Investigation of the Cellular Behavior of Polycaprolactone ...

of 14/14
International Journal of Scientific and Technological Research ISSN 2422-8702 (Online) Vol 5, No.1, 2019 www.iiste.org 148 | P a g e www.iiste.org Investigation of the Cellular Behavior of Polycaprolactone- Hydroxyapatite Tissue Materials Produced with Bioprinter Erdi Bulus (Corresponding author) Kocaeli University, Institute of Science and Technology, Polymer Science and Technology Program, Kocaeli, Turkey Istanbul Arel University ArelPOTKAM (Polymer Technologies and Composite Applications and Research Center), Istanbul, Turkey E-mail: [email protected] Yesim Muge Sahin Istanbul Arel University ArelPOTKAM (Polymer Technologies and Composite Applications and Research Center), Istanbul, Turkey Istanbul Arel University, Faculty of Engineering and Architecture, Biomedical Engineering Department, Istanbul, Turkey E-mail: [email protected] Hakan Darici Istinye University, Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Istanbul, Turkey E-mail: [email protected] Leyla Turker Sener Istanbul University, Faculty of Medicine, Department of Biophysics, Istanbul, Turkey Istanbul University, TETLAB (3B Medical and Industrial Design Laboratory), Istanbul, Turkey E-mail: [email protected] Abstract One of the most remarkable technologies for developing tissue engineering and artificial organ systems is 3D printers. 3D printers are a very fast developing technology that enables you to produce 3D solid objects from virtually virtualized data. Almost all 3D science printers used in the field of bioprinter, medical applications in the production of tissue and organ production has come forward. The first biological material printed with bioprinter is a supporting structure for bone tissue. In recent years, with the spread of this technology, live tissues such as cartilage, skin, heart valve and aortic vein have been produced. Bioprinter technology, organ transplantation related to the negativity of the tissue and organ regeneration are thought to be very important functions. In this study, tissue material production was produced by synthesized hydroxyapatite (MSSHA) bioceramics from seashells supplemented with polycaprolactone (PCL) matrix. MSSHA bioceramics were synthesized from sand shells (Donax trunculus) seashells by chemical agitation. Characterization studies of bioceramic and tissue scaffolds, structural (X-ray Crystallography (XRD), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), thermal (Thermal Gravimetric Analysis (TGA), Differential Scanning Calorimeter (DSC)), morphological (Field Emission Gun Scanning Electron Microscope) (FEGSEM), mechanical (Tensile) and biological (Cell Culture) analysis, based on the analysis values can be used in the major tissue engineering applications that can adapt to the body and biodegradable as alternative tissue material has been determined. Keywords: Tissue Engineering, Seashells, Hydroxyapatite, Bioceramic, Polycaprolactone, Bioprinter, Tissue Material.
  • date post

    03-Dec-2021
  • Category

    Documents

  • view

    1
  • download

    0

Embed Size (px)

Transcript of Investigation of the Cellular Behavior of Polycaprolactone ...

ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
Hydroxyapatite Tissue Materials Produced with Bioprinter
Erdi Bulus (Corresponding author)
Istanbul Arel University ArelPOTKAM
E-mail: [email protected]
Istanbul Arel University, Faculty of Engineering and Architecture, Biomedical Engineering
Department, Istanbul, Turkey
Department of Histology and Embryology, Istanbul, Turkey
E-mail: [email protected]
E-mail: [email protected]
Abstract
One of the most remarkable technologies for developing tissue engineering and artificial organ systems
is 3D printers. 3D printers are a very fast developing technology that enables you to produce 3D solid
objects from virtually virtualized data. Almost all 3D science printers used in the field of bioprinter,
medical applications in the production of tissue and organ production has come forward. The first
biological material printed with bioprinter is a supporting structure for bone tissue. In recent years, with
the spread of this technology, live tissues such as cartilage, skin, heart valve and aortic vein have been
produced. Bioprinter technology, organ transplantation related to the negativity of the tissue and organ
regeneration are thought to be very important functions. In this study, tissue material production was
produced by synthesized hydroxyapatite (MSSHA) bioceramics from seashells supplemented with
polycaprolactone (PCL) matrix. MSSHA bioceramics were synthesized from sand shells (Donax
trunculus) seashells by chemical agitation. Characterization studies of bioceramic and tissue scaffolds,
structural (X-ray Crystallography (XRD), Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), thermal
(Thermal Gravimetric Analysis (TGA), Differential Scanning Calorimeter (DSC)), morphological (Field
Emission Gun Scanning Electron Microscope) (FEGSEM), mechanical (Tensile) and biological (Cell
Culture) analysis, based on the analysis values can be used in the major tissue engineering applications
that can adapt to the body and biodegradable as alternative tissue material has been determined.
Keywords: Tissue Engineering, Seashells, Hydroxyapatite, Bioceramic, Polycaprolactone, Bioprinter,
Tissue Material.
