La celula
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PRIMER SEMINARIO ADN-CULTIVO CELULAR Y TÉCNICAS DOSIMETRÍA CITOGENÉTICA Adriana Katherine Molina Vargas Mayra Alejandra Hernández Victorino Laura Johana Díaz Gómez
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PRIMER SEMINARIO ADN-CULTIVO
CELULAR Y TÉCNICAS DOSIMETRÍA
CITOGENÉTICA
Adriana Katherine Molina Vargas
Mayra Alejandra Hernández Victorino
Laura Johana Díaz Gómez
Disponible en:
aprenderjugar.com.
Disponible en:
blog.educastur.es.
DIFERENCIAS ENTRE
CÉLULA ANIMAL Y VEGETAL
Disponible en:
vidabioquimica.blogspot.com
Disponible en:
jantoniodiaz.blogspot.com
Disponible en: jantoniodiaz.blogspot.com
Disponible en:
jantoniodiaz.blogspot.com
El gen es un segmento de ADN que da la
clave para una proteína en particular.
CONCEPTO DE GEN
Los genes son las unidades de herencia y
controlan las características del individuo:
color del pelo, tipo de sangre, color de la
piel y color de los ojos.
Un gen contiene la información suficiente
para formar una proteína, la misma que
será usada para las necesidades celulares
o del organismo
Los genes son parte de los cromosomas.Disponible en:
http://labbio.bligoo.com/content/view/71
0307/Historia-del-concepto-Gen.html
ESTRUCTURA DEL ADN
•Una molécula de ADN esta formada por unidades llamadas nucleótidos.
•Cada nucleótido contiene un grupo fosfato, un azúcar de cinco carbonos llamada
desoxirribosa y una base nitrogenada.
•Los nucleótidos están unidos por enlaces entre el grupo fosfato de un nucleótido
y el azúcar del siguiente nucleótido.
Disponible en:
www.bionova.org.es
FUNCIONES DE NUCLEÓTIDO
Disponible en:
http://santobiodomingo.blo
gspot.com/2012/12/acidos
-nucleicos-y-sintesis-de-
proteinas.html
•Constituyente de los ácidos
nucléicos.
•Garantizar los intercambios
energéticos.
•Actúan como señales
químicas.
•Componente estructural de
cofactores.
FUNDAMENTO
LA REPLICACIÓN DEL ADN
Disponible en:
http://biologon.blogspot.com/2012/03/entrada-n2-replicacion-transcripcion-y.html
LA TRANSCRIPCIÓN
En las células encontramos tres tipos de ARN:
1.El ARN mensajero o ARNm lleva las instrucciones para hacer una proteína en
particular, desde el ADN en el núcleo hasta los ribosomas. Las moléculas de ARNm se
disponen según el código contenido en el ADN.
2.El ARN de transferencia o ARNt.-lleva los aminoácidos a los ribosomas. El ARNt se
encuentra en el citoplasma de las células.
3.El ARN ribosomal o ARNr, es una de las sustancias químicas de las que están
compuestos los ribosomas.
Cuando se necesita cierta proteína , se forma el ARNm, de la información que hay en el
ADN.
Disponible en:
http://www.tutorvista.com/cont
ent/biology/biology-iii/gene-
expression/proteins-
synthesis.php
Disponible en:
http://biogeo.iespedrojimenezmontoya.es/BIOLOGIAJM/GENETICA/expresion_genetica.htm
LA TRADUCCIÓN
Disponible en:
http://biogeo.iespedrojimenezmontoya.es/BIOLOGIAJM/GENETICA/expresion_genetica.htm
Disponible en:
http://biogeo.iespedrojimenezmontoya.es/BIOLOGIAJM/GENETICA/expresion_genetica.htmc
CAMBIOS EN LA ESTRUCTURA DEL ADN
Las mutaciones son alteraciones en la secuencia de nucleótidos de la estructura del
ADN denominada gen
REPARACIÓN DEL ADN
Disponible en:
http://ocw.unican.es/ciencias-de-la-
salud/biogerontologia/materiales-de-clase-1/capitulo-
8.-danos-en-el-genoma-y-el-envejecimiento/8.3-
mecanismos-de-reparacion-del-adn
Disponible en:
Cap 31. Replicación, reparación y recombinación del DNA.
