8/20/2019 Inmodulen in Vitro Bovino

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Título:

Estudio del efecto de Inmodulen sobre la respuesta inmune bovina:

respuesta proliferativa de linfocitos a mitógenos y expresión de antígenosde superficie en PBLs bovinos.

Científico/s responsable del estudio: Belen Alvarez

Centro/s de realización del estudio: INI

Monitor del estudio:

Eva Navarrete

Patrocinador del estudio: Laboratorios !alier" #. . Les $ran%ueses del &all's

Objetivo del estudio:&alorar los efectos estimulantes de Inmodulen sobre c(lulas del sistema inmune de bovinos

Palabras clave: Inmodulen" linfocitos" mitógenos" antígenos de superficie" bovino

Fecha final estudio: #eptiembre )**)

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1. OBJETIVO

Los estudios realizados están dirigidos a conocer el efecto del compuestoI MO!"#$ (IM ! so"re la respuesta inmune en la especie "o#ina. $ara ello% se &aanalizado el efecto de la adici'n de este compuesto so"re determinados parámetrosinmunol'gicos en diferentes ensa os in #itro.

1) )espuesta proliferati#a de linfocitos a mit'genos.Esta t*cnica nos permite o"ser#ar la dinámica de crecimiento de linfocitos de sangre

perif*rica en respuesta a distintos est+mulos% al adicionar al medio de culti#o unnucle'tido alternati#o marcado radioacti#amente ,ue será incorporado en le -sintetizado de no#o.

2) nálisis por citometr+a de flu/o de la e0presi'n de ant+genos de &istocompati"ilidadde clase I de clase II en linfocitos de sangre perif*rica "o#inos en presencia dedistintos est+mulos

. M TE)I LE2 3 METO O2

.1.%ni&ales ' C(lulas)

La sangre utilizada proced+a de #acas de la raza 4risona% de la gran/a de la4acultad de Veterinaria de la 5ni#ersidad 6omputense de Madrid.

Las c*lulas mononucleares "o#inas se o"tu#ieron de sangre &eparinizada%mediante gradientes de densidad so"re 4icoll78 pa,ue (Bio79&itta:er!.La sangre &eparinizada se dilu ' ; con suero salino glucosado. iez ml de la sangrediluida se depositaron so"re < ml de la soluci'n de 4icoll78 pa,ue de 1%=>> g?ml dedensidad se centrifugaron durante @= minutos a A = 0 g. Las c*lulas mononucleares serecogieron de la interfase entre el 4icoll el plasma% se la#aron #eces con tamp'nfosfato salino ($B2!. espu*s del Cltimo la#ado se procedi' al recuento celular conTripán azul para #er la #ia"ilidad.

. . *espuesta proliferativa a &itó+enos)

Las c*lulas mononucleares de sangre perif*rica "o#inas resuspendidas en mediode culti#o )$MI 1A &. La

proliferaci'n de las c*lulas T se midi' por la incorporaci'n de timidina tritiada ( @87

Timidina! (1 µ6i?pocillo! durante las Cltimas A & de culti#o. espu*s del pulso las

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al"Cmina s*rica "o#ina (B2 ! al =%1G azida s'dica al =%1 G! centrifugando las placasa @ & de culti#o se realiz' además una tinci'n con Ioduro de $ropidio (1µg?ml! con o"/eto de descartar las c*lulas muertas en el análisis.

.@.

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@. )E25LT O2

@.1.*espuesta proliferativa a &itó+enos .

En la figura + se representa la respuesta proliferati#a de $BLs "o#inos en

presencia de IM s'lo (puro! o con dosis su"'ptimas de 6on (1 =%µg?ml! (diluciones seriadas 1? !. 6omo control positi#o se muestra la respuestalinfoproliferati#a inducida por distintas dosis de 6on ( % 1 =. µg?ml! como

control negati#o las cpm o"tenidas con c*lulas culti#adas en ausencia de est+mulo .