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
Materyallerinin Hücresel Davranlarnn ncelenmesi
Gelien doku mühendislii ve yapay organ sistemlerine yönelik olarak günümüzde dikkat çeken
teknolojilerden biride 3 boyutlu yazclardr. 3 boyutlu yazclar, sanal olarak tasarlanan datalardan 3
boyutlu kat objeler üretmeyi salayan, çok hzl gelien bir teknolojidir. Neredeyse bilimin her alannda
kullanlan 3 boyutlu yazclar, biyoyazc olarak tbbi uygulamalarda doku ve organ üretimini hedefleyen
çalmalarda öne çkmtr. Biyoyazclar ile baslan ilk biyolojik malzeme kemik dokusu için üretilen
destekleyici bir yapdr. Son yllarda bu teknolojinin yaygnlamas ile birlikte kkrdak, deri, kalp kapa
ve aort damar gibi canl dokular üretilmitir. Biyoyazc teknolojisi, organ nakliyle ilgili yaanan
olumsuzluklar için doku ve organ yenilenmesinde çok önemli ilevler yerine getirebilecei
düünülmektedir. Bu çalmada doku materyali üretimi polikaprolakton (PCL) matrisine takviye edilmi
deniz kabuklarndan sentezlenmi hidroksiapatit (DKSHA) biyoseramikleri ile üretilmitir. DKSHA
biyoseramikleri, kum irlan (Donax trunculus) deniz kabuklarndan kimyasal çöktürme yöntemi ile
sentezlenmitir. Biyoseramik ve doku iskelelerinin karakterizasyon çalmalar, yapsal (X In
Kristalografisi (XRD), Fourier Dönüümlü Kzlötesi Spektroskopisi (FTIR), termal (Termal
Gravimetrik Analiz (TGA), Difransiyel Taramal Kalorimetre Cihaz (DSC)), morfolojik (Alan Emisyon
Tabancal Taramal Elektron Mikroskobu (FEGSEM)), mekanik (Çekme) ve biyolojik (Hücre Kültürü)
analizler ile gerçekletirilmitir. Analiz deerleri esas alndnda balca doku mühendislii
uygulamalarnda kullanlabilecek vücuda uyum salayabilen ve biyolojik olarak parçalanabilir alternatif
doku materyali olarak kullanlabilirlii belirlenmitir.
Anahtar kelimeler: Doku Mühendislii, Deniz Kabuklar, Hidroksiapatit, Biyoseramik,
Polikaprolakton, Biyoyazc, Doku Materyali.
deitirmeye yönelik hücre, mühendislik ve malzeme üçlü kombinasyon sistemlerinin ve uygun
biyokimyasal ve fizikokimyasal faktörlerin kullanlmas ile multidisipliner bir uygulama alandr. Tbbi
uygulamalarda dokunun oluabilmesi için doku iskelelerinin kullanlmasn içermektedir. Organ
yetmezlii, klinik uygulamalarda oldukça ciddi sorunlarndan birisidir. Hastalarn birçou için tek tedavi
seçenei, hasarl doku ve organlar için nakil listesinde kendilerine uyan doku veya organn belirmesini
umutla beklemektir. Ancak gelien doku mühendislii ve yapay organ sistemleri, bilinen organ
nakillerindeki doku reddi ve benzeri sorunlarn da bir yandan çözüme ulamasn salamak için ortaya
çkmtr [1]. Geleneksel teknikler ile üretilen malzemelere alternatif olarak biyoyazc teknolojisi ortaya
çkmtr. Burada hastann gerekli bölgesinin bilgisayarl tomografisi (BT) çekilerek birebir üretimi
yaplabilmektedir. Üç boyutlu yazc teknolojisinin temelleri 1986 ylnda Charles Hull tarafndan
atlmtr. Bu teknoloji özellikle doku mühendislii ve yenileyici (rejeneratif) tp alanlarnda önem arz
etmektedir. Kuzey rlanda’da biyoyazc teknolojisinden faydalanlarak üretilen karacier, ilk kez üç
yandaki bir çocua nakledilerek organ nakli sras bekleyen insanlara umut olmutur [2]. Biyolojik
aktivasyon (biyoaktiflik), malzeme arayüzeylerinde meydana gelen özel bir biyolojik reaksiyon ile ba
oluumu olarak tanmlanmaktadr. Aktivitesi yüksek biyoseramikler, insan vücudunda yeralan kollajen
doku lifleri ile tepkimeye girerek arayüzeyde hidroksi karbona apatit (HCA) oluumu salamaktadr. Bu
tabaka, fiziksel ve kimyasal açdan canl kemii ile benzer yapdadr. Doku ve organlar ile implant
malzemesinin arayüzeyinde meydana gelen bu tabaka, balanma mevcudiyetinin bir göstergesi
olmaktadr [3]. mplant ya da doku destek materyali olarak kullanlabilecek biyomalzemelerin insan dii
ve kemii ile benzer özellikler göstermesi beklenmektedir. Vücudumuz oturma, durma ve koma gibi
günlük aktivitelerde, devaml olarak tekrarlanabilir yüklere maruz kalmaktadr. Vücudumuzda
kullanlabilecek biyomalzemelerin mukavemetli olmalar ve ani gerilmelere dayanabilecek özellikte
olmas istenmektedir [4]. Biyoseramikler vücut içerisinde genellikle iskelet sisteminin onarm için
kullanlmaktadr. Biyoseramikler; tek kristalli, çok kristalli, cam, cam seramik veya kompozit eklinde
deiik fazlarda üretilmektedir. Deiik fazlardaki biyoseramiklerin farkl özelliklerde olmasndan dolay
ilevleri de farkl olmaktadr [5[. Beta trikalsiyum fosfat (β-TCP), kortikal ve trabeküler kemik içi
hasarlarn tedavisinde kullanlan biyouyumlulua ve biyoaktiflie sahip bir biyoseramik malzemedir. β-
TCP ve HA gibi biyoseramikler, iyi biyouyumluluk ve baz durumlarda biyobozunurluluklar nedeniyle
kemik dokusu rejenerasyonu için umut verici biyomedikal malzemelerdir, fakat bu biyoseramiklerin
dezavantaj düük mekaniksel krlganla sahip olmalardr. HA bileiinin formülü Ca5(PO4)3(OH)
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
üretiminde polimerin yapmasn ve kemik oluumunu arttrd için tbbi uygulamalarda
kullanlmaktadr. Gözenekli yapya sahip HA ortopedik cerrahi uygulamalarnda kemik grefti olarak
kullanlmaktadr. Bu yap insan kemiinin mineral fazna en yakn, kalsiyum faz olarak kabul
edilmektedir. HA, insan ve hayvan kemiklerine greftlendikleri zaman toksik olmayan koruyucu yapsal
özellik göstermektedir. HA biyoseramiinin kemik geliimine olan etkisi, gözenek büyüklüü,
gözeneklerin birbiriyle olan balantlar ve kimyasal yap gibi birçok önemli kritere baldr [3]. HA
kristal yaps ekil 1’de yer almaktadr.
