INSTITUTO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS MÉDICAS FUNDACION Dr BARCELO

TECNICATURA DE ANALISIS CLINICOS ETAPA ANALITICA

DOCENTE Dra TELMA BRICH

AÑO 2013

LABORATORIO DE HEMATOLOGIA

CONTENIDOS:

HEMOGRAMA BASICO

MUESTRA

METODOLGIA MANUAL DE RECUENTO

AUTOMATIZACION

INTERPRETACION DE DATOS INSTRUMENTALES

VALORES DE REFERENCIA

CONTROL DE CALIDAD

CITOMORFOLOGÍA

FISIOPATOLOGIA: ANEMIAS- PATOLOGIA LEUCOCITARIA

BIBLIOGRAFIA

Diagnóstico citológico de las Hemopatías, Grignaschi, Editorial Panamericana, 1991

Diagnóstico Clínico por el laboratorio, Todd-Sanford, Editorial Salvat, 1990.

Fundamentos de Interpretación Clínica de los Exámenes de Laboratorio. G. Ruiz Reyes, Edit Panamericana, 2da

Ed.

CITOMORFOLOGÍA

I. SERIE ROJA NORMAL

A. HEMATIE

El hematíe designado también como eritrocito o glóbulo rojo cuando se encuentra en su último estadío de

maduración carece de organelas, mitocondrias, ribosomas, etc. Este elemento está desprovisto de núcleo, su

función es exclusivamente el transporte de oxígeno a los tejidos y perdura en circulación 120 días. Tiene forma

bicóncava, y la pérdida de su biconcavidad trae como consecuencia la disminución de la vida media y es un factor

hemolítico.

Integridad morfológica y estructural del eritrocito

Hay 3 entidades que mantienen la integridad del eritrocito:

Membrana

Hemoglobina

La glucosa y el complejo enzimático que provee de energía.

La estructura de la membrana permite la flexibilidad y deformabilidad del eritrocito condición indispensable

para la supervivencia. Debe ser lo suficientemente flexible para poder pasar por los capilares esplénicos y

por capilares de un calibre inferior a la mitad de su diámetro.

Patología eritrocítica por anomalías de membrana:

Microesferocotosis hereditaria.

Eliptocitosis familiar.

Estomatosis hereditarias o adquiridas

Hemoglobinuria paroxística nocturna.

La hemoglobina es una metaloproteína que constituye la masa del glóbulo rojo rodeada por una membrana.

Cualquier alteración en su estructura incide en la vida media eritrocítica frecuentemente con alteración de la

morfología.

L a hemoglobina S es una enfermedad molecular genética que se debe a una alteración producida por el

cambio de 2 aminoácidos en la cadena de globina, producen una deformación del eritrocito, alterando su

resistencia y acortando la vida media. Algo similar ocurre con las talasemias por fallas distintas en las

cadenas de globina.

Patologías eritrocítica por anomalía de hemoglobina

Drepanocitosis

Hemoglobina inestable

Hemoglobinas anormales

Talasemias

Anomalías enzimáticas

Déficit de G6PD

Déficit de piruvato kinasa

Morfopatología general del eritrocito:

Cuando la forma y el tamaño de los eritrocitos son coincidentes se habla de isocitosis (En una anemia por

pérdida crónica desangre puede haber isocitosis microcítica).

Anisocitosis: coincidencia de hematíes de variada forma y tamaño.

Isocromía es la coloración uniforme de todos los eritrocitos y lo contrario es anisocromía.

Discromía es la coloración irregular dentro del eritrocito (Por ejemplo por precipitación de hemoglobina

inestable).

Microcitosis disminución del diámetro celular.

Macrocitosis aumento del diámetro celular.

Leptocito es el hematíe de espesor muy disminuido frecuente en anemias ferropénicas.(2)

Esquizocito es el hematíe fragmentado debido a alteración del esqueleto de espectrina de la membrana.(4)

Keratocitos son hematíes en forma de cuerno.(5)

Esferocito hematíe que perdió la forma bicóncava y que tienen una menor superficie con respecto al

volumen.(15-16)

Crenocito hematíe espiculado.(13)

Estomatocito depresión central, cuadro de anemia hemolítica.(6)

Morfopatología eritrocítica por inclusiones:

Punteado basófilo: Se observa en extendidos coloreados con Giemsa Indica patología madurativa ya que se

trata de restos de RNA persistente.

Cuerpos de Howell- Jolly: Son formaciones azurófilas redondeadas constituidos por DNA residual. Aparecen

post esplenectomía.

Morfopatología del eritrocito

B. RETICULOCITO:

Los reticulocitos son células anucleadas predecesoras de los eritrocitos que se diferencian en que poseen gránulos

de ribosomas y algunas mitocondrias que les son útiles para concluir el proceso de síntesis de hemoglobina en

circulación.

Su determinación permite evaluar la producción eficaz de la serie roja por la médula ósea. Su utilidad real es

conocer la capacidad de respuesta de la médula en aquellos casos en los cuales hay disminución de hematíes en

sangre periférica. Esta información es de fundamental importancia en el diagnóstico de anemias por falla en la

producción (anemia aplásica) y por aumento en la destrucción (anemia hemolítica) y en el seguimiento de anemias

carenciales.

