Kinetika Reakcije DPPH- Radikala i Meduna Jele (Abies Alba Mill.) Gorskog Kotara

8/18/2019 Kinetika Reakcije DPPH- Radikala i Meduna Jele (Abies Alba Mill.) Gorskog Kotara

1/45

SVEUČILIŠTE U RIJECI

ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU

Preddiplomski sveučilišni studij

Biotehnologija i istraživanje lijekova

Martina Fabijanić

Kinetika reakcije DPPH• radikala i meduna jele ( Abies alba

Mill.) Gorskog kotara

Završni rad

Rijeka, 2014.


2/45

SVEUČILIŠTE U RIJECI

ODJEL ZA BIOTEHNOLOGIJU

Preddiplomski sveučilišni studij

Biotehnologija i istraživanje lijekova

Martina Fabijanić

Kinetika reakcije DPPH• radikala i meduna jele ( Abies alba

Mill.) Gorskog kotara

Završni rad

Rijeka, 2014.


3/45

Mentorica rada: doc. dr. sc. Mladenka Malenica Staver

Završni rad obran jen je dana 18.9.2014. pred povjerenstvom:

1. doc. dr. sc. Nela Malatesti (predsjednica)

2. doc. dr. sc. Dalibor Broznić (član)

3. doc. dr. sc. Mladenka Malenica Staver (članica)

Rad ima 44 stranice, 10 slika, 6 tablica i 37 literaturnih navoda.


4/45

i

SAŽETAK

Nastanak slobodnih radikala u tijelu je prirodan proces za aerobne stanice koje imaju

antioksidativne obrambene mehanizme pomoću kojih odstranjuju nastale slobodne

radikale. Stanje neuravnoteženosti oksidanasa i antioksidanasa u stanici naziva se

oksidativni stres, a oštećenje stanice koje zbog njega nastaje je temelj u nastanku

patofizioloških stanja poput neurodegeneracije, tumora, mutageneze, kardiovaskularnih

oboljenja i općenitog starenja organizma. Neki od prirodno prisutnih spojeva koji se

nalaze u prehrambenim proizvodima su fenolni spojevi i derivati, flavonoidi, određeni

biljni pigmenti, liposolubilni α-tokoferol (vitamin E) i hidrosolubilna L-askorbinska kiselina

(vitamin C) te mnogi drugi. Med je lako dostupan izvor vrlo učinkovitih antioksidansa.

Izlaganje meda vanjskim čimbenicima kao što su svjetlost i temperatura (iznad 40°C) može

utjecati na gubitak antioksidativne aktivnosti pa se proučavanje kinetike reakcije može

primijeniti u cilju njezinog očuvanja.

U ovom radu se istražila kinetika antiradikalne aktivnosti hvatanja DPPH• radikala u

prisustvu meduna jele ( Abies alba Mill.) s područja Gorskog kotara pri različitim

temperaturama. Utvrđeno je učinkovitije antiradikalno djelovanje pri višim

temperaturama. Dobivene vrijednosti postotka gašenja signala (I%) iznosile su: pri 25 ⁰C

46%, pri 35 ⁰C 50% i pri 50 ⁰C 68%. Pored toga, reakcije su bile intenzivnije na početku,

nakon čega intenzitet slabi.

Kinetika reakcije je proučavana primjenom različitih matematičkih modela. Korišteni su

monofazni (modeli nultog i prvog reda, te logaritamski model) i bifazni modeli (model

Weibull-ove raspodjele, te Gustafson-Holdenov model). Primjena testiranih modela

ukazuje na bifazno ponašanje reakcije nestanka DPPH• radikala. Gustafson-Holdenov

model odabran je za određivanje energije aktivacije reakcije, a dobivena energija

aktivacije za reakciju hvatanja DPPH• radikala u prisustvu meduna iznosila je 45,40

kJ/mol. Dobivena niska vrijednost energije aktivacije čini med značajnim antioksidansom

jer ukazuje na lakoću nastanka antioksidativne reakcije, a bifazna kinetika

antioksidativnog djelovanja upućuje na razne antioksidativne spojeve prisutne u

medljikovcu koji imaju različite brzine reagiranja s DPPH• radikalom.

Ključne riječi: medun; antioksidativna svojstva; DPPH•; kinetika


5/45

ii

SUMMARY

The formation of free radicals in the body is a natural process for aerobic cells, which

have antioxidant defence systems for removal of formed free radicals. The imbalance of

oxidants and antioxidants in the cell is called oxidative stress which causes several

pathophysiological states such as neurodegeneration, cancer, mutagenesis,

cardiovascular diseases and aging in general. Some of the naturally occurring compounds

found in food are phenol compounds and derivatives, flavonoids, some plant pigments,

liposoluble α-tocopherol (vitamin E), hydrosoluble L-ascorbic acid (vitamin C) and many

others. Honey is an easily accessible source of very effective antioxidants. Exposure of

honey to external factors such as light and temperature (>40 ⁰C) can have an effect on its

antioxidant activity and kinetics investigations of antioxidant reactions can serve to

preserve this activity.

In this study kinetics of DPPH• radical scavenging by fir ( Abies alba Mill.) honeydew honey

from Gorski kotar was investigated at different temperatures. It was concluded that

higher temperatures caused an increase of antioxidant activity. The obtained values of

loss signal percentage (I%) were 46%, 50% and 68% at 25 ⁰C, 35 ⁰C and 50 ⁰C,

respectively. In addition, the reactions were more intense at the beginning of the reaction

and slower towards the end.

The mathematical model analysis was conducted to obtain an optimal kinetics model for

the reactions. The monophasic (zero order, single first order and logarithmic) and biphasic

models (Weibull distribution and Gustafson-Holden model) were used. The optimal

kinetics models were biphasic models and Gustafson-Holden model was selected to

calculate activation energy. The activation energy for radical scavenging of DPPH• radical

in the presence of fir honeydew honey was 45,40 kJ/mol. The obtained low value of

activation energy indicated easy onset of antioxidant reaction, and biphasic kinetics point

to different antioxidant compounds in honeydew honey that had different rates for

DPPH• radical scavenging.

Keywords: honeydew honey; antioxidant properties; DPPH•; kinetics


6/45

iii

SADRŽAJ

SAŽETAK ....................................................................................................................................... i

SUMMARY .................................................................................................................................. ii

1. UVOD ...................................................................................................................................... 1 1.1. Povijest konzumacije meda .......................................................................................................... 1

1.2. Proizvodnja meda ......................................................................................................................... 1

1.3. Sastav meda.................................................................................................................................. 2

1.3.1. Ugljikohidrati ......................................................................................................................... 4

1.3.2. Bjelančevine, enzimi i aminokiseline ..................................................................................... 4

1.3.3. Vitamini, minerali i elementi u tragovima ............................................................................. 5

1.3.4. Hlapive tvari ........................................................................................................................... 5

1.3.5. Polifenoli ................................................................................................................................ 5

1.4. Učinci meda .................................................................................................................................. 6

1.4.1. Antimikrobno djelovanje ....................................................................................................... 6

1.4.2. Imunostimulirajuće djelovanje .............................................................................................. 7

1.4.3. Protuupalno djelovanje ......................................................................................................... 8

1.4.4. Antitumorsko djelovanje ....................................................................................................... 8

1.4.5. Antioksidativno djelovanje .................................................................................................... 8

1.4.6. Ostala terapeutska svojstva .................................................................................................. 9

1.5. Određivanje antioksidativnih svojstava meda ........................................................................... 10

1.5.1. Metode određivanja antioksidativnih svojstava meda ....................................................... 10

1.5.1.1. DPPH• test sadržaja antioksidanasa ............................................................................. 10

1.5.1.2. ABTS•+

test aktivnosti antioksidanasa .......................................................................... 12

1.5.1.3. FRAP - test antioksidativne sposobnosti redukcije željeza .......................................... 12

1.5.1.4. Antioksidativni kapacitet Trolox ekvivalenta ............................................................... 12

1.5.1.5. Ukupni sastav fenola – metoda ekvivalenta galne kiseline .......................................... 12

1.5.1.6. Intenzitet boje – apsorpcija na 450 nm (ABS450) .......................................................... 13

1.6. Kinetika kemijske reakcije .......................................................................................................... 13

1.6.1. Brzina reakcije ..................................................................................................................... 13

1.6.2. Zakoni brzine i konstante brzine reakcije ............................................................................ 14

1.6.3. Red reakcije ......................................................................................................................... 15

1.6.4. Određivanje zakona brzine .................................................................................................. 15

1.6.5. Integrirani zakoni brzine ...................................................................................................... 16

1.6.6. Temperaturna ovisnost brzine reakcije ............................................................................... 17


7/45

iv

1.7. Matematičko modeliranje kemijskih reakcija ............................................................................ 18

1.7.1. Monofazni matematički modeli .......................................................................................... 19

1.7.1.1. Model kinetike nultog reda .......................................................................................... 19

1.7.1.2. Model kinetike prvog reda ........................................................................................... 19

1.7.1.3. Kinetika logaritamskog modela .................................................................................... 19

1.7.2. Bifazni matematički modeli ................................................................................................. 20

1.7.2.1. Model Weibull-ove raspodjele ..................................................................................... 20

1.7.2.2. Gustafson-Holdenov model.......................................................................................... 20

2. CILJ RADA .............................................................................................................................. 22

3. METODE I MATERIJALI .......................................................................................................... 23

3.1. Uzorci i instrumenti .................................................................................................................... 23

3.2. Antiradikalna aktivnost i analiza kinetike nestanka DPPH• ....................................................... 23

3.3. Statistička analiza ....................................................................................................................... 24

4. REZULTATI............................................................................................................................. 25

5. RASPRAVA............................................................................................................................. 31

6. ZAKLJUČAK ............................................................................................................................ 33

7. ZAHVALE ............................................................................................................................... 34

8. LITERATURA .......................................................................................................................... 35

9. ŽIVOTOPIS ............................................................................................................................. 39


8/45

1

1. UVOD

1.1. Povijest konzumacije meda

Med je proizvod medonosnih pčela ( Apis mellifera; vrste Apis i Meliponini ) podrijetlom iz

Europe i Afrike [1]. Nastaje iz nektara cvjetova ili medne rose koje pčele prerađuju u svom

mednom želucu [2]. Još u 7. tisućljeću pr.n.e. ljudi su sakupljali i jeli med i saće divljih

pčela. Tada je to bio jedini izvor slatkog, te je bio važan prehrambeni proizvod. U drevnoj

Kini med se spominjao u knjizi pjesama Shi Jing koja datira iz 6. stoljeća pr.n.e., te kao lijek

u knjizi „52 recepta“, iz 3. stoljeća pr.n.e. U starom Egiptu med je bio često korišteni

zaslađivač te je prisutan u mnogim zidnim crtežima. Pčela je u antičkoj Grčkoj bila sveti

simbol Artemide. Aristotel je prvi opisao proizvodnju meda, a Hipokrat je govorio o

njegovim ljekovitim svojstvima. Afrika također ima dugu tradiciju iskorištavanja pčela za

med u područjima Mediteranske Afrike i primitivnijim regijama na jugu [3]. U kršćanskoj

religiji postoje mnoge napomene o važnosti meda i pčela u Bibliji, a Islamska religija

predlaže korištenje meda u prehrambene i medicinske svrhe.

