Penerapan Metode DNA di dalam Forensik Entomologi

AbstrakSebuah forensik entomologis investigasi bisa mendapatkan keuntungan dari berbagai metode genotip molekul dipraktekkan secara luas. Yang paling umum digunakan adalah identifikasi spesimen berbasis DNA. Aplikasi lain termasuk identifikasi isi usus serangga dan karakterisasi struktur genetik populasi suatu spesies serangga forensik penting. Aplikasi yang tepat dari prosedur ini menuntut bahwa analis secara teknis ahli. Namun, kita juga harus menyadari dari daftar panjang standar dan harapan bahwa banyak sistem hukum telah dikembangkan untuk analisis DNA forensik. Kami meringkas teknik DNA yang saat ini digunakan dalam, atau telah diusulkan untuk, forensik entomologi dan review didirikan analisis genetik dari bidang ilmiah lainnya yang membahas pertanyaan-pertanyaan serupa dengan yang ada di forensik entomologi. Kami menjelaskan bagaimana standar yang diterima untuk praktek forensik DNA dan validasi metode cenderung untuk menerapkan bukti serangga digunakan dalam kematian atau forensik entomologis investigasi lainnya.

PENDAHULUANAcara televisi populer pendaftaran dalam program pelatihan ilmu forensik

universitas di Amerika Serikat dan Eropa menunjukkan daya tarik yang luas dengan dan mengagumi bagaimana para ilmuwan membantu mengatasi kejahatan (37, 38, 47). Teknologi terus meningkatkan jenis bukti yang membutuhkan kesaksian ahli di pengadilan (34, 65, 80). Pada saat yang sama, para ilmuwan dan anggota dari sistem hukum yang terlibat dalam proses yang sulit untuk membantu hakim membedakan antara baik dan buruk kesaksian mantan nakal. Upaya ini sangat con-tentious ketika metode tradisional yang telah digunakan dalam kasus-kasus yang tak terhitung jumlahnya diperiksa dalam retrospeksi. Namun, keputusan hukum terbaru (42) dan demonstrasi oleh tes DNA dari keyakinan yang salah (58) harus menginspirasi semua ilmuwan forensik untuk menguji kembali metode mereka (29, 42).

Seperti dengan sebagian besar ilmu kehidupan, forensik entomologi semakin meliputi alat-alat biologi molekuler dengan efek bermanfaat untuk menarik orang-orang baru dan dana penelitian ke lapangan. Dalam pengalaman kami staf laboratorium DNA forensik yang khas tidak akan analisis genetik con-duct pada jaringan yang dianggap non-manusia (tapi lihat Referensi 77, 86, 108, dan 109). Akibatnya, seorang peneliti cenderung beralih ke seorang ilmuwan akademik untuk bantuan. Hampir semua universitas riset memiliki seseorang yang kompeten dapat melakukan forensik teknik ge-netic standar seperti mikrosatelit [juga disebut ulangi tandem pendek (STR) alel siz-ing dan mitokondria DNA (mtDNA) se-quencing pada berbagai spesies hewan. Banyak protokol genotip sekarang secara rutin dilakukan dengan menggunakan kit komersial dengan instruksi yang relatif sederhana. Namun, scien-tist harus tahu lebih dari cara menggunakan genotip kit sebelum menjadi terlibat dalam kerja kasus forensik.

Kami meninjau sini metode berbasis DNA yang telah dikembangkan untuk

forensik entomologi, dan mencoba untuk menyorot khusus con-cerns untuk seorang ilmuwan yang menerapkan metode ini dalam penelitian forensik atau kerja kasus. Kami juga mempertimbangkan perkembangan terakhir di bidang-bidang seperti analisis DNA forensik konvensional dan genetika konservasi yang cenderung mengarah pada penggunaan-ful forensik entomologis aplikasi.

APLIKASI UNTUK DNA FORENSIK ENTOMOLOGI

Penentuan spesiesDeterminasi spesies adalah satu-satunya aplikasi genotip sekarang secara rutin

digunakan oleh forensik en-tomologists. Identifikasi akurat dari spesimen-sekte biasanya merupakan langkah pertama yang penting dalam analisis forensik entomologis (95). Spesies bangkai Erat terkait bisa secara substansial berbeda-fer dalam tingkat pertumbuhan (60), respon diapause (8), atau kebiasaan ekologis (63). Karakter anatomi Spesies-diagnostik tidak dikenal untuk tahap belum matang banyak forensik serangga impor-tant, dan tombol yang ada mungkin dalam-lengkap atau sulit untuk nonspecialists untuk digunakan.Sperling et al. (96) adalah yang pertama untuk nyarankan-gest tes berbasis DNA untuk tujuan ini, dan banyak yang mengikutinya (4, 14, 26, 52, 53, 72, 87, 90, 92, 100, 111, 114, 122 , 124, 126, 134). Pendekatan ini sejajar daerah lain ilmu forensik, di mana mengidentifikasi tis-sue sampel bantu dalam penegakan hukum berburu dan konservasi (32, 35), penipuan keprihatinan-ing bernilai tinggi makanan (18, 71), identifikasi perut mayat isi (135), dan situasi numer-ous di mana manusia membedakan dari nonmanusia berguna (19).