MORFOPATOLOGÍA DE LA SERIE ROJA ANEMIAS La característica de la anemia es el descenso de hemoglobina con el consiguiente déficit de la capacidad de la sangre de transportar oxígeno y constituye la base patológica de la mayoría de síntomas y signos de la hipoxia tisular que son disnea, taquicardia, debilidad. Para los fines prácticos 12 g/dl de hemoglobina pueden considerarse como límite inferior para mujeres adultas y 13,5 g/dl para varones adultos. Para determinar la causa de una anemia es necesario realizar determinaciones de laboratorio que puedan establecer la eritropoyesis efectiva (producción y liberación de eritrocitos a la circulación), la eritropoyesis inefectiva y la destrucción de hematíes

CLASIFICACION MORFOLÓGICA SEGÚN LA ETIOLÓGIA

Tipo de anemia VCM CHCM Causa

MACROCITICA

>90 >30 Deficiencia Vit B12

Radiaciones

Absorción defectuosa

Requerimiento supera al

suministro

NORMOCITICA

83-99 >30 Pérdida súbita de sangre

Hemolisis excesiva

Reacciones inmunes

Esferocitosis hereditaria

Hemoglobinopatías

Defectos enzimáticos

Hemopoyesis defectuosa

Pnacitopenia-Radiaciones

MICROCITICA

simple

<83 >30 Formación imperfecta de la

sangre : Enfermedades agudas o

crónicas

MICROCITICA

HIPOCROMICA

<83 <30 Carencia de hierro: Dieta o

absorción deficiente.

Hemorragia crónica

Anomalía genética : Talasemia

Excesiva demanda de Fe:

Embarazos repetidos, crecimiento

Anemia ferropenica

Ferritina es la principal proteína almacenadora de hierro. Es útil para el diagnóstico de anemias

ferropénicas y su valor indica la cantidad de hierro disponible en el organismo.

Transferrina: Proteína transportadora específica de hierro en el plasma sanguíneo. Regula la

absorción de hierro. Toma el hierro liberado producto de la destrucción de los eritrocitos por los

macrófagos el procedente de la mucosa intestinal y lo transporta a los tejidos que lo requieran.

TIBC: Capacidad total de transporte de hierro por la transferrina

UIBC: Capacidad latente de fijación de hierro por la transferrina

% saturación de la transferrina: Mide la cantidad de proteína que fija el hierro circulante

Normalmente hay 200 mg/dl de transferrina transporta 115±50 microgramos /dl de hierro con una saturación

de 35 ±15 %. En anemias carenciales por déficit de hierro la transferrina se encuentra aumentada para

favorecer el transporte y la saturación disminuida.

En procesos inflamatorios la transferrina se encuentra disminuida, la saturación es normal y la

concentración de hierro elevada.

PRUEBA DE LABORATORIO

EVALUACIÓN DE…

Ferremia-Transferrina-TIBC

Anemia carencial

Vitamina B12-Acido Fólico

Anemia carencial

Haptoglobina

Anemia Hemolítica

Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa- Piruvato kinasa

Enzimopatías

Resistencia globular osmótica

Membranopatías

Electroforesis de hemoglobina

Hemoglobinopatías

I. SERIE BLANCA

LEUCOCITOS

Sólo se va a desarrollar el estudio citomorfologíco y morfopatológico de la serie granulocítica y linfomonocítica

madura.

Serie granulocítica Granulocito maduro: Es el elemento leucocitario más abundante en el frotis normal. Se caracteriza por la lobulación

de su núcleo normalmente entre 2 y 5 lóbulos. Cuando la segmentación supera esta última cifra se lo califica de

Pleocariocito, hecho propio de las anemias megaloblásticas

El granulocito eosinófilo debe su coloración a la arginina. Es rico en histamina.

El granulocito basófilo tiene componentes de histamina y heparina cuya función es antitrombótica y obra como

anticoagulante normal del organismo.

Índice neutrófilo: Consiste en contar todos los lóbulos nucleares de 100 neutrofilos. Se procede así: en una planilla

se clasifican los neutrófilos de 1 a 5 lóbulos. Durante la observación microscópica de 100 neutrófilos se anota debajo

de la cifra anterior la cantidad que se contó de cada variedad. Se multiplica cada cantidad por la cantidad de lóbulos

de cada casilla. La suma total constituye el índice. Valor normal: 276. Cuando la cifra es menor se habla de

desviación a la izquierda. Cuando la cifra es mayor se habla de desviación a la derecha.: la primera se da en

procesos infecciosos la segunda es patognomónica de anemias megaloblasticas.

Serie linfocítica

Linfocito: Morfológicamente se distinguen 2 formas circulantes definidas por diferentes momentos evolutivos del

mismo elemento: El linfocito pequeño y el linfocito grande especialmente abundante en la sangre de los niños.

El origen común de los linfocitos son las stem cells de la médula ósea. Como resultado de la migración al timo

adquieren los marcadores de membrana transformándose en Linfocitos T encargados de la inmunidad retardada

(rechazo de injertos). Los linfocitos B no pasan por el timo, migran a los folículos linfáticos de los ganglios y bazo y

son los productores de las Inmunoglobulinas.