MEIOSIS Y MITOSIS
Disponible en:
http://atlasgeneticsoncology.org/Educ/PolyMecaSp.html
MITOSIS
Disponible en:
www.tutorvista.com
MEIOSIS
Disponible en:
www.tutorvista.com
EMPAQUETAMIENTO DEL ADN
Disponible en:
aportes.educ.ar
CROMOSOMA
Disponible en:
rbastom08.blogspot.com
Los centrómeros son elementos CIS responsables de la segregación de los
cromosomas durante la división celular. La región mínima funcional del
centrómero se denomina región CEN.
•Mantener la integridad
estructural de los cromosomas
•Asegurar la replicación
adecuada de los extremos de
los cromosomas
•Pueden estar implicados en el
establecimiento de la estructura
tridimensional del núcleo y en
el apareamiento de los
cromosomas
CENTRÓMERO
Disponible en:
blogbiologia11.blogspot.com
TELÓMEROS
Los cinetocoros se forman
a ambos lados del
centrómero (uno por cada
cromátida) y representan
puntos de anclaje entre los
centrómeros y los polos del
huso.
CINETOCOROS
Disponible en:
www.catedu.es
CAMBIOS EN LOS CROMOSOMAS
Disponible en:
http://atlasgeneticsoncology.org/Educ/PolyMecaSp.html
TIPOS DE CAMBIOS
Disponible en:
www.biotech.bioetica.org
NUMÉRICAS
Disponible en:
http://atlasgeneticsoncology.org/Educ/PolyMecaSp.html
ESTRUCTURALES
Disponible en:
www10.uniovi.es
ASOCIACIONES TELOMÉRICAS
Cuando se cortan los
telomeros les es difícil separarse
en la mitosis
Inestabilidad cromosomicaasociada con el desarrollo neoplastico
Unión de los extremos de cromosomas
El TAS no se han
encontrado en
células sanas si no
en células
tumoralesDisponible en:
http://prezi.com/alknv-f0e_-l/telomerasa/
CAUSAS Y EFECTOS SOBRE LA
ESTRUCTURA DEL ADN
Causa Efecto
Temperatura Despurinización, rotura del enlace N-glicosídico.
Metabolitos reactivos Radicales libres
Radiaciones ionizantes
Alta energía
(gamma, x, flujo de
protones y neutrones)
Rompen el ADN y cromosomas
Forman radicales
y peróxidos
Baja energía
(UV)Forman dímeros
Radiación corpuscular
(alfa y beta)Rotura de cadenas de ADN
Sustancias químicasSe intercalan entre los pares de bases, estableciendo
puentes
Se debe tener en cuenta los efectos de la radiación pueden ser agudos, que
aparecen corto tiempo después de la exposición a la radiación, o crónicos, que
aparecen a menudo muchos años después de recibir la exposición. También
pueden clasificarse en somáticos, genéticos, si afectan a las células germinales
y dan lugar a efectos en la descendencia de los individuos irradiados, o
teratogénicos, si afectan al feto durante la gestación.
Disponible en:
http://proteccionradiologica.wordpress.com/
Para altos niveles de radiación, el daño celular
puede conducir a la muerte de la célula
afectada o a su inhabilitación para la
reproducción. A bajos niveles de radiación la
célula puede, habitualmente, recuperarse de
los daños recibidos (superar la irradiación por
un proceso de reparación celular)
Mutaciones en la célula, posible
daño a generaciones futuras
Algunos cambios en el ADN
pueden transmitirse a las
siguientes generaciones cuando
las células afectadas por la
radiación son las células
reproductoras o germinales.
El cultivo celular es adecuado y útil para el estudio y diferenciación del
desarrollo de diferentes células in vitro provenientes de un órgano o tejido
mantenidas en medios de cultivo de composición química definida y en
condiciones de temperatura, pH, aireación y humedad controladas. De esta
forma se aseguran su supervivencia y multiplicación, manteniendo todas
sus funciones metabólicas de una manera semejante a las que tenían en el
huésped.