Sebagaimana dengan begitu banyak molekul hewan sys-tematics (9), mtDNA telah memainkan peran utama dalam studi genom serangga. Tinggi copy num-ber, haploidy, dan ketersediaan primer mtDNA dilestarikan untuk lebih dari satu dekade (93) membuatnya mudah untuk mendapatkan data sekuens mtDNA dari banyak spesies serangga sebelumnya wajar. Hasilnya adalah pertumbuhan eksplosif dalam data sekuens mtDNA (25). Makalah serangga yang paling forensik spesies-diagnostik berfokus pada beberapa bagian dari gen untuk sitokrom c oksidase subunit satu dan dua (COI + II) (72, 96, 111, 114, 122, 124). Kebetulan, 5 menit akhir COI juga merupakan situs yang diusulkan yang universal barcode DNA hewan (56, 128).

Namun, tidak ada satu disepakati lokus untuk identifikasi berbasis DNA Forensik serangga, dan tidak jelas bahwa mungkin ada. Bahaya mengandalkan satu lokus baik diilustrasikan oleh beberapa penelitian-penelitian baru-baru ini (103, 125). Disarankan target selain COI + II termasuk diperkuat acak DNA poli-morphic (RAPDs) (14, 94, 98, 99), gen untuk 28S ribosom RNA (100), internal daerah spacer ditranskripsi ribosom Somal (87), dan NADH dehidrogenase subunit 5 (134). Beberapa penulis telah memasukkan lebih dari satu lo-cus dalam analisis tunggal (101, 103, 115).

Hampir semua metode berbasis DNA yang diusulkan untuk mengidentifikasi serangga forensik telah menggunakan di-rect sequencing atau teknik PCR-RFLP.

Baru-baru ini mengembangkan spesies-diagnostik metode, seperti pyrosequencing (10), analisis heterodu-plex (16), real-time PCR (127), atau

microarray (13), yang digunakan untuk taksa noninsect, dan kami menduga bahwa metode tersebut akan memainkan peran lebih besar dalam forensik entomologi. Be-menyebabkan berbagai probe oligonukleotida dapat ditempatkan pada sebuah chip microarray tunggal, microarray tunggal dapat diproduksi yang mampu melakukan hampir setiap tugas genotipe diperlukan untuk spesimen serangga forensik.

Populasi Metode genetik dan Isu AnalitisGenotipe hypervariable, yaitu, yang didasarkan pada lokus cenderung

bervariasi antara individu dari spesies yang sama, banyak digunakan oleh para ahli biologi untuk menyimpulkan hal-hal seperti peristiwa evolusi masa lalu dan perilaku tingkat populasi saat ini (119). Banyak literatur entomologi forensik tampaknya berasumsi bahwa spesies serangga mobil-rion sangat mobile, seperti lalat pukulan, ada sebagai populasi seragam di mana individu-individu secara acak campuran. Kami saat ini terbatas di bawah-berdiri apa serangga bangkai tidak ketika jauh dari mayat ini segera mungkin untuk revisi kembali quire, sebagai penyidik telah mulai beradaptasi alat genetika populasi taksa tersebut.

Mendeteksi dan menggunakan variasi geografis.Informasi biologis dasar forensik spesies di-sekte, seperti hubungan suhu dan

pengembangan tingkat menjadi-tween, telah di hampir setiap contoh diperoleh dari seperangkat terbatas lokasi geografis (121). Variasi geografis dalam fenotip untuk spesies luas, mungkin berhubungan dengan variasi genetik, akan menarik bagi ahli entomologi forensik untuk setidaknya dua alasan. Pertama, mungkin perlu untuk mengulang banyak eksperimen di lokasi baru karena data referensi dikembangkan di satu tempat tidak berlaku untuk penyelidikan kematian di tempat berbeda-beda. Kedua, geografis populasi struktur ge-netic bisa memungkinkan untuk menyimpulkan relokasi postmortem mayat jika serangga di dalamnya menunjukkan genotipe nonlokal.

Beberapa besar spesies lalat bangkai yang paling sering digunakan dalam penyelidikan kematian telah diamati untuk membubarkan beberapa kilometer dalam satu hari (12, 48, 81). Mereka tampaknya akan menjadi kandidat miskin untuk isolasi genetik menurut jarak pada skala setidaknya ratusan kilometer. Tentu saja adaptasi terhadap lingkungan lokal mungkin terjadi, dan pada kenyataannya kemerosotan lintang dalam menanggapi diapause telah didokumentasikan selama sarcophagids (64).

