Isolation and Characterization of the Microflora in Hummus 

Abstract  Hummus is a classic bean spread, popular as an appetizer in Syria, Lebanon, Egypt, Saudi Arabia, and Israel.  It is also part of a new health craze. Because of the rich nutrient composition of the food, it is very susceptible to microbial growth limiting shelf life of the product. Happy Monkey Hummus, a local company of Salt Lake City, Utah strives to create an organic hummus without any artificial preservatives and extended shelf life. However, their hummus is showing air pockets or cracking, due to possible microbial growth. The purpose of the study was to categorize and identify the microflora of hummus through a series of microbial tests in three different flavors produced by Happy Monkey Hummus. Tests included 3M™ Petrifilm™ Aerobic Count Plates for Aerobic plate count (APC), 3M E. coli/coliform, and yeast and mold Petrifilm™ (3M). Also, three sets of dilutions were prepared into flasks of liquid Tryptone glucose extract (TGE) agar from the prepared samples to perform the mesophilic aerobic spore (MAS) test. APC and coliform counts were determined after incubation of 48 h and 24 h at 39.9 C. Yeast and mold counts were also determined after incubation of 120 h at room temperature. The identification of samples was conducted with the microbial identification system (MIS), which uses whole cell fatty acid analysis via gas chromatography to identify bacterial species.   1. Introduction 

Hummus is one of the most popular traditional foods in Syria, Lebanon, Egypt, Saudi Arabia, and Israel. Its sales in the United States have dominated the "refrigerated flavored spreads" segment of the food industry to the tune of $530 million last year (1). The spread is made from cooked, grounded chickpeas blended with tahini, olive oil, lemon juice, salt and garlic. Additional flavorings have been added to hummus sold in the U.S. market to make it more attractive to consumers.  

Hummus has a pH of around 5 and relatively high water activity. Unfortunately, the availability of simple and complex carbohydrates in the product makes it very susceptible to bacterial growth and limits its shelf life to 48 hours under refrigerated conditions(2). Hummus manufacturers make use of inhibitor agents to extend shelf life of product. For the organic segment this may represent a challenge since inhibitors need to meet the requirements of organic certification. This certification is about the process of transformation, that the food ingredient is produced without the use of conventional pesticides, artificial fertilizers, and does not contain ingredients genetically engineered or subjected to irradiation. Any inhibitor agent to be used in hummus needs to meet the above criteria. 

Currently in the market of organic hummus there are other producers such as Tribe, Good Neighbors, Cedar’s, Trader Joe’s, Hope and Pita Pal. They all face a short shelf life problem because of organic preservation. Some companies have started using  HPP (High Pressure Processing) to extend the shelf life and preserve the loyalty to organic and natural banded foods. Hope Fresh Hummus is one of the companies that has found the HPP Solution helpful. HPP does not affect the nutritional value, taste, texture or freshness, and eliminates the pathogen problems in non­preservative foods.  

The company evaluated in this study was Happy Monkey Hummus which entered the market of 

organic hummus in June 2009. Their goal is to create wholesome, organic, preservative­free hummus made with local ingredients. Happy Monkey Hummus currently manufactures under a hot pack/hot fill process. Garbanzo beans are soaked overnight and  cooked in a large kettle at 180 F. Other ingredients, including spices are added to garbanzo kettle and cooked for an additional 15 minutes keeping temperature at 180 F. Garbanzo mix is grinded and transferred to a second kettle where it is pumped into a packaging system. Product is dispensed into individual containers then sealed and chilled. In early 2013, Happy Monkey acquired a 2,000­square­foot facility and a new piece of equipment, World Cup Packaging, which would allow the company to extend the shelf­life of the hummus to up to 60 days without chemical preservatives or fillers. The system reduces the oxygen availability through the introduction of nitrogen into the package’s headspace. This new packaging system has not been as effective in increasing shelf life. The product has been showing air pockets or cracking within two weeks after production limiting shelf life. Air pockets and cracking may be signing microbial growth of aerobic spore­forming organisms of the Genus Bacilli. The objective of this study was to identify and categorize microbial flora present in hummus, a microbial profile will provide a framework to determine appropriate inhibitory agents that meet organic standards to effectively extend shelf life of hummus. Three flavors were analyzed: Original (sample A), Fire Roasted Bell Pepper (sample B), and Pura Vida (sample C). Throughout the study, hummus chilling was monitored to assure that temperatures were consistent and appropriate (see figures 4 and 5). 

