 30 dias maximo

– De preferencia por via oral

– De preferencia una vez por dia

Estable en medio tropical

Costo abordable

Compuestos de origen natural activos in

vivo sobre Trypanosoma cruzi

….no hay !!

Compuestos aislado y probados en la enfermedad de Chagas

experimental

Canthin-6-ona


N-oxi-canthin-6-ona

benzo[4,5]-canthin-6-ona

N

N

O

Efecto del benznidazole, canthin-6-ona y 5-MeO-canthin

-6-ona en ratones Balb/c infectados con Trypanosoma cruzi en fase aguda

Químoterapia de la enfermedad de Chagas

J. Ethnopharmacol. 2007, 109, 258-263

Patente IRD/Universidad Nacional de Asuncion: PCT/FR03/03459 du 24/11/2003.

Serología ensayos in vivo fase crónica

(cepa CL, T. cruzi)

J. Ethnopharmacol., 2007, 109, 258Serología: ELISA anti-T. cruzi.

1/ 75 dias post-infección; 15 dias post-tratamiento

2/ 105 dias post-infección; 45 dias post-tratamiento. Valor de P vs no tratados

Patente IRD/Universidad Nacional de Asuncion: PCT/FR03/03459 du 24/11/2003

Nueva Estrategia de

Desarollo - Investigación

Extracción Síntesis

•Uso de recursos renovables

(hojas, frutos, semillas…)

• Preparación de extractos

estandarizados

• Confirmación de la eficacia

• Busqueda de socios

industriales

Para preservar el recurso natural: dos opciones

•Preparación por via síntetica

de una biblioteca de

canthinonas

• Optimización

• Estudios de farmacología

• Cambio de escala

ESTUDIOS A PARTIR DE LOS EXTRACTOS

La bioautografía

Extracto CH2Cl2Ketoconazole

Fase mobile : CH2Cl2/MeOH (8/2)

Extracto MeOH

Cryptococcus neoformans

KetoconazoleExtracto MeOHExtracto CH2Cl2

Candida albicans

Análisis por HPLC

Cromatogramas de los productos de referencias

(HPLC-UV)

Concentraciones en compuestos activos de los varios

extractos preparados a partir de los diferentes organos de

Z. chiloperone

Canthin-6-one

(mg/g extracto)

5-MeO-canthin-

6-one

N-oxido-canthin-

6-one

Corteza de tronco

(diclorometano)

64,7 29,4 63,2

Corteza de tronco

(metanol)

85,6 19,1 8,2

Hojas

(diclorometano)

5.2 10.8 ND

Hojas (metanol) 2.5 5.0 ND

Frutos ND 3.5 ND

Corteza de raiz 8.2 2.5 ND

Resina 0.6 5.0 1.9

ND= no detectado

Actividad tripanocida in vitro de los extractos de Z. chiloperone

(formas tripomastigote e amastigote)

Tripomastigotes

(% lisis)*

Amastigotes

Intracelulares

(µM)

% anti-amastigotes

actividad

Corteza de tronco

(diclorometano)51 -

Corteza de tronco

(metanol)56 -

Hojas (diclorometano) 73 -

Hojas (metanol) 78 -

Frutos 45 -

Corteza de raiz 48 -

Canthin-6-ona 79 15,1 90

5-metoxi-canthin-6-ona 75 15,1 66,4

Violeta de genciana 100 - -

Benznidazole 87 192 97,5

*% de lisis a 250 µg/ml

ACTIVIDAD IN VIVO DEL EXTRACTO ETANOLICO DE HOJAS

SOBRE RATONES INFECTADOS CON T. CRUZI

Cepa CL

Cepa Y

Elaboración de una pomada antifúngica a base de

un extracto total de la corteza de Z. chiloperone var.

angustifolium

« pie de atleta » tratado con la

pomada

pomada Uña con infección fúngica

… y tratado con la pomada durante

tres meses

ESTUDIOS A PARTIR DE LAS MOLECULAS

DE SINTESIS

Síntesis química

Síntesis de la canthin-6-ona y sus análogos

(ciclización de Bischler-Napieralski)

55 %

CH2Cl2, 18h, ATNH

NH2

R3

R1

R2

OOO

NH

O

R3

O

HO

NH

NH

O

R3

O

R1

R2

MeO

NH

R1

R2

N

DBU, CH2Cl2, 18h, AT

POCl3

refluxing benzene, 2h

Amberlit H-15 ¨MeOH, 18 h, 60¡C

R3

O

MeO

NH

R1

R2

N

N

O

Unos compuestos análogos obtenidos

10-metoxi-canthin-6-ona 9-fluoro-canthin-6-ona 2-metil-canthin-6-ona benzo[4-5]-canthin-6-ona

1,4-di-fluorobenzo[4-5]-

canthin-6-onapirazino[4-5]-canthin-6-ona ciclohexil[4-5]-canthin-6-ona

Síntesis de más de 40 canthinonasSoriano-Agaton F., J. Nat. Prod. 2005, 68, 1581

Optimización de la síntesis

Majoramiento de los rendimientos (80-85 %)

Preparación de 2-3 g de un golpe

Nuevo metodo « one spot »

Reducción drástica de los residuos y de los

catalizadores con metales pesados

Enfoque del mecanismo de

acción

Busqueda de blancos potenciales

Canthin-6-ona antifúngica se acumula en las gotas lipidicas y

afecta el metabolismo de los acidos grasos de

Saccharomyces cerevisiae

Localización de canthin-6-

one en el colorante rojo de

Nilo en Saccharomyces

cerevisiae por microscopia

confocal

Lagoutte et al., Biomed. Pharmacother. 2008, 62, 99.