Namun, Byrne et al. (23) melaporkan diferensiasi pop-modulasi pada skala geografis baik untuk luas calliphorid Phormia regina. Dalam hal ini, penulis mengukur profil hidrokarbon cu-khususnya, fenotipe yang hampir seluruhnya ditentukan oleh genotipe. Byrne et al. mampu membedakan antara P. regina dari dua daerah sekitar 70 km di bagian tenggara negara bagian Washington. Hasil ini mengejutkan mengingat mobilitas yang luar biasa dari serangga ini (121). Beberapa survei daerah molekuler genetik yang telah dilakukan pada Calliphoridae tidak menyarankan penghalang untuk aliran gen lebih dari jarak ribuan kilometer (102, 104, 113, 126), namun, studi ini sebagian besar didasarkan pada mtDNA-coding daerah, yang mungkin terlalu dilestarikan untuk mendeteksi apa pun selain isolasi

sejarah yang ekstrim. Wajib para-sitism tampaknya untuk mempromosikan mekanisme yang berbeda aliran gen di calliphorids, mengingat bahwa survei mtDNA sama menemukan variasi regional dalam screwworm primer lalat Cochliomyia ho-minivorax dan Chrysomya bezziana (49, 104, 110).

Penyelidikan dari populasi Genetik serangga forensik penting adalah di dalam-mewah meskipun praktis pentingnya subjek. Karena penelitian tersebut mungkin oc-skr di masa depan, kami ingin menarik di-inginannya untuk bidang yang sama penelitian biologi, khususnya di bidang populasi Genet-ics, pengendalian hama, dan biologi konservasi. Alat-alat untuk melakukan analisis tersebut adalah sia-sia-bisa untuk berbagai arthropoda, ter-masuk beberapa relevansi forensik. Ini termasuk mikrosatelit (40, 44, 106, 107, 118), ampli-fied panjang fragmen polymorphism (AFLP) (11), RAPDs (98, 99), dan polimorfisme nukleotida tunggal (62, 69). Berdasarkan atau-ganisms yang beberapa perpustakaan microsatel-lite telah dikembangkan (terutama calliphorids), identifikasi tingkat populasi pukulan lalat menggunakan teknik ini sekarang harus mungkin (lihat di bawah). Meskipun mudah gen-erated dari genom baru, profil RAPD telah terbukti sulit untuk mereproduksi (70, 84). Metode AFLP (112) sekarang digunakan pada berbagai taksa, termasuk calliphorids parasit (11). Penelitian jauh lebih sedikit telah dilakukan pada serangga polimorfisme nukleotida tunggal.

Penggunaan lokus mikrosatelit kini telah menjadi didirikan di banyak ilmiah murid-plines sebagai standar emas untuk menjelaskan tingkat populasi variasi genetik. Salah satu keuntungan utama menggunakan lokus mikrosatelit atas beberapa teknik lainnya adalah kemampuan untuk kembali liably mengenali alel dan (memberikan kondisi tertentu terpenuhi) untuk menafsirkan data genetik hasil-ing menggunakan analisis Mendel / Hardy-Weinberg berbasis konvensional kuat. Disiplin di mana data mikrosatelit telah terbukti berharga dalam menggambarkan populasi organisme termasuk biologi konservasi dan pengelolaan perikanan, dan beberapa metode yang dikembangkan dalam disiplin ilmu ini bisa dengan mudah meminjamkan diri untuk analisis tingkat populasi serangga kepentingan forensik.

Kepentingan tertentu adalah tugas teknik-teknik yang digunakan dalam biologi perikanan salmon sebagai-tanda ikan yang tidak diketahui asalnya tertangkap di laut ke sungai natal asalnya (untuk rincian lebih lanjut, lihat Referensi 39, 61, dan 85). Dalam murid-Pline, sebagian besar didorong oleh kebutuhan data konservasi stok ikan akurat dan isu-isu politis terkait, ikan bermigrasi individu dapat ditugaskan untuk sungai natal mereka dalam DAS (misalnya, Sungai Penobscot, Maine, 97). Dalam konteks forensik entomologi, contoh analog mungkin menugaskan spesimen serangga untuk populasi geografis tertentu. Perkembangan genetik metode menetapkan-ment (73) berarti bahwa tes sekarang dapat mengidentifikasi dengan derajat didefinisikan dari con-fidence ketika seorang individu yang tidak diketahui asalnya dapat dikecualikan dari memiliki berasal dari salah satu populasi termasuk dalam baseline populasi diduga (30). Kritis, dari sudut pandang forensik, ini berarti bahwa bahkan jika populasi asal belum dimasukkan dalam analisis awal, serangga yang tidak diketahui asalnya tidak akan keliru ditugaskan dan dapat dikecualikan dari para penduduk yang telah dianalisis. Memberikan tugas adalah statistik yang kuat, kemampuan untuk menentukan asal ge-ographic menawarkan tambahan yang kuat

