SOUTHERN BLOTTING DAN NORTHERN BLOTTING

Oleh : Kelompok VI

Almaun (F1C1 13 044) Andi Amalia Hamka (F1C1 13 084) Debby Zulfitri Cahyuni (F1C1 13 012) Fathmasari Fitrianingsih (F1C1 13 058) Wasiara (F1C1 13 090)

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2016

Pendahuluan

Southern Blotting (DNA)

Northern Blotting (RNA)

Western Blotting (Protein)

Blot/Blotting

Teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, atau protein ke lembaran tipis atau matriks membran. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis gel.

Pengertian

Berdasarkan Tipenya, terdiri atas :

1 2 3

Southern Blotting (DNA)

Southern Blotting (DNA)

Pengertian dan Sejarah Komponen-

Komponen

Tahapan dan Mekanisme

Kerja

Pengertian dan Sejarah Southern Blotting (DNA)

Southern Blotting (DNA) Pengertian

Sejarah

Metode ini ditemukan oleh seorang ahli biologi dari Inggris yang bernama Edward M. Southern, yang mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di Universitas Edinburgh

Sebuah metode yang sering digunakan dalam bidang Biologi Molekular untuk menguji keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA.

Edward M. Southern Southern Blotting (DNA)

Komponen-Komponen utama pada Southern Blotting (DNA)

Membran Nitroselulos

a

DNA probe

Membran Nitroselulosa digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen DNA dari gel agarosa

Merupakan sutau fragmen dna yang berfungsi sebagai pelacak target gen

Harus bersifat spesifik dan komplemen terhadap DNA target

Struktur Nitroselulosa

DNA Probe

Lanjutan…

Larutan Buffer

DNA

Larutan buffer berfungsi untuk membawa DNA dari gel dan mengimobilisasi DNA pada membran (Larutan akan bergerak dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah)

Merupakan materi atau molekul yang akan diidentifikasi pada tekhnik Southern Blotting

Berfungsi untuk memotong DNA menjadi suatu fragmen tertentuEnzim

Retriksi

Tahapan Southern Blotting

Tahap- tahap Southern Blotting (DNA)

Isolasi DNA dan Pemotongan DNA

Fragmentasi DNA dengan Elektroforesis

Hibridisasi DNA

1 2Transfer DNA ke Membran (Blot)

4

Deteksi DNA

3

5

Tahap untuk memperoleh DNA yang akan dideteksi. Pemotongan DNA yang ingin diperoleh dilakukan dengan menggunakan enzim retriksi (endonuklease retriksi) yang bersifat spesifik terhadap DNA

EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I

Isolasi DNA dan Pemotongan DNA

1

Merupakan tahap dimana Fragmen-fragmen dari DNA akan terpisah berdasarkan ukuran berat molekulnya.

Berdasarkan prinsip elektroforesis, Fragmen DNA yang ukuran berat molekulnya lebih kecil akan lebih cepat bergerak dari kutub negatif kekutub positif dibandingkan dengan fragmen DNA dengan berat molekul lebih besar.

Fragmentasi DNA dengan Elektroforesis gel

2

Denaturasi DNAProses denaturasi DNA dilakukan dengan

merendam gel dalam larutan denaturan (NaOH )

NaOH bersifat basa sehingga dapat menyebabkan rusaknya ikatan hidrogen antar untai DNA

Ikatan hidrogen antar untai DNA yang putus menyebabkan struktur DNA yang semula double heliks menjadi DNA single strand

A C AT T G

T G A A TC

DNA yang telah diperoleh kemudian ditransfer ke membran nitroseluloasa, tahap inilah yang disebut dengan blotting.

Transfer DNA ke Membran nitroselulosa

4

Tahap ini dapat dilakukan dengan 2 pilihan metode, yaitu:

Berdasarkan prinsip Kapilaritas Berdasarkan prinsip elektroforesis

Gel agarosa dijiplak pada membran nitroselulosa

Fragmen DNA yang telah terjiplak pada membran nitroselulosa kemudian dipanaskan pada suhu 60oC kemudian membran diberi radiasi UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan membran

Merupakan salah satu metode tahapan transfer DNA ke membran nitroselulosa yang berdasarkan pada prinsip Kapilaritas

Kapilaritas adalah peristiwa naiknya zat cair pada pembuluh, celah atau pori-pori kecil

Hibridisasi DNA adalah proses pembentukan molekul double helix dari single strand DNA probe dan single strand DNA target

Tahap ini terjadi ketika membran nitroselulosa direndam dalam larutan yang berisi probe DNA Ss* (diberi radioisotop)

Hibridisasi DNA6

Fragmen Single Strand DNA

Probe yang cocok untuk Single strand DNA Label isotop

atau fluoroscense

Merupakan tahap lanjutan dari proses hibridisasi DNA yang menggunakan pelacak/probe

Probe biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida.