Znanost je do sada na više razina dokazala ljekovita svojstva meda koja su drevni pisci i

pjesnici opisivali [3].

Dugo je vremena u ljudskoj povijesti med bio važan izvor ugljikohidrata, te jedini široko

dostupan zaslađivač sve do početka industrijske prizvodnje šećera nakon 1800-tih godina.

1.2. Proizvodnja meda

Pčele proizvode med iz cvjetnog nektara koji sa cvijeta donose u košnicu. Cvjetni nektar je

vrlo vodenast te se lako kvari ukoliko ga pčela ne preradi u svom mednom želucu i iz njegane ispari suvišna voda [4]. Nektaru pčele dodaju i izlučevine posebnih žlijezda koje sadrže

enzime pomoću kojih se saharoza iz nektara cijepa na glukozu i fruktozu. Višak vode iz

nektara se uklanja prozračivanjem košnice [2]. Zgusnuti nektar se odlaže u saće gdje med

dalje dozrijeva. Tako med dobiva svoj osebujni okus i miris. Kada se dovol jno zgusne pčele

ga pokrivaju tankim slojem voska. Med može biti uniflorni i poliflorni ovisno o

sakupljenom nektaru s jednog ili više različitih vrsta cvijeća [1].


9/45

2

Slika 1. Artemida, grčka božica pčela [3].

Pored cvjetnog nektara pčele sakupljaju i slatke sokove na listovima i iglicama različ itih

biljaka, koje nazivamo medna rosa ili medljika. Uz same biljke, medljiku izlučuju lisne uši i

neki drugi insekti [4]. Na temelju opisanog razlikuje se nektarski med (cvjetni med) i med

medljikovac ili medun (ne-cvjetni med) [4]. Uvriježeni izraz kod pčelara za medljikovac

crnogorice je medun, a mogu se pronaći i izrazi šumski med ili mana.

1.3. Sastav meda

Med se sastoji većinom od vode i različitih šećera uz nešto vitamina i minerala (Tablica 1 i

2). Ostale sastojke meda čine aminokiseline, proteini, fenolni spojevi i mikronutrijenti.

Med sadrži sve glavne sastojke uravnoteženog obroka uz mikronutrijente koji potpomažu

probavu i apsorpciju dijetetskih sastojaka i onih koji su potrebni za metabolizam i tjelesne

funkcije [5].

Kod meduna je ustanovljen veći udio peludi biljaka koje ne proizvode nektar, ali manji

udio uobičajenih peludi nego kod cvjetnog meda. Skupljajući mednu rosu pčele ne dolaze

u dodir s cvijetom, a time ni s peludi. S druge strane, pelud beznektarnih biljaka, nošen

vjetrom dolazi do raznih dijelova drugih biljaka i dospijeva u mednu rosu. Medun od

cvjetnog meda razlikuje i viši pH te tamnija boja. Od značajnijih šećera, medun sadrži

manje monosaharida glukoze i fruktoze, kao i disaharida saharoze od cvjetnog meda, ali je


10/45

3

omjer fruktoza/glukoza kod meduna viši [6]. Medun sadrži više ukupnih trisaharida

(melecitoze) i puno više oligosaharida nego cvjetni med. Upravo taj sadržaj oligosaharida,

koji je najviši kod meduna, ima veliki utjecaj na funkciju probavnog sustava time što

oligosaharidi djeluju kao prebiotici. Kroz održavanje crijevne mikroflore medunpotpomaže nastanak i apsorpciju kratkolančanih masnih kiselina (butirat) i minerala

(kalcij) [1, 7].

Sastav meda je vrlo promjenjiv. Primarno ovisi o cvjetnom izvoru, ali veliki utjecaj imaju i

vanjski čimbenici poput zemljopisnog podneblja, godišnjeg doba, načina obrade i blizinevećih naseljenih mjesta ili industrije. Med sačinjava više od 180 sastojaka od ko jih mnogi

imaju antioksidativna svojstva. Neki od tih sastojaka su fenolne kiseline i flavonoidi,

određeni enzimi (glukoza oksidaza, katalaza) i aminokiseline. Važno je napomenuti

ovisnost sastava meda o biljnom podrijetlu, činjenica koja se rijetko uzima u obzir

prilikom nutritivnih i fizioloških ispitivanja [8].

Tablica 1. Nutritivni sastav meda (g/100g) [5].

Cvjetni med Medun

Raspon Srednja

vrijednost Raspon

Srednja

vrijednost

Voda 15 – 20 17,2 15 – 20 16,3Ukupni šećeri 79,7 80,5Monosaharidi

Fruktoza 30 – 45 38,2 28 – 40 31,8Glukoza 24 – 40 31-3 19 – 32 26,1

Disaharidi

Saharoza 0,1 – 4,8 0,7 0.1 – 4,7 0,5Ostali 2,0 – 8,0 5,0 1,0 – 6,0 4,0

Trisaharidi

Oligosaharidi 3,1 10,1

Erloza 0,5 – 6,0 0,8 0,1 – 6,0 0,1Melezitoza


11/45

4

Tablica 2. Kemijski elementi i vitamini nađeni u medu [5].

Minerali Količina (mg/100 g) Vitamini

Količina

(mg/100 g) Natrij (Na) 1,6 – 17 Tiamin (B1) 0,00 – 0,01Kalcij (Ca) 3 – 31 Riboflavin (B2) 0,01 – 0,02Kalij (K) 40 – 3500 Niacin (B3) 0,10 – 0,20Magnezij (Mg) 0,7 – 13 Pantotenska kiselina (B5) 0,02 – 0,11Fosfor (P) 2 – 15 Piridoksin (B6) 0,01 – 0,32Selen (Se) 0,002 – 0,01 Folna kiselina (B9) 0,002 – 0,01Bakar (Cu)

* 0,02 – 0,6 Askorbinska kiselina (C) 2,2 – 2,5

Željezo (Fe)* 0,03 – 4 Filokinon (K) 0,025Mangan (Mn)

* 0,02 – 2

Krom (Cr)*

0,01 – 0,3Cink (Zn)

* 0,05 – 2

*Teški metali

1.3.1. Ugljikohidrati

Med se sastoji uglavnom od ugljikohidrata koji čine čak 95% njegove suhe tvari. Njih

sačinjava kompleksna mješavina šećera, većinom neposredno probavljivih u tankom

crijevu. Mnogi od ovih šećera se ne nalaze u cvjetnom nektaru već oni nastaju za vrijeme

dozrijevanja meda u saću uz pčelinje enzime i kiseline. U procesu probave meda glukoza ifruktoza se vrlo brzo apsorbiraju u krvotok i mogu se iskoristiti za energetske potrebe

ljudskog tijela [8].

1.3.2. Bjelančevine, enzimi i aminokiseline

Med sadržava otprilike 0,5% bjelančevina, većinom enzime i slobodne aminokiseline. Tri

osnovna enzima meda su dijastaza (amilaza) koja razgrađuje škrob ili glikogen na manje

šećerne jedinice, invertaza (saharaza, α-glukozidaza) koja razgrađuje saharozu na glukozu

i fruktozu, te glukoza oksidaza koja proizvodi vodikov peroksid i glukonsku kiselinu od

glukoze.

Prolin čini 50% ukupnih slobodnih aminokiselina u medu, a osim njega nalazi se i 26

drugih aminokiselina čiji relativni udjeli ovise o podrijetlu meda (nektar ili medljika).

Glavne aminokiseline zajedničke medu različitog biljnog i zemljopisnog podrijetla su:

glutaminska kiselina (Glu), aspartanska kiselina (Asp), asparagin (Asn), serin (Ser),

glutamin (Gln), histidin (His), glicin (Gly), treonin (Thr), β-alanin (β-Ala), arginin (Arg), α-


12/45

5

alanin (α-Ala), γ-aminomaslačna kiselina (GABA), prolin (Pro), tirozin (Tyr), valin (Val),

metionin (Met), cistein (Cys), izoleucin (Ile), leucin (Leu), triptofan (Trp), fenilalanin (Phe),

ornitin (Orn) i lizin (Lys) [8].

1.3.3.

Vitamini, minerali i elementi u tragovima

Poznata je ovisnost prisutnosti mineralnih elemenata i elementa u tragovima u medu o

biljnom i zemljopisnom podrijetlu samog meda. Elementi u tragovima u medu imaju

važnu ulogu u biomedicinskim procesima. Dokazano je prisustvo vitamina B1, B2, B3, B6 i

K, ali općenito je količina vitamina i minerala u medu mala pa je njegov doprinos

preporučenom dnevnom unosu (RDI) takvih elemenata malen [8].

1.3.4.

Hlapive tvari

Profil hlapivih tvari je jedna od najsvojstvenijih karakteristika prehrambenog proizvoda.

On predstavlja svojevrsni „otisak prsta“ namirnice koji pomaže u određivanju njezinog

podrijetla. Identificirano je više od 500 različitih komponenti arome u različitim vrstama

meda. Hlapive tvari su u medu prisutne u vrlo malim koncentracijama i imaju različite

funkcije. Postoji nekoliko organskih spojeva koji bi mogli predstavljati markere specifičnih

mednih vrsta. Primjerice, med citrusa sadrži kombinaciju metil antranilata, hotrienola i 1-

p-mentenala; med eukaliptusa sadrži specifične mirisne spojeve - nonanol, nonanal i

nonanolnu kiselinu, a med vrijesa karakterizira visoki udio izoforona [8].