ekil 1. HA kristal yaps [3]
Bifazik seramikler (HA+TCP) sayesinde HA’nn çözünmeme ve TCP’nin çok çabuk çözünme ve
dalma sorunlarnn önüne geçilebilmektedir. Böylece hem çat vazifesini istenilen ekilde yerine
getirmesi hem de çözünmenin gereken zamanda gerektii kadar olmas salanarak hücre nüfuziyetine
izin vermesi temin edilmi olmaktadr [6]. Bifazik malzeme kimyasal yaps ekil 2’de yer almaktadr.
HA TCP
Biyouyumluluu yüksek polimer malzemeler, doku mühendislii ve biyomedikal uygulamalarnda
kullanlmaktadr. Bunun yan sra, biyouyumlu polimerler (biyopolimerler) biyomalzeme olarak
kullanldklarnda birtakm problemler ortaya çkmaktadr. Bunlar; in vivo ortamdaki bozunabilme
potansiyelleri ve doal dokuyla elemeyen zayf mukavemet özellikleridir. Biyoseramik ve
biyopolimerlerde gözlemlenen bu eksiklikleri amak için; kemik doku mühendislii iskelelerinin
hazrlanmas amacyla kullanlan seramik/polimer kompozit malzemeler ortaya çkmtr.
Biyoseramikler ve biyopolimerler ile hazrlanan gözenekli kompozit biyomalzeme iskeleleri çeitli
uygulama alanlarnda kullanlmaktadr [3]. Yaplan bu çalmada biyoyazc ile biyouyumlu ve
biyobozunur doku destek materyali üretimi deniz kabuklarndan sentezlenen biyoseramik takviyeli
polimer matris ile salanmtr. Biyoseramik ve doku destek materyalinin karakterizasyon çalmalar
gerçekletirilerek doku destek materyali üzerine biyoseramik yapnn etkisi, doku destek materyalinin
hücre kültürü davranlar özellikleri belirlenmitir. Sentezlenen biyoseramik yapnn kemik ve di
yapsnda da yeralmas, doku mühendislii uygulamalarnda dokunun vücudu kabul etme, vücuda uyum
salamas gibi avantajlar salamas özellikleri göz önüne alndnda doku ve organ yetmezlii
durumlarna alternatif bir materyal üretimi salanmaya çallmtr. Biyoyazc ve biyoyazc uygulama
alanlar ekil 3’de gösterilmektedir.
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
A
B
ekil 3. (A) Biyoyazc ve (B) biyoyazc uygulama alanlar [7]
2. Materyal ve Yöntem
Doal kaynaklardan HA biyoseramik eldesi için kum irlan (Donax trunculus) deniz kabuklar stanbul
Eminönü'ndeki deniz ürünleri sat yapan bir marketten satn alnmtr. Ortofosforik asit (% 85 saflkta
Merck/Almanya) biyoseramik sentezi srasnda fosfat kayna olarak kullanlmtr. Doku destek
materyali üretiminde, molekül arl 80.000 g/mol PCL (%97 saflkta Sigma-Aldrich/Türkiye)
kullanlmtr. Hücre kültürü çalmalarnda kullanlmak üzere perasetik asit, etanol, cam petri kaplar,
insan göbek kordonu kaynakl 3 milyon mezenkimal kök hücre, tripsin, kollajen ve florasan boya gibi
sarf malzemeler stinye Üniversitesi Hücre Kültürü ve Doku Mühendislii Laboratuvar’ndan temin
edilmitir.
Kum irlan (Donax trunculus) deniz kabuklar öncelikli olarak ultrasonik banyoda ve sonrasnda frça
ile çeme suyunda ykanarak kirliliklerinden arndrlmtr. Deniz kabuklar seramik havanda seramik
tokmak yardm ile öütülerek 63 µm’lik elekten elenerek standart toz boyutuna getirilmitir. TGA analizi
ile deniz kabuunun içeriinde bulunan kalsiyum karbonat (CaCO3) miktar belirlenmitir. Stokiyometrik
molar oran HA için Ca/P = 10/6, TCP için Ca/P = 3/2 olarak tespit edilmitir. Aadaki kimyasal
formüller kalsiyum karbonat (CaCO3) ve fosforik asitten (H3PO4) HA üretimini (2.1) ve TCP üretimini
(2.2) göstermektedir.