2. Materials and methods 2.1 Sample collection Twelve samples of Happy Monkey hummus were collected from Happy Monkey company. All 

samples were made in the same day and collected within a few hours after production. They were of three flavors: Original (A), Fire Roasted Bell Pepper (B), and Pura Vida (C). Samples were packaged in routined containers by machine, placed immediately on ice, and transported on ice to Brigham Young University within 24 h of collection.  

2.2 Enumeration and isolation of microorganisms Upon arrival at Brigham Young University, three 50 g replicates of the first three samples were 

aseptically transferred to a Whirl­Pak® stomacher bag (Nasco, Fort Atkinson, WI, USA) along with 450 g of sterile 0.1% peptone water (HiMedia Laboratories, Mumbai, India) and stomacher for 1 min using a Smasher blender (AES Chemunex, Bruz, France). Homogenates were serially diluted and plated on 3M™ Petrifilm™ Aerobic Count Plates, 3M E. coli/coliform, and yeast and mold Petrifilm™ (3M). APC and coliform counts were determined after incubation of 48 h and 24 h at 39.9 C. Yeast and mold counts were also determined after incubation of 120 h at room temperature.  

Three sets of dilutions were prepared into flasks of liquid Tryptone glucose extract (TGE) agar from the prepared samples to perform the mesophilic aerobic spore (MAS) test ("DIFCO Manual: Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology" 1984).The flasks were held in a water bath of 80 C, incubated, and prepared into pour plates. Counts were determined after incubation of 48 hours at 39.9 C (“Examination of Foods. Washington, DC: American Public Health Association” 1992). The process was repeated every week for a period of 4 weeks to track the microbial growth of the various hummus types over time. 

Colonies from 3M™ Petrifilm™ Aerobic Count Plates and TGE plates were enumerated and categorized based on their differing morphologies. Individual colonies were selected to be identified 

based on the number of morphology types from the APC and TGE plates to obtain an appropriate representation of pertinent colonies. Pure cultures were obtained by streaking individual colonies on fresh nutrient agar plates and incubating for 48 hours at 39.9 C.  

2.3 Identification of bacteria Methods Only colonies from the APC and TGE plates were isolated and identified to the species level 

due to their substantially higher colony counts. The identification of samples was conducted with the microbial identification system (MIS), which uses whole cell fatty acid analysis via gas chromatography to identify bacterial species (MIDI Inc., Newark, DE, USA). The information was analyzed using the MIDI MIS software (MIDI Inc.). The top possible matches for identification were given similarity indexes based on the particularity of the fatty acid profile. The identification of a given isolate was selected as the best match by choosing the species with the highest similarity index. A similar method was used in a study of microbial profile on corn masa. (Adolphson et al. 2013)  

3. Results and discussion 3.1 Enumeration of microorganisms Fig. 1. shows the microbial profiles of the three hummus samples throughout a four week 

period. Data from Week 3 was eliminated from the results due to mechanical issues with the autoclave. Counts for APC ranged from <1.0 x 101 to 1.8 x 102 cfu/ml, while MAS counts ranged from <1.0 x 101 to 9.0 x 101cfu/ml.  

 APC 

In general, more growth is found in Original flavor while least growth is found in Pura Vida. This is attributed to the different ingredients that were used in the different samples. In Original flavor there are very few ingredients. Red bell pepper is a key ingredient in the Bell Pepper sample of hummus, as it is the only additional ingredient differentiating it from the Original hummus flavor. Pura Vida has the most ingredients, including various spices.  

The overall lower levels of APC growth in Bell Pepper flavor in comparison to Original flavor is partly due to the antimicrobial activity of red bell pepper. This is in accordance to the study of Alijaloud S.O, et. al (Aljaloud et al. 2012). Their research showed relatively strong antimicrobial effects of red bell pepper in four strains of E. coli. Red bell peppers may have similar effects in the Bell Pepper hummus, keeping the APC growth significantly below the  

   Fig. 1: Weekly Results 

 

Fig. 1. Microbial profile for coliforms, yeast and mold, APC, and spore formers from three samples of hummus from Happy Monkey Hummus over a four week period. APC= aerobic plate count. *No growth is reported as <10 cfu/ml. **Any growth below 25 cfu/ml is reported as an estimate. 