CULTIVO CELULAR
Disponible en:
www.iats.csic.es
TIPOS DE CULTIVO CELULAR PRIMARIO
•Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un soporte sólido (plástico o
vidrio). El anclaje al sustrato es un prerrequisito para la proliferación celular. Es el
método utilizado para la mayoría de las células excepto para las hematopoyéticas.
• Cultivos en suspensión: las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo.
Su crecimiento no depende del anclaje. Este tipo de cultivo se restringe a las células
hematopoyéticas, células madre, líneas celulares transformadas y células tumorales.
Alcanzan la confluencia cuando el número de células es grande y los nutrientes son
insuficientes.
• Baño termostatizado
• Nevera y congelador
• Micro centrifuga
• Depósito de nitrógeno líquido
• Campana de flujo laminar
• Autoclave
INSTRUMENTACIÓN
Para realizar un cultivo celular es necesaria unas condiciones físicas
y de instrumentación básicas.
Disponible en:
info.apluswhs.com
MATERIALES USADOS COMO SOPORTE
a. Vidrio: Empleado usualmente como
sustrato de cultivo. Ventajas.
o Escaso costo
o Facilidad de limpieza y
esterilización.
o Útil para posterior observación al
microscopio por su calidad óptica.
b. Plástico desechable: Empleado
como material desechable estéril por
irradiación.
El plástico más empleado es el
poliestireno, de buena calidad óptica
debido a que es hidrofóbico requiere
un tratamiento mediante irradiación-
gamma, químico, o mediante
descargas eléctricas que produzca
una superficie mojable.c. Superficies tratadas:
La adherencia y crecimiento de las células
en un frasco mejora en muchos casos si la
superficie ha sido tratada con el medio de
crecimiento de otro cultivo, debido a la
presencia de colágeno o fibronectina
liberada por las células, o bien sobre
superficies recubiertas de proteínas de
matriz extracelular.
El tratamiento con colágeno
desnaturalizado aumenta la adhesión de
muchos tipos celulares, y especialmente
de las células epiteliales.
d.Microsoportes (”microcarriers").
Se trata de soportes plásticos y
poliacrilamida (BioRad) en forma de
pequeñas bolas ("beads") a las que se
unen las células dependientes de
anclaje.
Estas bolas con las células adheridas
se mantienen en suspensión.
e. "Feeder layers“:
Una manera de obtener estos
suplementos es la de hacerlos crecer
sobre los restos de monocapas de otros
tipos celulares.
Estas monocapas previas se esterilizan o
se inhibe su crecimiento (normalmente por
irradiación X o gamma). Este efecto
podría ser debido a dos posibilidades:
suplementación del medio o modificación
del sustrato.
f. Matrices tridimensionales:
Son sustratos en los que las células
penetran, estableciendo una distribución
tridimensional: geles de colágeno,
esponja de celulosa sola, o recubierta de
colágeno, o "gelfoam".
En estas matrices muchos tipos celulares
crecen y se establecen de una manera
análoga a como lo hacen en el tejido de
origen.
g. Sustratos no adherentes: Son
sustratos que no permiten la adhesión
celular, por ejemplo agar, agarosa, o
methocel (metilcelulosa de alta
viscosidad). Son de utilidad en
situaciones en las que no conviene que
exista dispersión de las células
derivadas de una originaria, por ejemplo
en los procesos de aislamiento de
colonias infectadas por virus.
h. Interfases líquido-gel o
líquido-líquido.
Se han observado en algunas
situaciones proliferación celular y
adhesión a las interfases líquido-
líquido o líquido-gel, a pesar de
que se desconocen exactamente
los mecanismos.
RECIPIENTES DE CULTIVO
Placas de petri
MultiplacasFrascos de
Roux
Disponible en:
www.minitube.de
COMPONENTES GASEOSOS
Mezcla de gases
La mayor parte de los cultivos celulares son
cubiertas con la tensión
atmosférica
Los cultivos requieren
concentraciones especificas de los gases similares al ambiente in vivo de las células.
Esto se debe a la geometría del órgano y a las dificultades de
difusión del gas en su interior.
PROPIEDADES FÍSICAS
PH Y CAPACIDAD TAMPONADORA
Se mantiene para la mayoría en 7.4
OSMOLARIDAD:
Es recomendable emplear medios ligeramente hipotónicos para compensar la evaporación durante el
periodo de incubación
TENSIÓN SUPERFICIAL
Se ha de mantener baja, y en general sólo se ve alterada por la aparición de espumas en los
cultivos en suspensión donde se burbujea CO2
.