1.3.5. Polifenoli

Polifenoli su još jedna skupina spojeva važna za izgled i djelotvornost meda. Ova skupina

spojeva ima potencijalnu ulogu kao biokemijski marker za dokazivanje zemljopisnog

podrijetla i antioksidativne aktivnosti meda. Zastupljenost triju glavnih fenolnih skupina

(benzojevih kiselina, cinaminskih kiselina i flavonoida) ovisi o vrsti cvijeta od kojeg je med

napravljen. Flavonoidi (npr., kvercetin, luteolin, apigenin) su općenito najzastupljeniji u

cvjetnom medu. Glavni flavonoidi identificirani u različitim vrstama meda su prikazani u

Tablici 3 [8].


13/45

6

1.4. Učinci meda

U današnje vrijeme med postaje prihvatljivo i uvaženo ljekovito sredstvo, te ga sve više

preporučuju i koriste liječnici i javnost. Njegov terapijski potencijal potječe od

antimikrobnog, protuupalnog, antioksidativnog i imunostimulirajućeg djelovanja. Štoviše,

nutritivna vrijednost meda, učinkovitost u borbi protiv mikroorganizama koji su otporni

na antibiotike, lakoća primjene i izostanak nuspojava prilikom upotrebe su sve faktori koji

čine med vrlo dobrom alternativom ili dodatkom u svakodnevnoj profilaksi pa čak i

kemoterapiji [1].

1.4.1. Antimikrobno djelovanje

U terapiji je vrlo važno antimikrobno djelovanje, posebice u slučajevima kada je

imunološki sustav oslabljen i nedostatan za uklanjanje infekcije. Med je pokazao snažnu

učinkovitost protiv patoloških i nepatoloških mikroorganizama (kvasaca i gljivica), čak i

kod onih koji su razvili otpornost na antibiotike. Med djeluje protiv Bacillus subtilis,

Tablica 3. Fenolne kiseline i flavonoidi identificirani u medu različitih cvjetova [8].

Fenolne kiseline Flavonoidi

4-dimetilaminobenzojeva kiselina Apigenin

Kavena kiselina Genistein

p-kumarna kiselina Pinocembrin

Galna kiselina Tricetin

Valerinska (pentanska) kiselina Krizin

Siringinska kiselina Luteolin

Klorogenska kiselina Kvercetin 3-metil eter

Kamferol

Kamferol 8-OMe

Kamferol 3-OMe

Kvercetina

Kvercetin 3-OMe

Kvercetin 3,7-OMe

Kvercetin 3,3'-OMe

Kvercetin 7,3'-OMe

Galangin

Pinobanksin

Mircetina

Mircetin 3-OMe

Mircetin 3,7,4',5'-OMeaAglikoni pronađeni u peludi


14/45

7

Enterococci rezistentne na vankomicin (VRE), multirezistentne Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus rezistentnog na meticilin (MRSA) , Escherichia coli, Candida

albicans, Rubella virusa i Leishmania parazita. Takvo djelovanje pripisuje se određenim

svojstvima meda poput visoke osmolarnosti (nizak sadržaj vode), kiselosti (niski pH),prisutnosti vodikovog peroksida, lizozimskim i fenolnim sastavnicama [1, 8]. Med je visoko

zasićena otopina šećera koji imaju visoki afinitet za vodu te ostavljaju vrlo malo vode

mikroorganizmima na korištenje, koji posljedično dehidriraju i umiru. Također, prirodna

kiselost meda sprječava rast i razvoj mnogih patogena čiji je optimalni pH između 4,0-4,5.

No, najviše zasluge za antimikrobno djelovanje ima vodikov peroksid koji nastaje

oksidacijom glukoze prilikom razrjeđenja meda. Razgradnjom vodikovog peroksida

oslobađaju se visoko reaktivni slobodni radikali koji reagiraju i ubijaju bakterije.

Peroksidna aktivnost meda se može uništiti toplinom ili u prisutnosti katalaze.

Postoje vrste meda koje imaju mnogo stabilniju, ne-peroksidnu antibakterijsku aktivnost.

Takve vrste meda nazivaju se „ne-peroksidni med“ (novozelandski i australijski manuka

med proizveden od biljaka Leptospermum scoparium J.R.Forst. & G.Forst. i Leptospermum

plygalifolium Salisb.) koji zadržava antimikrobnu aktivnost čak i u prisutnosti katalaze. U

novozelandskom manuka medu pronađeni su fenolni ne-peroksidni antimikrobni sastojci

poput metil siringata i siringinske kiseline koji su se pokazali vrlo učinkoviti protiv MRSA-e.

Reakcijom vodikovog peroksida s benzojevim kiselinama nastaju peroksikiseline koje su

stabilnije i imaju jače antimikrobno djelovanje od samog vodikovog peroksida, a na njih

ne utječe katalaza [1].

Postoje pretpostavke o boljoj učinkovitosti ne-peroksidne antibakterijske aktivnosti, ali

ne-peroksidni sastojci su manje zastupljeni pa med valja čuvati na mračnom i hladnom

mjestu te iskoristiti dok je svjež [8]. Izolirani spojevi koji se smatraju nositeljima ne-

peroksidne antimikrobne aktivnosti su: flavonoidi, fenolne kiseline, askorbinska kiselina,

sastojci nalik karotenu, organske kiseline, neutralni lipidi, aminokiseline i bjelančevine [1].

1.4.2. Imunostimulirajuće djelovanje

Osim izravnog antimikrobnog djelovanja, med potpomaže borbu s infekcijom poticanjem

rada imunološkog sustava. Pokazalo se aktivirajuće djelovanje meda na limfocite T i B koji

posljedično aktiviraju neutrofile. Stimulacijom monocita pomoću meda in vitro dolazi do

oslobađanja citokina TNF-α, IL-1 i IL-6 koji djeluju kao glasnici upale i aktiviraju mnoge


15/45

8

aspekte imunološkog odgovora. Osiguravanjem zaliha glukoze med omogućava povećano

stanično disanje makrof aga koji proizvode vodikov peroksid, a osiguravanjem supstrata za

glikolizu makrofagima je omogućena proizvodnja energije čak i unutar oštećenih tkiva sa

smanjenom opskrbom kisika. Postoje pretpostavke o ulozi kiselosti meda u potpomaganjufagocitoze jer fagocitne vakuole u makrofagima imaju kiseli pH pomoću kojeg se

fagocitirane bakterije uništavaju [1].

1.4.3. Protuupalno djelovanje

Iako je upala prirodan i učinkovit odgovor tijela na infekciju, pretjerano ili oduženo upalno

stanje može naštetiti organizmu. Pri procesu upale leukociti stvaraju slobodne radikale u

inficiranim ili oštećenim tkivima. Slobodni radikali imaju vrlo štetno djelovanje, kako na

bakterije i stanice patogena tako i na stanice tijela. Mogu degradirati lipide, bjelančevine i

nukleinske kiseline koje su osnovne građevne jedinice svake stanice. Protuupalno

djelovanje meda se zasniva upravo na sprječavanju nastanka slobodnih radikala, odnosno,

antioksidativnom djelovanju [1].

1.4.4. Antitumorsko djelovanje

Medni oblozi pomažu kod pacijenata s kožnim tumorima nakon što uobičajeni pristupi,

poput terapije zračenjem, nemaju učinka [5]. Fizikalno-kemijsko djelovanje (smanjenje

dostupnosti kisika u okolini tumora, tj. antiangiogeno djelovanje) i medni antioksidansi

mogu spriječiti širenje metastatskih stanica. Saznanja ukazuju na komplementarno

djelovanje biljnih antioksidansa (fenolnih derivata) koji djeluju sinergistički s vodikovim

peroksidom, ali i neovisno o njemu prilikom borbe protiv tumorskih stanica [8].

1.4.5. Antioksidativno djelovanje

Prisutnost slobodnih radikala i reaktivnih kisikovih vrsta uzrokuje staničnu disfunkciju, atime i patogenezu raznih bolesti i starenje [5]. Med je antioksidans jer ima sposobnost

inaktivirati i spriječiti nastajanje slobodnih radikala. Antioksidativne tvari meda vežu

metalne ione u komplekse i time sprječavaju katalizu reakcija prilikom kojih nastaju

slobodni radikali. Veliki dio protuupalnog djelovanja meda je sadržan u antioksidativnom

djelovanju, ali i kad ne djeluje izravno na upalu, antioksidativni sastojci meda pronalaze

postojeće slobodne radikale u tijelu, hvataju ih i time smanjuju količinu štetnog učinka [1].

Antioksidativne tvari meda su flavonoidi, fenolne kiseline, askorbinska kiselina, tvari nalik


16/45

9

karotenoidima, organske kiseline, tvari koje nastaju Maillardovom reakcijom (reakcije

između aminokiselina i reducirajućih šećera gdje dolazi do nastajanja melanoidnih

pigmenata), aminokiseline, bjelančevine i mineralne tvari. Anitoksidativna aktivnost

nastaje kao rezultat istodobne aktivnosti svih navedenih sastavnica. Važno je napomenutisinergističko djelovanje kompleksa mineralnih tvari s fenolnim spojevima na

antioksidativni kapacitet jer mnogi metali djeluju kao donori elektrona te im se naboj lako

stabilizira unutar polifenolnih struktura. Antioksidativni kapacitet uvelike ovisi i o

cvjetnom izvoru meda zbog različitog sastava biljnih sekundarnih metabolita i enzimske

aktivnosti. Također, boja meda odražava sadržaj te je tamniji med bogatiji

antioksidansima [5]. Med povećava količinu antioksidativnih tvari u tijelu, odnosno

biodostupnost fenolnih sastavnica meda, povećava antioksidativno djelovanje plazme

povišenjem plazmatskog vitamina C, β-karotena, urične kiseline i glutation reduktaze.

Također, in vitro ispitivanjem zaštitnog djelovanja meda na stanice izložene stresu uočena

je inhibicija staničnog oštećenja, oksidacije stanične membrane i nastanka reaktivnih

kisikovih vrsta te uspostava unutarstaničnog glutationa.

