This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

REAKTIONSKINETIK VON PAPAIN MIT BROMACETAMID 4 3

Kinetik der Reaktion von Papain mit Bromacetamid Kinetics of the reaction of papain with bromoacetamide

HANS-GERHARD LÖFFLER, FRIEDHELM SCHNEIDER u n d HELMUT W E N C K

Physiologisch-chemisches Institut der Universität Tübingen

(Z. Naturforsch. 26 b, 43—46 [1971] ; eingegangen am 25. September 1970)

The pH-dependence of the second order rate constants of the reaction of papain with bromo-acetamide in the pH-range 5,5—8,5 is described by a curve with a turning point corresponding to a pK 7,3 + 0,1 at 25°. This is the pK of a catalytically essential imidazole residue. The activa-tion parameters of the reaction of papain with bromoacetamide were determined. The second order rate constants at pH 7 for the reaction is 200 times greater than for the reaction of bromoacet-amide with simple SH-compounds.

An niedermolekularen Modellsubstanzen läßt sich zeigen 2, daß die Reaktivität von SH-Gruppen durch Wechselwirkung mit einem Imidazolrest über das auf Grund ihres pK-Wertes zu erwartende Maß erhöht werden kann. Das kommt z. B. in der durch Imidazol-SH-Verbindungen katalysierten Ester-hydrolyse 3, der Reaktion mit ./V-Äthylmaleinimid4

sowie mit Bromacetamid 5 zum Ausdruck. Diese Be-funde stützen die Hypothese, daß die außergewöhn-liche Reaktivität essentieller SH-Gruppen von Enzy-men durch Kooperation mit einem räumlichen ideal benachbarten Imidazolrest Zustandekommen soll, wie es zum Beispiel für das Papain postuliert wird 6.

Unsere Untersuchungen über die Kinetik der Reaktion von Papain als Prototyp eines Imidazol-SH-Enzyms mit iV-Äthylmaleinimid führten zu dem Ergebnis, daß die pH-Abhängigkeit der Geschwin-digkeitskonstanten zweiter Ordnung durch eine Kurve mit zwei Wendepunkten beschrieben wird, denen ein pK-Wert von 7,75 bzw. 8,75 zu entneh-men ist. Der niedrigere ist einem Imidazolrest, der höhere der essentiellen SH-Gruppe des Papains zu-zuordnen7. In Fortsetzung dieser Untersuchungen berichten wir nachstehend über die pH-Abhängigkeit der Reaktion von Papain mit Bromacetamid sowie die Bestimmung der Aktivierungsparameter dieser Reaktion.

Sonderdruckanforderungen an Prof. Dr. F. SCHNEIDER, Institut f. Physiolog. Chemie, Lehrstuhl II, D-3550 Mar-burg/Lahn, Lahnberge.

1 FR. SCHNEIDER, Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 348,1034 [ 1 9 6 7 ] .

2 FR. SCHNEIDER, E . SCHAICH U. H . WENCK, ibid. 3 4 9 , 1 5 2 5 [ 1 9 6 8 ] ,

3 FR. SCHNEIDER U. H . WENCK, ibid. 3 5 0 , 1 6 5 3 [ 1 9 6 9 ] . 4 FR. SCHNEIDER U. H . WENCK, ibid. 3 5 0 , 1 5 2 1 [ 1 9 6 9 ] .

Material und Methoden

Papain: Kristallsuspension reinst in 0,05 M Natrium-acetatpuffer pH 4,5 der Fa. Serva, Heidelberg:

L-Cystein: Präparat der Fluka; Dithioerythrit (Cleland-Reagenz (DTE) : Präparat der

Serva, Heidelberg; Äthylendiamino-tetraessigsäure (EDTA) p. a.: Präpa-

rat von Merck; 7V-a-Benzoyl-arginin-äthylester HCl: Präparat von

Merck; iV-a-Benzoyl-arginin-p-nitroanilid HCl: Präparat von

Merck; Bromacetamid: Synthese nach 1. c. 8.