VISCOCIDAD
Esta determinada fundamentalmente por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre el crecimiento
TEMPERATURA
La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células, de ahí la importancia de un
buen control de ésta en la incubación
CONDICIONES FISIOLÓGICAS
R.P.M.I 1640
Medio diseñado para el crecimiento de linfoblastos
MEM (Medio Esencial Mínimo)
Tiene los requerimientos
esenciales mínimos, pH óptimo 7.0 - 7.2,
tiene un alto contenido de ácido fólico que favorece la división celular
Todo medio de cultivo
Soluciones salinas equilibradas (BSS).
Aminoácidos.
Vitaminas
Suplementos orgánicos de bajo peso molecular.
Hormonas y factores de crecimiento (suero).
Inhibidores del crecimiento de los contaminantes.
AGENTE MITOGÉNICO
“Fitohemaglutinina”
Los linfocitos no se multiplican en la sangre periférica, sin embargo in vitro si se logra
adicionando al cultivo un agente mitogenico esto quiere decir que induce a la mitosis,
cabe resaltar que este influye en células jóvenes. El agente mas utilizado es la
fitohemaglutinina (PHA),m la cual es extraída principalmente del frijol rojo.
Esta estimula la división de linfocitos T y logra el reintegro de las células en el ciclo
celular
Figura 1. Metafase parcial obtenida a partir de
cultivos de linfocitos de sangre periférica
estimulados con fitohemaglutinina, teñida
diferencialmente con la técnica de FPG. Las flechas
indican los Intercambio de Cromatides Hermanas
Disponible en:
http://www.respyn.uanl.mx/i/2/articulos/cancer.html
FUNDAMENTO DEL CULTIVO
Periodo de cultivo:
• Para linfocitos humanos se requiere un periodo de incubación de 72 horas.
Agente mitogénico
• “Fitohemaglutinina”
KCl 0.075 M (1.398 g/250
ml) a 37º
• Se incuba en esta solución con el objetivo de generar un movimiento de moléculas hacia en interior de la célula aumentando su volumen hasta provocar un shock hipotónico facilitando la ruptura de membranas y lisis celular en el goteo.
Fijador Metanol/Ac. Acético 3:1
(Fijador Carnoy)
•Un fijador modifica una celula mediante la estabilización de las proteínas de modo que la hace resistente a los cambios posteriores. Carnoy es un fijador tipo coagulante que transforma las proteínas en estructuras insolubles mantienendo la morfología de las estructuras celulares a nivel de microscopía de luz.
Goteo
•Proceso que consiste en tomar con una micropipeta, pipeta de vidrio o pipeta pasteur una cantidad pequeña de cultivo linfocitario ya procesado y dejar caer 1 o 2 gotas desde una distancia de aprox 50-60 cm sobre un portaobjetos limpio. La altura permite que la gota al entrar en contacto con la superficie del vidrio colapse y se liberen los cromosomas.
Envejecimiento
•Se envejecen los preparados en una estufa por 1 noche a 65ºC o por 3 a 4 días a 37º C para que el fijador se evapore, las celulas se aplanen, los cromosomas comiencen a expandirse y el citoplasma disminuya.
BANDEO CROMOSÓMICO
Consiste en someter a los cromosomas a desnaturalizaciones, a digestión enzimática o
a ambos, seguido de una tinción con colorante específico para ADN. Esto hace que los
cromosomas se tiñan con una serie de bandas claras y oscuras. Hay diversos tipos de
bandeo:
Disponible en:
www.scielo.org.ar
Bandeo Método Características
Q Tinción con quinacrina Bandas fluorescentes brillantes
G Tinción con giemsa, tras
pretatamiento de cromosomas con
tripsina
Bandas G oscuras corresponden a las
Q brillantes
R Naranja de acridina, giemsa
modificado
Patrón inverso al Q y G, útil para
definir los extremos de los
cromosomas
T Varias técnicas Resaltan las regiones teloméricas
C Extracción de DNA/proteínas, tinción
con giemsa
Resaltan las regiones centroméricas
Disponible en:
www.javeriana.edu.co
¿QUÉ ES LA DOSIMETRÍA BIOLÓGICA?