   Fig. 2: APC Growth Trend Fig. 3:Sporeformer Growth Trend 

     

       

  Fig. 2 and 3. *No growth is reported as <10 cfu/ml. **Any growth below 25 cfu/ml is reported as an estimate.  APC growth of Original hummus. APC growth was lowest for Pura Vida, which is attributed to its many ingredients, including many spices. Cumin, curry, mustard seed, and red chile flakes are ingredients in the Pura Vida hummus, which have antimicrobial properties. Research has been done by Allahghadri et. all on the effects of cumin on various pathogens, and found it to be inhibitory to many, including E. coli, Staphylococcus aureus, and Streptococcus faecalis (Allahghadri et al. 2010). 

The APC counts gathered from the samples were similar and even somewhat lower compared to the APC counts obtained by Mohammed I. Yamani  and Ghadeer F. Mehyar for hummus (Yamami et al. 2011). The hummus used in both cases were of higher acid (pH < 4.5) and without added chemical preservatives. 

As shown in Fig. 2, there was an increase in APC counts of Original and Bell Pepper hummus up to the second week, then declined at the fourth week. The decline in counts in the fourth week might be due to the outcompeting of different microorganisms. In addition, variance in the APC trends may be due to certain species of bacteria which liquify the gel in the Petrifilm APC plates. This factor could have led to some inaccurate counting of the Petrifilm plates.  MAS (mesophilic Aerobic Spores) 

As Fig. 3 indicates, there were mesophilic spores formers present in week 0. There was a decrease in growth for Bell Pepper and Pura Vida hummus, while an increase of growth for Original hummus throughout the period of four weeks.  

It is suggested that Tahini could be one of the main food vehicles of mesophilic aerobic sporeformers due to the nature of sesame seeds and its processing. Tahini is often processed in traditional ways in developing countries without good manufacturing practices. In addition, sesame seeds are often grow close to soil where spores are often found. Samples taken from 14 plants located in Amman, Jordan were studied, and the mesophilic aerobic sporeformer counts immediately after production ranged from 10.0 cfu/g to 1.5 x 103 cfu/g. This is critical when tahini is incorporated with other foods that are essentially suitable for microbial growth, such as in the case of hummus. ("Hazard Analysis and Critical Control Point Generic Models for some Traditional Foods" 2008). 

 Research has shown that superdormant Bacillus spores are of higher moist­heat resistance, 

lower water core content than regular spores, and are able to recover from heat stress injuries during refrigeration. This may cause the increased growth of the mesophilic spores formers in sample A.(Rodriguez­Palacios et al. 2011)  

On the other hand, the reverting of activated spores to dormant spores in refrigerated temperatures of 3 °C could be a cause for the decrease in spore former growth in Bell Pepper and Pura Vida flavors. Similar results were obtained by Amaeze, N.J. in his study of spore formers in fruit (Amaeze 2013). His research concluded that in storage of less than 5 °C after 12 and 24 hours, some of the activated spores returned to a dormant state. The research of Rodriguez­Palacios, and LeJeune, 

JT (Rodriguez­Palacios et al. 2011) found results that were in correspondence to the data, concluding that growth of aerobic mesophilic spore formers can be decreased with refrigerated storage time. After 14­18 days of refrigerated storage, growth was decreased due to reversible states of spores from active to dormant.   

Coliforms, Yeast and Mold Bacteria counts from coliforms of all three samples throughout the time of 4 weeks were <10 

cfu/ml, which were insignificant compared to those from APC and TGE plates. Similar results were obtained by other researchers as well, such as Almualla et al. (Almualla et al. 2010). The lack of coliform growth could be due to the pH of the hummus, as well as the temperature at which it was cooked and held. E. coli, for example, grows at a pH of 4.3­8.0, with optimum growth within a pH of 6.0­7.5, and a temperature of 5­50 °C. Happy Monkey Hummus is kept at a pH of <4.0, which would inhibit growth of E. coli, as well as similar coliforms. The modified processing of Happy Monkey Hummus cooks their beans at 100 °C adds the dry ingredients and holds  at a temperature of 82.2 °C for 10­15 minutes before grinding and packing. This is well above the growth range of E. coli, further inhibiting growth.   

Yeast and mold were also present at insignificant levels. However, yeast and mold are expected to be found in organic hummus after onset of spoilage according to Mohammed I. Yamani  and Ghadeer F. Mehyar’s findings (Yamami et al. 2011). The acidic pH that Happy Monkey Hummus is kept at contributes to the lack of yeast and mold growth, similar to the coliform growth. Further growth inhibition may be due to competition from other microorganisms in the hummus. As this is a ready­to­eat product, the negative results in coliform, yeast, and mold are satisfactory.   