Serie monocítica

El monocito es el elemento de mayor tamaño del extendido hemático periférico. El monocito se encuentra en sangre

periférica como un estado transitorio de evolución para su repartición a las células como macrófago.

El examen de los leucocitos comprende dos fases técnicas. En la fase cuantitativa se determina el recuento de leucocitos totales y las cifras absolutas y relativas de las diversas formas de glóbulos blancos. Variaciones cuantitativas de los leucocitos: Se habla de leucocitosis por encima de la cifra de 10000 en adultos y de leucopenia por debajo de la de 4000 por mm3. La cifra normal está comprendida entre 5000 y 7000 por mm3. Ante leucocitosis altas algunos profesionales las denominan reacción leucemoide pero es un término incorrecto ya que la reacción leucemoide estaría acompañada de formas inmaduras. La leucopenia aislada o acompañada de anemia y plaquetopenia es característica de hipoplasia medular. Un aumento o disminución del número total de células en cada serie se denominará:

NEUTROFILIA / NEUTROPENIA

EOSINOFILIA / EOSINOPENIA

LINFOCITOSIS / LINFOPENIA

BASOFILIA / BASOPENIA

MONOCITOSIS / MONOCITOPENIA

Variaciones cualitativas de los leucocitos:

En el aspecto cualitativo se estudian las anormalidades en núcleo y citoplasma y por extensión su funcionalidad.

LEUCEMIA

Es una proliferación o acumulación neoplásica generalizada de células leucopoyéticas con invasión o sin ella de la sangre periférica. Pueden ser agudas, subagudas o crónicas de acuerdo a su evolución. En pacientes que no tienen leucemia, un recuento leucocitario muy elevado (generalmente mayor de 50.000/ml) puede producir un frotis de sangre periférica similar a una leucemia. El tipo más común de reacción leucemoide es granulocítico. Las infecciones bacterianas y algunas neoplasias (como la enfermedad de Hodgkin) pueden ocasionar una reacción leucemoide.

LEUCEMIAS AGUDAS:

El comienzo de la enfermedad es súbito y se asemeja a una infección aguda o séptica. Se observa elevado recuento de formas blásticas circulantes. En la leucemia linfocítica aguda (LLA) se observa una combinación de anemia, trombocitopenia y leucopenia. El elemento predominante es el blastocito inmaduro mieloblasto en el adulto, linfoblasto en el niño.

En la leucemia granulocítica aguda, mielomonocitica y, eritroleucemia tiene como célula común el mieloblasto, ya que monocitos, granulocitos y células eritroides proceden de una célula primitiva común.

LEUCEMIAS CRONICAS

LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA Ocurre principalmente en adultos jóvenes y de edad media. Su aparición puede descubrirse accidentalmente durante una prueba sanguínea habitual. El recuento leucocitario supera generalmente los 50.000/ml y puede superar 300.000/ml. El recuento diferencial es característico y se aprecia un espectro completo de células granulocíticas, desde algunos mieloblastos hasta los neutrófilos maduros. Por otra parte, casi siempre se observa basofilia.

LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÓNICA Más frecuente en varones mayores de 50 años. El recuento leucocitario suele estar entre 30.000 y 200.000 mm3 y un 80 a 90 % de linfocitos pequeños. La citometría de flujo de sangre periférica puede ayudar a establecer un diagnóstico. MIELOMA Proliferación neoplásica de células plasmáticas normales o morfológicamente anormales que se dan generalmente en la médula. En general aparece una gammapatía monoclonal y proteinuria.

C. SERIE MEGACARIOCÍTICA La plaqueta es el producto citoplasmático de la fragmentación del megacariocito. Carecen de núcleo y su rol es la

participación en los eventos de coagulación y fuente de factores de crecimiento.

LABORATORIO DE HEMOCITOLOGIA

La hematología es la especialidad que se encarga del estudio de los elementos formes de la sangre y sus

precursores, así como de los trastornos estructurales y bioquímicos de estos elementos y de los mecanismos de

coagulación.

El hemograma básico comprende:

a) Evaluación recuento de:

Eritrocitos o hematíes

Leucocitos

Plaquetas

El resultado se informa como concentración, cantidad de cada uno de los elementos por volumen de

sangre.

b) Determinación de hemoglobina y hematocrito.

c) Fórmula leucocitaria ,

MUESTRA Y METODOLOGIA

MUESTRA

METODOLOGIA

RECUENTO

HEMATIES,LEUCOCITOS,

PLAQUETAS

Sangre tratada con anticoagulante

EDTA: Etilendiamino tetraacético

tripotasico. Mecanismo: captura de

calcio. No modifica la morfología de

los elementos hasta 24 hs a 4°C.

Heparina Sodio o Litio. Interfiere en

la coloración cuando se realiza el

extendido a partir del tubo de

recolección.

1. Manual en cámara.( Microscopia

óptica)

2. Automatizado

ANALISIS MORFOLOGICO

DE CELULAS

Extendido o frotis sanguíneo.

Microscopia óptica.