Pada tahap deteksi DNA digunakan Autoradiogram untuk melihat lokasi sinyal DNA

Deteksi DNA7

Northern Blotting (RNA)

Northern Blotting (RNA)

Pengertian dan Sejarah

Komponen-Komponen

Tahapan dan Mekanisme Kerja

Pengertian dan Sejarah Northern Blotting (RNA)

Northern Blotting (RNA)

Pengertian

Sejarah

Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama kali oleh Alwin pada tahun 1977

Secara umum teknik ini mirip dengan Southern Blot, akan tetapi sampel yang digunakan, yaitu RNA.

Prinsip northern blot adalah memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membran menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target

Komponen-Komponen utama pada Northern Blotting (RNA)

Membran digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen RNA dari gel agarosa formaldehid

Membran yang digunakan pada Northern blooting adalah nilon

Probe atau RNA probe adalah fragmen yang digunakan untuk hibridisasi asam nukleat

Probe dilengkapi semua, atau sebagian, urutan basa komplementer dari urutan mRNA target.

Formaldehid

Membran

Probe

Nilon

Tahap- tahap Northern Blotting (RNA)

Isolasi RNA Elektroforesis

Prehibridisasi dan hibridisasi dengan probe

Pencucian

1 2

5

Transfer ke membran dan imobilisasi

3

Deteksi 6

4

Isolasi RNA1

Isolasi RNA dapat dilakukan dengan beberapa tahap berikut, yaitu :

Penghancuran dinding sel

Penghilangan protein dan DNA

Pemurnian RNALisis dilakukan menggunakan detergen

Pengotor akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi

Kemudian molekul nukleotida (DNA dan RNA) dipisahkan dari protein menggunakan fenol

Enzim DNAase digunakan untuk menghancurkan DNA sehingga RNA diisolasi secara utuh

Purifikasi RNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan tersebut dengan PCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan RNA dari larutan, dan mengendapkan.

Elektroforesis2

Gel dapat diwarnai dengan ethidium bromide (EtBr) dan dilihat di bawah sinar UV untuk mengamati kualitas dan kuantitas RNA sebelum blotting.

Merupakan tahap dimana RNA dielektroforesis menggunakan gel agarosa formaldehida

Formaldehida

Transfer ke membran dan imobilisasi

3 Tahap dimana RNA yang sebelumnya telah berhasil diisolasi kemudian ditransfer ke membran nilon

Membran nilon dengan muatan positif paling efektif untuk digunakan dalam northern blot karena asam nukleat bermuatan negatif sehingga memiliki afinitas tinggi.

Transfer buffer yang digunakan mengandung formamida karena menurunkan suhu dari interaksi probe-RNA yang dapat menyebabkan degradasi RNA.Setelah RNA ditransfer ke membran,

maka membran harus segera disiapkan untuk crosslink RNA dengan sinar UV Tujuan crosslink RNA adalah untuk membuat RNA terikat kuat di membran Nilon Formamida

Prehibridisasi dan hibridisasi dengan probe

4 Tujuan dilakukannya prehibridisasi sebelum hibridisasi adalah memblok bagian nonspecific untuk mencegah probe yang single strand dari mengikat sembarang bagian pada membran.

Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan bahwa probe ini melengkapi semua atau sebagian, dari urutan mRNA target

Probe harus diberi label baik dengan isotop radioaktif (32P) atau dengan chemiluminescence di mana alkali fosfatase atau horseradish peroxidase (HRP) memecah chemiluminescent substrat menghasilkan emisi terdeteksi cahaya

Horseradish peroxidase (HRP) Alkali fosfatase

Pencucian5

Tujuan dari pencucian membran adalah untuk memastikan bahwa probe telah terikat secara khusus dan untuk mencegah sinyal balik yang timbul

Hal ini juga dilakukan untuk menghilangkan unhibridisasi probe, dengan larutan buffer misalnya dengan Sodium Citrate

Sodium Citrate

Deteksi6

Tahapan deteksi dalam Northern Blot dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu :

Radioaktivitas Non-radioaktif

Probe ditandai dengan 32P (atau

33p)

Deteksi dilakukan dengan pewarnaan, misalnya dengan

teknik chemiluminescence

Jika probe radiolabeled selesai digunakan, blot disimpan dalam bungkus pastik agar tidak kering

kemudian membran di autoradiografi dengan X-ray

Perbedaan Tekhnik Southern dan Northern Blotting

Southern Blotting Northern Blotting

Deteksi molekul DNA (ds) mRNA (ss)

Membran Nitroselulosa Nilon

Elektroforesis gel Gel agarosa Gel agarosa formaldehid

Perawatan gel Pemurnian, denaturasi dan netralisasi

-

Metode blotting Transfer melalui kapiler Transfer melalui kapiler

Probes DNA (radioaktif dan nonradioaktif)

cDNA, cRNA (radioaktif dan nonradioaktif)

Sistem deteksi Autoradiography, ChemiluminescentColorimetric

AutoradiographyChemiluminescentColorimetric

DANKE SCHőN !!!