Razvijene su mnoge metode za određivanje antioksidativne aktivnosti meda poput

određivanja aktivnih kisikovih vrsta, sposobnost hvatanja radikala, (1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil; DPPH•), sadržaj antioksidansa, enzimatsko i neenzimatsko mjerenje

sprječavanja peroksidacije lipida, određivanje redukcije željeza i antioksidativne aktivnosti

(FRAP) i test antioksidativnog kapaciteta Trolox ekvivalenta (TEAC) [8].

1.4.6. Ostala terapeutska svojstva

Medom je moguće tretirati razne vrste površinskih rana i već su dostupni medovi koji su

registrirani kao medicinski proizvodi za korištenje u profesionalnom liječenju rana u

Europi, Americi i Australiji. Med potiče stvaranje novih krvnih kapilara i rast fibroblasta

koji proizvode kolagenska vlakna te nadomještaju i očvršćuju vezivno tkivo unutar kože.

Poticanjem rasta površinskih, epitelnih stanica kože, med sprječava stvaranje ožiljkastog

tkiva i time umanjuje potrebu za kožnim presadcima čak i kod većih oštećenja [1]. Zbog

velikog udjela šećera med potiče apsorpciju natrija i vode iz crijeva, pomaže u obnovi

oštećene sluznice crijeva, potiče rast novog tkiva te djeluje protuupalno u probavnom

sustavu [1, 5]. Jedan vrlo važan učinak meda se pripisuje oligosaharidima koji djeluju kao

prebiotici, odnosno, neprobavljivi sastojci hrane koji doprinose ljudskom zdravlju time što


17/45

10

podržavaju i potiču rast i razvoj bifidobakterija i laktobacila u crijevima. Med korišten kao

zaslađivač fermentiranih mliječnih proizvoda ne sprječava rast bakterija kao što su

Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbruekii i

Bifidobacterium bifidum koje su prisutne u zdravom probavnom sustavu [1]. Med imazaštitni učinak na srce, krvožilni sustav i metaboličke procese pa zamjena rafiniranih

šećera medom u prehrani može biti jako blagotvorna [5, 8].

1.5. Određivanje antioksidativnih svojstava meda

U istraživanjima antioksidativne aktivnosti meda koristi se kombinacija analitičkih metoda

i testova kako bi dobiveni rezultati bili što potpuniji. U pokušaju standardizacije

antioksidativnih svojstava meda, Beretta i sur. (2005) primjenjuju kombinaciju

spektrofotometrijskih i fluorimetrijskih metoda te kemometriju [9].

1.5.1. Metode određivanja antioksidativnih svojstava meda

1.5.1.1. DPPH• test sadržaja antioksidanasa

DPPH• je stabilni slobodni radikal, ali i „hvatač“ drugih slobodnih radikala, koji ima

nespareni valentni elektron [10].

Slika 2. IUPAC naziv: di(fenil)-(2,4,6-trinitrofenil)iminoazanil radikal [11].

Reakcija redukcije DPPH• uz pomoć prirodnih antioksidanasa može se sažeti na slijedeći

način:

1) DPPH• + AOx → DPPH—H + A•

2) DPPH• + A• → DPPH—A

3) A• + A• → A—A

gdje je AOx antioksidans koji se nalazi u medu, a A• je radikal koji nastaje oksidacijom

molekule antioksidansa i koji može reagirati samo po principu radikal—radikal čime


18/45

11

nastaju stabilne molekule radikalnim disproporcioniranjem (poništavanjem radikala među

sobom) [12, 13].

Određivanje antiradikalne aktivnosti pomoću DPPH• se temelji na prijenosu elektrona.

Otopina DPPH• radikala ima ljubičastu boju, na sobnoj temperaturi je relativno stabilan te je njegov maksimum apsorpcije na 515 nm. U prisutnosti molekule antioksidansa

(primanjem elektrona) radikal prelazi u neradikalni oblik koji daje žutu boju otopine te se

vrijednost reakcije može izmjeriti spektrofotometrijski [14]. Ispitivanje antioksidativne

aktivnosti hvatanja DPPH• radikala preporučeno je raditi s koncentracijom DPPH• od 50

μM jer previše radikala uzrokuje pogreške u spektrofotometrijskom mjerenju. Ovisno o

topljivosti ispitivane tvari i zbog osjetljivosti apsorbancije DPPH• na pH, otopina se može

raditi s metanolom ili puferiranim metanolom. Test bi se trebao odvijati u tamnoj ili

slabije osvijetljenoj prostoriji jer apsorpcija ovisi i o količini svjetlosti [10]. Antioksidativna

aktivnost uzorka se izračunava kao postotak gubitka signala (I%), odnosno,

antioksidativna aktivnost radikala, prema slijedećoj jednadžbi (1):

% ()−()() ×100 (1)

gdje je AC (0) apsorpcija DPPH• otopine, a AA(t) apsorpcija otopine radikala i uzorka meda

u vremenu t [15].

Slika 3. Prikaz promjene boje DPPH• radikala u reakciji s antioksidansom i grafa s

apsorpcijskim maksimumom [16].


19/45

12

1.5.1.2. ABTS•+

test aktivnosti antioksidanasa

Prvobitna zamisao ovog testa bila je aktivacija metmioglobina pomoću vodikovog

peroksida u prisutnosti ABTS-a [2,2'-azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina)]

kako bi se stvorio radikalni kation na kojeg bi djelovali antioksidansi prisutni u uzorku.Novija, dorađena metoda se temelji na metodi izravnog uvođenja stabilnog radikala prije

reakcije s uzorkom antioksidansa. Reakcijom ABTS-a s kalijevim persulfatom (K2S2O8)

nastaje kromoforni ABTS•+

radikal koji daje plavo-zelenu boju otopine s maksimumima

apsorpcije na valnim duljinama od 415, 645, 734 i 815 nm. Dodatkom antioksidanasa u

pripremljenu otopinu oni reduciraju ABTS•+ u ABTS čime se gubi obojenje. Razina

obezbojenja odražava postotak inhibicije ABTS•+ radikala i određuje se kao funkcija

koncentracije i vremena te uspoređuje sa standardom ekvivalenta. Ova metoda je

primjenjiva za antioksidanse topive u vodi i one topive u mastima, čiste tv ari i ekstrakte

prehrambenih proizvoda [17, 18].

1.5.1.3. FRAP - test antioksidativne sposobnosti redukcije željeza

FRAP (engl. Ferric reducing antioxidant power ) test temelji se na sposobnosti ispitivane

tvari, odnosno antioksidansa, da reducira željezo unutar spoja željezo-2,4,6-tripiridil-s-

triazina (TPTZ) iz feri (Fe

3+

) u fero (Fe

2+

) oblik. Pri niskom pH se razvija intenzivno plavoobojen kompleksni spoj ferotripiridiltriazina čiji je apsorpcijski maksimum na 593 nm.

Rezultati se izražavaju kao μmol Fe2+/mL uzorka [19].

1.5.1.4. Antioksidativni kapacitet Trolox ekvivalenta

TEAC (engl. Trolox equivalent antioxidant capacity ) je metoda mjerenja antioksidativnog

kapaciteta neke tvari u usporedbi s Trolox standardom. Trolox standard je analog

vitamina E, tokoferola. Najčešće se ovaj standard koristi u ABTS•+ testu obezbojenja,

DPPH• i FRAP testu. Često se koristi za mjerenje antioksidativnog kapaciteta

prehrambenih proizvoda, pića i dodataka prehrani [20].

1.5.1.5. Ukupni sastav fenola – metoda ekvivalenta galne kiseline

Usporedbenim ispitivanjima potvrđena je pozitivna korelacija između sadržaja fenola u

medu i njegove antioksidativne aktivnosti. Određivanje sastava fenola provodi se prema

Folin-Ciocâlteu metodi koja se temelji na reakciji Folin-Ciocâlteu reagensa s fenolnim i

polifenolnim antioksidansima u ispitivanom uzorku. Folin-Ciocâlteu reagens je mješavina


20/45

13

fosfomolibdata i fosfovolframata čija redukcija dovodi do stvaranja kromogena koji oboje

otopinu plavo i mogu se spektrofotometrijski kvantificirati. Boja nastaje zbog prijenosa

elektrona pri bazičnom pH pri čemu se reduciraju kompleksi

fosfomolibdenske/fosfovolframatne kiseline te nastaju kromogeni u kojima metali imajunižu valenciju [18, 21].

1.5.1.6. Intenzitet boje – apsorpcija na 450 nm (ABS450)

Boja meda djelomično odražava sastav pigmenata koji posjeduju antioksidativne

karakteristike poput karotenoida i flavonoida, stoga je boja dobar okvirni indikator

antioksidativne aktivnosti meda [9]. Apsorpcija meda se određuje kao razlika

spektrofotometrijske apsorbancije pri 450 i 720 nm, a izražava se u mAU (engl. mili-

absorbance unit ) [18].

1.6. Kinetika kemijske reakcije

Kemijska kinetika je grana fizikalne kemije koja se bavi proučavanjem brzine kemijskih

reakcija. Kemijska reakcija i njezina brzina ovisi o varijablama od kojih se neke mogu

kontrolirati poput tlaka, temperature, prisutnosti katalizatora te se time može optimizirati

brzina reakcije odgovarajućim izborom uvjeta. Prvi korak u analizi kinetike reakcije je

određivanje stehiometrije reakcije te identifikacija popratnih reakcija koje se odvijaju

istovremeno. Osnovni čimbenici kemijske kinetike su koncentracije reaktanata i

produkata u različitim vremenima nakon početka reakcije. Brzina kemijske reakcije često

ovisi o temperaturi pa se prilikom određivanja brzine kemijske reakcije treba održavati

konstantnom kako bi rezultati bili pouzdani. Postoje prilike kada se primjenjuju

neizotermalni uvjeti, primjerice prilikom određivanja starenja ili ubrzanog starenjaprehrambenih proizvoda i lijekova [22].

1.6.1. Brzina reakcije

Brzina reakcije ovisi o sastavu i temperaturi reakcijske smjese. Trenutna brzina potrošnje

reaktanta u vremenu t određena je jednadžbom -d[R]/dt , a brzina nastanka produkata

jednadžbom d[P]/dt .

Definiranjem trenutne brzine u obliku tangente na krivulju prikazuje se promjena

koncentracije u vremenu (Slika 4).