Alle für die Herstellung der Puffer verwendeten Salze waren p. a. Substanzen der Firma Merck.

Für alle Versuche wurde ein Dreikomponentenpuffer nach GERWIN benutzt, der mit 1 N NaCl auf eine konstante Ionenstärke von 0,09 eingestellt war.

Messung der Reaktionsgeschwindigkeit Die Messung der Reaktionsgeschwindigkeit von

Bromacetamid mit Papain erfolgte auf indirektem Wege über die Bestimmung der Inaktivierungsgeschwin-digkeit des Enzyms, indem mit DTE (8-10_5M) akti-viertes Enzym mit einer äquimolaren Menge Bromacet-amid bei 5 °C mit Argon begastem G e r w i n - Puffer inkubiert wurde; die Reaktion wurde bei 5 °C und unter Bedingungen zweiter Ordnung durchgeführt, weil sie bei höheren Temperaturen und unter Bedingungen pseudo erster Ordnung vor allem im höheren pH-Bereich zu schnell verläuft. Im Abstand von 2 Min. wurden 50 fA Proben entnommen und in 200 fA einer eiskalten

5 E . ZIEGLER, H . WENCK U. FR. SCHNEIDER, Z . Naturforsch. 2 5 b , 1 4 1 7 [ 1 9 7 0 ] .

6 G. LOWE, Phil. Trans. Roy. Soc. [London], Ser. B 257, 2 3 7 [ 1 9 7 0 ] .

7 M . KAIL, FR. SCHNEIDER U. H . WENCK, Hoppe -Sey ler ' s Z . physiol . C h e m . 3 5 1 , 1 2 8 0 [ 1 9 7 0 ] .

8 M . CLAASZ, C h e m . Ber . 4 5 , 1 0 1 5 [ 1 9 1 2 ] . 9 B . J. GERWIN, J. biol . Chemistry 2 4 2 , 4 5 1 [ 1 9 6 7 ] .

4 4 H.-G. LÖFFLER, F. SCHNEIDER UND H. WENCK

2-10~2 M Cysteinlösung gegeben. Durch die hohe Cysteinkonzentration wird das gesamte Bromacetamid sofort verbraucht und kein weiteres Enzym mehr alky-liert. In den Proben wird eine Aktivitätsbestimmung unter Verwendung von Benzoyl-arginin-äthylester (4 • IGT2 M) als Substrat in N/10 KCl-Lösung (2 • 10~8 M Cystein, 5 -10 _ 2 M EDTA) und N/100 KOH als Titrant mit der pH-stat-Technik durchgeführt; die Aktivitäts-bestimmung erfolgte immer bei pH 6,5 und 30°. Die Messungen wurden mit einem pH-Meter E 300 B, mir Impulsomat E 473, Dosimat E 412, Multidosigraph E 425 der Firma Metrohm A.G. Herisau durchgeführt. Elektroden EA 147 U (niederohmig), EA 147 X (hoch-ohmig); 0,2 ml Mikrobürette E 412 — 026', Elektroden-gefäß 1ml, EA 8 7 6 - 1 mit Ultrathermostat K 3259 der Fa. Colora.

Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten Die Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten

zweiter Ordnung erfolgte bei äquimolarer Enzym- und Inhibitorkonzentration nach der Formel

k-t = bzw. k-t = 1-ct [£0] ( [ £ „ ] - [ £ / ] )

Dabei bedeuten: [£0] = Anfangskonzentration des Papains, in den mei-

sten Fällen photometrisch ermittelt aus E 17m — 25 und dem Molgewicht 21000, wobei unberück-sichtigt blieb, daß das Enzym-Protein nicht 100-proz. aktivierbar ist.

a = gemessener Aktivitätsbruchteil nach der Zeit t. Bei t = 0 ist a = 1.