Ca10(PO4)6(OH)2 2Ca3(PO4)2 + Ca4P2O9 + H2O (2.2)
50 ml saf su bir behere alnarak 2 gr deniz kabuu tozu ilave edilmi ve manyetik kartrc ile karma
balanlmtr. Vücudun stokiyometrik molar oranna göre deniz kabuunun yapsndaki CaCO3 miktar
esas alnarak H3PO4, karm halindeki çözeltiye damla damla dökülerek 80 °C’de 80 MHz güçte 120 dk
ile kartrma ilemi yaplmtr. Elde edilen çözelti etüvde 100 °C’de 2 gün bekletilerek sv ksmndan
uzaklatrlmas salanmtr. Oluan çökeltiler krozelere alnarak amac dorultusunda 450 °C ve 850
°C’de sinterleme ilemi uygulanmtr. Her iki scaklk için frnn scakl dakikada bir 5 °C arttrlarak
450 °C ve 850 °C’ye getirilerek stma ilemi uygulanm ve 4 saat sonra kendi halinde soumaya
braklmtr [6]. ekil 4’de deniz kabuklarndan biyoseramik sentezi aamalar gösterilmektedir.
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
ekil 4. Deniz kabuklarndan biyoseramik sentez aamalar; 1. Donax trunculus deniz kabuklar, 2.
Ultrasonik banyo ile temizleme ilemi, 3. Deniz kabuklarnn frça ile çeme suyunda ykanmas, 4.
Temizlenen deniz kabuklarnn seramik havanda öütülmesi, 5. Öütülen deniz kabuklarnn elekten
elenerek standart toz boyutuna getirilmesi, 6. Donax trunculus deniz kabuuna ait TGA grafii, CaCO3
miktarnn belirlenmesi, 7. Çözeltinin oluturulmas, 8. Stokiyometrik mol oranna göre H3PO4 miktar
hesab ve damla damla karmakta olan çözeltiye ilave edilmesi, 9. Oluan çözeltinin etüvde
kurutulmas ve çökeltinin svdan uzaklatrlmas, 10. Çökeltinin 450 °C ve 850 °C scaklklarnda
sinterlenmesi ilemi, 11. DKSHA biyoseramik eldesi ve kimyasal bileimi.
2.3. Biyoyazc le Doku Destek Materyali Üretimi
3 boyutlu kat modelleme program Solidworks ile doku destek materyalinin tasarm yaplmtr.
Programdan STL format alnarak biyoyazcnn kontrolünün saland modifiye edilmi repeater
programna aktarlmtr. Modifiye edilmi repeater program üzerinden tasarm açlarak özellikler
ksmndan tasarma ilikin biyoyazc bünyesinde yeralan rnga ve tabla scaklk deerleri, doku
materyalinin katman says ve hz, doku materyalinin eni ve boyu özellikleri belirlenmitir. Doku
materyali üretimi için Axolotlbioprinter marka çift rngal ve UV n ile kürleme sistemine olan
paslanmaz rngaya sahip biyoyazc kullanlmtr. Doku materyali üretimi, Tablo 1’deki deerlere göre
paslanmaz rnga içine 10 gr PCL granülleri doldurulmutur. Program üzerinden rnga ucu, biyoyazc
bask hz deerleri, tabla ve rnga scaklk deerleri girilmitir. Eriyik haldeki PCL çözeltisine %1, %5,
%8 orannda 63 µm partikül boyutundaki HA takviye edilerek steril bir odada petri kabna bask
alnmtr [8]. ekil 5’de biyoyazc yardm ile doku destek materyali üretim aamalar yer almaktadr.
Tablo 1. Doku destek materyali üretim parametre deerleri [8]
Çözelti
konsantrasyonu
(arlkça %)
hz (mm/s) Tabaka scakl
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
ekil 5. Biyoyazc ile doku destek materyali üretim aamalar; 1. Doku destek materyalinin bilgisayar
ortamnda tasarlanmas, 2. PCL granüllerinin paslanmaz rnga içine doldurulmas ve repeater
program üzerinden stlarak eriyik hale getirilmesi, 3. DKSHA biyoseramiklerinin Tablo 1’de yer alan
konsantrasyonlarda eriyik PCL’e takviye edilmesi, 4. Biyoyazc ile doku destek materyalinin cam petri
kabna baslmas, 5. Doku destek materyali görseli
2.4. Sentezlenen Biyoseramik ve Üretilen Doku Destek Materyallerinin Karakterizasyonu Setaram Labsys marka TGA analiz cihaz ile azot gaz atmosferinde 550 °C scakla kadar 40 ml/dk
boyunca uygulanarak analiz ilemi gerçekletirildi. DSC analiz cihaz Hitachi 7000X DSC modeldir.
Analizde scaklk aral -80 °C ile 100 °C arasnda ve scaklk art hz da 10 oC/dk olarak belirlendi.