3.2 Identification of bacteria Results A total of 2 bacterial colonies were isolated for identification from the three samples. One 

colony (Isolate 1) represented Micrococcus lylae with a similarity index of 0.146. The other bacterial colony (Isolate 2) represented Microbacterium barkeri with a similarity index of 0.383 or Microbacterium lacticum with a similarity index 0.234 . The two isolates were obtained from microbial growth on TGE plates from Original (sample A) and were later isolated on APC plates. The categorizing of colonies isolated from sample A are shown in Table 1 and 2 from the BYU reports on identification.   Table 1: QUALITY SPECIFICATIONS for Isolate 1 

TEST  SPECIFICATION  RESULTS 

 PURITY Bacterial cultures were grown on solid media and checked for purity by expected colonial morphology. 

Pure culture  Pure culture 

 PHENOTYPIC CHARACTERISTICS 

Bacteria confirmed to have typical appearance and biochemical reactions typical for the genus/species. 

  

Gram stain morphology shows gram­positive cocci. 

 

MIDI FAME ANALYSIS 

Fatty acids were extracted from bacterial cells and methylated using MIDI procedures. Products were analyzed by GC. The FAME profile was compared to a standard library and given a match and similarity index. 

Analysis with the RTSBA6 library method was used. 

Entry name                                     Sim Index   

Micrococcus lylae                     0.146 

  

     Table 2: QUALITY SPECIFICATIONS for Isolate 2 

TEST  SPECIFICATION  RESULTS 

PURITY 

Bacterial cultures were grown on solid media and checked for purity by expected colonial morphology.  

Pure culture  Pure culture 

PHENOTYPIC CHARACTERISTICS 

Bacteria confirmed to have typical appearance and biochemical reactions typical for the genus/species.  

Gram stain morphology shows gram­positive rods. 

MIDI FAME ANALYSIS 

Fatty acids were extracted from bacterial cells and methylated using MIDI procedures. Products were analyzed by GC. The FAME profile was compared to a standard library and given a match and similarity index. 

Analysis with the RTSBA6 library method was used. 

Entry name                              Sim Index   

Microbacterium barkeri                   0.383 

Microbacterium lacticum                 0.234 

  

  

Micrococcus lylae is a non­spore forming organism. It is also an opportunistic pathogen. Only those who are severely immunocompromised are affected by it. It is commonly found on human skin and is common to be released into the indoor air (Kooken et al. 2012). It is highly possible that this organism was introduced to APC plate from the air or human contact during isolation. 

Microbacterium barkeri is a confirmed biocontrol agent against several plant pathogens. It is commonly isolated in the soil (Liu et al. 2012). This organism is not a spore former. One study showed that this organism was commonly found on paper mill pulps containing recycled fibers (Suihko et al. 2009). This is again, a possible contamination and could have been sourced from paper. However this is a beneficial organism due to the fact that it is a biocontrol agent. 

The results point to Microbacterium lacticum as another possible contaminant. It is a non­pathogenic found on human hands (Blaser). It is also highly heat resistant. It is possible that the organism was introduced to hummus during production and was resistant to the spore forming identification method (Collins­Thompson et al. 1972).   

Four organisms were also isolated for gram­staining. They were taken from isolated colonies on an Original APC plate. The Original Hummus was chosen due to the fact that it had the highest overall in microbial loads. They were also chosen due to their diversifying coliform appearance. The staining was done for two purposes. The first was for a better visual of the cells morphology. The second was an understanding of the cells structure based on a gram­negative or gram­positive result. The results of the staining can be seen in Table 3. Table 3 ­ Gram Stain Results 

Coliform appearance  Gram Negative vs Positive  Morphology 

A ­ perfect circle, creamy, rings, uniform color 

negative and positive   bacillus with encapsulation 

B ­ spheres, creamy, flat  negative  diplobacilli 

C ­ circular and jagged edges  positive  streptococci 

 D ­ cloudy, circular 

positive  diplococci 

  

4. Conclusion In this study it was demonstrated that the majority of bacteria present in hummus is gram 

positive. A ratio of 3:2 positive to negative was the result in gram staining, moreover a variety of morphology was observed including bacillus with encapsulation, streptococci and diplococci. In addition to gram stain results, the microbial identification system (MIS) identified the presence of gram positive cocci and gram positive rods. Any inhibitory agent may be targeted to gram positives. 