Ausgleichsrechnung erfolgte mit Hilfe der Methode der Summe der kleinsten Fehlerquadrate. Die Auswertung der Daten wurde mit Hilfe eines ALGOL-Programms und einer Rechenanlage Control Data CD 3300 des Tü-binger Rechenzentrums * durchgeführt. Die Aktivie-rungsparameter der Alkylierungsreaktion wurden aus der Temperatur-Abhängigkeit der Geschwindigkeits-konstanten nach

k— (k'-T/h) .e^'IR.e~AH'IRT bestimmt. Zur Ermittlung von AS* und AH* wird die Gleichung in die Form \n(k/T) = — AH*/RT + AS*/R + ln(&'/h) gebracht. Trägt man In k/T gegen l/T auf, so erhält man aus dem Ordinatenabschnitt die Aktivie-rungsentropie AS* und aus der Steigung die Aktivie-rungsenthalpie AH*. Aus AG* = AH* — TAS* erhält man die freie Aktivierungsenthalpie AG*. Lineare Aus-gleichsrechnung erfolgte wie oben angegeben.

Ergebnisse und Diskussion

Die Geschwindigkeit der Reaktion von Papain mit Bromacetamid wurde im pH-Bereich von 7,0 bis 8,5 unter Bedingungen zweiter Ordnung und kon-stanter Ionenstärke untersucht. Oberhalb pH 8,5 konnte die Reaktion mit der hier verwendeten Tech-

* Wir danken dem Tübinger Rechenzentrum für die Unter-stützung.

nik nicht mehr gemessen werden, da sie zu schnell verläuft. Aus Abb. 1 ist für ein ausgewähltes Bei-spiel zu ersehen, daß die Reaktion im gemessenen Zeitraum nach der zweiten Ordnung verläuft. Abb. 2 zeigt die pH-Abhängigkeit, Abb. 3 die Temperatur-Abhängigkeit der Inaktivierung des Enzyms durch Bromacetamid.

12 16 20 24 min >•

Abb. 1. Reaktion zweiter Ordnung der Inaktivierung des Pa-pains durch Bromacetamin. E0 = 71,3 <MM; /0 = 71,31HM;

pH 7,0, 20°.

100

90

A SO

I 70

5 60

• O40

30

20

10

\ \ o A \ u. 7.3

\ 7'6

-\ T \ pH 79

\ pH 8,2

pH 8,5

1 i i l l i l 0 2 4 10 12 14 16

min

Abb. 2. pH-Abhängigkeit der Inaktivierung des Papains durch äquimolare Mengen Bromacetamid bei 5°.

100

90

| 80

I 70

> 5 50

40 ty~ 30

20

10

5°C

— Q \ 70°C

" \ °C

1

\ ^30° C

40° C

L L I L I I I 0 2 10 12 14 16 18

min >-

Abb. 3. Temperatur-Abhängigkeit der Inaktivierung bei pH 7,0.

REAKTIONSKINETIK VON PAPAIN MIT BROMACETAMID 4 5

Trägt man die Geschwindigkeitskonstanten zwei-ter Ordnung gegen den pH-Wert auf, so erhält man die in Abb. 4 dargestellte Kurve. Im pH-Bereich von 5,5 — 7 steigt die Geschwindigkeit der Reaktion langsam an. Im Rahmen unserer Untersuchungen hat uns besonders der Bereich von 7 — 8,5 inter-essiert, da für die Reaktion mit jV-Äthylmaleinimid in diesem Bereich eine Reaktivität der SH-Gruppe gefunden wird, die höher liegt als auf Grund ihres pK-Wertes zu erwarten ist7. Wie aus Abb. 4 ersicht-lich ist, beobachtet man denselben Effekt auch für die Reaktion des Papains mit Bromacetamid, d. h. die pH-Abhängigkeit auch dieser Reaktion wird im Bereich von 7,3 — 8,5 nicht durch eine einfache Dissoziationskurve beschrieben. Oberhalb 8,5 er-folgt ein steiler Anstieg der Geschwindigkeitskon-stanten; z.B. konnte bei pH 9 nach 1,5 min keine Aktivität mehr gemessen werden.

