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IV REUNIÓN DE USUARIOS DE SISTEMAS UPLC

Procedimientos de diagnóstico y mantenimiento de sistemas UPLC

Madrid, 24 de Enero 2012


Test de Estanqueidad en Bombas


Bombas en sistemas ACQUITY UPLC

Existen dos tipos de bomba: – Binaria (BSM): 2 bombas en paralelo _2 cabezales cada una (mezcla

a alta presión). o ACQUITY UPLC: hasta 15000 psi. o ACQUITY UPLC I-Class: hasta 18000 psi.

– Cuaternaria (QSM): 1 bomba_2 cabezales (mezcla a baja presión). o ACQUITY UPLC H-Class/Bio: hasta 15000 psi.

Cabezales trabajan en serie.

– Primario → Acumulador


Funcionamiento de los cabezales

Primario Acumulador

Llenado lento del primario

Pre compresión del primario

Vaciado rápido del primario

Vaciado sostenido del acumulador

Llenado rápido del acumulador

Primario Acumulador

Vel. sistema ≈ Presión

t

Vel. relativa

0

-

+

Salida

Entrada


Funcionamiento de los cabezales

Funcionamiento correcto:

Funcionamiento errático


Test de estanqueidad en bombas

¿Por qué se realiza? – Para detectar posibles fugas en la bomba.

¿Cuándo se realiza?

– Después del mantenimiento de las bombas. – Al observar repetidamente oscilaciones de presión. – Falta de reproducibilidad en los tiempos de retención. – Cuando se sospeche que hay una fuga o una válvula defectuosa. – Después de cambiar tubos o conexiones en el sistema de bombeo.

¿Cómo se realiza? – Usando Metanol como solvente. – Habiendo bombeado a 4500 psi (310 bar) durante 5-10 minutos

antes de realizar el test.



Accesibles desde la consola y realizables sin herramientas.

Existen dos tipos de Test de estanqueidad: – Static Decay Test:

o Disponible en ACQUITY UPLC (versión de ICOP <1.50).

o Reservado para servicio técnico en ACQUITY UPLC H-Class/I-Class.

– Dynamic Leak Test:

o Disponible para todas las bombas ACQUITY UPLC.

Se realiza el test en el cabezal Acumulador y si se supera, se realiza en el cabezal Primario.



Test Primario Test acumulador Bomba Binaria

Bomba Cuaternaria



Bomba a comprobar (A ó B)

Presión del test

Static Decay Test:



Static Decay Test:

– Se comprime el cabezal a la presión establecida.

– Se monitoriza la caída de presión (Pressure Decay).

– Criterios de superación:

o Cada cabezal llega al valor de presión establecido.

o La caída de presión (Pressure Decay) es <500 psi/min.

o En el cabezal primario no incrementa la presión al hacer el test en

el cabezal acumulador.



Static Decay Test:



Dynamic Leak Test:



Dynamic Leak Test:

– Se comprime el cabezal a la presión establecida

– Se mantiene la presión por movimientos del émbolo

– La fuga detectada (Leak rate) se calcula por el movimiento requerido

por el émbolo para mantener la presión

– Criterios de superación:

o Cada cabezal llega al valor de presión establecido

o La fuga detectada (Leak rate) es <150 nL/min

o En el cabezal primario no incrementa la presión al hacer el test en

el cabezal acumulador



Dynamic Leak Test:


Test de Estanqueidad en Inyectores


Inyectores en sistemas ACQUITY UPLC

Existen dos tipos de inyectores:

– Sample Manager

o ACQUITY UPLC

o ACQUITY UPLC I-Class – Sample Manager – FL (Fixed Loop)

– Sample Manager - FTN (Flow Through Needle)

o ACQUITY UPLC H-Class/Bio

o ACQUITY UPLC I-Class


Test de estanqueidad en Inyectores

¿Por qué se realizan? – Para detectar posibles fugas en los componentes del inyector.

¿Cuándo se realiza?

– Después del mantenimiento del inyector. – Al observar problemas de reproducibilidad. – Cuando se sospeche que hay una fuga o elemento defectuoso. – Después de cambiar componentes del sistema de inyección.

¿Cómo se realiza? – Usando Metanol como solvente. – Habiendo purgado bien el inyector.

Accesibles desde la consola y realizables sin herramientas.