3. MEDICION DE PARAMETROS

3.1. HEMATOCRITO (Hto)

Es el porcentaje ocupado por los hematíes respecto al volumen total de la sangre. (Plasma + células)

El microhematocrito se realiza por centrifugación de un tubo capilar cargado con sangre tratada con Citrato de

Sodio, a 10.000 rpm durante cinco minutos en centrifuga para microhematocrito

NEUTROPENIA-LINFOCITOSIS-

LINFOCITOS ATIPICOS? GRANULOCITOS INMADUROS?

Este parámetro no debe utilizarse en forma aislada para establecer el diagnóstico de anemia.

3.2. DETERMINACION DE HEMOGLOBINA (Hb)

Este parámetro es imprescindible para definir si hay anemia o no.

La determinación se realiza por el método de cianometahemoglobina que mide el contenido de hierro y se mide

espectrofotométricamente a 540 nm

Representa la cantidad de esta proteína por unidad de volumen, expresada en g/dl.

3.3. RECUENTO DE HEMATIES

TECNICA MANUAL

RECUENTO EN CAMARA: Se utiliza en laboratorios con muy bajo volumen de trabajo o para confirmación de

resultados. Podemos considerar el recuento en cámara obsoleto y sujeto a graves errores. Si no se dispone de

valores por automatizaciones mejor prescindir del dato y guiarse por el hematocrito y dosaje de hemoglobina.

El tubo de recolección de la muestra sanguínea se debe homogeniezar por inversión por lo menos 60 veces durante un mínimo de 2 minutos. Se diluye la sangre con solución de CLNa (cloruro de sodio) en proporción 1:200. Se carga la cámara de Neubauer con la dilución bien homogeneizada, se deja en reposo para que sedimenten los glóbulos y se cuenta el contenido en 80 cuadraditos, (5 cuadrados de 16 cuadraditos cada uno del retículo central). Ver Cámara de Neubauer. Cálculo:

N X 200 X 10 X 400 Simplificando N X 10.000= cantidad de eritrocitos/ mm3 de sangre.

80 N: número de eritrocitos contados 200: título de dilución 10: corrección de profundidad de la cámara para llevar a 1 mm

3

400: total de cuadraditos de la cámara 80: total de cuadraditos contados

3.4. RECUENTO DE LEUCOCITOS

TECNICA MANUAL Diluyente: Solución acuosa de ácido acético al 2%. Se realiza una dilución de la sangre 1/20 para lo cual debe medirse exactamente: Solución de ácido acético al 2% ...................0,38 ml Sangre ………………………..0,02 ml

VOLUMEN TOTAL

DE SANGRE (VT)

PAQUETE DE

HEMATIES (VH)

CALCULO DEL % HEMATOCRITO:

VT (cm)…………………..100%

VH (cm)………………….100% X VH

VT

Con esta dilución se carga la cámara de Neubauer y se cuenta los 4 retículos para glóbulos blancos, de 16 cuadrados más pequeños c/u. Calculo

N x 20x10 Simplificando N x 50= Leucocitos por mm3 de sangre

4

N=cantidad de leucocitos en 4 cuadrados

20= título la dilución de sangre

10= corrección de profundidad de la cámara para llevar a 1 mm3

3.5. RECUENTO DE PLAQUETAS

TECNICA MANUAL

Diluyente

RVO 1 Clorhidrato de novocaína al 24.3 g/%

RVO 2 Cloruro de sodio al 0,222g/%

Técnica: Mezclar en el momento de usar

Rvo 1……………………0,1 ml

Rvo 2……………………0,9 ml

Mezcla de reactivos …..0,38 ml

Sangre…………………..0,02 ml

Dejar hemolizar en tubo de hemolisis 20 minutos

Contar en cámara de Neubauer en el Retículo de hematíes

Cálculo: N x 400 x 20 x 10 = Simplificando N x 1000= Plaquetas /mm3 de sangre

80

3.6. OBSERVACION MICROSCOPICA DEL FROTIS DE SANGRE PERIFERICA

Objetivo:

Realizar el conteo de la proporción de los diferentes elementos de la serie blanca.

Observar las características morfológicas de los hematíes.

Confirmar recuento y morfología de plaquetas.

Coloración panóptica (May-Grundwald- Giemsa) del frotis.

Solución de May-Grundwald: Es una solución de eosinato de azul de metileno en alcohol metílico.

Colorante de Giemsa: Es una solución de alcohol metílico y glicerina, de eosina, azul de metileno y azur II.

Técnica:

1. Cubrir el frotis con solución de May-Grundwald durante 3 minutos. Fase de fijación.

2. Sin volcar agregar igual cantidad de agua de la destilada .Dejar 30 segundos. Volcar y lavar.

3. Se hace una dilución acuosa de Giemsa a razón de 11 gotas de colorante por cada ml de agua de la canilla.

Se cubre con ella el preparado y se deja un tiempo medio de 15 minutos. Lavar con agua de la canilla. Se

deja escurrir y secar al aire.

4. La solución de May-Grundwald se la puede reemplazar por alcohol metílico puro de buena calidad. Los

resultados son comparables.

5. Se realiza la observación microscópica en 40x. Se realiza el recuento de 100 elementos y se calcula el

porcentaje de cada elemento de la serie de leucocitos.

Formula leucocitaria:

Existen dos tipos: porcentual y relativa. La primera expresa la cantidad por tipo leucocitario por 100

leucocitos. La segunda la cantidad de cada uno por mm3 de sangre.