Sentezlenen biyoseramiklerinin amorf-kristal yaplar, X-Pert Pro Philips PANalytical marka X-Ray
difraksiyon cihaz kullanlarak, X-nlarnn üretilmesiyle ve dalm açs oran (2θ) 10 °C ve 90 °C
arasnda 2θ admlar ile 0.02 o/s ilerleyerek ilem yapld. Sentezlenen biyoseramik ve doku destek
materyallerinin FTIR analizleri Jasco 6600 model analiz cihaznda 400 ile 4400 cm-1 dalga boyu
aralklarnda yaplarak gerçekletirildi. 400-4400 cm-1 dalga boyu aralnda belirlenen yüzde transmitans
(%T) deerlerine bal olmakta ve numunelerin yaplarnda bulunan balar tespit edildi. Tutuculara
yerletirilen biyoseramik ve doku destek materyalleri numuneleri FEI QUNTA FEG 450 SEM mikroskop
ile incelendikten sonra fotoraflar çekildi. Sentezlenen biyoseramik ve üretilen doku destek
materyallerinin çap ve boyutlarnn incelenmesi srasnda FEGSEM analizleri için 6000x ve 12000x kat
oranlarnda büyütülmü görüntüler 7 kV potansiyelde incelendi. Doku destek materyalleri mekanik test
cihaz kelepçelerine tutturulmutur. 500 N yük altnda 5 mm2/dk. çekme hzna, 10 mm çene aralna
ayarlanp cihazla mekanik özellikler belirlenmitir. PCL, PCL-%1 DKSHA, PCL-%5 DKSHA ve PCL-
%8 DKSHA içeren doku destek materyalleri %4 perasetik asit %96 etanol içeren solüsyonda 15 dakika
x 3 kez ykanarak steril edilmitir. Ardndan iki kez PBS ile ykanan örnekler UV altnda kurumaya
braklmtr. Sterilizasyonu tamamlanan örnekler s yardm ile cam petri kaplarnn tabanna
sabitlenmitir. nsan göbek kordonu kaynakl 3 milyon mezenkimal kök hücre tripsin ile toplanarak
santrifüj edilmitir. Hücreler 1 ml besiyerinde dilüe edildikten sonra besiyeri 1 ml kollajen solüsyonu ile
kartrlmtr. Karm doku iskelesindeki porlarn üzerine braklarak hücrelerin porlara yerlemesi
salanmtr. Doku materyalleri son olarak florasan boya ile iaretlenerek florasan mikroskopta
görüntülenmitir [3,9].
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
bileimlerde, 4 adet farkl kalsiyum fosfat bileikleri bulunmutur. Sentezlenen biyoseramiklerin XRD
analiz sonuçlar Tablo 2’de yer almaktadr.
Tablo 2. Sentezlenen Biyoseramiklerin XRD Analiz Sonuçlar
Donax trunculus deniz kabuklarndan sentezlenen yaplarn sinterleme öncesi ve sonras deerleri
XRD Kristal yaplar 80 °C 450 °C 850 °C
HA (HCa5O13P3) 43,8 64,0 97,3
Trikalsiyum bisfosfat (Ca3O8P2)
Donax trunculus 80 °C scaklnda; 98-004-9808 JCPDS kart numaral HA (HCa5O13P3) ve 98-000-4710
JCPDS kart numaral Brushite (H5CaO6P) kristal yaplar bulunmaktadr. Donax trunculus 450 °C
scaklnda; 98-008-0526 JCPDS kart numaral HA (HCa5O13P3), 98-000-5561 JCPDS kart numaral
Monotite (HCaO4P) kristal yaplar yer almaktadr. Donax trunculus 850 °C scaklnda; 98-005-2692
JCPDS kart numaral HA (HCa5O13P3) ve 98-007-6896 JCPDS kart numaral Trikalsiyum bisfosfat v-
alfa (Ca3O8P2) kristal yaplar bulunmaktadr. Bu yap yüksek miktarda biyouyumluluu sahiptir ve
kemik yapmzda benzerlii olduundan kemik ve di dolgu malzemesi olarak kullanlmaktadr [3]. ekil
6’da Donax trunculus kabuklarndan sentezlenen biyoseramiklerin 450 °C ve 850 °C’deki sinterlenmi
HA kristal yaps yer almaktadr.
ekil 6. Donax trunculus kabuklarndan sentezlenen biyoseramiklerin 450 °C ve 850
°C’deki sinterlenmi HA kristal yaps
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
3.1.2. FTIR
ekil 7. Donax trunculus deniz kabuklarndan elde edilen, 450°C ve 850°C’de sinterlenmi
biyoseramiklerin FTIR spektrumlar
450 ºC ve 850 ºC’de sinterlenmi Donax trunculus deniz kabuklarndan sentezlenen biyoseramik FTIR
spektrumlar ekil 7’de yer almaktadr. 450 ºC sinterlenmi biyoseramik FTIR spektrumu incelendiinde
PO4 -3 titreimlerine karlk gelen pikler; 449.33, 552.50, 718.35, 921.80, 1031.70, 1070.30 ve 1136.83
cm-1 frekanslarnda iddetli pikler bulunurken, 421.37, 473.43, 669.17 ve 999.91 cm-1 frekanslarnda zayf
pikler halinde gözlemlenmitir. CO3 -2 titreim bantlar 1457.92 ve 1647.88 cm-1’de zayf pikler eklinde
olduu tespit edilmitir. 850 ºC’de sinterlenmi biyoseramik FTIR spektrumu incelendiinde 450 ºC
sinterlenmi biyoseramik FTIR spektrumuna ek olarak; 557.32, 597.82 ve 1026.40 cm-1’de iddetli PO4 -
-
3.2. Termal Analiz
Kalsiyum ve fosfat kayna olan Donax trunculus kullanlarak, kimyasal çöktürme yöntemi ile HA ve
TCP üretimi için gerekli H3PO4 oranlar belirlenmitir. Biyoseramiklerin hazrlanmasnda kalsiyum
kayna olarak CaCO3, fosfat kayna olarak da H3PO4 kullanlmtr. HA için Ca/P: 10/6, β-TCP için
Ca/P: 3/2 stokiyometrik molar oran ile kimyasal reaksiyon için gerekli H3PO4 miktar hesaplanmtr. 2
gr tartlmtr ve Ca mol miktar hesaplanmtr. ekil 8’de Donax trunculus deniz kabuuna ait TGA
grafii yer almaktadr. Tablo 3’de TGA sonuçlar ve ham malzemenin Ca içerikleri bulunmaktadr.