untuk setiap forensik entomologi toolbox.Disiplin lain di mana analisis mi-crosatellite lokus telah digunakan secara luas untuk menilai tingkat lokal keanekaragaman hayati subspecific dan untuk melacak gerakan serangga biologi konservasi dan pengelolaan hama serangga. Dalam konservasi serangga sampai saat ini, penelitian telah sering berfokus pada kelompok karismatik yang lebih besar di-sekte, termasuk Lepidoptera (7) dan Odonata (118), dan studi tentang hama tanaman sering berfokus pada hama tanaman yang bernilai lebih tinggi, misalnya buah (17, 116) dan kapas (59). Barangkali relevansi paling langsung ke dis-cipline forensik entomologi adalah studi tingkat populasi yang sedang berlangsung dari New World screwworm, C. hominivorax, di Amerika Selatan dan Tengah (106, 107), dan suite lokus mikrosatelit diidentifikasi oleh Florin & Gyllenstrand (44) untuk pukulan lalat Lucilia ser-icata dan Lucilia illustris.

Dengan demikian, alat-alat yang tersedia, dan pertanyaan utama masih beredar adalah, Apa yang merupakan ukuran sampel awal yang cocok untuk memastikan tugas sta-tistically kuat diketahui spesimen yang ke populasi asal mereka? Sekali lagi, jawaban atas pertanyaan ini tergantung pada num-ber faktor termasuk tingkat imigrasi dan emigrasi, waktu generasi, dan popu-lation ukuran. Sekali lagi, biologi perikanan tampaknya menjadi salah satu dari beberapa daerah di mana faktor-faktor ini telah resmi ditangani. Menggunakan data dari koleksi besar larva cod (Gadus morhua) dari daerah tunggal, Ruzzante (89) un-dertook studi simulasi untuk menguji ef-fect ukuran sampel pada tujuh metrik jarak genetik dan dua metrik struktur berdasarkan data lokus mikrosatelit dan datang ke con clusion bahwa ikan ini ukuran sampel spesies antara 50 dan 100 individu per kependudukan umumnya diperlukan untuk tepat es-timation jarak genetik. Selain itu, jumlah orang yang dibutuhkan tergantung pada jumlah lokus, jumlah alel, dan berbagai ukuran alel pada populasi awal; ukuran sampel yang kecil menghasilkan bias yang signifikan dalam jarak genetik. Simulasi selanjutnya untuk menilai karakteristik metode jarak dan kemungkinan (termasuk metode Bayesian) oleh Cornuet et al. (30) menunjukkan bahwa lokus tambahan meningkatkan kemampuan untuk menetapkan individu benar untuk suatu tingkat diferensiasi antara populasi. Jadi, semua hal lain dianggap sama, kekuatan tugas meningkat dengan setiap lokus tambahan yang ditambahkan ke panel lokus digunakan untuk menandai satu set data dasar dan, kemudian, untuk menetapkan individu-als asal tidak diketahui.

Sayangnya, dari studi yang dilakukan sampai saat ini yang memungkinkan masalah ini untuk disikapi (50, 59, 79), tampak bahwa genom arthro-pod mungkin berisi frekuensi yang lebih rendah dari urutan mikrosatelit daripada genom vertebrata. Akibatnya, isolasi lokus mikrosatelit digunakan dari serangga ini tidak semudah seperti yang telah untuk, misalnya, biologi perikanan, dimana peneliti memiliki kemewahan untuk memilih dari ribuan lokus tersedia dan primer set yang dikaitkan. Misalnya, di pondok bollworm, Helicoverpa armigera, over-semua efisiensi mikrosatelit-kloning hanya 2,5%, yang kira-kira delapan kali lipat lebih rendah dari itu untuk ikan gadoid (20%) menggunakan protokol pengayaan yang sama (59).Genotip Isi Gut Serangga

Analisis genetik Forensik usus serangga con-tenda memiliki beberapa kegunaan potensial (24). JDW telah menerapkan pendekatan ini dalam kematian

beberapa investigasi-kewajiban. Sebuah genotipe manusia dapat pulih dari makan nyamuk (31), dan informasi ini bisa menempatkan tersangka di lokasi di mana nyamuk ditemukan. Demikian pula, darah di kutu ditransfer selama serangan seksual dapat mengidentifikasi penyerang (68, 76, 88). Meskipun pencernaan preoral parsial mereka, bangkai lalat belatung isi usus dapat cocok untuk semua tipikal kal identitas prosedur genetik manusia (27, 66, 67, 91, 120, 133). Sebagaimana disebutkan di atas, tubuh kadang-kadang pindah setelah kematian, dan mag-harus ditinggalkan dapat mengungkapkan identitas dari almarhum (120). Pertanyaan lain juga bisa dijawab oleh genotipe konten usus (24). Suatu persyaratan penting untuk memulihkan DNA vertebrata dari serangga hidup adalah bahwa pencernaan proses dihentikan sesegera mungkin dengan membunuh dan melestarikan spesimen. Setelah makan telah berhenti, usus dari hematophagous atau bangkai-makan serangga dapat dikosongkan dari kita-mampu DNA dalam waktu kurang dari 24 jam (31, 66). Namun, penelitian DNA forensik terus improvisasi-ing kemampuan untuk andal ciri de-dinilai dan / atau menyalin rendah DNA template (34). Seperti begitu banyak lainnya forensik biologis ev-idence, isi usus serangga sebelumnya unsuit-mampu untuk analisis mungkin sekarang atau dalam waktu dekat akan berhasil genotipe.