21/45

14

Za negativne nagibe (reaktanti), predznak se mijenja prilikom određivanja brzine reakcije

kako bi sve brzine reakcije bile pozitivne.

Slika 4. Grafičko određivanje trenutne brzine reakcije za reaktante pomoću tangente na

krivulju [22].

Za reakciju, npr. A + 2B --> 3C + D, iz stehiometrije proizlazi izraz:

[] 3 []

[] 2 [] (2)

iz kojeg je vidljivo kako unutar jedne kemijske reakcije postoji više različitih brzina te je

brzina reakcije funkcija vremena. Kako bi se izbjeglo korištenje više brzina za opis iste

reakcije brzina reakcije može se prikazati i kroz promjenu dosega reakcije. Promjena

dosega reakcije je izražena jednadžbom (3):

(3)

gdje je: ni količina proučavanog reaktanta ili produkta, a v i stehiometrijski broj istog

reaktanta ili produkta. Brzina reakcije je onda: , odnosno promjena dosega reakcijeu vremenu. Brzina reakcije izražava se jedinicama molarne koncentracije po vremenu

(mol dm-3

s-1

) [22].

1.6.2. Zakoni brzine i konstante brzine reakcije

Brzina reakcije je često proporcionalna potenciranim koncentracijama reaktanata.

Stehiometrijski broj reaktanta određuje potenciju koncentracije. Brzina reakcije može biti

proporcionalna molarnim koncentracijama dvaju reaktanata, A i B, na slijedeći način:


22/45

15

[ ][]2 (4)gdje je v brzina reakcije, k konstanta brzine reakcije, [A] koncentracija reaktanta A na prvu

potenciju, a [B]2 koncentracija reaktanta B na drugu potenciju. Konstanta brzine reakcije

je neovisna o koncentracijama reaktanata, ali ovisi o temperaturi. Ukoliko je jednadžba

koja povezuje brzinu reakcije i koncentraciju ili parcijalni tlak (za plinove) sudionika

eksperimentalno određena za reakciju tada se naziva zakonom brzine. Zakon brzine

reakcije može, ali ne mora uvijek odražavati kemijsku jednadžbu reakcije. Poznavajući

zakon brzine reakcije i vrijednost konstante brzine moguće je predvidjeti brzinu reakcije iz

sastava reakcijske otopine. Isto tako, moguće je predvidjeti sastav reakcijske otopine u

kasnijoj fazi reakcije. Zakon brzine daje uvid u mehanizam reakcije jer svaki mehanizam

mora biti dosljedan sa zakonom brzine iste reakcije [22].

1.6.3. Red reakcije

Parcijalni red reakcije po nekom sudioniku je njegov eksponent u zakonu brzine. U reakciji

koju određuje zakon brzine [ ][]2 reakcija je prvog reda za A i drugog reda za B.Ukupni red reakcije je zbroj pojedinačnih redova, odnosno eksponenata, a + b + ···, pa je

navedena reakcija ukupno trećeg reda. Postoje reakcije nultog reda čija je brzina neovisna

o koncentraciji reaktanta, uz uvjet da je reaktant prisutan. U tom slučaju v = k , odnosno

brzina reakcije je jednaka konstanti brzine reakcije. Reakcije nultog reda su česte kod

reakcija kod kojih dolazi do zasićenja reakcijske površine ili enzimskih reakcija kod kojih je

supstrat u suvišku naspram enzima.

Pseudo-red reakcije je reducirani red koji se određuje kada je jedan sudionik u suvišku

naspram drugih jer tada koncentracija sudionika koji je u suvišku postaje konstanta.

[22].

1.6.4. Određivanje zakona brzine

Ovisnost brzine reakcije o koncentraciji pojedinog reaktanta može se odrediti njihovom

pojedinačnom izolacijom na način da svi sudionici, osim željenog reaktanta, budu prisutni

u suvišku. Za reakciju s reaktantima A i B, kako bi se odredila brzina reakcije u odnosu na

koncentraciju [A] potrebno je osigurati [B] u suvišku čime [B] postaje konstanta. Na ovaj

način reakcija koja je ukupno bila drugog reda (prvog reda po A + prvog reda po B) postaje

reakcija pseudo-prvog reda.


23/45

16

Metodom početnih brzina, mjeri se brzina za nekoliko različitih koncentracija reaktanata

na početku reakcije. Ukoliko je, primjerice, [ ] onda je početna brzina, v 0 , određena početnom koncentracijom reaktanta A, odnosno [].Logaritmiranjem navedenog izraza dobiva se jednadžba (5):

[ ] (5)Za seriju primijenjenih vrijednosti početnih koncentracija, graf logaritama početnih brzina

u odnosu na logaritme početnih koncentracija reaktanta A trebao bi biti pravac s nagibom

a koji ujedno određuje i red reakcije s obzirom na reaktant A. Navedenom metodom se

koji put ne može odrediti cijeli zakon brzine jer nastali produkti mogu sudjelovati u

reakciji i utjecati na njezinu brzinu. U tom slučaju se zakon brzine podešava predviđanjemkoncentracija prema pretpostavljenom zakonu brzine te usporedbom predviđenih s

eksperimentalno dobivenim vrijednostima [22].

1.6.5. Integrirani zakoni brzine

Zakoni brzine su diferencijalne jednadžbe. Integriranjem zakona brzine dobivaju se

funkcije ovisnosti koncentracije sudionika reakcije o vremenu.

Reakcije prvog reda:

Za zakon brzine reakcije prvog reda,

[] [] (6)

Integrirani oblik je:

[][] [ ] [ ]− (7)

gdje je [ ] početna koncentracija A u vremenu 0.Graf ovisnosti [][] o t prema jednadžbi (6) daje pravac nagiba –k. Jednadžba (7) ukazujena eksponencijalno smanjenje koncentracije reaktanata tijekom vremena brzinom koja je

određena s k , u reakciji prvog reda.

Reakcije drugog reda:

Za zakon brzine reakcije drugog reda,


24/45

17

[] [ ]2, (8)

integrirani oblik može biti jedna od slijedećih formulacija:

[]

(9)

[ ] []+[] (10)

gdje je [ ] početna koncentracije A u vremenu 0. Iz Kako bi se testirala reakcija nazakon brzine drugog reda potrebno je grafički prikazati ovisnost 1/[A] o t te očekivati

pravac s nagibom k . Jednadžba (10) integriranog zakona brzine drugog reda omogućava

predviđanje koncentracije sudionika A u bilo kojem vremenu nakon početka reakcije. Iz

nje je vidljivo kako koncentracija A prilazi nuli sporije nego u reakciji prvog reda iste

početne brzine [22].

1.6.6. Temperaturna ovisnost brzine reakcije

Konstante brzine većine reakcija se povećavaju s povišenjem temperature.

Eksperimentalno je otkriveno da je graf ovisnosti ln(k ) o 1/T linearan. Matematički se to

prikazuje logaritmiranom Arrhenius-ovom jednadžbom (11):

l n (11)

gdje je k konstanta brzine reakcije, A faktor frekvencije (pre-eksponencijalni faktor) koji

predstavlja odsječak na osi x kada je 1/T = 0 (pri beskonačnoj temperaturi), E a energija

aktivacije koja predstavlja nagib pravca, R opća plinska konstanta i T temperatura u

stupnjevima Kelvin. Parametri A i E a nazivaju se još i Arrhenius-ovi parametri.

Što je viša E a to je veća ovisnost konstante brzine o temperaturi, odnosno, nagib pravca je

veći. Ukoliko je energija aktivacije jednaka nuli tada je brzina reakcije u potpunosti

neovisna o temperaturi. Ukoliko je energija aktivacije reakcije negativna brzina reakcije se

smanjuje povišenjem temperature. Takva priroda reakcije upućuje na kompleksni

reakcijski mehanizam.

Ovisnost nekih reakcija o temperaturi ne uklapa se u Arrhenius-ovu jednadžbu, odnosno,

graf ovisnosti ln(k ) o 1/T nije linearan. Bez obzira, moguće je odrediti energiju aktivacije

pri svim temperaturama prema slijedećoj jednadžbi (12):


25/45

18

2 (12)

Ova definicija se svodi na prijašnji izraz (nagib pravca) za energiju aktivacije koja je

neovisna o temperaturi. Jednadžba (12) je općenitija od jednadžbe (11) jer dozvoljava

očitanje E a iz nagiba pravca pri željenoj temperaturi čak i kada Arrhenius-ova jednadžba

nije pravac. Ukoliko se reakcija ne uklapa u Arrhenius-ovu jednadžbu to može biti naznaka

snažnog utjecaja kvantne mehanike na reakciju [22].

1.7. Matematičko modeliranje kemijskih reakcija

Modeliranje kemijskih reakcija je određivanje jednadžbi brzina reakcija koje unutar

velikog razmjera obuhvaćaju niz modela vjerojatnosti manjih razmjera. Sukladno

tome, postoje tri opće ideje vezane uz matematičko modeliranje kemijskih reakcija:

1. Matematički modeli se moraju temeljiti na pretpostavkama modeliranja, a

prikladnost modela u potpunosti ovisi o prikladnosti tih pretpostavki.

2. Kompleksni sustavi su većinom preskupi da bi se simulirali u potpunosti. Stoga su

potrebni višerazmjerni modeli i odgovarajući kompjutacijski algoritmi koji mogu

operirati na najkrupnijoj razini koja je moguća u cilju povećanja učinkovitosti.

3. Diferencijalne determinističke jednadžbe kontinuirane vrijednosti obično nastaju iz

suptilnih modela vjerojatnosti temeljenih na česticama te određivanje, s obzirom na ta

dva ekstrema, zahtijeva vještinu i razumijevanje.

Općenito, prilikom određivanja matematičkog modela za opis određene kemijske reakcije

radi se o procesu koji uključuje N različitih vrsta molekula ili kemijskih vrsta (sudionika

reakcije). Ove molekule mogu sudjelovati u jednoj ili više M vrsta kemijskih reakcija.

Primjerice, molekula A i molekula B mogu reagirati kako bi nastala molekula C . Moguće je

odrediti pozicije i brzine molekula te dopustiti razvoj sustava sukladno sa zakonima fizike

uz praćenje sudara molekula i reakcija koje iz toga rezultiraju . Modeliranjem pristup se

svodi na ignoriranje prostornih formacija i jednostavno praćenje broja molekula svake

vrste. Ovakvo pojednostavljenje je vjerodostojno ukoliko je osiguran dobro izmiješan

sustav u kojem je svaka molekula uniformno raspoređena kroz prostornu domenu. Uz to,

pretpostavlja se toplinska ravnoteža i konstantni volumen prostorne domene [23].