Test en SM: – Sample Syringe Leak Test

o Comprueba la integridad de la jeringa de muestra – Wash Syringes Leak Test

o Comprueba la integridad de las jeringas de lavado (Weak & Strong) – Needle Seal Leak Test

o Comprueba la estanqueidad del sello de la aguja – Back Pressure Regulator Test

o Comprueba el funcionamiento de la válvula de seguridad de sobrepresión

Principios: – El inyector se coloca en posición cerrada – Se comprime hasta cierta presión – Se estabiliza y vuelve a comprimir – Se monitoriza la perdida de presión



Sample Syringe Leak Test:




– La compresión se realiza con la jeringa

de muestra

– Se comprime a 150 psi

– Debe haber un delta ≤ 95 psi

Monitorización

Test Fallido

Test Superado



Wash Syringes Leak Test:



Wash Syringes Leak Test:

– La compresión se realiza con

cada jeringa de lavado

– Se comprime a 190 psi

– Debe haber un delta ≤ 40 psi

Test Superado

Weak Strong



Needle seal Leak Test:



Needle seal Leak Test:

– Se comprime a 100 psi.

– Debe haber delta ≤ 75 psi.

Weak solvent

Sello

Aguja



Back Pressure Regulator Test:



Back Pressure Regulator Test:

– Se comprime a > 150 psi.

– Se monitoriza que la presión se

mantenga estable a 150 psi por la

apertura del BPR.

Regulador de Sobrepresión

(150 psi)



Test en SM-FTN:

– Sample Syringe Leak Test:

o Comprueba la integridad de la jeringa de muestra.

– Dynamic Leak Test:

o Comprueba la estanqueidad del inyector (junto con la bomba).



Sample Syringe Leak Test: – El inyector se coloca en posición cerrada.

– La jeringa comprime hasta cierta presión.

– Se estabiliza y vuelve a comprimir.

– Se monitoriza la presión.

Monitorización



Dynamic Leak Test:



Dynamic Leak Test:

Test Primario Test acumulador

A B

A

B

Bomba Cuaternaria


Células de Luz Guiada de detectores UPLC


Células de flujo de luz guiada ¿Por qué son necesarias?

La tecnología UPLC produce picos de pequeño volumen

Para evitar el ensanchamiento y mantener la concentración, el

volumen de la célula debe ser igualmente pequeño.

Si se utilizaran células convencionales, el paso de luz debería

reducirse resultando en una perdida de sensibilidad.

Waters ha diseñado las células de flujo de luz guiada que tienen

una longitud óptima de la trayectoria y un rendimiento lumínico

elevado.


Diseño de la célula en detectores UPLC

Célula de flujo de luz guiada UPLC™ – 10 mm de paso de luz, 0.010”, y 500 nL de volumen

– El canal de paso de luz está situado en el interior de un tubo de Teflon® AF

– Hay una reflexión interna total de la luz en las paredes, de forma similar al producido en fibra óptica

α Teflon® AF

agua

d

Teflon® AF

Célula de Tubo de Teflon® AF A = ε. c. l


Células de flujo de luz guiada

Las células de flujo con paso de luz guiado son una fibra óptica: – El revestimiento es Teflon® AF – El núcleo es la muestra líquida

La luz se refleja en el Teflon transmitiéndose por la célula sin pérdidas.


Células convencionales

El diseño de las células de detección convencionales (que normalmente son de acero inoxidable) impide que la luz toque las paredes de la célula para evitar que esto afecte a la señal medida. Los rayos “errantes” que aparecen cuando el haz de luz toca la pared, tienen cierta energía que varía dependiendo de la fase móvil y la calidad del acabado de la pared de la célula, que nunca refleja el 100%, o el ensuciamiento de la misma.


Células de luz guiada

En las células de luz guiada el funcionamiento es el opuesto. La luz debe rebotar en las paredes para aumentar el paso óptico. Las paredes son de un material especial (Teflon® AF) de carácter especular. La reflexión en las paredes es del 100% (TOTAL INTERNAL REFLECTION= TIR).


¿Qué efecto produce el ensuciamiento de la célula?

Cualquier suciedad depositada en las paredes de una célula de luz guiada puede dar lugar a efectos indeseados como es la dispersión de la luz o la absorción de parte de la energía del haz, con lo que disminuye la energía del haz saliente.

Las consecuencias de este efecto pueden ser, entre otras: ruido en la línea base, bajos niveles de energía o fallos en la calibración.


¿Qué efecto produce el ensuciamiento de la célula?