MASALAH KHUSUS UNTUK MELAKUKAN FORENSIK DNAPedoman ekstensif telah dikembangkan untuk identitas manusia berbasis DNA

dan pengujian paternitas di Amerika Serikat (3, 21, 22, 78). Sebagaimana dinyatakan di atas, seorang analis yang bukan anggota komunitas DNA forensik utama mungkin diminta untuk melakukan analisis DNA forensik serangga. Ini mungkin tidak dimungkinkan atau diperlukan agar sesuai dengan setiap standar pengujian manusia ketika menganalisis jaringan bukan manusia, namun perlu menyadari isu penting bahwa alamat standar dan dari expec-sultasi anggota masyarakat hukum mungkin memiliki dari seorang analis DNA forensik.

Quality ControlSelain metode validasi dan data isu-terpretation, mendokumentasikan lacak

balak dan menjaga keamanan fisik dari sampel sangat penting. DNA Prosedur ekstraksi-tion harus mencakup negatif kendali, dan prosedur harus genotip mencakup kontrol positif dan negatif. Jika mungkin, sebagian dari jaringan asli harus disimpan sehingga tersedia untuk pengujian independen.

Memilih Metode ValidFitur inti validasi metode adalah bahwa prosedur ini harus ditunjukkan oleh

masa lalu expe-rience dapat diandalkan. Bukti untuk keandalan meliputi catatan ekstensif reproducibil-ity di bawah kondisi kerja tertentu, baik ketika dilakukan oleh analis yang sama dan oleh para analis yang berbeda. Langkah-langkah rumit yang diambil untuk memvalidasi tes DNA forensik manusia di Amerika Serikat (105) mungkin tidak yang praktis untuk sampel serangga. Namun, masih es-sential bahwa kehandalan metode ini akan dinilai untuk kepentingan analis dan sistem hukum. Sebuah metode baru yang menjanjikan dapat menjadi kekecewaan. Misalnya, RAPD sempat dianggap metode geno-mengetik semua tujuan yang dapat diterapkan untuk

setiap organisme (129), tetapi genotipe hewan RAPD dengan cepat dilaporkan sulit untuk repro-Duce (70, 84). Sebuah metode yang telah banyak digunakan oleh para ilmuwan selama bertahun-tahun dan pada berbagai jenis sampel harus dipilih jika memungkinkan. Analis harus memiliki pengalaman mempertimbangkan-mampu dengan metode genotyp-ing tertentu, sebaiknya dengan catatan ac-complishment seperti publikasi ilmiah yang didasarkan pada jenis yang sama analisis. Sebuah deskripsi tion semua aspek laboratorium protokol yang digunakan (misalnya, urutan primer PCR) harus disediakan dalam menanggapi permintaan yang masuk akal.

Perhitungan probabilitasAplikasi khas probabilitas dan statistik untuk data genetik forensik terfokus

pada menyimpulkan identitas (misalnya, Lakukan dua atau lebih sampel tis-sue berasal dari individu yang sama?) Atau kekerabatan (41). Sedikit perhatian tampaknya telah dibayarkan kepada aplikasi yang paling com-mon di forensik entomologi: spesies diagnosa. Hal ini sangat disayangkan karena tanpa kerangka statistical mungkin sulit untuk mengetahui jika penelitian dasar yang mendukung metode telah memadai untuk masalah yang dihadapi. Beberapa makalah telah menganjurkan forensik serangga identifikasi spesies dengan filogenetik analisi-sis data sekuens (53, 100, 114, 122, 124). Meskipun ukuran kuat dukungan, seperti nilai bootstrap (43) untuk cabang yang menghubungkan spesimen bukti untuk spesimen referensi diketahui, mungkin tampaknya menunjukkan tes yang handal, hasil ini mengatakan apa-apa tentang seberapa baik analisis yang sama kemungkinan untuk bekerja dengan spesimen masa depan. Ini adalah pertanyaan ini yang harus de-tapkan apakah tes diagnostik spesies telah divalidasi. Berapa ukuran sampel penelitian memadai untuk uji spesies-diagnostik untuk digunakan di pengadilan?

