Isolation of cDNA clones encoding T cell-specific membrane-associated proteins

01.03.2010 Matthias Weißkopf

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Sequence relationships between putative T-cell receptor polypeptides and immunoglobulins

Mark M. Davis, et al.Nature Vol. 308, March 1984

Gliederung

• Ausgangspunkt• Ziel des Versuchs• Methoden• Ergebnis / Zusammenfassung• Heutiger Stand

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Stand der Dinge (1984)

• T-Zellen erkennen Antigene anders als B-Zellen und in einem anderen Zusammenhang

• Struktur von Immunglobulinen bekannt

• Identifikation des T-Zell Rezeptor Proteins, u.a. von Jim Allison• Heterodimer über Disulfidbrücken verbunden• Besteht aus konstanten und variablen Regionen

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Ziel des Versuchs• Isolierung der Gene, die für den T-Zell Antigen Rezeptor kodieren

• Vier Annahmen zur Identifikation wurden aufgestellt. Die Gene müssen:• ausschließlich in T- und nicht in B Zellen exprimiert werden• membrangebunden sein• von Genen kodiert werden die sich neu anordnen, wie jene bei

Immunglobulinen• aus konstanten und variablen Bereichen bestehen.

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• Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA

Methoden

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T-Zelle

Isolierung der mRNA von membrangebunden Polysomen

cDNA erstellen

5‘ 3‘

5‘3‘

3‘5‘

d

ba

c

a

bc

d

Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA

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B-Zelle

b

a

c

d

a

b

c

e

e

f

Hybridisierung mit Überschuss an B-Zell mRNA

• Trennung von Einzel- und Doppelsträngen per Hydroxyapatit Säule• Weitere Eingrenzung durch Hybridisierung mit ähnlich hergestellter T-Zell

cDNA Probe• cDNA Fragmente wie „d“ und „f“ mögliche Kandidaten für T-Zell Rezeptor

• Einklonieren der cDNA in Plasmide-> etwa 30 TM Klone

Isolierung von T-Zell spezifischer mRNA

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d f

d

• Hybridisierung an genomische DNA aus Leber- und T-Zellen• Radioaktiv markierte Inserts aus den Klonen als Sonde• Verdau mit Pvu II

-> Southern Blot

Überprüfen von somatischer Rekombination

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• Insert aus TM86 besitzt anderes Muster• Somatische Rekombination findet statt

• Annahme: Rekombination des Rezeptorgens unterscheidet sich bei T-Zellen unterschiedlicher Antigenspezifität• Überprüfung durch Hybridisierung mit Insert

von TM86

Überprüfen von somatischer Rekombination

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Überprüfen von somatischer Rekombination

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• Unterschiedliche Bindemuster in allen untersuchten T-Zelllinien

• B-Zellen besitzen selbes Muster wie Leberzellen

-> Diese Art von Rekombination findet nur in T-Zellen statt

• Screening von Thymozyten mit TM86 für weitere gleichartige Klone• 86T1, 86T3 und 86T5

• Sequenzierung der Thymusklone zeigt Genstruktur mit variablen und konstanten Bereich

• Starke Ähnlichkeit zu Immunglobulinen• Variable, Konstante und Joining Regionen

• Strukturanalyse zeigt Transmembran Abschnitt

Sequenzierung des Gens

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Sequenzanalyse

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• TM86 ähnliche mRNAs kodieren für eine Kette des T-Zell Rezeptors (β-Kette)• Unterschiedliche Anordnung von Genen je nach Antigenspezifität

-> somatische Rekombination auf DNA Ebene• Ähnlichkeit im Aufbau zu Immunglobulinen• Vorausgesagte Struktur der Kette:

Ergebnis / Zusammenfassung

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Heutiger Stand

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Quelle: Janeway

Vielen Dank für die Aufmerksamkeit !

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