No hay diferencia sexual en la formula leucocitaria, pero sí en cambio con la edad.

Evolución de la formula leucocitaria en el niño:

Variación de la formula leucocitaria con el stress:

Se cumple en la mayoría de los procesos infecciosos, en muchos metabólicos y necrotizantes.

El síndrome de adaptación comprende tres fases: alarma, reacción o lucha y agotamiento o curación.

Fase de alarma: Se caracteriza por leucocitosis neutrófila con desviación a la derecha del índice de

Arneth.(Regenerativo)

Fase de reacción: Incremento de la cifra de monocitos y descenso de la neutrofilia.

Fase de curación: Linfocitosis y eosinofilia. Desaparición de la desviación a la izquierda del índice de

Arneth.(Degenerativo)

3.7. INDICES HEMATIMETRICOS

Los valores o índices hematimétricos se obtienen combinando los datos obtenidos por la determinación del volumen

globular (hematocrito), el dosaje de hemoglobina y el recuento de hematíes. Estos valores se aplican para la

clasificación hematimétrica de las anemias.

Volumen corpuscular medio:

Relaciona el hematocrito con el recuento de hematíes. Es el “volumen término medio de un eritrocito”.

Expresa el volumen medio de cada eritrocito en femtolitros (10-15

litro)

V.C.M.= Hematocrito x 100

2 primeras cifras de hematíes

Hemoglobina corpuscular media:

Indica la cantidad promedio de hemoglobina en cada hematíe. Se expresa en picogramos.

H.C.M: = Hemoglobina g% x 100

2 primeras cifras de hematíes

Concentración de hemoglobina corpuscular media:

Expresa el porcentual hemoglobínico respecto al hematocrito. Se expresa en porcentaje.

C.H.C.M. = Hemoglobina g% x 100

Hematocrito

3.8. RETICULOCITOS

No se visualizan por la coloración habitual, se debe utilizar un colorante supravital que es azul brillante de cresil.

En condiciones vitales, los eritrocitos más jóvenes que contienen restos de basofilia protoplasmática (restos de

ribosomas) fijan el azul brillante de cresil, el cual los colorea en forma de filamentos o gránulos azules.

Colorante: Azul brillante de cresil 0,1 g/litro en citrato de sodio al 3,8%.

Técnica.

1. Se mezcla en un tubo de hemólisis 0,5 ml de la solución colorante con 3 a 5 gotas de sangre y se incuba a

37 °C 15 minutos.

2. Efectuar extendidos con una gota del contenido de los tubos homogeneizados por agitación suave.

Recuento:

Se hace la relación con la cantidad de hematíes por campo microscópico, observando con inmersión y sin

ninguna contracoloración agregada. Deben contarse los reticulocitos correspondientes a 1000 hematíes e

informarlos en forma porcentual y absoluta, lo cual requiere conocimiento de la cantidad de glóbulos rojos por mm3.

La cifra de reticulocitos para un sujeto con número normal de eritrocitos oscila entre 0,5 y 1,0 %.

Ver CAMARA DE NEUBAUER ANEXO 1

3.9. ERITROSEDIMENTACION o VSG

Consiste en medir la velocidad con la que sedimentan los hematíes de la sangre, provenientes de una

muestra de plasma sanguíneo (Citratado), en un periodo determinado de tiempo, habitualmente una hora.

Es un marcador inespecífico de fase aguda cuya elevación implica procesos inflamatorios, infecciosos o

neoplásicos. La VSG se utiliza como dato de rutina en el screening inicial de enfermedades, como

seguimiento de múltiples enfermedades crónicas, y excepcionalmente como criterio de diagnóstico.

Técnica:

Se llena el tubo de Wintrobe de sangre sin burbujas hasta la marca ¨O¨.

Colocar en un soporte vertical y al cabo de una hora, se lee en la escala descenderte, la cantidad de

milímetros cúbicos que sedimentó la sangre.

RECUENTO AUTOMATIZADO.CONTADORES HEMATOLOGICOS

La automatización proporciona mayor exactitud y precisión que los métodos manuales.

Durante los últimos 20 años la automatización reemplazó casi en su totalidad el recuento manual, con la posible

excepción del recuento de plaquetas con contraste de fase como un procedimiento confirmador. Numerosos

fabricantes de instrumentos desarrollaron y comercializaron analizadores hemáticos. En los casos típicos, estos

analizadores proporcionan en menos de un minuto, los ocho parámetros hemáticos estándar de hemograma

completo [HC], más un recuento diferencial de leucocitos de tres a cinco componentes según el equipo, utilizando

100 ul a 300 ul de sangre entera.

Se generan ocho parámetros medidos o calculados : leucocitos, eritrocitos, plaquetas, hemoglobina, hematocrito,

volumen corpuscular medio (VCM), hemoglobina corpuscular media (HCM) y concentración media de hemoglobina

corpuscular(CMHC).

Los sistemas más grandes y complejos a los parámetros básicos adicionales agregan información sobre la

morfología de los eritrocitos expresada como ancho de distribución eritrocitaria (ADE), volumen plaquetario medio

(VPM) y un histograma diferencial de leucocitos.