Meskipun penelitian lebih lanjut diperlukan pertanyaan ini statistik, kami sarankan panduan heuristik berikut untuk mengestimasi min-Imum validasi ukuran sampel penelitian. Masalah adalah salah satu memperkirakan proporsi populasi yang relevan yang akan misidentified menggunakan prosedur yang diusulkan. Selama uji validasi, sebuah "dikenal" spesimen, typ-turun tajam serangga dewasa yang diidentifikasi oleh morfologi, dianalisis seolah-olah sebuah "tidak dikenal" (126). Ini menyajikan binomial out-datang. Spesimen baik benar atau salah diidentifikasi menggunakan kriteria uji. Mengingat sampel acak dari populasi, interval keyakinan binomial (28) dapat digunakan untuk memperkirakan proporsi dari individuals dalam suatu populasi yang akan menghasilkan baik hasil. Misalnya, jika 100 diketahui spesimen sampel dan semua menghasilkan genotipe yang akan diidentifikasi dengan benar, maka setiap genotipe hipotetis (s) yang akan salah mengartikannya diamati 0/100 kali. A 95% confidence interval binomial tentang proporsi sebenarnya dari hasil diamati 0/100 kali adalah 0,0295. Kata lain, jika kemungkinan metode gagal adalah sebagai besar sebagai 0,0295, maka akan tidak mungkin untuk ob-melayani 0/100 kegagalan selama studi validasi. Dengan pendekatan ini kita dapat memilih ukuran sampel sesuai dengan apa pun yang menganggap probabilitas diterima kegagalan. Diakui, logika ini sederhana dan tidak mempertimbangkan kemungkinan faktor yang dapat meningkatkan ukuran sampel de-bapak seperti variasi geografis. Namun, kami percaya bahwa para peneliti tidak harus bergantung pada sampel

validasi yang lebih kecil daripada yang ditunjukkan oleh perhitungan ini.Meskipun forensik entomologi belum menyertakan identitas genetik atau

pengujian kekerabatan DNA serangga, ini mungkin terjadi dan valida-tion akan diperlukan. Untuk aplikasi ini perhitungan statistik biasanya termasuk es-timates proporsi alel dan setiap penyimpangan dari keseimbangan Hardy-Weinberg (HWE) atau linkage ekuilibrium (LE) (41, 78). Bahkan jika kondisi HWE dan LE berlaku, maka probabilitas tadinya relatif kecil bahwa dua individu yang tidak berhubungan akan memiliki genotipe yang sama dapat dihitung secara konservatif tanpa proporsi alel memperkirakan jika kita memeriksa sejumlah besar lokus heterozigot (74). Bagaimana-pernah, sejarah analisis forensik dari kubah-tic pet DNA di Amerika Serikat nyarankan-gests bahwa sistem hukum sekarang akrab dengan sejumlah besar data kependudukan yang mendasari analisis STR manusia cenderung mengharapkan dukungan serupa untuk analisis DNA bukan manusia . Kesaksian perintis dalam kasus pembunuhan anjing yang berkenaan probabilitas genotipe berdasarkan sampel populasi yang tidak dipublikasikan dari sekitar 100 orang ditemukan tidak dapat diterima (117), mendorong publikasi sampel yang jauh lebih luas dari lokus dan berkembang biak (33). Weir (119) menjelaskan metode untuk memperkirakan proporsi alel dari data populasi.

Kesalahan umum dalam DNA Berbasis Spesies IdentifikasiDalam rangka upaya kami untuk mengembangkan dan menggunakan metode

identifikasi berbasis mtDNA untuk serangga forensik penting, kita memiliki ampli-fied apa itu rupanya pseudogene ketika menggunakan primer dikembangkan untuk jauh hubungan-tive, menemukan bahwa spesimen untuk sebuah pub-likasikan dan merekam urutan sering dikutip telah salah diidentifikasi (123), dan menemukan bahwa lokus yang muncul untuk membedakan antara kerabat dekat setelah pengambilan sampel tambahan tidak cocok untuk tujuan ini (lihat di bawah).Perangkap potensial mencoba serangga identifikasi spesies forensik berdasarkan DNA es-pecially banyak mengingat bahwa banyak keterampilan laboratorium ba-sic begitu banyak dipraktekkan oleh para ilmuwan lain terbiasa dengan masalah interpretasi data penting.

Mungkin salah mengambil amatir paling umum adalah identifikasi spesies oleh pencarian BLAST kritis dari besar dan mudah tanya GenBank / EMBL / DDBJ urutan database (83). Pencarian tersebut mengembalikan catatan dengan persen kesamaan tertinggi dengan urutan pertanyaan disebutkan. Sebuah pencarian BLAST adalah cara con-venient untuk mendapatkan gambaran umum tentang apa yang mungkin menjadi sampel, tetapi dengan sendirinya merupakan metode unreli-bisa karena kesenjangan dan kesalahan dalam database.Analis harus cukup akrab dengan taksonomi dan biologi dari organisme yang relevan untuk mengetahui apakah calon spesies, misalnya, salah satu bahwa sampel bukti mungkin, mengingat hasil genetik dan keadaan koleksinya, hilang dari database. Sampai aspek database referensi complete, seseorang tidak bisa memastikan bahwa semua kerabat dekat dapat dibedakan dengan menggunakan tes genetik tertentu. Peneliti individu menyerahkan mereka-hasil ke GenBank. Meskipun beberapa kesalahan kotor secara otomatis terdeteksi, misalnya, proteincoding gen dengan