Hipotesis: una estimulación de la cadena alkila de la enzima desaturasa. Los agentes

antifúngico clasicos no afectan el nivel de desaturasa.

Jours

0%

20%

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J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14

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C6 20 IP

Jours

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C6 20 VO (canthin-6-one 20 mg/kg/j par voie orale)

Jours

% de

survie

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100%


C6 10 IP

fluconazole

Actividad in vivo del canthin-6-ona

Canthin-6-ona

No tratado

Actividad in vivo de la 9-fluoro-canthin-6-ona

Jours

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60%

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% de

survie

C6-9F 20 VO

Jours

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100%


% de

survie

C6-9F 20 IP

no tratado

9-fluro-canthin-6-one

kétoconazole

la metilación

reduce la actividad

la quaternización

reduce la actividad

auscencia de

sustitución

un atómo de fluor favorece

la actividad

la metoxilación

reduce la actividad

Relación estructura-actividad

N

N

O

2

4

5

10

9

Colaboración entre

IRD y DNDi

(Drugs for Neglected Diseases initiative)

Consorsio « canthin »

IRD, CNRS, Paris 11 (Francia), Universidad Nacional de Asuncion (Paraguay): redes y proveedores de hits

Centre for Drug Candidate Optimisation (CDCO), Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Australia, ADMET (administración, distribución, metabólismo, excreción y toxicología), bioensayos in vitro contra Trypanosoma cruzi

Alpha Chimica (Francia): síntesis de canthin-6-ona y derivados

OTROS ESTUDIOS CON CANTHIN-6-ONA

Estudio farmacéutico de la forma

galénica

Preparación de sales de canthinonas y

ensayos de cristalización

Perfíl fisicoquímico y formulación

Estudio de la estabilidad física y química

bajo estrés y estudio de polimorfismo

Formulación relevante por la

administración por via oral

Parametros farmacologicos de la canthin-6-ona

Propriedades fisicoquímicas

– in silico predictions consistent with “drug-like” properties

– Moderate to good aqueous solubility, pH dependent

– Moderately protein bound (91.1%)

Intermediate to high in vitro metabolism (microsomes)

– EH 0.80 (mouse); 0.63 (human)

High permeability in PAMPA (52% recovery)

In vivo mouse exposure

– Rapidly absorbed following IP dosing; Cmax ~5 min

– Good exposure following PO dosing; Cmax ~15min, exposure out to >7.5h

– Data suggests reasonable oral BA

Structure-based toxicity alerts

– No alerts

– Toxicity: LD50 reported at around 400 mg/kg.

Perspectivas

A corto plazo:

• Micropropagación de plantines (comunidades campesinas en

Itaipu)

• Desarollo local de productos fitofarmacos con extractos para

tratamiento de las infecciones fúngicas

•Estudios complementarias de la actividad antichagasica, de

toxicología del extracto

Con las canthin-6-onas y derivados de síntesis:

• Nuevos analogos, optimización de la síntesis, nuevas

propriedades biológicas (malaria…), toxicología, cambio de

escala (scale-up), farmacología, formulación…..

ANUNCIO

Busquamos inversionistas o facilidores en Paraguay

para desarollar productos antifúngicos a base de

Z. chiloperone (hojas)

Uso como fitofarmacos para medicinas humana y

veterinaria

Muchas gracias a todas las personas que participaron

a los estudios sobre Z. chiloperone y las canthin-6-onas

Laboratoire de Pharmacognosie, UMR 217(CNRS-Paris 11, IRD), Faculté de Pharmacie, Université Paris-

Sud, Châtenay-Malabry France

-Pr Reynald Hocquemiller Dr Bruno Figadère, Pr Erwan Poupon

-- Dra Delphine Lagoutte Dra Flor Agaton Dr Gerardo Cebrian

-Dr Alain Fournet

Instituto de Investigaciones en las Ciencias de la Salud, Departamento de Medicina Tropical, Universidad de

Asunción, Asunción, Paraguay

- Dra Antonieta Rojas de Arias -Lic. Maria Elena Ferreira, - Lic. Ninfa Vera de Bilbao

-Dra Alicia Schinini - Dr Hector Nakayama, - Lic. Susana de Ortiz, - Lic.

Luis Sanabria, - Lic. Elva Serna

CEDIC, Asuncion, Paraguay:

Dra Antonieta Roja de Arias Dra Miriam Rolon

Dra Celeste Vega

Alpha Chimica, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry, France:

Dr. Bernardin AKAGAH Dr Anh Tuan LORMIER

Muchas gracias por su

atención !!

La historia del canthin-6-ona.

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