26/45


27/45

20

gdje je At koncentracija reaktanta u vremenu t , A0 početna koncentracija reaktanta, k 1

konstanta brzine reakcije, a c odsječak na osi x kada je y = 0. Početna koncentracija

reaktanata određuje brzinu reakcije [25].

1.7.2. Bifazni matematički modeli

1.7.2.1. Model Weibull-ove raspodjele

Model Weibull-ove raspodjele je prikladan za opis mnogih prirodnih događaja zbog svoje

svestranosti. Ovisno o vrijednostima parametara, Weibull-ova raspodjela se može

primijeniti kao model za mnoga ponašanja vezana uz životne procese. Postoje tri

formacije Weibull-ove raspodjele:

Najopćenitiji oblik s tri nepoznata parametra: α parametar oblika koji određuje oblik

funkcije brzine, β parametar lokacije koji postavlja lokaciju za varijablu t i γ koji

definira odgovarajuću nultu točku.

S dva nepoznata parametra, gdje se uzima 0:

[−(∙)

] (17) gdje je At koncentracija reaktanata u vremenu t , A0 početna koncentracija

reaktanata, a nepoznati parametri: k α parametar oblika koji određuje oblik funkcije

brzine i β parametar lokacije koji određuje lokaciju za varijablu t.

S jednim nepoznatim parametrom gdje se uzima 0 i pretpostavlja vrijednost za, a nepoznati parametar je β parametar lokacije koji postavljalokaciju za varijablu t [26].

1.7.2.2. Gustafson-Holdenov model

Gustafson-Holdenov model je nelinearni model koji se temelji na pretpostavci prostorno

promjenjive konstante brzine reakcije prvog reda, a koja se reducira u linearnu ukoliko je

konstanta brzine reakcije prostorno uniformna. Jednadžba (18) Gustafson-Holdenovog

modela je:

( 1)

−

(18)


28/45

21

gdje je At koncentracija reaktanata u vremenu t , A0 početna koncentracija reaktanata, k α

parametar oblika, a β parametar lokacije [27].


29/45

22

2. CILJ RADA

Prirodni antioksidansi imaju značajnu ulogu u borbi protiv slobodnih radikala prisutnih u

organizmu te djelomičnom sprječavanju njihovog štetnog djelovanja. U medu su prisutni

enzimski i neenzimski antioksidansi, a proučavanje mehanizma njihovog djelovanja od

velike je važnosti. Izlaganjem meda vanjskim čimbenicima kao što su sv jetlost i

temperatura (iznad 40°C) može se utjecati na gubitak antioksidativne aktivnosti pa se

proučavanje kinetike reakcije može primijeniti u cilju očuvanja antioksidativne aktivnosti.

Cilj ovog rada bio je istražiti kinetiku antiradikalnog djelovanja (reakcija hvatanja DPPH•

radikala) meduna jele ( Abies alba Mill.) na različitim temperaturama.

Spektrofotometrijskim mjerenjem odredit će se vrijednosti gubitka signala DPPH• radikala

u vremenu od 60 min na temperaturama 25 ⁰C, 35 ⁰C i 50 ⁰C i time eksperimentalno

odrediti ovisnost antiradikalne aktivnosti meduna o temperaturi. Primjenjujući različite

matematičke modele dobivene eksperimentalne vrijednosti antiradikalnog djelovanja

meduna analizirat će se različitim monofaznim i bifaznim modelima za opis kinetike.

Uzimajući vrijednosti konstante modela koji optimalno zadovoljava eksperimentalne

vrijednosti odredit će se vrijednost energije aktivacije primjenom Arrhenius-ove

jednadžbe.


30/45

23

3. METODE I MATERIJALI

3.1. Uzorci i instrumenti

Korišten je medun jele ( Abies alba Mill.) iz Gorskog kotara, proizvođača „Gorski d.o.o“ iz

Fužina. Spektrofotometrijsko mjerenje (Slika 5) je provedeno Uv-Vis spektrofotometrom

Varian Cary 100 Bio (Agilent technologies, Inc., CA, USA).

Slika 5. UV-Vis spektrofotometar.

3.2. Antiradikalna aktivnost i analiza kinetike nestanka DPPH•

Antiradikalna aktivnost se odredila DPPH• testom na temelju hvatanja DPPH• radikala

(Sigma-Aldrich Chemie, Germany) pri tri različite temperature.

Alikvot od 3 mL DPPH• (0,1 mM otopine u metanolu; Kemika, Zagreb) se promiješao sa 1

mL otopine meda (5% w/v u destiliranoj vodi). Apsorpcija se mjerila spektrofotometrom

na 515 nm pri temperaturama od 25 ⁰C, 35 ⁰C i 50 ⁰C. DPPH• test se proveo u duplikatu

za svaku temperaturu. Postotak inhibicije DPPH• radikala (I%) je izračunat prema formuli

(1) iz uvodnog dijela.

Kako bi se opisala kinetika eliminacije DPPH• radikala u prisutnosti uzoraka meda pri

različitim temperaturama mjerilo se smanjenje apsorpcije na 515 nm, 60 min u


31/45

24

intervalima od 1 min. Postotak inhibicije DPPH• radikala (I%) u svakoj minuti je izračunat

prema jednadžbi (1). Kinetički parametri su izračunati korištenjem pet monofaznih i

bifaznih matematičkih modela.

Predviđene teoretske vrijednosti dobivene su matematičkim modelima uporabom

procedura nelinearne regresije koje su dostupne u sastavu programskog paketa Wolfram

Research Mathematica® Verzija 7.0 (WolframResearch Co., IL, USA).

3.3. Statistička analiza

U ovom radu korišteni su statistički pokazatelji: korelacijski koeficijent (R2), koeficijent

varijacije korijena srednjeg kvadrata odstupanja (engl. Scaled Root Mean Squared Error -

SRMSE) i pogreška hi-kvadrat testa χ 2.

SRMSE x,̅̅ √ ∑ (x,i-d,i)i

N (19)

2

pogreška 100 ∙ √

∑(,−,)

,̅=

(20)

gdje su Mexp i Mpred eksperimentalne i pretpostavljene vrijednosti dobivene za pojedini

matematički model, ,̅ srednja vrijednost svih eksperimentalno dobivenih vrijednosti,a N broj mjerenja.


32/45

25

4. REZULTATI

U ovom radu provedeno je istraživanje antiradikalne aktivnosti, odnosno reakcije

hvatanja DPPH• radikala u prisustvu meduna jele Abies alba Mill. Na temelju

spektrofotometrijskog mjerenja gubitka signala na 515 nm tijekom 60 minuta praćen je

tijek reakcije, a % gubitka signala preračunat je na temelju izraza (1).

Gubitak DPPH• signala se značajno povećao povišenjem temperature kao što je vidljivo na

Slici 6. Konačni gubitak signala pri temperaturi 25 ⁰C bio je 46%, pri 35 ⁰C 50%, a pri 50 ⁰C

68%.

Slika 6. Grafički prikaz gubitka signala DPPH• radikala u prisutnosti meduna jele ( Abies

alba Mill.) pri temperaturama 25 ⁰C, 35 ⁰C i 50 ⁰C.

Uočen je nagli porast postotka gubitka DPPH• signala u prvim minutama reakcije i nešto

sporiji, ali dosljedni gubitak signala ostatak vremena.

Eskperimentalno dobivene vrijednosti testirane su primjenom matematičkih kinetičkih

modela. Analizirani su monofazni (nulti red, prvi red i logaritamski model) i bifazni modeli

(model Weibull-ove raspodjele te Gustafson-Holdenov model), a rezultati su prikazani u

Tablicama 4 i 5. Najbolje slaganje eksperimentalnih i vrijednosti dobivenih modeliranjem

dobiveno je za bifazne modele što je vidljivo na osnovu visokih vrijednosti R

2

. Za model

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60

G u

b i t a k D P P H s i g n a l a / %

Vrijeme t/min

25 ˚C

35 ˚C

50 ˚C


33/45

26

Weibull-ove raspodjele dobivene su vrijednosti R2

= 0,9996 za 25 ⁰C; 0,9998 za 35 ⁰C i

0,9993 za 50 ⁰C, a za bifazni Gustafson-Holdenov model R2 = 0,9997 za 25 ⁰C; 0,9996 za 35

⁰C i 0,9996 za 50 ⁰C.

Tablica 4. Monofazni matematički modeli analize kinetike hvatanja DPPH• radikala u

prisustvu meduna jele ( Abies alba Mill.).

Model/parametriTemperatura/C

25 35 50

Model nultog reda

k0 -0,0039 -0,0051 -0,0080

R2 0,9962 0,9956 0,9857

SRMSE 0,0624 0,0671 0,1253

χ2 – pogreška 5,5190 5,9394 11,0842

Model prvog reda

k1 0,0065 0,0088 0,0180

R2 0,9966 0,9966 0,9924

SRMSE 0,0588 0,0595 0,0916

χ2 – pogreška 5,2056 5,2599 8,1067

Logaritamski model

k1 0,0702 0,0581 0,0588

R2 0,9984 0,9989 0,9982

SRMSE 0,0402 0,0339 0,0444

χ2 – pogreška 3,5835 3,0250 3,9561


34/45

27

Tablica 5. Bifazni matematički modeli analize kinetike hvatanja DPPH• radikala u prisustvu

meduna jele ( Abies alba Mill.).