kodon berhenti di center akan langsung ditolak, terserah kepada Pengirim individu untuk menghindari kesalahan urutan lain dan untuk benar mengidentifikasi organisme. Menerbitkan rekor untuk lokus noncoding seperti daerah kontrol mtDNA sangat penuh dengan kesalahan (51,132). Bahkan manusia mtDNA Cambridge Referensi Sequence (5), standar yang digunakan untuk pelaporan haplotype manusia dalam kerja kasus forensik, kemudian diubah (6). Banyak kesalahan GenBank lainnya juga telah diidentifikasi (20).

Oleh karena itu, sumber referensi genotipe harus diketahui sebelum dapat dipercaya, dan ini biasanya membutuhkan pengawasan dari pub-lication dari mana ia diambil. Apakah seorang ahli Taxoekonomi mengidentifikasi spesimen? Apakah pekerjaan direplikasi? Apakah materi voucher telah disimpan untuk analisis masa depan konfirmasi independen? Apakah ada kesepakatan antara pengajuan independen dikaitkan dengan spesies yang sama? Sebuah contoh dari kontrol kualitas untuk identifikasi berbasis urutan Saksi untuk situs Web Paus (36). Urutan mtDNA dalam arsip ini semua dari spesimen ahli diidentifikasi, dan daftar spesies lengkap.Beberapa ilmuwan yang mengembangkan data referensi mereka sendiri ditetapkan untuk tujuan identifikasi forensik serangga diabaikan untuk mempertimbangkan apakah pemilihan spesies bisa log-turun tajam mendukung seperti tes. Misalnya, Ratcliffe dkk. (87) menyatakan bahwa PCR-RFLP dari daerah internal transcribed spacer memberikan "identifikasi akurat forensi-Cally penting [terbang] spesies." Ini kesimpulan yang didasarkan pada demonstrasi mereka bahwa masing-masing 10 spesies forensik penting menghasilkan PCR unik -RFLP pola. Bagaimana-pernah, Ratcliffe dkk. (87) tidak mengevaluasi sev-eral umum dan forensik penting kerabat dekat dari spesies studi mereka, termasuk kerabat dekat yang dapat co-terjadi dengan lalat mereka menyelidiki. Hal ini tidak diketahui apakah mereka prosedur-dure membedakan antara spesies mereka mantan amined, misalnya, Calliphora vicina, dan satu mereka tidak memeriksa yang mungkin mudah ditemukan di mayat yang sama, misalnya, Calliphora vomitoria. Al-meskipun metode mereka dapat membuktikan berharga untuk tujuan ini, seseorang tidak bisa mengatakan dari hasil penelitian ini tertentu. mtDNA filogeni terkenal untuk mengungkapkan paraphyly sehubungan dengan spesies yang dekat kekerabatannya (45). Setiap penyimpangan dari timbal balik monophyly (75) dengan lokus uji bermasalah untuk diagnosis spesies (126). Al-meskipun timbal balik monophyly harus mengembangkan lebih cepat di mtDNA dari lo-cus nuklir (82, tapi lihat 57), pengalaman hanya akan menunjukkan apakah hal ini terjadi. Berikut mantan amples dimaksudkan untuk menunjukkan bagaimana metode awalnya menjanjikan mungkin atau mungkin tidak menahan dicermati lebih lanjut. Kedua contoh didasarkan setidaknya sebagian pada penggunaan filogenetik anal-ysis urutan COI untuk mengidentifikasi anggota dari garis keturunan yang calliphorid.

The subfamili Chrysomyinae termasuk screwworms dan kerabat dekat mereka (48). Sequencing inisial dari satu atau dua orang dari masing-masing spesies forensik penting dari Kanada dan Amerika Serikat tidak menemukan haplotype dibagi antara spesies dan persentase penyimpangan dis-tinctly besar antara spesies daripada di dalam spesies (124). Perbandingan berikutnya homolog urutan perwakilan-senting ratusan spesimen chrysomyine dan sejumlah kecil perwakilan spesimen luar kelompok dikonfirmasi pola ini, dengan tidak ada hubungan positif palsu atau

negatif-palsu dari salah satu "tes" haplotype dengan haplotype merujuk-ence (126). Hal ini dapat dibandingkan dengan awal, tapi masih cukup besar (dibandingkan