ekil 8. Donax trunculus deniz kabuuna ait TGA grafii
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
Hammadde % Kütle azalmas % CaO miktar 2 gr da CaO mol
miktar
Donax trunculus 54,5 45,5 0.02785
Çalmada %85’lik H3PO4 konsantre (younluu 1.71) kullanlmtr. HA için Ca/P: 10/6, TCP için Ca/P:
3/2 stokiyometrik molar oran ile asit çözeltisinin reaksiyon için gerekli hacmi hesaplanmtr. Tablo 4’de
biyoseramiklerin sentezinde kullanlan H3PO4 miktar yer almaktadr.
Tablo 4. Biyoseramiklerin Sentezinde Kullanlan H3PO4 Miktar
HA(Ca:P = 10:6) TCP (Ca:P = 3:2)
Numune P mol miktar H3PO4 µl/2gr P mol miktar H3PO4 µl/2gr
Donax trunculus 0.01772 1188µl 0.011935 1293 µl
3.2.2. DSC
Doku destek materyallerinin termal analizleri -80 °C ile 110 °C scaklk aralnda 10 °C/dk stma hznda
azot gaz altnda gerçekletirilmitir. lem stma-soutma-stma olacak ekilde 3 admda
gerçekletirilmitir. ekil 8 ve Tablo 5’deki deerler nda PCL’e nazaran Tc, Te ve Tk deerleri
artmtr. Bu scaklk art doku destek materyalinin termal özelliklerinin arttn desteklemektedir.
DKSHA takviye miktar doku destek materyalinde arttkça termal özelliklerinin artt amorf bir yapdan
daha kristal bir yap haline geldii tespit edilmitir [11]. ekil 9’da doku destek materyallerinin DSC
analiz spektrumu ve Tablo 5’de doku destek materyallerinin Tc, Te ve Tk analiz deerleri bulunmaktadr.
ekil 9. Doku destek materyallerin DSC analiz spektrumu
Tablo 5. Doku destek materyallerinin Tc, Te ve Tk analiz deerleri
Tc: Cams geçi scakl
PCL -68.6 57.9 28.8
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
Donax trunculus deniz kabuklarndan sentezlenen biyoseramiklerin 450 ºC ve 850 ºC scaklklarndaki
sinterlenmi farkl büyütmelerdeki (6000x, 12000x) FEGSEM görüntüleri ekil 10 ve ekil 11’de yer
almaktadr. Donax trunculus deniz kabuklarndan sentezlenen 450 ºC’de sinterlenmi biyoseramiin
yapsnda kaln plaka halinde kristallerinin yan sra inemsi whisker tipi kristaller de görülmektedir. ne
kristallerin boyutlar 1-20 µm arasndadr. Buna karlk boyutlar 20 mikrondan daha büyük plaka
halinde yaplar bulunmaktadr. Yüksek scaklklarda sinterlemenin Donax trunculus nano yaplarn oran
ve inceliini arttrd tespit edilmitir. 450 ºC’de ve 850 ºC’de sinterlenmi biyoseramik yaplar
incelendiinde büyük yapsal bir deiim olduu gözlemlenmitir. Ayrca oluan bu partiküllerin
ortalama çaplar 80 nm olduu belirlenmitir. Plaka tipi yaplarn iyi kristallenmi halde olduu yaplan
XRD analizleri ile dorulanmtr. 850 ºC’de sinterlenmi biyoseramik yaps incelendiinde farkl
boyutlara sahip partiküllerin olduu tespit edilmitir. Bu partiküllerin ortalama çaplar 94 nm olduu
tespit edilmitir. Sinterleme scaklnn artmas ile plaka tipi yaplarn deierek küçük parçacklar
eklinde inemsi bir hal ald gözlemlenmitir [3].
ekil 10. 450 ºC sinterlenen Donax trunculus deniz kabuundan sentezlenen biyoseramiklerin
FEGSEM görüntüleri; (A): 6000x, (B): 12000x
ekil 11. 850 ºC sinterlenen Donax trunculus deniz kabuundan sentezlenen biyoseramiklerin
FEGSEM görüntüleri; (A): 6000x, (B): 12000x
3.3.1.2. Doku destek materyallerinin FEGSEM analizi
PCL, PCL-%1 DKSHA, PCL-%5 DKSHA ve PCL-%8 DKSHA doku destek materyallerinin FEGSEM
morfolojik görüntüleri ekil 12’de gösterilmektedir. PCL yaps üzerinde irili ufakl birçok çukur
gözlemlenmitir. Bu çukur yaplar hücre kültürü davran çalmalarnda hücre büyümesini arttrc
yüzey aktivitesi özellii sergilemektedir. PCL matrisine %1, %5 ve %8 orannda DKSHA takviyesi ile
doku destek materyalinin morfolojisi üzerinde DKSHA inorganik biyoseramik yapnn yerald tespit
edilmitir. Ayrca PCL-%8 DKSHA doku destek materyali kesiti incelendiinde fibrillerinin
uzunlamasna yönlendii ve DKSHA biyoseramiinin doku destek materyalinin yüzeyini kaplad
gözlemlenmitir [3,12]. ekil 12’de doku destek materyallerinin FEGSEM morfolojik görüntüleri yer
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
3.4. Mekanik Analiz
3.4.1. Çekme testi
PCL, PCL-%1 DKSHA, PCL-%5 DKSHA ve PCL-%8 DKSHA doku destek materyallerinin çekme
testleri gerçekletirilmi ve ekil 13’de doku destek materyallerinin çekme test deerleri yer almaktadr.