Model/parametri Temperatura/C

25 35 50

Model Weibull-ove raspodjele

kα 19,0293 17,4272 8,6510

Β -0,1941 -0,2733 -0,4649

R2 0,9998 0,9998 0,9993

SRMSE 0,0128 0,0150 0,0284

χ2 – pogreška 1,1354 1,3231 2,5096

Gustafson-Holdenov model

kα 0,1097 0,1820 0,4490

Β 0,3118 1,9409 5,9630

R2 0,9997 0,9996 0,9996

SRMSE 0,0183 0,0190 0,0209

χ2 – pogreška 1,6285 1,6894 1,8619

Dobro slaganje bifaznih modela s eksperimentalnim vrijednostima pokazuju i niže

vrijednosti koeficijenta varijacije korijena srednjeg kvadrata odstupanja. Dobivene

vrijednosti SRMSE za model Weibull-ove raspodjele iznosile su 0,0128 za 25 ⁰C; 0,0150 za

35 ⁰C i 0,0284 za 50 ⁰C, a za Gustafson-Holdenov model 0,0183 za 25 ⁰C; 0,0190 za 35 ⁰C i

0,0209 za 50 ⁰C. Pored toga, dobivene su i niže vrijednosti pogreške hi-kvadrat testa ( χ 2 =

1,1354 za 25 ⁰C; 1,3231 za 35 ⁰C i 2,5096 za 50 ⁰C za model Weibull-ove raspodjele i1,6285 za 25 ⁰C; 1,6894 za 35 ⁰C i 1,8619 za 50 ⁰C za Gustafson-Holdenov model, Tablica

5). Slaganje eksperimentalnih vrijednosti s vrijednostima dobivenim matematičkim

modeliranjem prikazano je na Slikama 7-9.


35/45

28

Slika 7. Usporedba eksperimentalnih vrijednosti i vrijednosti dobivenih Gustafson-

Holdenovim modelom za temperaturu 25 ⁰C.



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60 70

P r e o s t a l i D

P P H •

Vrijeme t (min)

25˚C predviđeno

25˚C… 25 ⁰C izmjereno 25 ⁰C predviđeno

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60 70

P r e o s t

a l i D P P H •

Vrijeme t (min)

35˚C predviđeno

35˚C izmjereno

35 ⁰C predviđeno

35 ⁰C izmjereno


36/45

29



S obzirom na idealno slaganje eksperimentalno dobivenih vrijednosti s oba bifazna

modela, za daljnju analizu kinetičkih parametara (energije aktivacije) odabran je

Gustafson-Holdenov model. To je iz razloga što se za model Weibull-ove raspodjele

konstante brzine reakcije nisu mijenjale proporcionalno s temperaturom, a navedeni

model nije definiran u nuli što predstavlja njegov nedostatak. Za određivanje energije

aktivacije (E a) primijenjena je logaritmirana Arrhenius-ova jednadžba (11).

Na temelju vrijednosti temperature i parametra oblika (k α) koji utječe na brzinu reakcije i

time može zamijeniti konstantu brzine kemijske reakcije, izračunate su vrijednosti za

grafički prikaz ovisnosti ln(k α) o 1/T u cilju dobivanja vrijednosti energije aktivacije (Slika

6).

Tablica 6. Podaci za izračun energije aktivacije (Ea).

T (K) 1/T × 10-3 (K-1) kα (s-2) ln(k α)

298 3,36 1,10 -2,21

308 3,25 1,82 -1,70

323 3,10 4,49 -0,80

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 10 20 30 40 50 60 70

P r e o s t a l i

D P P H •

Vrijeme t/min

50˚C predviđeno

50˚C izmjereno

50 ⁰C predviđeno

50 ⁰C izmjereno


37/45

30

Prema logaritmiranom Arrhenius-ovom izrazu i temeljem podataka iz Tablice 6 izrađen je

graf ovisnosti ln(k α) o 1/T za sve tri temperature (Slika 10). Na grafu je uočljiva linearna

ovisnost parametara s visokom R2 vrijednošću (R2 = 0,9953).

Energija aktivacije izračunata je prema jednadžbi linearne funkcije dobivene na osnovuovisnosti vrijednosti ln(k α) o 1/T u kojoj nagib funkcije predstavlja energiju aktivacije.

Slika 10. Ovisnost ln(k α ) o 1/T za temperature 25 ⁰C, 35 ⁰C i 50 ⁰C za reakciju hvatanja

DPPH• radikala u prisustvu meduna jele ( Abies alba Mill.). Vrijednost konstante kemijske

reakcije dobivena je iz odabranog Gustafson-Holdenovog kinetičkog modela.

R² = 0,9953-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,00305 0,0031 0,00315 0,0032 0,00325 0,0033 0,00335 0,0034

l n ( k

α )

1/T [K-1]


38/45

31

5. RASPRAVA

Za analizu kinetike hvatanja DPPH• radikala primijenjeno je nekoliko matematičkih

monofaznih (model nultog i prvog reda te logaritamski) [28] i bifaznih modela (model

Weibull-ove raspodjele i Gustafson-Holdenov model) od kojih su se bifazni modeli

pokazali prikladniji za predviđanje nestanka DPPH• radikala pri različitim temperaturama

od 25 ⁰C, 35 ⁰C i 50 ⁰C [29, 30].

Bifazni modeli uzimaju u obzir postupnost antiradikalne aktivnosti koja objedinjuje dvije

zasebne faze, prvu brzu i drugu sporiju fazu. Ovi rezultati sukladni su s rezultatima

postojećih studija [31, 32] u kojima su se ispitivale kinetike reakcija uzoraka propolisa i

polifenolnih sastojaka vina DPPH• metodom. U obje navedene studije, uzorci su pokazali

bifaznu prirodu reagiranja na radikal s time da je prva faza bila brža, a druga sporija.

Razlog bifazne prirode antiradikalne aktivnosti moguće je objasniti raznovrsnošću

antioksidativnih sastavnica. Skupina polifenolnih spojeva, sama za sebe, obuhvaća veliki

broj različitih spojeva od kojih neki brzo reagiraju na prisutnost radikala, dok drugi

reagiraju sporije [32]. Osim polifenola, u medu nalazimo još mnoge skupine

antioksidativnih spojeva od kojih svaki ima različitu brzinu reagiranja na radikale, te iz tog

razloga dolazi do prve, brze faze prilikom koje su aktivni „brzi“ antioksidansi, i druge,

spori je faze prilikom koje djeluju „spori“ antioksidativni spojevi. Osim bifazne prirode

reakcije, primijećeno je znatno intenzivnije antioksidativno djelovanje u prvih nekoliko

minuta odvijanja reakcije. Razlog tomu leži u opisanom mehanizmu inhibicije radikal a od

strane antioksidansa. Naime, antioksidans daje svoj proton prisutnom radikalu kako bi ga

neutralizirao. Zbog gubitka protona, spoj koji je nekada bio antioksidans postaje radikal,

ali takav može sudjelovati isključivo u reakcijama disproporcion iranja, dakle daljnjoj

neutralizaciji ostalih prisutnih radikala. Ovim mehanizmom postiže se nagli skok u početkureakcije jer se naglo gubi veliki broj radikala zbog čega se pojedinačne reakcije hvatanja

radikala nastavljaju odvijati nešto manjom brzinom [12, 13].

Krajnji gubitak signala, na kraju druge faze, bio je najveći na 50 ⁰C (68%), a najmanji na 25

⁰C (46%). Dobiveni rezultati su sukladni s rezultatima studije Horvathova i sur. (2007) koja

se također provodila na uzorcima meda pri različitim temperaturama, više dana te su

uzorci pokazali povećanje antioksidativne aktivnosti na DPPH• radikal s povišenjem

temperature. Predloženo je objašnjenje povećanja antioksidativne aktivnosti kroz


39/45

32

nastanak neenzimskih reakcija putem kojih nastaje smeđe obojenje meda [33, 34].

Navedene reakcije uključuju raznovrsne spojeve i različite kemijske puteve ovisno o

sastavu produkata i vanjskim uvjetima (poput temperature). Općenito su glavne grupe

reakcija koje dovode do nastanka smeđe boje enzimatska oksidacija fenola i neenzimskereakcije smeđenja. Neenzimske reakcije smeđenja nastaju zagrijavanjem te uključuju

veliki raspon reakcija poput Maillardovih reakcija, karamelizacije i kemijske oksidacije

fenola. Enzimska i kemijska oksidacija polifenola obično rezultira gubitkom

antioksidativnih svojstava, ali djelomično oksidirani polifenoli su pokazali veću

antioksidativnu aktivnost od ne-oksidiranih [35]. Većina glavnih Maillardovih reakcija

odvija se preko skupina šećer-aminokiselina koje prilikom zagrijavanja stvaraju

reducirajuće spojeve poput melanoidnih pigmenata reakcijom reducirajućih šećera s

aminokiselinama ili proteinima [34].

Od testiranih bifaznih modela, vrijednosti dobivene modelom Weibull-ove raspodjele kao

i Gustafson-Holednovim modelom pokazuju vrlo dobro slaganje s eksperimentalnim

vrijednostima što je vidljivo na osnovu statističkih pokazatelja (R2, SRMSE i χ2-pogreška,

Tablica 5) ukazujući na bifazni nestanak DPPH• radikala pri ispitivanim temperaturama.

Iako oba bifazna modela prema statističkim pokazateljima optimalno zadovoljavaju opis

kinetike nestanka DPPH• radikala, za određivanje energije aktivacije za reakcije pri

različitim temperaturama odabran je Gustafson-Holdenov model. Naime, kod modela

Weibull-ove raspodjele se konstante brzine reakcije nisu mijenjale proporcionalno s

temperaturom, a navedeni model nije definiran u nuli što predstavlja njegov nedostatak.

Iz podataka dobivenih Gustafson-Holdenovim modelom izrađen je graf prema Arrheinus-

ovoj jednadžbi te je za reakciju hvatanja DPPH• radikala u prisustvu meduna jele ( Abies

alba Mill.) pokazana linearnost s primijenjenim zakonom, a izračunata energija aktivacije

iznosila je 45,40 kJ/mol.

Ovakva vrijednost energije aktivacije smatra se izrazito niskom te čini medun vrlo dobrim

antioksidansom. Niska energija aktivacije znači jednostavnost otpuštanja protoniranog

vodika kako bi se neutralizirao radikal [36, 37]. Uz to, pozitivna energija aktivacije

potvrđuje eksperimentalno određeno povećanje konstante brzine s povišenjem

temperature.


40/45

33

6. ZAKLJUČAK

Temeljem dobivenih rezultata može se zaključiti da je kinetika antioksidativnog djelovanja

meduna jele ( Abies alba Mill.) Gorskog kotara u prisutnosti DPPH• radikala bifazne

prirode iz razloga što razni antioksidativni spojevi prisutni u medljikovcu imaju različite

brzine reagiranja s radikalom.