dengan kebanyakan studi), sampel greenbottle lalat (Luciliinae) difokuskan pada luas dan penting adik spesies Lucilia sericata dan Lu-silia cuprina. Sebuah sampel global yang diproduksi filogeni sur-prizing, tapi tidak satu mendorong kami untuk kembali byek penggunaan COI untuk membedakan spesies ini. Filogeni berdasarkan DNA ribosom 28S dan COI dari sampel global spesimen yang sumbang (103). L. sericata dan L. cuprina masing-masing monofiletik untuk 28S tapi paraphyletic untuk COI. Namun, COI pat-tern tampaknya lebih bermakna daripada kurangnya sederhana keturunan penyortiran oleh L. cuprina haplotipe. Monophyly L. cuprina COI dilanggar oleh keturunan Hawaii yang monofiletik itu sendiri dan berbeda (Gambar 1). Kami menyimpulkan bahwa Hawaii mtDNA silsilah adalah unik ke pulau-pulau, dan bahwa setelah pengakuan tes berbasis COI akan cor-secara tidak langsung mengidentifikasi satu spesies ini baik sebagai L. sericata, L. cuprina Hawaii, atau L. cuprina non-Hawaii.

Sebagai tambahan GenBank catatan untuk spesies hijau botol telah muncul, namun, mereka termasuk Asia COI catatan untuk L. cuprina dan Hemipyrelia ligurriens yang sangat mirip urutan Hawaii kami, dan ada contoh dari monophyly timbal balik antara spesies adik telah ditemukan (125) (Gambar 2). Meskipun tes diagnostik spesies-berbasis COI mungkin masih berguna untuk lalat greenbottle dalam kondisi tertentu, seperti jika hanya spesies greenbottle dis-tantly terkait beberapa terjadi di daerah penelitian, semakin besar pola filogenetik untuk lokus ini membutuhkan sampel besar sebelum metode tersebut dapat dianggap sah.

KESIMPULANKami percaya bahwa metode berbasis DNA yang dijelaskan dalam kajian ini akan semakin digunakan dalam forensik entomologi penelitian dan kasus-pekerjaan di seluruh dunia. Banyak kesempatan, hubungan yang ada bagi para ilmuwan dengan keterampilan biologi molekuler untuk terlibat dalam bidang ini menarik, yang menghadapkan substansial dunia nyata prob-masalah. Yang paling penting, untuk menghindari keguguran keadilan, tetapi juga untuk mempromosikan penerimaan oleh pengadilan metode-metode baru, kami mendesak para ilmuwan tertarik untuk membiasakan diri dengan standar lokal untuk kesaksian ahli dan literatur yang diterbitkan substansial keprihatinan-ing validasi ilmu forensik.

PERNYATAAN PENGUNGKAPAN KESIMPULANKami percaya bahwa metode berbasis DNA yang dijelaskan dalam kajian ini akan semakin digunakan dalam forensik entomologi penelitian dan kasus-pekerjaan di seluruh dunia. Banyak kesempatan, hubungan yang ada bagi para ilmuwan dengan keterampilan biologi molekuler untuk terlibat dalam bidang ini menarik, yang menghadapkan substansial dunia nyata prob-masalah. Yang paling penting, untuk menghindari keguguran keadilan, tetapi juga untuk mempromosikan penerimaan oleh pengadilan metode-metode baru, kami mendesak para ilmuwan tertarik untuk membiasakan diri dengan standar lokal untuk kesaksian ahli dan literatur yang diterbitkan substansial keprihatinan-ing validasi ilmu forensik.

POIN RINGKASAN1. Metode genotip molekul yang digunakan saat ini, atau kemungkinan akan digunakan, oleh ahli entomologi forensik secara luas digunakan oleh para ilmuwan di bidang lain.2. Karena anggota staf laboratorium DNA forensik biasanya tidak menerima sampel asing seperti serangga, anggota tim investigasi akan meminta seorang ilmuwan akademik melakukan analisis genetik.3. Seorang ilmuwan dihadapkan dengan prospek menarik dari pekerjaan forensik mungkin belum terbiasa dengan standar analisis yang diharapkan dan sifat permusuhan dari banyak sistem hukum.4. Banyak masalah hukum dan profesional yang relevan mengenai DNA forensik dirangkum dalam rangka untuk mengingatkan seorang ahli biologi molekuler yang mungkin terlibat dalam kerja kasus.5. Contoh dari aplikasi yang lebih matang genotip, forensik yaitu manusia, biologi konservasi, dan manajemen hama, mungkin berguna untuk program penelitian untuk pengembangan lebih lanjut dari aplikasi berbasis DNA untuk forensik entomologi.Penulis tidak mengetahui adanya bias yang mungkin dianggap sebagai mempengaruhi objektivitas ulasan ini.

UCAPAN TERIMA KASIH'Penulis penelitian tentang topik ini didukung oleh US National Institute of Justice (JDW) dan Inggris Wellcome Trust dan Alam Lingkungan Research Council (JRS). Pandangan yang dikemukakan adalah dari penulis dan belum tentu orang-orang dari lembaga pemberian.