Gerçekletirilen çekme test deerleri incelendiinde PCL-%8 DKSHA doku destek materyali
çalmadaki en yüksek deere sahip olduu tespit edilmitir. DKSHA takviye miktar arttkça doku
destek materyalinin mukavemet özellikleri de dorusal olarak artmtr. Bu mukavemet art hem yük
tama kapasitesi yüksek polimerik (PC) matrisin, hem nanobiyoseramik katknn hem de doku
materyalinde homojen dalmn bir sonucudur [3, 13].
ekil 13. Doku destek materyallerinin çekme test deerleri
3.5. Biyolojik Analiz
3.5.1. Hücre kültürü
PCL, PCL-%1 DKSHA, PCL-%5 DKSHA ve PCL-%8 DKSHA doku destek materyallerinin hücre
davranlar incelendiinde; PCL içeren numuneler UV na maruz brakldnda mavi tonda hafif
otoflorasan özellikte olduu gözlemlenmitir. Hücrelerin, kültüre edildikleri 24 saatlik sürenini ardndan
kollajen içerisindeki ekillerini koruduklar belirlenmitir. Bir ksm hücrenin ise porlarn kenar
ksmlarndan PCL numunesine tutunduklar tespit edilmitir. Por içerisinde bir ksm tabana bir ksm
porun kenarlarna tutunmu, bir ksm ise kollajen içinde 3 boyutlu yerleimini koruyan mezenkimal kök
hücreler (yeil) ve otoflorasan ma yayan PCL-DKSHA içeren doku iskelesi (periferde) yer almaktadr.
ekil 14’de UV na maruz braklm doku destek materyallerinin kollajen içinde hücre yaps ve
otoflorosan ma yayn PCL-DKSHA içeren doku iskelesi gösterilmektedir.
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
A
B
ekil 14. (A) UV na maruz braklm doku destek materyallerinin kollajen içinde hücre yaps, (B)
3 boyutlu yerleimini koruyan mezenkimal kök hücreler (yeil) ve otoflorosan ma yayn PCL-
DKSHA içeren doku destek materyali görüntüsü
PCL-DKSHA içeren por çap daha geni dier bir doku destek materyali içerisinde çok sayda hücrenin
kollajen içerisinde yaamaya devam ettii gözlemlenmitir. Canl hücre oran (boyanmamlar) ölü
hücrelere oranla (krmz) oldukça yüksek olduu ve canl hücre oran en yüksek PCL-%8 DKSHA doku
materyalinde olduu belirlenmitir. ekil 15’de PCL-DKSHA içeren por çap daha geni dier bir doku
destek materyali içerisinde bulunan canl (boyanmamlar) ve ölü hücreler (krmz) gösterilmektedir.
ekil 15. PCL-DKSHA içeren por çap daha geni dier bir doku destek materyali içerisinde bulunan
canl (boyanmamlar) ve ölü hücreler (krmz)
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
Sadece PCL içeren bir dier doku destek materyalinin poru içerisinde iaretli çok sayda hücrenin (yeil)
kollajen ile birlikte porun çeperine tutunduu gözlemlenmitir. Alt ksmdaki hücreler bir hava kabarc
çevresine yerlemi durumda bulunmaktadr Bu durum hücrelerin oksijen almak için doku materyali
içerisinde uygun bölgeleri tercih ettiini iaret etmektedir. Bu hava kabarc çevresine yerlemi
hücreler PCL’e takviye edilen DKSHA biyoseramii orann artmas ile daha da çoalmtr. Hem
kullanlan biyopolimerin hem de takviye edilen biyoseramiin bir etkisi olduu tespit edilmitir [3, 6,
14]. Doku destek materyali por çeperlerine kollajen ile hücrelerin tutunma görüntüsü ekil 16’da
bulunmaktadr.
ekil 16. Doku destek materyali por çeperlerine kollajen ile hücrelerin tutunma görüntüsü
4. Sonuçlar
Kimyasal çöktürme yöntemiyle Donax trunculus deniz kabuklarndan HA ve dier kristal yaplar
sentezlenmitir. Bu yaplar bifazik özellikler sergilemektedir, HA ve TCP yaplarna göre daha
biyouyumlu ve kontrollü biyolojik bozunabilirlik etkileri salyabilmektedirler. Biyoyazc sistemi ile
doku mühendisliine yönelik doku destek materyalleri oluturulmutur. Sentezlenen biyoseramiklerin
yüksek miktarda DKSHA içerdii ve DKSHA orann artmas ile birlikte doku destek materyalinin termal,
mekanik ve biyolojik özelliklerinin de artt belirlenmitir. Hücre kültürü davranlar esas alndnda
doku destek materyallerinin hücre uyumluluunu arttrd belirlenmitir. Biyoyazc ile baslm PCL-
%8 DKSHA doku destek materyalinden dier numunelere göre daha yüksek sonuçlar elde edilmitir.