Comparing plate counts between the three different hummus flavors over a four­week period, it is concluded that the microbial flora is affected by ingredients in hummus. Ingredients present in Bell Pepper flavor and Pura Vida flavor demonstrated an antimicrobial effect. Original flavor (sample A) had the most amount of growth overall, having fewer spices compared to Bell Pepper and Pura Vida. More accurate counts can be obtained in the future using nutrient agar plants in place of APC Petrifilm. In addition, further research can be done to determine whether superdormant Bacillus spores or other specific sporeformers are present in hummus.  Figure 4: Temperature Data Logger 1 

  Figure 5: Temperature Data Logger 2 

    References 

Adolphson, Stephen J., Michael L. Dunn, Laura K. Jefferies, and Frost M. Steel. "Isolation   and characterization of the microflora of nixtamalized corn masa." International Journal of Food Microbiology. no. 3 (2013): 209­213. 

Aljaloud, Sulaiman O., Rabin Gyawali, R. Reddy Muccha, and Salam A. Ibrahim. "Antibacterial  Activity of Red Bell Pepper against Escherichia coli 0157:H7 in Ground Beef." Internet Journal of Food Safety. (2012): 44­47.  

Allahghadri, Tolou, Iraj Rasooli, Parviz Owlia, and Mohammadreza Jalali Nadooshan. "Antimicrobial Property, Antioxidant Capacity, and Cytotoxicity of Essential Oil from Cumin Produced in Iran."Journal of Food Science. no. 2 (2010): G54­H61.  

Almualla, Najla A., Louis C. Laleye, Aisha A. Abushelaibi, Rasha A. Al­Quassemi, Abdulkadar A. Wasesa, and Jobe Baboucarr. "Aspects of the Microbiological Quality and Safety of Ready­to­Eat Foods in Sharjah Supermarkets in the United Arab Emirates." Journal of Food Protection. no. 7 (2010): 1328­1331.  

Amaeze, N.J. "Effect of different fruit components, aeration and cold storage at 5°C on the  germination of ascospores of Neosartorya fischeri." Letters in Applied Microbiology. no. 6 (2013): 443­448. 

Blaser, Martin . Craig J. Venter Insitute, "http://hmp.jcvi.org/jumpstart/hmp079/index.shtml." Accessed December 13, 2013. Martin Blaser, NYU. 

Collins­Thompson, D.L., T Sorhaug, L. D. Witter, and Z. J. Ordal. "Taxonomic Consideration  of Micro bac terium lacticum, Microbacterium flavum, and Microbac terium thermosphac tum."INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATIC BACTERIOLOGY. no. 2 (1972): 65­72. http://ijs.sgmjournals.org/content/22/2/65.full.pdf html (accessed December 13, 2013). 

DIFCO Manual: Dehydated Culture Media and Reagents for Microbiology. Detroit, MI:     DIFCO Laboratories, 1984. Hazard Analysis and Critical Control Point Generic Models for some Traditional Foods. Nasr  

City, Cairo: World Health Organization, 2008.   Kooken, Jennifer M., Karen F. Fox, and Alvin Fox. "Characterization of Micrococcus strains 

isolated from indoor air." Molecular and Cellular Probes. no. 1 (2012): 1­5. http://www.sciencedirect.com.erl.lib.byu.edu/science/article/pii/S089085081100051X (accessed December 13, 2013). 

Liu, Jian, Qing Zhou, He Liu, Gulei Jin, Bo Zhu, Guanlin Xie, and Muhammad Ibrahim. "Genome Sequence of the Biocontrol Agent Microbacterium barkeri Strain 2011­R4." Journal of Bacteriology. no. 23 (2012): 6666­6667. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.erl.lib.byu.edu/pmc/articles/PMC3497549/ (accessed December 13, 2013). 

Rodriguez­Palacios, Alexander, and Jeffrey T. LeJeune. "Moist­Heat Resistance, Spore Aging, and  Superdormancy in Clostridium difficile." Applied Environmental Microbiology. no. 9 (2011): 3085­3091. 

Suihko, ML, and E. Skytta. "Characterisation of aerobically grown non­spore­forming bacteria from paper mill pulps containing recycled fibres." Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. no. 1 (2009): 53­64.  

Vanderzant, Carl, and Don F. Splittstoesser. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Washington, DC: American Public Health Association, 1992. 

Yamami, Mohammed I. , and Ghadeer F. Mehyar. "Effect of Chemical Preservatives on the Shelf Life of Hummus during Different Storage Temperatures."Jordan Journal of Agricultural Sciences. no. 1 (2011): 19­30.