La dosimetría biológica mediante
técnicas citogenéticas consiste en
realizar estimaciones de dosis por
exposición a radiaciones ionizantes en
personas; analizando las alteraciones en
las células de la sangre, empleando
indicadores de daño por radiación
reconocidos internacionalmente; los
cuales son:
• Aberraciones cromosómicas
• Micronúcleos
Ambos para linfocitos en sangre
periférica, estableciendo relaciones de
dosis-efecto en ambos indicadores.
Disponible en:
http://www.cphr.edu.cu/servicio/serv12.htm
¿POR QUÉ EN LINFOCITOS?
1
• Este tipo de célula es consideradocomo uno de los más radiosensibles.
2• Es un tejido fácil de obtener.
3
• Se pueden inducir a la división mitóticaquímicamente. (misma edad).
4
• En el torrente sanguíneo no seencuentran en división mitótica.
IMPORTANCIA DE DICÉNTRICOS Y
MICRONÚCLEOS
•Cromosoma dicéntrico: Se trata de un
cromosoma que tiene dos centrómeros y
que surge de la rotura de dos cromosomas y
posterior fusión de los fragmentos que
tenían el centrómero
Disponible en:
http://mural.uv.es/monavi/disco/primero/biologia/Tema37.pdf
http://atlasgeneticsoncology.org/Educ/PolyMecaSp.html
http://www.bdigital.unal.edu.co/4254/1/598925.2011.pdf
•Micronúcleos: Son masas de cromatina
que aparecen en el citoplasma de la
célula interfásica y son el resultado de
fragmentos cromosómicos o cromosomas
enteros que no se han orientado
correctamente en la anafase. Los
micronúcleos son fragmentos de
cromosomas (o cromosomas completos)
extranucleares, rodeados de su propia
membrana.
INDICADOR DE MICRONÚCLEOS Y DICENTRICOS.
(MÉTODO DE MEDIDA DE INESTABILIDAD GENÉTICA)
• El material genético en elnúcleo celular se replica divide(2 células hijas = ).
1
• Radiaciones, genotóxicos:Roturas cromosómicas, pérdidacromosómica, reparto genéticono equitativo-
2
Origina núcleo de menor tamaño que el
primario (MN), durante la anafase.
Origina un cromosoma con dos centrómeros en
forma de anillos, fragmentos y otras
reordenaciones asimétricas
CRITERIOS DE SELECCIÓN DEFINIDOS
POR EL HUMAN-PROJECT.
Se necesita tener criterios de selección para reconocer las células en que se va a
realizar el recuento, así como las características de los micronúcleos para que puedan
ser reconocidos como tal y que el recuento sea fiable y objetivo.
Para células binucleadas Para micronúcleo
El citoplasma debe distinguirse
claramente.
El diámetro oscila entre 1/16-1/3 de la
media del diámetro del radio principal.
Membranas citoplasmática y nuclear
intactas.
No refractarios.
Núcleos con similar grado de
condensación de la cromatina.
Intensidad de tinción similar a los núcleos
principales o superior.
Igual tamaño, forma (ovalados) y patrón
de tinción.
Forma similar a los núcleos de la célula
binucleadas.
Pueden estar unidos por puentes
nucleoplasmáticos.
No conectados con ninguno de los
núcleos de la célula binucleadas.
Pueden tocarse pero no solaparse. Pueden tocar los núcleos de la célula
binucleadas pero no solaparse con ellos.
Ninguno de los núcleos debe encontrarse
en etapas de apoptosis.
TINCIÓN HOMOGÉNEA GIEMSA
Gota gruesa
Secado de la lámina
Azul de metileno fosfatado (deshemoglobinizar)
Buffer fosfatado (lavar)
Colorante (1/1) giemsa/buffer
Agua (lavar)
Extendido
Secado de la lámina
Alcohol metílico (extendido)
Colorante (2/1) giemsa/buffer
Agua Lavar
VISTA MICROSCOPICA
Micronúcleos Dicentricos
Fragmentos Dicentricos y acéntricos
Translocaciones
Deleción
GRACIAS