DKSHA takviyesi ile PCL matris yaplarnn insan kök hücreleri için destek materyali olarak
kullanlabilecei belirlenmitir. Çalmannn devam olarak, canl hücrelerin dorudan hassas
konumlandrlmasyla geleneksel yöntemlerle hedef dokunun oluturulmas srasnda meydana gelen
zaman ve maddi kayplar önlenecektir. Ayrca transplantasyon sonras malzeme kaynakl uyumsuzluun
tamamen ortadan kaldrlmasna imkan salanacaktr.
Teekkür
Üniversitesi ArelPOTKAM (Polimer Teknolojiler ve Kompozit Uygulama ve Aratrma Merkezi), Doku
destek materyali üretiminde Axolotl Biyosistemler San. ve Tic. Ltd. ti. firmas, Doku destek
materyallerinin mekanik özelliklerinin belirlenmesinde Zwick/Roell Zwick Avrasya Ltd. firmas, Donax
trunculus deniz kabuklarnn TGA ve sentezlen biyoseramiklerin XRD analizlerinde stanbul Teknik
Üniversitesi Prof. Dr. Adnan Tekin Malzeme Bilimleri ve Üretim Teknolojileri Uygulama Aratrma
Merkezi ve Hücre kültürü çalmalarnda stinye Üniversitesi Hücre Kültürü ve Doku Mühendislii
Laboratuar çalanlarna desteklerinden ötürü teekkür ederiz.
ISSN 2422-8702 (Online)
www.iiste.org
Kaynaklar
[1] Tarafder, S., & Bose, S. (2014). Polycaprolactone-coated 3D printed tricalcium phosphate
scaffolds for bone tissue engineering: in vitro alendronate release behavior and local delivery
effect on in vivo osteogenesis. ACS applied materials & interfaces, 6(13), 9955-9965.
[2] Aydn, M., Yldrm, F., & Çant, E. (2018). Farkl Yazdrma Parametrelerinde Pla Filamentin
lem Performansnn ncelenmesi. Technologes And Dgtal Industry (3d-Ptc2018) Scentfc
Program, 160.
Elaz.
Dokusundan Türetilmi Mezekimal Kök Hücreler Üzerindeki Osteojenik Etkisinin Deneysel
Kemik Defekti Modelinde Aratrlmas.
[5] Köymen Çaar, P. (2009). Co bazl implant malzemeler üzerine HAP filmlerinin üretilmesi ve
fiziksel ve mekaniksel özelliklerinin incelenmesi (Doctoral dissertation, DEÜ Fen Bilimleri
Enstitüsü).
[6] Bulus, E., Ismik, D., Mansuroglu, D. S., Sahin, Y. M., & Tosun, G. (2017). Synthesis and
characterization of hydroxyapatite powders from eggshell for functional biomedical application. In
Electric Electronics, Computer Science, Biomedical Engineerings' Meeting (EBBT), pp. 1-3.
[7] Mironov, V., Kasyanov, V., & Markwald, R. R. (2011). Organ printing: from bioprinter to organ
biofabrication line. Current opinion in biotechnology, 22(5), 667-673.
[8] Gu, B. K., Choi, D. J., Park, S. J., Kim, M. S., Kang, C. M., & Kim, C. H. (2016). 3-dimensional
bioprinting for tissue engineering applications. Biomaterials research, 20(1), 12.
[9] Bártolo, P. J., Chua, C. K., Almeida, H. A., Chou, S. M., & Lim, A. S. C. (2009).
Biomanufacturing for tissue engineering: present and future trends. Virtual and Physical
Prototyping, 4(4), 203-216.
[10] Meejoo, S., Maneeprakorn, W., & Wnotap, P. (2006). Phase and thermal stability of
nanocrystalline hydroxyapatite prepared via microwave heating. Thermochimica Acta, no. 447,
p. 115–120.
[11] Nyberg, E., Rindone, A., Dorafshar, A., & Grayson, W. L. (2017). Comparison of 3D-printed
poly--caprolactone scaffolds functionalized with tricalcium phosphate, hydroxyapatite, bio- oss,
or decellularized bone matrix. Tissue Engineering Part A, 23(11-12), 503-514.
[12] Endres, M., Hutmacher, D. W., Salgado, A. J., Kaps, C., Ringe, J., Reis, R. L., ... & Schantz, J. T.
(2003). Osteogenic induction of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells in
novel synthetic polymer–hydrogel matrices. Tissue Engineering, 9(4), 689-702.
[13] Becker, J., Lu, L., Runge, M. B., Zeng, H., Yaszemski, M. J., & Dadsetan, M. (2015).
Nanocomposite bone scaffolds based on biodegradable polymers and hydroxyapatite. Journal of
Biomedical Materials Research Part A, 103(8), 2549-2557.
[14] ahin, Y. M. (2019). Synthesis of an Antimicrobial Thioanthraquinone Compound to Produce
Biodegradable Electrospun Mats for Tissue Engineering Purposes. Journal of the Turkish
Chemical Society, Section A: Chemistry, 5(3), 1119-1134.