B

A

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000180000

Ctrl Con A I MD I MD+ConA 1 I MD+ConA 0,5

c p

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000180000

Ctrl Con A I MD I MD+ConA 1 I MD+ConA 0,5

c p

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En dic&a gráfica podemos o"ser#ar ,ue ninguno de los dos lotes de IM

produce un efecto mitog*nico por si solo ,ue am"os aumentan% de forma significati#a

( !% la respuesta proliferati#a de linfocitos "o#inos a dosis su"'ptimas de 6on (1 =% µg?ml!% es decir poseen un efecto co7estimulador.

En el caso de los e0cipientes del producto no parecen tener ningCn efecto so"relas c*lulas.

@. .%n,lisis del efecto del IM! en la e-presión de antí+enos de M4C de clase I '

de Clase II bovinos .

En el análisis de la e0presi'n de mol*culas de clase I del 6omple/o $rincipal de

8istocompati"ilidad "o#ino (BoL I! o"ser#amos ,ue tiene lugar un incremento en su

ni#el de e0presi'n en el tiempo con el est+mulo IM % cuando lo comparamos con los

ni#eles de e0presi'n en c*lulas sin estimular (6trl!. Este efecto se pone de manifiesto en

los &istogramas de fluorescencia o"tenidos con el anticuerpo BLA8< ( $ig. ) !% en los ,uese representan unidades relati#as de fluorescencia en a"scisas nCmero de c*lulas en

ordenadas% por un desplazamiento &acia la derec&a del perfil de distri"uci'n de las

c*lulasH as+ como en la figura donde se representa la densidad de ant+genos por c*lula

en funci'n de distintos est+mulos en el tiempo.

En la figura 2 se representa la e0presi'n de las mol*culas de clase II )

del 6omple/o $rincipal de 8istocompati"ilidad "o#ino% analizadas mediante el uso de

los anticuerpos monoclonales porcinos con reacti#idad cruzada en #aca% ED?1@ 141

Figura. 1 *espuesta proliferativa de P #s bovinos en presencia de IM! . %! IM Lote + ! IM Lote

) . @01= c*lulas fueron culti#adas durante @ d+as en presencia de IM % diferentes dosis de 6on ( % 1 =.

µg?ml! o "ien coincu"adas con una mezcla de distintas diluciones de IM dosis su"'ptimas de 6on (1

=. µg?ml!. Los #alores representan la media de las cpm de la incorporaci'n de @87Timidina Error Estandard

de < e0perimentos independientes. p =%= comparando con los datos de 6on 1 µg?ml ( ! 6on =.

µg?ml (! mediante el test de la t de student.

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BL 8 BL

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Figura. 3 !ensidad de antí+enos

o#% I/c(lula .

En esta gráfica se representa la

intensidad media de fluorescencia

(IM4! de los ant+genos de

&istocompati"ilidad de clase I

"o#inos a =% < > & de culti#o en

funci'n de distintos est+mulos.

IMF

Figura. 4 $-presión de antí+enos o#% II en P #s esti&ulados con IM!)

$orcenta/e de c*lulas ,ue e0presan los ant+genos BoL II ) reconocidos respecti#amente

por los anticuerpos 141 ED?1@ BL 8 BL

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El aumento en los ni#eles de e0presi'n de las mol*culas de clase I ' en el porcenta/e de

c*lulas ,ue e0presan mol*culas de clase II o"ser#ado en presencia de IM refle/a una

cierta capacidad de acti#aci'n de los linfocitos. demás% considerando el papel de estas

mol*culas en la presentaci'n antig*nica a linfocitos T% podr+a fa#orecer el desarrollo de

respuestas espec+ficas de ant+geno.

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. BIBLIOR) 4I .

5 %lvarez ) ( ===!. N6aracterizaci'n de c*lulas mielomonoc+ticas porcinas . ;esisdoctoral.

5 ald6in C#7 Machu+h !7 $llis 8%7 aessens 87 e6son 87 Morrison 9I) (1DQQ!.N Monoclonal anti"odies S&ic& react Sit& "o#ine T7l mp&oc te antigens and induce

"lastogenesis tissue distri"ution and functional c&aracteristics of t&e target N. Immunology" A@ (@!