Ventajas de la automatización

Velocidad

Precisión en el recuento

Eliminación de fatiga visual del operador.

El número de células que cuenta el analizador es 100 veces mayor que el manual lo que indica un error

estadísticamente menor. Los recuentos se realizan por triplicado.

Los analizadores hemáticos tienen algunos componentes básicos comunes, como los sistemas hidráulicos, neumáticos y eléctricos. El sistema hidráulico incluye la unidad de aspiración, los dispensadores, los diluyentes, las cámaras de de mezclado, los baños de apertura, el flujo de células o ambos, y un hemoglobinómetro. La hemoglobina puede medirse en los contadores hematológicos por el método tradicional con cianometahemoglobina o sulfometahemoglobina.

Para recuento y diferenciación de poblaciones celulares usan dos principios básicos:

Impedancia electrónica

Dispersión óptica.

IMPEDANCIA ELECRONICA

La impedancia electrónica, o la resistencia a la corriente continua (CC) de bajo voltaje fueron desarrolladas por Wallace Coulter en la década de 1950. El principio de la impedancia en el recuento de células se basa en la detección y la medición de cambios en la resistencia eléctrica producida por las células cuando atraviesan una apertura pequeña.

1. Las células suspendidas en un diluyente conductor de la electricidad, como solución fisiológica, se impulsan a través de una apertura (orificio) en un tubo de vidrio.

2. En la cámara de recuento se aplica la corriente eléctrica de baja frecuencia entre un electrodo externo (suspendido en la dilución celular) y uno interno (alojado dentro del tubo de apertura).

3. Se produce una resistencia eléctrica entre los dos electrodos a medida que las células atraviesan la apertura produciendo pulsos de voltaje medibles cuando éstas interrumpen la corriente.

4. El número de pulsos es proporcional al número de células contadas. 5. El tamaño del pulso de voltaje es directamente proporcional al tamaño (volumen) de la célula, lo que

permite la diferenciación por tamaño y el conteo de células de tamaño específico. 6. Los pulsos se reúnen y ordenan (canalizan) según su amplitud mediante analizadores de la altura de los

pulsos.(osciloscopio)

Los datos se proyectan en un gráfico de distribución de frecuencia, o histograma de distribución de tamaño, con el número relativo de células en el eje Y y el tamaño en el eje X. El histograma producido representa la distribución del volumen de las células contadas. Los equipos Coulter realizan una primera dilución para el recuento de hematíes y plaquetas. Si bien en la dilución se encuentran en suspensión también los leucocitos, el orificio de pasaje de la cubeta es de 50um, lo que permite el pasaje sólo de partículas que miden entre 2 y 20 fl como las plaquetas Las que superan los 36 fl son consideradas hematíes. Debido a que en el rango de 35 a 360 fl puede haber población de hematíes la forma de separarlos es mediante la lisis de éstos con detergentes durante la segunda dilución, que producen la ruptura las membranas de los hematíes. Nuevamente vemos diferentes amplitudes de pulsos, según el tamaño, para las 3 poblaciones de leucocitos.

DISPERSIÓN OPTICA

La dispersión óptica puede utilizarse como la metodología primaria o en combinación con otros métodos. En los sistemas de dispersión óptica la muestra circula a través de un canal que, mediante un sistema hidráulico genera un flujo celular laminar (de a una célula por vez), sobre el que impacta un haz de luz monocromática halógena de tungsteno o laser de helio y neón. (Sistema óptico) La interferencia en el haz de luz posibilita la cuantificación de las células. La luz se dispersa en todas direcciones con ángulos de desvío relativos a las características (densidad y tamaño) del cuerpo golpeado. Se generan a su vez procesos de absorción, difracción y de dispersión lumínica en ángulos específicos. La luz dispersa se colecta con lentes, mediante filtros y espejos que separan las distintas longitudes de onda, y los fotodetectores traducen dichas longitudes de ondas en señales eléctrónicas proporcionales.

La dispersión frontal de luz (0°) se correlaciona con el tamaño de la célula. FORDWARD SCATTER.(FS o FSC)

La dispersión “lateral” es consecuencia de la refracción y reflexión lumínica, y se correlaciona con la densidad nuclear, granularidad y complejidad celular. SIDE SCATTER (SS o SSC)

SEPARACION DIFERENCIAL DE POBLACIONES LEUCOCITARIAS.

El uso de varios métodos en un equipo dado para la determinación de por lo menos dos propiedades celulares permite la separación diferencial de los leucocitos en cinco componentes (neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos) y evaluar grado de maduración celular.

CITOMETRIA DE FLUJO (Contadores 3ra Generación)

Es una técnica de análisis celular de última generación que combina las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células cuando se las marca con fluorocromos y se las hace pasar a través de un rayo de luz laser de argón. Para su análisis, un sistema hidráulico impulsa a las células en una corriente de flujo líquido laminar.

Las células al atravesar el rayo de luz, interaccionan con éste causando dispersión de la luz .La dispersión frontal evalúa el tamaño celular mientras que la reflexión de la luz de manera lateral evalúa la granularidad o complejidad de éstas.