Abb. 4. a) pH-Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung der Reaktion von Papain mit Bromacetamid bei 5 °C. b) Aus der „idealen" Dissoziationskurve ist der

untersuchte Bereich zu erkennen.

Stellt man die Frage, worauf die aus Abb. 4 ersichtliche Abweichung der pH-Abhängigkeitskurve vom theoretisch zu erwartenden Verlauf zurück-zuführen ist, so ist die einfachste Erklärung die, daß der Dissoziation der SH-Gruppe die Dissoziation einer zweiten Gruppe überlagert ist, die die Reak-tivität der SH-Gruppe im pH-Bereich von 7,3 — 8,5 stark erhöht; dabei kann ausgeschlossen werden, daß Bromacetamid noch mit anderen Gruppen rea-

1 0 B . J. FINKLE u. E . L . SMITH, J. biol . Chemistry 2 3 0 , 6 6 9 [1958].

11 I. M. CHAIKEN U. E. I. SMITH, J. biol. Chemistry 244, 5087 [1969],

giert als der essentiellen SH-Gruppe10. Wie ein Vergleich der Reaktion des Enzyms mit Chlor-acetamid zeigt11, ist dieser Effekt eigenartigerweise beim Bromacetamid bedeutend deutlicher und ausge-prägter. Aus dem Wendepunkt der Kurve (Abb. 4) läßt sich ein pK-Wert von etwa 7,6 + 0,1 für 5 °C ermitteln. Unter Zugrundelegung einer Dissozia-tionsenergie von 7,0 kcal errechnet sich daraus ein pK-Wert von etwa 7,3 für 25 °C. Unter Berücksichti-gung unserer Kenntnisse über den Mechanismus der Papain-Katalyse 6 ist dieser Wert höchstwahrschein-lich einem Imidazolrest zuzuordnen. Der Wert stimmt mit dem von SHINITZKY 12 für einen essen-tiellen Imidazolrest des Papains durch fluorometri-sche Titration ermittelten gut überein, liegt dagegen etwas niedriger als der aus der Reaktion mit N-Äthylmaleinimid ermittelte von 7,7 7.

Die Aktivierungsparameter der Alkylierungs-reaktion wurden aus der Temperatur-Abhängigkeit der Geschwindigkeitskonstanten bei pH 7 ermittelt; aus der A r r h e n i u s - Gerade (Abb. 5) konnten die Aktivierungsparameter AG*, AH* und J5* bestimmt werden; diese sind in Tab. 1 aufgeführt.

t: -2

-3

-4

3,0 3.1 3.2 3,3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8

Abb. 5. Temperatur-Abhängigkeit der Geschwindigkeitskon-stanten zweiter Ordnung der Inaktivierung von Papain durch

Bromacetamid bei pH 7,0.

In Tab. 1 werden außerdem die Aktivierungs-parameter und Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung der Reaktion von einfachen SH-Verbin-dungen, Imidazol-SH-Verbindungen und Papain mit Bromacetamid verglichen. Dieser Vergleich zeigt, daß die Reaktivität der SH-Gruppe des Papains gegenüber derjenigen von niedermolekularen SH-Verbindungen auf größenordnungsmäßig das Zwei-

1 2 M . SHINITZKY U. R . GOLDMAN, Europ. J. biochem. [Ber-lin] 3,139 [1967].