Reakcija antioksidanasa na radikal bila je jača u prvih nekoliko minuta što odražava

mehanizam hvatanja radikala. Uz to, antioksidativna aktivnost se poboljšala povišenjem

temperature. Razlog tomu moglo bi biti nastajanje antiradikalnih spojeva prilikom

različitih neenzimskih reakcija smeđenja (Maillardovih reakcija) koje nastaju pod

utjecajem temperature.

Dobivena linearna ovisnost ln(k ) o 1/T u Arrheniusovom zakonu rezultirala je niskom

vrijednošću energije aktivacije (Ea = 45,40 kJ/mol) što ga čini značajnim antioksidansom

jer upućuje na lakoću nastanka antioksidativne reakcije. Pozitivna energija aktivacije

upućuje na povećanje konstante brzine reakcije s povećanjem temperature.


41/45

34

7. ZAHVALE

Zahvaljujem mentorici doc. dr. sc. Mladenki Malenici Staver na pomoći pri provedbi

eksperimentalnog dijela i pisanju rada, doc. dr. sc. Daliboru Brozniću za matematičko

modeliranje kinetike te gosp. Damiru Zanoškaru iz firme Gorski d.o.o za prikupljanje

uzorka meduna.


42/45

35

8. LITERATURA

1. Manyl-Loh, C. E.; Clarke, A. M.; Ndip, R. N. (2011). An overview of honey: Therapeutic

properties and contribution in nutrition and human health. African Journal of

Microbiology Research, 5: 844-852.

2. Kuštrak, D. (2005),. Posebni dio fitofarmacije: Liječenje ljekovitim biljem –

fitoterapija. U: Farmakognozija – Fitofarmacija. Zagreb: Golden Marketing - Tehnička

Knjiga, str.: 82-84.

3. Bogdanov, S. (2011), The Book of Honey, Chapter 1, Bee Hexagon [online]. Dostupno

na: www.bee-hexagon.net [07. Veljače 2014]

4. Senegačnik, E.; Senegačnik, J. (1996) Med naša vsakdanja hrana in zdravilo, Ljubljana:

MEDEX, str. 7-8.

5. Ajibola, A.; Chamunorwa, J. D.; Erlwanger, K. H. (2012). Nutraceutical values of

natural honey and its contribution to human health and wealth.

Nutrition&Metabolism. 9: 61-73.

6. Manzanares, A. B.; García, Z. H.; Galdón, B. R.; Rodríguez, E. R. (2010). Differentiation

of blossom and honydew honeys using multivariate analysis on the physiochemical

parameters and sugar composition. Food Chemistry. 126: 664-672.

7. Macfarlane, S.; Macfarlane, G. T.; Cummings, J. H. (2006). Review article: prebiotics in

the gastrointestinal tract. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 24: 701-714.

8. Alvarez-Suarez, J. M.; Tulipani, S.; Romandini, S.; Bertoli, E.; Battino, M. (2009).

Contribution of honey in nutrition and human health: a review. Mediterranean

Journal of Nutrition and Metabolism. 3: 15-23.

9. Beretta, G.; Granata, P.; Ferrero, M.; Orioli, M.; Facino; M., R. (2005). Standardization

of antioxidant properties of honey by a combination of

spectrofotometric/fluorimetric assays and chemometrics. Analytica Chimica Acta.

533: 185-191.

10. Sharma, O. P.; Bhat, T. K. (2008). DPPH antioxidant assay revisited. Food Chemistry.

113: 1202-1205.

11. Academic, © (2014) Academic Dictionaries and Encyclopedias [online]. Dostupno na:

http://en.academic.ru/dic.nsf/enwiki/11603110 [14. Kolovoza 2014.]

12. Rufino, M. S. M.; Alves, R. E.; Fernandes, F. A. N.; Brito, E. S. (2010). Free radical

scavenging behavior of ten exotic tropical fruits extracts. Food Research

http://en.academic.ru/dic.nsf/enwiki/11603110http://en.academic.ru/dic.nsf/enwiki/11603110


43/45

36

International . 44: 2072-2075.

13. Antolovich, M.; Prenzler, P. D.; Patsalides, E.; McDonald, S.; Robards, K. (2001).

Methods for testing antioxidant activity. The Analyst. 127: 183-198.

14.

Garcia, E. J.; Oldoni, T. L. C.; Alencar, S. M. d.; Reis, A.; Loguercio, A. D.; Grande, R. H.

M. (2012). Antioxidant Activity by DPPH• Assay of Potential Solutions to be Applied

on Bleached Teeth. Brazilian Dental Journal. 1: 22-27.

15. Escuredo, O. M. M.; Fernández-González, M.; Sejio, C. M. (2012). Nutritional value

and antioxidant activity of honeys produced in a European Atlantic area. Food

Chemistry. 138: 851-856.

16. Tam, J. (2011). Nanocrystalline Cellulose: A Novel, Renewable Antioxidant [online].

Dostupno na: http://www.odec.ca/projects/2011/tamtaj/index_files/Page393.html

[19. Kolovoz 2014.]

17. Re, R.; Pellegrini, N.; Proteggente, A.; Pannala, A.; Yang, M.; Rice-Evans, C. (1999).

Antioxidant activity applying an improved ABTS•+ radical cation decolorization assay.

Free Radical Biology and Medicine. 26: 1231-1237.

18. Piljac-Žegarac, J.; Stipčević, T.; Belščak, A. (2009). Antioxidant properties and phenolic

content of different floral origin honeys. Journal of ApiProduct and ApiMedical

Science. 1: 43-50.

19. Zappalá, M.; Fallico, B.; Arena, E.; Verzera, A. (2005). Methods for the determination

of HMF in honey: a comparison. Food Control. 16: 273-277.

20. Wikipedia, c. (2014). Trolox equivalent antioxidant capacity [online]. Dostupno na:

http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Trolox_equivalent_antioxidant_capacity&

oldid=577661192 . [11. Kolovoza 2014.]

21. Analytical, F. (2014). Sigma-Aldrich [online] Dostupno na:

https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-

aldrich/docs/Sigma/Datasheet/6/47641dat.pdf . [12. Kolovoza 2014.]

22. Atkins, P.; De Paula, J. (2006). The rates of chemical reactions. U: Atkins' Physical

Chemistry, 8th ed. New York: Oxford University Press, str.: 791-803; 807-809.

23. Higham, D. J. (2008). Modeling and Simulating Chemical Reactions. Society for

Industrial and Applied Mathematics. 50: 347-368.

24.

Rao, K. G. S. N. (2014). Pharmainfo.net [online]. Dostupno na:


44/45

37

http://www.pharmainfo.net/files/groupsimages/differences_between_zero_and_firs

t_order_kinetics.pdf [24. Kolovoza 2014].

25. Jones, J. James Jones (2014). Professor of Mathematics [online]. Dostupno na:

https://people.richland.edu/james/lecture/m116/logs/models.html [24. Kolovoza2014].

26. ReliaSoft Corporation (2012). Chapter 8: The Weibull Distribution. U: Life Data

Analysis [online]. Dostupno na:

http://reliawiki.org/index.php/The_Weibull_Distribution. [24. Kolovoza 2014.]

27. Gustafson, D. I.; Holden, L. R. (1009). Nonlinear Pesticide Dissipation in Soil: A New

Model based on Spatial Variability. Environmental Science Technology. 24: 1032-

1038.

28. Maskan, M. (2006). Production of pomegranate (Punica granatum L.) juice

concentrate by various heating methods: color degradation and kinetics. Journal of

Food Engineering. 72: 218-224.

29. Broznić, D.; Milin, Č. (2013). Mathematical prediction of imidacloprid persistence in

two Croatian soils with different texture, organic matter content and acidity under

laboratory conditions. Journal of Environmental Science and Health Part B-Pesticides

Food Contaminants and Agricultural Wastes. 48: 906-918.

30. Zheng, H. &. L. F. (2011) Use of kinetic, Weibull and PLSR models to predict retention

of ascorbic acid, total phenols and antioxidant activity during storage of pasteurized

pineapple juice. Lwt-Food Science and technology. 44: 1273-1281.

31. Jasprica, I.; Bojić, M.; Mornar, A.; Bešić, E.; Bučan, K.; Medić-Šarić, M. (2007).

Evaluation of Antioxidative Activity of Croatian Propolis Samples Using DPPH· and

ABTS·+ Stable Free Radical Assays. Molecules. 12: 1006-1021.

32. Villaño, D.; Fernández-Pachón, M. S.; Moyá, M. L.; Troncoso, A. M.; García-Parrilla, M.

C. (2007) Radical scavenging activity of polyphenolic compounds towards DPPH· free

radical. Talanta. 71: 230-235.

33. Turkmen, N.; Sari, F.; Poyrazoglu, E. S.; Velioglu, Y. S. (2006). Effects of prolonged

heating on antioxidant activity and colour of honey. Food Chemistry. 95 (4): 653-657.

34. Horvathova, J.; Suhaj, M.; Šimko, P. (2007). Effect of thermal treatment and storage

on antioxidant activity of some spices. Journal of Food and Nutrition Research. 46:

20-27.

http://reliawiki.org/index.php/The_Weibull_Distributionhttp://reliawiki.org/index.php/The_Weibull_Distributionhttp://reliawiki.org/index.php/The_Weibull_Distribution


45/45

35. Manzocco, L.; Calligaris, S.; Mastrocola, D.; Nicoli, M. C.; Lerici, C. R. (2001). Review of

non-enzymatic browning and antioxidant capacity in processed foods. Trends in Food

Science & Technology. 11: 340-346.

36.

Woodhead Publishing in Food Scienca and Technology (2002). U: Ohlsson, T.;Bengtsson, N., ur., Minimal processing technologies in the food industry. Abington

(Engleska): Woodhead Publishing Limited, str.: 147-148.

37. Msagati, T. A. M. (2013). Antioxidants and Radical Sacvengers: Types of antioxidants.

U: Chemistry of Food Additives and Preservatives. Chirchester (UK): John Wiley &

Sons, Ltd., str.: 4-5.

Kinetika Reakcije DPPH- Radikala i Meduna Jele (Abies Alba Mill.) Gorskog Kotara

Documents

Transcript of Kinetika Reakcije DPPH- Radikala i Meduna Jele (Abies Alba Mill.) Gorskog Kotara