Además de medir la dispersión de la luz, si previo a su análisis, se hace reaccionar las células con anticuerpos monoclonales específicos marcados con fluorocromos, éstos pueden reaccionar con sus antígenos complementarios (por ejemplo reticulocitos, enzima peroxidasa, ADN) produciendo una reacción de fluorescencia medible.

El uso de moléculas fluorescentes distintas (naranja de acridina, tioflavina T, isotiocianato de fluresceina y ficoeritrina) permite analizar la presencia de varios marcadores de manera simultánea y realizar un análisis multi paramétrico.

Los impulsos de luz se enfocan sobre tubos fotomultiplicadores y la señal se convierte en una señal digital cuantificable.

CITOQUIMICA La actividad peroxidasa (PX) de la progenie mieloide es nula en los Blastos indiferenciados, y aumenta con su diferenciación, alcanza un máximo de actividad en el Promielocitos, y luego declina manteniendo alta actividad en todos los estadios de diferenciación. La correlación entre la intensidad de la reacción citoquímica PEROX, con la complejidad nuclear, permite clasificar el tipo celular presente. En el canal PEROX, los eritrocitos se lisan y los leucocitos se tiñen por su actividad de PX convirtiendo el sustrato a un precipitado . La suspensión celular pasa por una corriente de flujo laminar donde un sistema óptico halógeno de campo oscuro con tungsteno mide: ABSORBANCIA: proporcional al contenido de PX de cada célula DISPERSIÓN FRONTAL proporcional al tamaño de cada célula INTERPRETACION DE DATOS INSTRUMENTALES

HISTOGRAMAS

Los histogramas son representaciones gráficas de frecuencias de las células (eje y) contra sus tamaños (eje x). En una población celular homogénea la curva adquiere una forma de campana simétrica o distribución de Gauss. La curva es más ancha o aplanada cuando se aumenta la desviación estándar del promedio. Los histogramas también muestran la presencia de subpoblaciones.

HISTOGRAMAS DE HEMATIES

El eje X representa el volumen en fl, en el eje Y se representa el número relativo de células.

ADE: DISPERSION DE

TAMAÑO-ANISOCITOSIS

1. Curva con desviación a la derecha: Presencia de hematíes más grandes como es el caso de las anemias megaloblásticas. VCM ALTO

2. Curva con desviación a la izquierda: Las células son más pequeñas de lo normal, como en las anemias microcíticas ferropenicas VCM BAJO

3. Distribución bimodal : Puede verse en varias situaciones, como la enfermedad por aglutininas en frío, después de transfusión de eritrocitos normales a una persona con eritrocitos de tamaño anormal, en presencia de fragmentos de eritrocitos o cuando hay aglutinación.

ANCHO DE DISTRIBUCIÓN DE LOS ERITROCITOS Es un parámetro exclusivo de los analizadores electrónicos. Es el coeficiente de variación del tamaño eritrocitario. Da idea de la homogeneidad de la población. Indica la presencia de ANISOCITOSIS (DE/MEDIA) *100 =RDW ö ADE 11,5 a 15,1 % Se encuentra aumentada en anemias megaloblastica, anemias por deficiencia de hierro.

HISTOGRAMA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

Anormalidades detectables con el histograma

1- Células por debajo de 35 fL: partículas como plaquetas aglomeradas o gigantes, eritrocitos nucleados y eritrocitos íntegros.

2- Células entre la región de los linfocitos y las células mononucleares: linfocitos más grandes de lo normal, ciertas formas blásticas, células plasmáticas, eosinofilia, basofilia.

3- Células entre las poblaciones mononucleares y de granulocitos: aumento de granulocitos inmaduros o en otras poblaciones de células anormales como ciertos tipos de blastos y eosinófilos.

4- Células en la región derecha lejana de la curva: casi siempre un recuento de granulocitos alto. 5- Alguna anormalidad detectada justo en el límite de 35 fL. 6- Un aumento significativo en la población mononuclear. 7- Una alerta múltiple, cuando se afecta más de una de estas regiones. 8-

HISTOGRAMA DE PLAQUETAS

Histograma de plaquetas: Se define como plaquetas las partículas con volumen entre 2 y 20 fl. El histograma plaquetario es más sensible para determinar las trombocitopatias que los estudios convencionales de visión directa en los extendidos de sangre periférica.

Volumen Medio Plaquetario (VMP).Es el tamaño de la plaqueta expresado en la unidad de volumen fl. su resultado promedio es la medida electrónica del tamaño de unas 3000 plaquetas. La utilidad clínica, está en la clasificación etiológica de las diferentes alteraciones plaquetarias como trombocitopenicas y no trombocitopenicas.

Ancho de distribución de las plaquetas (ADP): Presenta el coeficiente de variación en el tamaño de las mismas. El ancho de distribución de las plaquetas desde el punto de vista morfológico, representa una forma electrónica de cuantificar el tamaño plaquetario.

Plaquetocrito (Pto): Equivalente al Hto., se define como la relación entre el volumen de la masa de plaquetas con la masa total de la sangre. Refleja la concentración de las plaquetas. El plaquetocrito se obtiene para cálculos matemáticos que relacionan el número de plaquetas por volumen y tamaño de las mismas.