4 6 D. HIEDEMANN-VAN W Y K AND C. G. KANNANGARA

Thiolverbindung k AH* AS* AG* [ l x Mol- 1 sec-1] [kcal/Mol] [eu] [kcal/Mol]

L-Cystein 0,355 — — 18,0 N-Acetylcysteinamid 0,33 20,0 + 6,4 18,0 N-Acetyl-cys-his-asp 0,21 17,0 — 4,7 18,4 5-(2-Mercaptoäthyl)imidazol 0,530 9,7 - 3 4 , 2 19,2 5-Mercaptomethyl-imidazol 0,207 18,7 — 1,0 18,4 Papain 67,5* 13,6 - 5,0 15,0

Tab. 1. Aktivierungsparameter und Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung bei pH 7 und 25 °C der Reaktion von Brom-acetamid mit SH-Verbindungen und Papain. * Für 30 °C.

hundertfache erhöht ist; für Chloracetamid beträgt der Faktor dagegen etwa 20 13. Die AG* für alle niedermolekularen SH-Verbindungen liegen bei 18 kcal/Mol, betragen für Papain dagegen 15 kcal/ Mol.

Die Arbeit wurde von der Deutschen Forschungs-gemeinschaft und dem Fond der Chemischen Industrie unterstützt.

1 3 M . R . HOLLAWAY, A . P . MATHIAS U. B. R . RABIN, Bio-chim. biophysica Acta [Amsterdam] 92, 111 [1964].

Localization of ferredoxin in the thylakoid membrane with immunological methods

DORIS H I E D E M A N N - V A N W Y K a n d C . GAMINI K A N N A N G A R A

Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung (Erwin-Baur-Institut), Köln 30

(Z. Naturforsch. 26 b, 46—50 [1971]; eingegangen am 29. August 1970)

Antibodies were prepared against ferredoxin isolated from spinach. These antibodies and those against TPN-ferredoxin-reductase, carboxydismutase and coupling factor were used to clarify the localization of these proteins in the thylakoid membrane. Chloroplast preparations obtained by different methods show not the same immunological reactions. Only lamellar systems suspended in the leaf homogenate are agglutinated by anti-ferredoxin. Washed lamellar systems show an ag-glutination with anti-ferredoxin only if ferredoxin is added. In certain preparations of lamellar systems the presence of ferredoxin inhibit the reaction of anti-TPN-ferredoxin-reductase with the lamellar system. Lamellar systems freed of coupling factor by EDTA treatment are agglutinated by anti-TPN-ferredoxin-reductase. Addition of coupling factor to the EDTA treated lamellar systems inhibit the agglutination but not the adsorption of TPN-ferredoxin-reductase antibodies. By the assumption that the inhibition of the agglutination by the TPN-ferredoxin-reductase anti-bodies is caused by sterical hindrance, these results indicate, that ferredoxin, coupling factor and TPN-ferredoxin-reductase are localized close to each other in the thylakoid membrane.

Lamellar systems suspended in leaf homogenate are agglutinated by anti-TPN-ferredoxin-reductase. That means, that to a certain extend the molecular structure of the thylakoid membrane changes with the kind of preparations employed.

In earlier publications it was shown, that anti-bodies against ferredoxin-TPN-reductase, coupling factor and carboxydismutase agglutinate the lamel-lar systems (stroma freed chloroplasts)1_3. This is only possible, if these proteins are localized at the

surface of the lamellar system in such a way, that the antibodies can react with the determinants of the antigens. It is wellknown, that ferredoxin which is involved in a number of photosynthetic electron transport reactions 4' 5, goes into solution during the

Reprints request to Dr . DORIS HIEDEMANN-VAN W Y K , MPI f. Züchtungsforschung, Abt. Menke, D-5000 Köln-Vogelsang-30.

1 R. BERZBORN, Z. Naturforsch. 23 b, 1096 [1968]. 2 R. BERZBORN, Z. Naturforsch. 24 b, 436 [1969]. 3 C . G . KANNANGARA, D . VAN W Y K , and W . MENKE, Z . N a -

turforsch. 25 b, 613 [1970].

4 D . L . KEISTER, A . SAN PIETRO, and F . E . STOLZENBACH, J. biol. Chemistry 235, 2989 [I960].

5 D. J. ARNON, in: Progress in Photosynthesis Research 3. 1444. Ed. H. METZNER, Verlag C. Lichtenstern, München 1969.