Las células de detector de luz guiada pueden, con el tiempo, hacer que los cromatogramas presenten curvaturas en la línea base.

Esto se atribuye a cambios en las características ópticas de la superficie reflectante interna debido a suciedad.

Otro efecto producido por una célula sucia es el aumento de ruido aleatorio en la línea de base

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.206-Oct-2005 11:09:15 grdswp1114.arw

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4

-15

-10

-5

0

5

x 10-3 06-Oct-2005 11:09:15 grdswp1114.arw

Ejemplo de curvatura en la línea base: El diagrama superior representa el cromatograma de una separación en gradiente. El diagrama inferior es una ampliación en el eje vertical para mostrar más claramente la magnitud de la curvatura.


¿Cómo se detecta si una célula está sucia?

– Midiendo la Energía del Detector


Medida de la Energía Detector TUV

Medir la energía a 230 nm pasando agua por la célula

Si la célula está limpia la energía de referencia y muestra deben ser similares.

Si la energía de muestra es mucho mas baja indica que la célula está sucia o estropeada.


Medida de la Energía Detector PDA


Medida de la Energía Detector PDA

Medir la energía pasando agua por la célula Dejar los valores que vienen marcados por defecto, solo marcar ‘Continuous Read’

y marcar ‘Read’ para comenzar la lectura Seleccionar la Wavelength en el valor mas cercano a 230 nm.

Ejemplo de detector con energía baja Ejemplo de detector con buena energía


Mantenimiento de Detectores UV

Precauciones básicas con la célula del detector: – Limpiar con agua después de haber trabajado con tampones

– No dejar nunca la célula en agua durante mucho tiempo para evitar crecimiento de microorganismos

– Desarrollar métodos con tiempos de limpieza suficientemente largos

– Limpiar el sistema con fase móvil adecuada (ACN, Metanol, Agua) al final del día

– Nunca dejar la célula seca. El paso de luz por una célula seca puede estropearla irreversiblemente Siempre que esté la lámpara encendida ha de estar circulando fase móvil por la célula

– Pasar disolvente por las columnas nuevas antes de conectarlas al detector

– Pasar fase móvil por la célula antes de encender el detector cuando éste lleve un tiempo apagado.


Métodos de limpieza

Ante la sospecha de suciedad en la célula el cliente debería seguir estos puntos en orden hasta que se recupere la energía: – Pasar agua si se sospecha de la existencia de precipitados

– Pasar por el detector fase móvil recién preparada.

– Lavar la célula con un disolvente orgánico puro (100% ACN o MeOH, recomendado ACN).

– Lavar durante al menos 30 min (recomendado 4 h) la célula con agua + 1% de ácido fórmico (ó 90:10 agua:orgánico + 1% de fórmico) y después aclarar bien el sistema con agua.

– Hacer un lavado ácido del sistema.

– Llamar al Servicio Técnico de Waters

Mantener la célula es responsabilidad del cliente igual que en los detectores convencionales


Lavado ácido del sistema I

Nunca debe hacerse con sistemas que tengan detector de MS.

Hay que quitar los filtros de las botellas por si fueran Hastelloy.

Consta de los siguientes pasos: 1. Purga de todas las vías (A1, A2, B1, B2, weak needle wash,

strong needle wash y seal wash) con agua:MeOH 50:50 2. Quitar la columna y poner un restrictor que genere 2000 psi a

flujo 0.5 ml/min (apróx.) 3. Llenar un vial con la misma fase móvil y hacer 30 inyecciones full

loop con un run time de 0.5 min y un flujo de 0.5 ml/min 50:50 A1:B1 (esto lleva 30 min apróx.)

4. Repetir los pasos del 1 al 3 usando como disolvente isopropanol. En este paso el líquido no debe pasar por el detector. Hay que llevar la salida del capilar a desecho.


Lavado ácido del sistema II

5. Repetir los pasos del 1 al 3 con agua, volviendo a conectar el capilar al detector.

6. Repetir los pasos del 1 al 3 con ácido fosfórico:agua 30:70 teniendo la precaución de sacar el seal wash de la botella para que no le pase ácido. Al acabar las 30 inyecciones dejar durante 3 horas más el ácido fosfórico circulando por el sistema para acabar de limpiar la célula.

7. Repetir los pasos del 1 al 3 con agua.

8. Repetir los pasos del 1 al 3 con agua:MeOH 50:50

9. Volver a colocar los filtros de las botellas en las líneas de disolvente.

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