Interferencias

Las partículas que se encuentran dentro del intervalo del tamaño de las plaquetas pueden interferir con el recuento y el histograma plaquetario: 1- Las partículas pequeñas pueden superponerse en el extremo bajo del histograma: burbujas, polvo. 2- Los eritrocitos microcíticos interfieren en el extremo superior.

INTERPRETACIÓN DE DISPERSOGRAMAS.

Representación gráfica que muestra la distribución de 2 variables en una población: Volumen celular y contenido celular. La densidad del acumulo representa cantidad y evidencia así aumento o disminución o presencia de células inmaduras o atípicas.

BLASTOS

GRANULOCITOS INMADUROS

NEUTROFILOS

EOSINOFILOS

MONOCITOS

LINFOCITOS

CELULAS

DAÑADAS/ENVEJECIDAS

BLASTOS

HEMATIES NUCLEADOS PLAQUETAS

GIGANTES

1.-Sospecha de células no blancos, neutropenia,

linfocitosis, linfocitos atípicos.

2. Sospecha de granulocitos inmaduros.

3.-Sospecha de linfocitos atípicos.

4.-Neutropenia, linfocitosis, sospecha de

linfocitos atípicos

1 2

3 4

VALORES DE PANICO

Procedimiento de laboratorio para la notificación de valores críticos

1. Serán verificados confirmando el test.

2. Reportados inmediatamente al médico

3. Registrado en el sistema.

VALORES DE MENOS DE MAS DE

PLAQUETAS 20.000 /mm3 1.000.000 /mm3

HEMOGLOBINA 7,0 g/dl 18 g/dl

HEMATOCRITO 21% 55 %

RBC 2,0 *106

/ mm3 7,0 * 106 /mm3

WBC 1.500 /mm3 (ONCOLOGICOS: 0,5) 30.000 /mm3

BLASTOS CONFIRMADO POR FROTIS CONFIRMADO POR FROTIS

CONTROL DE CALIDAD

POSIBLES CAUSAS DE INTERFERENCIAS

Aumento de VCM / discrepancia entre HB y HTO / CHCM anormalmente alto: Presencia de crioaglutininas.

Pseudo trombocitopenia: Agregación EDTA dependiente

Pseudo trombocitosis: Fragmentos eritrocitarios, fragmentos citoplasmáticos en leucemias.

Normocitopenia. Trombocitopenia enmascarada por fragmentos de blastos

Pseudoleucocitosis: Contaminación grasa por venipuntura traumática-Agregados plaquetarios-Plaquetas gigantes-GR resistentes a lisis de reactivos.

Pseudoneutropenia: deficiencia de mieloperoxidasa

CONTROL DE CALIDAD: CBC

Uso de sangre control estabilizada

Monitoreo de moving averages (VCM, MCH,CHCM)

Muestras retenidas de pacientes o combinación de los anteriores. Procesar al menos 2 niveles de sangre cada 8 horas y evaluar. Observar modificaciones o cambios repentinos fuera de los 2DS. Checkeo del background (Dentro de los límites de aceptabilidad del fabricante

8. PARAMETROS DE REFERENCIA HEMOGRAMA BASICO ADULTOS

WBC /LEUCOCITOS 5000-10000/ mm3 NEUTROFILOS 2000-7000/mm3 54-62 % LINFOCITOS 1500-4000/mm3 30-40 % MONOCITOS 200-800/mm3 4-10 % EOSINOFILOS 0-450/mm3 1-3 % BASOFILOS 0-200/mm3

0-1 %

RBC /HEMATIES 4.5-5.5 X106 /mm3

HB / HEMOGLOBINA F: 12-16 g/dl M: 14-18 g/dl HTO/HEMATOCRITO F: 40-44 % M: 46-50 % VCM 80-100 fl HCM 27-32 pg CHCM 32-36 g/dl PLAQUETAS 150000-450000/mm3 ADE /RDW 11,5-15,1 % El recién nacido tiene aproximadamente 5,8 millones de glóbulos rojos por mm3 en la primera semana, luego desciende gradualmente, un volumen globular entre 54 y 58% y hemoglobina entre 17,5 y 18,5% g durante el mismo lapso. Interesa considerar la evolución de los valores con la edad para evitar falsos conceptos de enfermedad

ANEXO1

Cámara de Neubauer: Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las cuales se halla marcado una cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un cubrecámaras que se adhiere por tensión superficial.

Luego se introduce por capilaridad entre la cámara y el cubrecámara la dilución a contar; ya que tiene dos zonas esto permite hacer dos recuentos simultáneamente. Para contar las células se observa el retículo al microscopio con un aumento de 40x y se cuentan las células.

Con base en la cantidad de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el campo del retículo, se calcula la concentración de células por unidad de volumen de la muestra líquida inicial.

AREA DE RECUENTO

LEUCOCITOS

AREA DE RECUENTO DE

HEMATIES

En el retículo central, la cámara de Neubauer posee un cuadrado primario que contiene nueve cuadrados secundarios cada uno de ellos divididos a su vez en 16 cuadrados terciarios, el cuadrado central contiene 25 cuadrados, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. En los bordes de este cuadrado central se cuentan los hematíes, utilizando sólo los cuadrados de los bordes del terciario central y uno de los centrales.

En los secundarios de los bordes superiores e inferiores de la cámara se hace el recuento leucocitario.